CN106636459A - 一种美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光rt‑rpa特异性检测 - Google Patents

一种美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光rt‑rpa特异性检测 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光RT‑RPA特异性检测的引物和exo探针组合，其正向引物序列如SEQ ID No.1所示；反向引物序列如SEQ ID No.2所示；exo探针序列如SEQ ID No.3所示。本发明还包括利用上述引物及exo探针组合进行荧光RT‑RPA特异性检测的方法，以及包含该引物和exo探针的试剂盒。本发明能够用于现场检测，操作简单、快速、特异性强、灵敏性高。

Description

一种美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光RT-RPA特异性 检测
技术领域
本发明涉及分子生物学和病毒检测鉴定技术领域，具体涉及一种美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光RT-RPA特异性检测方法、其相应的引物和探针组合以及包含该引物和探针组合的试剂盒。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)主要引起怀孕母猪的繁殖障碍和所有日龄猪的呼吸道症状，被认为是影响世界养殖业最重要的传染病之一。引起该病的病原是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，是一种具有囊膜的单股正链RNA病毒，属于尼多病毒目，动脉炎病毒科，动脉炎病毒属。PRRSV于1987年首次分离于北美，然后于1990年分离于西欧。目前，PRRSV遍布全球，成为造成经济损失最严重的猪病之一。根据PRRSV基因和抗原差异，目前将之分为两个基因型，即欧洲型(基因1型)和美洲型(基因2型)。
我国自1986年首次分离到PRRSV以来，目前该病毒已经遍及全国，并且部分地区猪群的感染率达到90％。2006年，以Nsp2基因出现30个不连续氨基酸缺失为特征的高致病性PRRSV在我国的爆发，对我国养猪业造成了巨大的经济损失。2006年6月到9月，高致病性PRRSV造成约2,120,000头猪感染，400,000头猪死亡，而2007年1月到7月，造成约143,221头猪的感染，39,455头猪死亡。截至目前，我国猪群主要流行美洲型PRRSV，并且经典毒株(C-PRRSV)和高致病性毒株(HP-PRRSV)同时存在。随着我国大型养猪场和集约化养殖模式的发展，对猪病的现场、快速诊断将极大有益于猪场疫病控制，尤其是大型养猪场多位于边远地区的情况下。
上述事实清晰表明，对PRRSV的快速、现场诊断极大有益于我国猪场中PRRS的防控。传统的PRRSV检测技术，主要是病毒分离、免疫组化和免疫荧光技术，费时费力，对检测人员技术要求较高，灵敏性低，无法满足目前快速检测的需要。
目前对PRRSV的实验室分子诊断技术主要包括RT-PCR、同时检测美洲型和欧洲型PRRSV、特异性检测HP-PRRSV和同时检测C-PRRSV和HP-PRRSV的荧光RT-PCR，以及特异性针对美洲型PRRSV的RT-LAMP方法。但是，PRRSV快速进化和基因变异使得建立长期有效的RT-PCR方法异常复杂，设计保持足够敏感性的LAMP引物异常困难，从而导致假阴性检测结果。同时，RT-PCR和RT-LAMP试剂需要冷链运输、价格高昂的设备和经验丰富的技术人员，从而难以应用于现场检测。因此，需要建立一种能够用于PRRSV现场检测的操作简单、快速、准确和成本较低的检测方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明建立了一种能够用于现场检测，操作简单、快速、特异性强、灵敏性高的PRRSV荧光RT-RPA检测方法、其相应的引物和探针组合以及包含该引物和探针组合的试剂盒。
本发明采用如下技术方案：
一种用于美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光RT-RPA特异性检测的引物和exo探针组合，其关键技术在于，其正向引物序列如SEQ ID No.1所示；反向引物序列如SEQ ID No.2所示；exo探针序列如SEQ ID No.3所示。
一种美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光RT-RPA特异性检测的方法，其关键技术在于，提取待测样品的RNA为模板，利用上述的引物及exo探针组合进行扩增及实时荧光检测。
检测方法中，向50μL实时RT-RPA反应体系中加入浓度均为10μM的正向引物和反向引物各2.1μL；浓度为10μM的exo探针0.6μL；RNA模板1μL；扩增程序为：使用RPA扩增仪于42℃下反应20分钟，并在扩增过程中实时收集检测荧光信号。
一种用于美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光RT-RPA特异性检测的试剂盒，其关键技术在于，该试剂盒包含上述的引物和exo探针组合。
