CN102399910A - 一种鉴别猪瘟病毒疫苗株与野毒株的引物及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种鉴别猪瘟病毒疫苗株与野毒株的引物及方法。引物如下：5’-AGTAGGACCC TATTGTAGATAA-3’和5’-AGTGCTGTT AAAAATGAGTG-3’。该引物特异性强，可在猪瘟病毒检测中进行应用。使用该引物的检测方法包含如下步骤：模板为猪样本的cDNA，利用前述引物，进行PCR反应，得到扩增产物；通过电泳检测扩增产物，做出如下判断：没有扩增产物，证明所检测的猪样本没有猪瘟病毒感染；扩增产物长度为154bp，证明所检测的猪样本为猪瘟病毒疫苗免疫猪；扩增产物长度不是154bp，初步证明所检测的猪样本为猪瘟病毒野毒感染猪。该方法特异性强、灵敏度高、样品预处理简单、重复性好、易于分析，且实用价值高，能有效将猪瘟病毒疫苗免疫猪与猪瘟病毒野毒感染猪进行区别。

Description

一种鉴别猪瘟病毒疫苗株与野毒株的引物及方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种鉴别猪瘟病毒疫苗株与野毒株的引物及方法。

背景技术

猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种急性、热性和高度接触性传染病。猪瘟在世界上许多养猪国家都有不同程度的流行，OIE将其规定为必须申报的动物传染病之一。近年来，猪瘟成为影响我国养猪业健康发展的一大隐患。在猪瘟的防控方面，发达国家普遍采取扑杀患病猪和带毒猪从而达到对该病的净化，如欧盟从20世纪90年代开始采取对猪瘟患猪和猪瘟病毒感染猪进行宰杀的方式而达到对该病的净化；我国采取的是疫苗免疫接种为主的政策。我国研制的猪瘟兔化弱毒疫苗是国际公认的最安全有效的弱毒疫苗，在我国乃至全球得到广泛应用，为猪瘟的防控做出了巨大贡献。弱毒疫苗免疫猪后虽然可以产生完全的保护，但也存在无法从血清学上区分猪瘟病毒感染猪和疫苗免疫猪的问题，给猪瘟病毒感染猪和疫苗免疫猪的鉴别诊断带来了很大困难。因此亟待建立一种可以准确区分猪瘟病毒疫苗免疫猪与猪瘟病毒野毒感染猪的检测方法。

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。PCR反应类似于DNA的天然复制过程，由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成，即在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模版DNA链互补的半保留复制链。通过PCR，能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，具有特异、敏感、产率高、快速简便、重复性好、易于自动化等突出优点，PCR已广泛应用于生物检测和疾病诊断等领域。由于猪瘟病毒基因组是单股正链RNA，因此需用RT-PCR的方法来扩增病毒目的片段。反转录酶链反应(Reverse Transcription-polymeraseChain Reaction，RT-PCR)的基本原理是以所需检测的病毒RNA为模版，反转录合成cDNA，然后以cDNA为模板进行PCR扩增。典型的RT-PCR包括样品RNA的制备、引物的设计和合成、反转录合成cDNA、以cDNA为模板进行PCR扩增，、扩增产物的检测。合理的引物设计是成功应用RT-PCR技术的关键。引物的特异性对反应有很大影响，如果引物特异性不高，可能在扩增过程中产生非靶标条带，影响检测结果的判定。对同种病毒的不同毒株进行检测，则应选择该株系的特异序列区进行引物设计。

对于猪瘟病毒疫苗株与野毒株的检测，更好的专用引物和检测条件是该领域研究的重要技术问题。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种鉴别猪瘟病毒疫苗株与野毒株的引物。

本发明的另一目的在于提供所述的鉴别猪瘟病毒疫苗株与野毒株的引物的应用。

本发明的再一目的在于提供一种鉴别猪瘟病毒疫苗株与野毒株的方法；该方法通过应用上述鉴别猪瘟病毒疫苗株与野毒株的引物实现。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种鉴别猪瘟病毒疫苗株与野毒株的引物，其核苷酸序列如下所示：

CSFV-P1：5’-AGTAGGACCCTATTGTAGATAA-3’；

CSFV-P2：5’-AGTGCTGTTAAAAATGAGTG-3’；

所述的鉴别猪瘟病毒疫苗株与野毒株的引物在猪瘟病毒检测中的应用；

所述的猪瘟病毒为猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)或CSFV野毒株(GXW-07)。

一种鉴别猪瘟病毒疫苗株与野毒株的方法，通过使用上述引物实现；具体包含以下步骤：

(1)PCR反应：引物为CSFV-P1和CSFV-P2，模板为猪样本的cDNA；得到扩增产物；

(2)结果判断：通过电泳检测扩增产物，做出如下判断：

①没有扩增产物，证明所检测的猪样本没有猪瘟病毒感染；

②有扩增产物的，扩增产物长度为154bp，证明所检测的猪样本为猪瘟病毒疫苗免疫猪；

③有扩增产物的，扩增产物长度不是154bp，初步证明所检测的猪样本为猪瘟病毒野毒感染猪；通过对扩增产物进行测序，进行猪瘟病毒种类的确认；

步骤(1)中所述的猪样本的cDNA可通过使用随机引物、OligodT或者CSFV-P2对猪样本的总RNA逆转录得到；逆转录的条件根据所使用的逆转录酶的说明书推荐的反应体系和反应参数操作即可；

