CN101407847A - 肠道病毒Cox A16核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种肠道病毒柯萨奇A16型(Cox A16)核酸荧光定量RT－PCR检测试剂盒及检测方法。所述荧光定量RT－PCR检测试剂盒的上下游引物和特异性探针序列如下：上游引物CA16YGF：5’－GGGAATTTCTTTAGCCGTGC－3’；下游引物CA16YGR：5’－CCCATC AAR TCAATG TCCC－3’；特异性探针COXA16PB：5’－ACAATGCCCACCACGGGTACACA－3’；本发明方法对肠道病毒Cox A16的检测有高度的特异性，与其他肠道病毒无交叉反应，且灵敏度达0.1TCID₅₀，可直接从疑似手足口病患者的脑脊液、疱疹液和粪便等标本中检测肠道病毒Cox A16核酸，从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右，非常适用于手足口病等由肠道病毒Cox A16感染引起突发疫情的实验室早期诊断。

Description

肠道病毒Cox A16核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒及检测方法

(一)技术领域

本发明涉及一种肠道病毒柯萨奇A16型(Cox A16)核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒及检测方法，可应用于手足口病等暴发疫情的实验室应急检测。

(二)背景技术

手足口病(Hand foot mouth disease HFMD)是婴幼儿常见的传染病，临床上以发热和手、足、口腔等部位出现皮疹、溃疡等表现为主，个别患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等致命性并发症，手足口病是全球性传染病，世界大部分地区均有此病流行的报导。

手足口病一般是由肠道病毒引起的一种急性传染病，近年中国手足口病的爆发流行引起了全球的关注，卫生部已将手足口病纳入国家丙类法定报告传染病，通过网络直报系统对疫情进行监测。

由于HFMD是由多种人肠道病毒感染引起，其中以EV 71及Cox A16型最为常见，为了对该病迅速查明病因，及时采取控制措施，急需进行实验室快速诊断，但肠道病毒传统的检测方法是病毒分离和中和法定型，繁琐费时，不适合早期诊断。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种手足口病感染实验室应急检测的肠道病毒Cox A16型荧光RT-PCR检测试剂盒及检测方法。

本发明采用的技术方案是：

肠道病毒Cox A16核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒，所述荧光定量RT-PCR检测试剂盒的上下游引物和特异性探针序列如下：

上游引物CA16YGF：5’-GGGAATTTCTTTAGCCGTGC-3’

下游引物CA16YGR：5’-CCC ATC AA R TCAATG TCC C-3’

特异性探针COXA16PB：5’-ACAATG CCC ACC ACG GGTACA CA-3’

引物CA16YGR序列中，碱基R为A或G的兼并碱基，此处为引物的突变位点，就是说该处有些病毒是A，有些是G。而在引物的合成工艺过程中，其合成原理是到这个位点时，原料各加一半也就是加一半A，加一半G。

本试剂盒中关键组分为引物和探针序列，此外还包括dNTP，MgCl₂，RNase抑制剂，AMV逆转录酶，Taq酶等，这些组分对于本领域技术人员来说属于公知常识，可根据需要选用。

本发明还涉及一种肠道病毒Cox A16核酸荧光定量RT-PCR检测方法，所述方法包括：

(1)根据肠道病毒Cox A16基因序列，设计上下游引物和特异性探针序列如下：

CA16YGF：5’-GGGAATTTCTTTAGCCGTGC-3’

CA16YGR：5’-CCC ATC AA R TCAATG TCC C-3’

COXA16PB：5’-ACA ATG CCC ACC ACG GGT ACA CA-3’

引物CA16YGR序列中，碱基R为A或G的兼并碱基。

(2)提取待测样品RNA，以待测样品RNA为模板、在包括步骤(1)

所述引物和探针序列的RT-PCR反应体系中进行RT-PCR反应；

(3)对RT-PCR反应产物进行荧光检测，根据荧光检测的最低Ct值和最高荧光强度判断结果，若荧光RT-PCR反应呈阳性，则待测样品含有肠道病毒Cox A16核酸。

本发明关键在于引物和探针序列的设计，RT-PCR反应体系组成、反应条件选择和反应结果判断均可按本领域常规方法进行。

优选的，所述RT-PCR反应体系终浓度组成如下：

RT-PCR缓冲液            终浓度为1×

Ex Taq HS               0.1U/μL

RT Enzyme Mix II        0.1U/μL

上游与下游引物          各1.60μM

探针                    0.80μM

模板RNA                 X～X ng/μL

DEPC水补足至25μL。

所述RT-PCR缓冲液为one step RT-PCR缓冲液，其终浓度为1×，是指缓冲液各组分在反应体系中的终浓度与1×one step RT-PCR缓冲液中各组分的浓度相同。通常采用反应体系1/2体积的2×one step RT-PCR缓冲液。1×one step RT-PCR buffer的具体组成参照Takara公司的one stepPrime Script RT-PCR(Perfect Real time)，Code：DRR064A。