本发明的有益效果在于：本发明根据美洲型PRRSV ORF7保守序列设计引物和exo探针，基于能够实现等温扩增且收集荧光信号的设备，建立了能够用于现场检测，操作简单、快速、特异性强、灵敏性高的PRRSV荧光RT-RPA检测方法。
附图说明
图1 PRRSV荧光RT-RPA方法的特异性检测I。
图1中，1：PRRSV(JXA1-R)；2：FMDV；3：CSFV；4：PRV；5：PPV；6：PCV-2；7：猪基因组DNA。
图2 PRRSV荧光RT-RPA方法的特异性检测II。
图2中，1：JXA1-R；2：VR-2332；3：HuN4-F112；4：TJM-F92；5：R98；6：Ch-1R；7：猪基因组DNA。
图3 PRRSV荧光RT-RPA方法的敏感性检测结果。
图4 PRRSV real-time RT-PCR方法的敏感性检测结果。
图3和图4中，1：106copies RNA；2：105copies RNA；3：104copies RNA；4：103copiesRNA；5：102copies RNA；6：101copies RNA；7：100copies RNA。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。本发明保护范围不限于实施例，本领域技术人员在权利要求限定的范围内做出任何改动也属于本发明保护的范围。
下述各实施例中，未注明具体条件的实验方法，按照通常的常规条件或一起和试剂盒制造厂商所建议的条件。
下述各实施例中，需要的材料和设备如下。
病毒株与临床样品
6株PRRSV毒株，均来自商业化弱毒疫苗，其中3株C-PRRSV毒株，VR-2332、CH-1R和R98，分别来自德国勃林格殷格翰公司、维科生物技术开发公司和瑞普(保定)生物药业有限公司；3株HP-PRRSV毒株，JXA1-R、HuN4-F112和TJM-F92，分别来自普莱柯生物工程股份有限公司、维科生物技术开发公司和青岛易邦生物工程有限公司。
猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV,AV1412)，来自瑞普(保定)生物药业有限公司商业化弱毒疫苗；O型口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease virus，FMDV，TypeO)，来自兰州兽医研究所商业化液相阻断ELISA试剂盒；伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)和猪圆环病毒2型(Porcinecircovirus-2，PCV-2)，均为本实验室保存。
60份临床样品，包括淋巴结、肺脏、脾脏和肝脏，均来自河北省不同养猪场。取10mg样品在1mL无菌PBS中研磨处理，4℃，3000g离心10min收集上清用于病毒RNA/DNA提取。
主要试剂和设备
TwistAmpTM RT exo kit，购自英国TwistDx公司；病毒DNA/RNA提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司；One Step PrimeScript RT-PCR Kit、NdeI酶、PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit均购自宝生物工程(大连)有限公司；pGEM-T-EASY载体、Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System-T7均购自美国Promega公司。
等温扩增荧光检测仪(OptigeneⅢ，型号Genie III)，英国Optigene公司；实时荧光定量PCR仪(ABI 7500)，美国ABI公司；EPS梯度PCR仪，为美国Eppendorf公司产品；核酸蛋白测定仪(Nanodrop ND-2000)，为美国Thermo公司产品。
实施例1引物及exo探针的设计
参考GenBank中美洲型PRRSV ORF7序列(EF112445)，选择特异性保守区域，设计RPA引物和exo探针，目的片段大小为178bp。引物和exo探针的序列见SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3，如表1。
表1引物及exo探针序列
实施例2荧光实时RT-RPA检测PRRSV
(一)病毒DNA/RNA提取
按照病毒DNA/RNA提取试剂盒说明，提取病毒株和临床样品上清液中核酸，并使用核酸蛋白测定仪(Nanodrop ND-2000)测定提取病毒核酸的浓度。所有提取的病毒RNA或DNA保存于-80℃，备用。
(二)实时RT-RPA反应体系及条件
使用TwistAmpTM RT exo kit配制50μL实时RT-RPA反应体系。扩增反应的50μL反应体系中加入浓度10μM的正向引物序列(RPA-Forward)2.1μL(终浓度420nM)，浓度10μM的反向引物序列(RPA-Reverse)2.1μL(终浓度420nM)，浓度10μM的exo探针(RPA-Probe)0.6μL(终浓度120nM)，Buffer 29.5μL，蒸馏水12.2μL，混匀后转入含有聚合酶、重组酶、单链结合蛋白和外切核酸酶III等冻干制剂的0.2mL反应管中，将1μLRNA模板、2.5μL浓度为280mM的MgAc(终浓度14mM)加入该反应管中。将反应管盖紧后瞬时离心并涡旋后，放入Genie III中，42℃反应20min。在扩增过程实时收集检测荧光信号，目的基因扩增后荧光信号会明显增加。