步骤(1)中所述的PCR反应的参数优选为93～95℃变性45s～5min；93～95℃变性30s，46～56℃退火30s，70～72℃延伸30s，30个循环，最后70～72℃终延伸10min；

所述的PCR反应的参数更优选为94℃2min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃终延伸10min；

步骤(2)中所述的电泳检测优选为琼脂糖凝胶电泳检测或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

本发明所述的鉴别猪瘟病毒疫苗株与野毒株的引物的设计方法，包括以下步骤：

A、通过NCBI(美国国立生物信息中心)的GENBANK数据库检索已公布的Alfort株、Shimen株、ALD株、Brescia株、HCLV株等44株猪瘟病毒的基因组序列；

B、通过DNAMAN软件将不同株系的同一病毒基因序列进行比对，寻找其保守区域以及强弱毒有明显差异的区段；

C、使用PRIMER5.0引物设计软件在强弱毒有明显差异的区段内设计引物。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

首先，本发明提供了一种鉴别猪瘟病毒疫苗株与野毒株的引物，该引物特异性强，根据实验证明，该引物能特异检出猪瘟病毒疫苗株与野毒株，对乙脑病毒(JEV)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)无反应；而且，由于该引物的序列存在于已知的猪瘟病毒株中，因此，对猪瘟病毒株的检出率高。

其次，本发明所提供的方法具有如下优点：特异性强、灵敏度高、样品预处理简单、重复性好、易于分析。该方法实用价值高，能有效将猪瘟病毒疫苗免疫猪与猪瘟病毒野毒感染猪进行区别。

附图说明

图1是不同退火温度下PCR反应电泳图，其中：

泳道M为DNA Marker；

泳道1为退火温度为46℃的PCR产物；

泳道2为退火温度为47℃的PCR产物；

泳道3为退火温度为48℃的PCR产物；

泳道4为退火温度为49℃的PCR产物；

泳道5为退火温度为50℃的PCR产物；

泳道6为退火温度为52℃的PCR产物；

泳道7为退火温度为54℃的PCR产物；

泳道8为退火温度为56℃的PCR产物。

图2是本发明所述的方法的特异性检测结果电泳图，其中：

泳道M为DNA Marker；

泳道C为为HCLV；

泳道W为GXW-07；

泳道1为JEV；

泳道2为PRRS。

图3是本发明所述的方法的敏感性检测结果电泳图，其中：

图A为猪瘟病毒疫苗；图B为猪瘟病毒GXW-07；

泳道M为DNA Marker；

泳道c1为使用猪瘟病毒疫苗10pg为模板；

泳道c2为使用猪瘟病毒疫苗1pg为模板；

泳道c3为使用猪瘟病毒疫苗0.1pg为模板；

泳道c4为使用猪瘟病毒疫苗0.01pg为模板；

泳道w1为使用猪瘟病毒GXW-07 10pg为模板；

泳道w2为使用猪瘟病毒GXW-07 1pg为模板；

泳道w3为使用猪瘟病毒GXW-07 0.1pg为模板；

泳道w4为使用猪瘟病毒GXW-07 0.01pg为模板。

图4是对猪瘟疑似病例的检测结果电泳图。

图5是对猪瘟疑似病例的检测结果电泳图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(一)引物的设计。

1、通过NCBI(美国国立生物信息中心)的GENBANK数据库检索已公布的Alfort株、Shimen株、ALD株、Brescia株、HCLV株等44株猪瘟病毒的基因组序列；

2、通过DNAMAN软件将不同株系的同一病毒基因序列进行比对，寻找其保守区域以及强弱毒有明显差异的区段；

3、使用PRIMER5.0引物设计软件在强弱毒有明显差异的区段内设计引物，得到如下引物：

CSFV-P1：5’-AGTAGGACCCTATTGTAGATAA-3’；

CSFV-P2：5’-AGTGCTGTTAAAAATGAGTG-3’。

(二)PCR反应：25μL反应体系中，以猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)为模板反转录得到的cDNA 2μL，10×EXTaq缓冲液2.5μL，dNTP2.5μL，CSFV-F(10μmol/L)和CSFV-R(10μmol/L)各1μL，EXTaq酶0.25μL，去离子水16μL。PCR反应条件为94℃2min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃终延伸10min。

PCR退火温度的确定。

引物在不同退火温度(46℃～56℃)均能扩增出特异性目的条带，其中50℃扩增效率最高(图1)。因此，选择50℃为最佳退火延伸温度。

RT-PCR标准化检测方法。

RT-PCR检测步骤是现有常规步骤，采集猪的血液样本进行RNA抽提，然后进行检测。下面是相关检测条件。

逆转录反应：20μL体系中，总RNA 6μL，dNTP(10mM)6μL，RNA酶抑制剂1μL，反转录酶AMV1μL，随即引物1μL，Oligo(dT)1μL，5×Buffer4μL。RT反应条件为：42℃反应1h。