所述RT-PCR反应条件为：42℃ 30min，95℃ 2min进行逆转录，然后95℃ 5s，51℃ 35s，在51℃进行单点荧光检测，共进行40个循环。

所述样品RNA提取可按常规方法进行，如采用德国QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit或其它试剂盒，按照试剂盒说明书进行提取。

手足口病是由多种人肠道病毒感染引起，其中以EV 71及Cox A16型最为常见，对手足口病爆发疫情尽早作出实验室确诊是及时采取防控措施与对诊治疗的关键。肠道病毒检测传统的方法是采用细胞培养进行病毒分离，然后用肠道病毒组合血清进行型别鉴定，该方法虽然正确可靠，但繁杂耗时，不适应早期应急诊断。近年来，随着分子生物学技术的发展，采用RT-PCR技术对肠道病毒进行诊断国内外已有报导，它具有灵敏度高，特异性强，所需时间短等优点，目前已在肠道病毒的核酸检测中得到应用，但其检测时间仍需6～7h，且容易由于PCR扩增产物污染而产生假阳性。

近几年发展起来的以特异性荧光探针为特点的荧光定量PCR技术，实行完全闭管式操作，不仅能大大减少扩增产物污染的机会，而且较常规RT-PCR技术，无论从敏感性，特异性与速度上都更具有优势，当然它对引物和探针的设计也提出了更高的要求。

本申请发明人从美国的NCBI基因库上下载了近二十年来世界各地的肠道Cox A16毒株，对其进行了同源性比较，在Cox A16的VP1区设计若干对引物与Taqman探针，对该区域进行特异性扩增，从中筛选出最佳的引物和探针，并对荧光RT-PCR方法进行优化，验证其敏感性、特异性和重复性。经肠道病毒标准株、Cox A16毒株与近期手足口病爆发疫情疑似患者临床样本的检测比较，该方法具有高特异性，只能检出肠道病毒Cox A16型，与其他肠道病毒如柯萨奇A组Cox A4、Cox A16、Cox A21、Cox B5、艾苛病毒E6、E30、EV71、POLIO I型等毒株均无交叉反应，而且比常规RT-PCR法更敏感、快速和简便。肠道病毒Cox A16的RT-PCR检测敏感度在1.0TCID₅₀左右，从病毒核酸提取、RT-PCR反应与电泳，整个过程大约需6～7h左右，而采用本方法从核酸提取至完成检测，仅需3h左右，能同时完成多个疑似患者临床样本的高通量检测，敏感度达0.1TCID₅₀，比普通PCR的灵敏度高10倍左右，可直接从手足口病患者的脑脊液、粪便、疱疹液等临床样本中检测肠道病毒Cox A16核酸。用建立的新方法，对近期浙江省疑似手足口病爆发疫情疑似患者80份临床样本进行实验室早期快速诊断，获得了令人满意的结果，为该病及时采取控制措施发挥了很好的作用。

本发明的有益效果主要体现在：本发明方法对肠道病毒Cox A16的检测有高度的特异性，与其他肠道病毒EV71、Cox A4、Cox A21、E6、E30、CoxB5、POLIO等病毒无交叉反应；本发明方法检测的灵敏度达0.1TCID₅₀，可直接从疑似手足口病患者的脑脊液、疱疹液和粪便等标本中检测肠道病毒Cox A16核酸，从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右；本发明方法是一种快速检测肠道病毒Cox A16特异、敏感的方法，非常适用于手足口病等由肠道病毒Cox A16感染引起突发疫情的实验室早期诊断。

(四)附图说明

图1为荧光RT-PCR法检测肠道病毒Cox A16的灵敏度；A～E分别代表不同的病毒浓度，从A至E依次为1000、100、10、1、0.1TCID₅₀；

图2为荧光RT-PCR法检测手足口病疑似患者临床样本中肠道病毒CoxA16核酸；A：肠道Cox A16阳性对照，B至I：手足口病疑似患者临床样本的检测。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

1材料与方法

1.1病毒株与临床标本：

肠道病毒EV71、柯萨奇A组(Cox)Cox A4、Cox A16、Cox A21、柯萨奇B5、E6、E30、POLIO 1型等病毒株来源于中国医学科学院、北京生物制品研究所和浙江省疾病预防控制中心分离株。临床样本来源于近期浙江省手足口病爆发疫情疑似患者的脑脊液、疱疹液、粪便等，样本采集后带冰运送到实验室。

1.2引物与探针

从GenBank上下载不同年份和地区的肠道病毒Cox A16基因序列，用生物学软件进行同源性比较，在VP1区设计特异性引物和TaqMan探针，序列为：

CA16YGF：5’-GGGAATTTCTTTAGCCGTGC-3’

CA16YGR：5’-CCC ATC AA RTCAATG TCC C-3’

COXA16PB：5’-ACAATG CCC ACC ACG GGTACA CA-3’

引物和探针委托上海基康生物工程有限公司合成。

1.3病毒定量标准与病毒RNA的提取：

以肠道病毒CoxA16为标准毒株，用人横纹肌瘤细胞(RD)进行病毒效价滴定(112.2TCID₅₀/ml)后作为参考株，将其稀释至1000、100、10、1、0.1、0.01TCID₅₀每个反应管。病毒RNA的提取采用德国QIAGEN公司的Reansy Mini Kit，按试剂盒说明书提取，得到病毒RNA(10³ng/μL)，备用。

1.4荧光RT-PCR反应体系和条件的优化：

试剂盒：选用Takara公司的one step Prime Script RT-PCR(Perfect Realtime)，Code：DRR064A。按说明书操作，反应体系为25μl，其中2×onestep RT-PCR缓冲液12.5ul，Ex Taq HS(5U/μl)0.5ul，RT Enzyme Mix II(5U/μl)0.5ul，上游与下游引物(20μmol/L)各0.8μl，探针(20μmol/L)0.4μl，模板RNA8μl，DEPC水补足25μl。反应条件为42℃ 30min，95℃ 2min进行逆转录，然后95℃ 5s，51℃ 35s，在51℃进行单点荧光检测，共进行40个循环。

结果判断：选择荧光检测模式FAM，荧光基线调整取3～15个循环的荧光信号平均值，阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点，样本呈典型的扩增曲线，判断为阳性。无典型的扩增曲线，判断为阴性。体系的优化试验，在以相同浓度阳性核酸为模板的反应体系中，引物浓度从0.10～1.00μM，探针浓度从0.10～0.50μM，采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度，根据最低Ct值和最高荧光强度增加值(ΔRn)选择最佳引物和探针浓度。

1.5常规RT-PCR反应：

肠道病毒Cox A16RT-PCR引物序列，

Cox A16-S(上游)：5`-ATT GGT GCT CCC ACT ACA GC-3`

Cox A16-A(下游)；5`-TCA GTG TTG GCA GCT GTA GG-3`扩增片断208bp。采用TAKARA公司one step RT-kit(code：DRR024A)，按试剂盒说明书操作，反应体系为25μl，其中10×RT-PCR缓冲液2.5ul，MgCl2 2.5ul(25mM)，dNTP混合物(各10mM)2.5μl，RNase抑制剂(40U/μl)0.5μl，AMV酶(5U/μl)0.5ul，Taq酶(5U/μl)0.5ul，上游与下游引物(20μM)各0.5μl，模板RNA 8μl，DEPC水4.5μl。反应条件为50℃ 30min，95℃ 3min进行逆转录，然后95℃ 20s，50℃ 25s，72℃ 30s进行扩增，40个循环后转入72℃ 10min，取8μl产物电泳后判断有无特异性条带(208bp)。

1.6荧光RT-PCR特异性、敏感性和重复性试验

选择肠道病毒Cox A16型毒株，柯萨奇A组Cox A4、Cox A21、柯萨奇B5、艾柯病毒E6、E30、EV71、POLIO 1型和近期手足口爆发疫情疑似患者的脑脊液、疱疹液和粪便等临床样本，对上述病毒株和样本分别提取核酸，用肠道病毒Cox A16荧光RT-PCR方法进行检测，验证方法的特异性；对已标定TCID₅₀的肠道病毒Cox A16型(112.2TCID₅₀/ml)稀释后分别提取RNA，平行进行荧光RT-PCR与RT-PCR反应，比较其灵敏度。此外，对每一个浓度的病毒稀释液作5次重复检测，得到的Ct值计算标准差，验证方法的重复性。