(三)性能检测

①特异性试验。

用建立的RT-PCR方法，用猪瘟病毒特异性引物对猪瘟病毒疫苗株(HCLV)(广东永顺生物制品公司产品)、猪瘟病毒野毒株(GXW-07)(猪瘟病毒感染对猪外周血T淋巴细胞亚群及TNF-α和IFN-γ的影响.中国预防兽医学报，2011，33(2)：126-129)、乙脑病毒(JEV)GZ0409-31株(猪乙型脑炎病毒3种灭活疫苗的制备及免疫效果比较.华南农业大学学报，2011，32(2)：85-88)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)GD08-1株(猪繁殖与呼吸综合症病毒分离株ORF5和Nsp2基因的序列分析.华南农业大学学报，2010，31(2)：108-112)进行检测，结果表明，HCLV株与GXW-07株分别扩增出2条大小分别为154bp、142bp的特异性条带，与预期大小相符，JEV、PRV、PRRSV均未出现任何扩增条带(如图2所示)。

②敏感性试验。

用建立的PCR方法对10倍梯度稀释的HCLV株与GXW-07株cDNA为模版进行检测，结果显示，建立的PCR方法对HCLV株与GXW-07株cDNA模板的最低检出量均为0.1pg(图3)。

③疑似病料的检测。

分别用猪瘟病毒特异性引物和猪瘟病毒通用引物对HCLV、GXW-07和临床上采集的8份疑似CSF血液病料进行检测。附图4和附图5检测结果显示，检测结果一致。由图4可知，其中1份类似于弱毒，3份类似于CSFV强毒，4份无CSFV检出。

④重复性试验。

每份样品做3个重复，分别提取RNA，反转录后，在同一次扩增中进行测定。试验重复3次检测结果一致(如图5所示)。

对比实施例：

通过实施例1步骤(一)引物的设计的方法，还得到如下引物：

弱毒特异-P1：5’-GCAGTTTACTCCAGGACGCA-3’；

弱毒特异-P2：5’-CACATTCCAGACTGATGACGG-3’。

shimen-P1：5’-ATCAGTCTGGAATGTTGGCA-3’；

shimen-P2：5’-CAAGCAGATGAGGAATGCCG-3’。

HCLV-P1：5’-CACACACCAAGGTGGCATC-3’；

HCLV-P2：5’-TGAATTCTCCCCTGCTCG-3’。

用上述3种引物，分别以HCLV株与GXW-07株cDNA为模版进行检测，结果显示，每对引物针对HCLV株与GXW-07株的cDNA模版均出现了相同大小的条带，但通过琼脂糖凝胶电泳的方法不能对疫苗株与野毒株进行有效的区分，实验证明只有引物对CSFV-P1和CSFV-P2的特异性和灵敏性好。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种鉴别猪瘟病毒疫苗株与野毒株的引物，其特征在于核苷酸序列如下所示：

CSFV-P1：5’-AGTAGGACCCTATTGTAGATAA-3’；

CSFV-P2：5’-AGTGCTGTTAAAAATGAGTG-3’。

2.权利要求1所述的鉴别猪瘟病毒疫苗株与野毒株的引物在猪瘟病毒检测中的应用。

3.根据权利要求2所述的鉴别猪瘟病毒疫苗株与野毒株的引物在猪瘟病毒检测中的应用，其特征在于：所述的猪瘟病毒为猪瘟兔化弱毒疫苗或CSFV野毒株GXW-07。

4.一种鉴别猪瘟病毒疫苗株与野毒株的方法，通过使用权利要求1所述的鉴别猪瘟病毒疫苗株与野毒株的引物实现，其特征在于包含以下步骤：

(1)PCR反应：引物为CSFV-P1和CSFV-P2，模板为猪样本的cDNA；得到扩增产物；

(2)结果判断：通过电泳检测扩增产物，做出如下判断：

①没有扩增产物，证明所检测的猪样本没有猪瘟病毒感染；

②有扩增产物的，扩增产物长度为154bp，证明所检测的猪样本为猪瘟病毒疫苗免疫猪；

③有扩增产物的，扩增产物长度不是154bp，初步证明所检测的猪样本为猪瘟病毒野毒感染猪；通过对扩增产物进行测序，进行猪瘟病毒种类的确认。

5.根据权利要求4所述的鉴别猪瘟病毒疫苗株与野毒株的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的PCR反应的参数为93～95℃变性45s～5min；93～95℃变性30s，46～56℃退火30s，70～72℃延伸30s，30个循环，最后70～72℃终延伸10min。

6.根据权利要求5所述的鉴别猪瘟病毒疫苗株与野毒株的方法，其特征在于：所述的PCR反应的参数为94℃2min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃终延伸10min。

7.根据权利要求4所述的鉴别猪瘟病毒疫苗株与野毒株的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的电泳检测为琼脂糖凝胶电泳检测或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

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