2结果

2.1荧光RT-PCR反应体系及条件

采用TAKARA公司的一步法荧光RT-PCR试剂盒，总反应体系为25μl。矩阵法优选后引物最佳浓度均为0.64μM，探针最佳浓度为0.32μM，模板RNA 8μl，最后用DEPC水补至25μl。用MJ Research Option 2荧光检测系统进行检测，反应参数为：42℃ 30min逆转录，95℃变性2min，以95℃ 5s，51℃ 35s扩增40个循环，在51℃进行单点荧光检测，可获得最低Ct值和最高荧光强度。

2.2特异性试验

本发明建立的荧光RT-PCR方法对肠道病毒Cox A16具有较好的特异性，对其他肠道病毒如Cox A4、Cox A21、E6、E30、COXB5、POLIO1型等无交叉反应。

2.3敏感性试验

对肠道病毒Cox A16毒株，采用RD细胞进行病毒效价测定(112.2TCID₅₀/ml)，然后稀释成1000、100、10、1、0.1、0.01TCID₅₀，提取病毒RNA，分别用荧光RT-PCR与常规RT-PCR方法进行检测，结果荧光RT-PCR方法检测敏感性达到0.1TCID₅₀，RT-PCR方法检测敏感性达1.0TCID₅₀，荧光RT-PCR方法比常规RT-PCR方法的灵敏度高10倍左右(见图1)。

2.4重复性试验

肠道病毒Cox A16毒株按10倍梯度稀释成3个不同的浓度，对每一个浓度的样本作5个重复检测，结果不同核酸浓度各自的检测Ct值标准差在0.11～0.31之间，具有较好的重复性(表1)。

表1荧光RT-PCR法检测肠道病毒Cox A16的重复性试验

2.5临床样本的检测

从近期浙江省各地报告的手足口爆发疫情疑似患者的脑脊液、粪便和疱疹液共80份临床样本中直接提取病毒RNA，用本发明肠道病毒CoxA16型荧光RT-PCR方法和普通RT-PCR方法(见操作1.5)同时检测，结果本发明肠道病毒Cox A16荧光RT-PCR方法检测出肠道Cox A16核酸阳性8份，普通RT-PCR法检测出Cox A16核酸阳性6份，本发明肠道病毒Cox A16荧光RT-PCR方法比普通RT-PCR法检测Cox A16的阳性率高。本发明肠道病毒Cox A16荧光RT-PCR方法用于临床样本检测的验证在4个平行实验室进行，均获得了满意的结果，图2显示的是临床样本的检测图谱。

序列表_ST25

SEQUENCE LISTING

<110>浙江省疾病预防控制中心

<120>肠道病毒Cox A16核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒及检测方法

<130>

<160>3

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>1

gggaatttct ttagccgtgc                        20

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>2

cccatcaart caatgtccc                         19

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>3

acaatgccca ccacgggtac aca                    23

Claims (4)

1.肠道病毒Cox A16核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于所述荧光定量RT-PCR检测试剂盒的上下游引物和特异性探针序列如下：

CA16YGF：5’-GGGAATTTCTTTAGCCGTGC-3’

CA16YGR：5’-CCC ATC AA R TCA ATG TCC C-3’

COXA16PB：5’-ACA ATG CCC ACC ACG GGT ACA CA-3’

引物CA16YGR序列中，R为A或G。

2.一种肠道病毒Cox A16核酸荧光定量RT-CR检测方法，所述方法包括：

(1)根据肠道病毒Cox A16基因序列，设计上下游引物和特异性探针序列如下：

CA16YGF：5’-GGGAATTTCTTTAGCCGTGC-3’

CA16YGR：5’-CCC ATC AA R TCA ATG TCC C-3’

COXA16PB：5’-ACA ATG CCC ACC ACG GGT ACA CA-3’

引物CA16YGR序列中，R为A或G。

(2)提取待测样品RNA，以待测样品RNA为模板、在包括步骤(1)所述引物和探针序列的RT-PCR反应体系中进行RT-PCR反应；

(3)对RT-PCR反应产物进行荧光检测，根据荧光检测的最低Ct值和最高荧光强度判断结果，若荧光RT-PCR反应呈阳性，则待测样品含有肠道病毒Cox A16核酸。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述RT-PCR反应体系终浓度组成如下：

RT-PCR缓冲液                 终浓度为1×

Ex Taq HS                       0.1U/μL

RT Enzyme Mix II                0.1U/μL

上游与下游引物                  各1.60μM

探针                            0.80μM

模板RNA                         10～105ng/L

DEPC水补足至25μL。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述RT-PCR反应条件为：42℃30min，95℃2min进行逆转录，然后95℃5s，51℃35s，在51℃进行单点荧光检测，共进行40个循环。

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