实施例3特异性
以C-PRRSV，HP-PRRSV，CSFV，FMDV，PRV，PPV和PCV-2的病毒RNA或DNA，通过实施例2的方法进行实时荧光RT-RPA检测，确定是否出现特异性扩增曲线。结果如图1和图2所示。
结果表明C-PRRSV毒株(VR-2332，R98and CH-1R)和HP-PRRSV毒株(JXA1-R，HuN4-F112and TJM-F92)均出现特异性扩增曲线(见图2)，而其他病毒则没有出现扩增(见图1)，说明该方法具有良好的特异性，能过实现对不同C-PRRSV毒株和HP-PRRSV的特异性检测，而不能扩增猪场常见的其他病原。这对于我国猪场中C-PRRSV和HP-PRRSV同时存在的现实具有重要意义。
需要说明的是，在本发明建立的针对美洲型PRRSV的荧光RT-RPA方法中，在反应即将结束时出现了荧光的急剧升高(见图1和图2)。其原因在于，在TwistAmpTM RT exo反应中，聚合酶和外切核酸酶III处于竞争关系，当反应即将结束，能量耗尽时，外切核酸酶III占据主导地位，进而导致exo探针的大量切割而出现荧光的突然升高。
实施例4敏感性
(I)PRRSV体外转录RNA的制备
以JXA1-R病毒RNA作为模板，以表2中N-forward和N-Reverse为引物进行RT-PCR，获得433bpRT-PCR产物，涵盖了PRRSV 3’端ORF7和3’非编码区的部分区域。使用DNA纯化回收试剂盒回收纯化433bpRT-PCR产物，将之克隆到pGEM-T Easy载体中，并转化入感受态细胞DH5α，获得重组质粒pGEM-T-PRRSV-N。
表2N-forward和N-Reverse引物序列
使用Nde I将pGEM-T-PRRSV-N线性化，使用Wizard SV Gel and PCR纯化试剂盒进行纯化回收后，使用RiboMAX Large Scale RNA Production System-T7进行体外转录。室温下采用100μL体系：T7Transcription 5X Buffer 20μL，rNTPs(25mM ATP，CTP，GTP，UTP)30μL，linear DNA template(5–10？？g total)plus Nuclease-Free Water 40μL，Enzyme Mix(T7)10μL，轻轻充分混匀，37℃反应2-4h。使用RNase-Free DNase I处理RNA，20-25℃孵育10min，以除去残留的DNA，纯化RNA。
所有体外转录PRRSV RNA经琼脂糖凝胶电泳确定大小均为433bp左右，并使用Nanodrop ND-2000测定浓度，通过公式计算拷贝数：拷贝数(copies/μL)＝[RNA浓度(g/μL)/(RNA碱基数×340)]×6.02×1023，并10倍系列稀释至1.0copies/μL。
(II)敏感性分析
将体外转录病毒RNA进行10倍倍比稀释，使其浓度在106-100拷贝/μL之间，106-100拷贝/μL系列浓度的体外转录PRRSV RNA以1μL作为模板进行实时RT-RPA反应，确定该方法的最低检测浓度。与OIE参考方法进行比较。
OIE参考方法，即在ABI7500上进行美洲型PRRSV的荧光RT-PCR检测。荧光RT-PCR检测方法所用引物及序列如表3所示。在反应体系配制中，使用One Step PrimeScript RT-PCR Kit代替原方法中使用的反转录酶、DNA聚合酶、dNTP混合液等试剂，其他试剂浓度不变。反应条件为：42℃5min；95℃10s；95℃5s，60℃34s，40个循环。
结果表明，荧光RT-RPA最低可以检测到102拷贝病毒RNA(见图3)，同OIE推荐荧光RT-PCR方法一致(见图4)。荧光RT-RPA对106-102拷贝病毒RNA的检测时间是5-15min，而荧光RT-PCR的检测Ct值是21-37，所需时间则为40-60min。
表3荧光RT-PCR所用引物及序列
实施例5对临床样品的检测
采用OIE推荐荧光RT-PCR方法及本发明实施例2中的荧光RT-RPA方法进行测试。在60份临床实际样品中，荧光RT-RPA对PRRSV的阳性检出率为86.6％(52/60)，而荧光RT-PCR的阳性检出率则为83.3％(50/60)(结果见表4)。对于阳性样品的检测时间，荧光RT-RPA为3-16min，而荧光RT-PCR则为1h左右。这说明，本发明建立的荧光RT-RPA的检测效果要优于荧光RT-PCR，就检测时间而言，荧光RT-RPA为3-16min，远远小于荧光RT-PCR所需要的30-60min。
表4荧光RT-RPA和荧光RT-PCR对临床样品的检测结果比较
综合上述各实施例，本发明建立了一种特异性快速检测美洲型PRRSV的荧光RT-RPA方法。聚合酶重组酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)是一种基于等温扩增的分子检测技术。RPA已经被广泛应用于疫病病原的检测。相对于普通PCR和荧光PCR，RPA具有以下优势：1、RPA试剂以冻干粉形式存在，在运输和保存过程中不需要冷链，可以在25℃下存放12周，45℃下存放3周；2、RPA能够在5-20min内获得检测结果，远远快于PCR方法(一般需要60min以上)；3、RPA所用的引物和探针可以耐受5-9个碱基的错配，而对检测结果没有影响，从而可以耐受检测对象的一定程度上的突变，而荧光PCR所用的探针的突变能够造成检测的失败；4、RPA对常见的PCR抑制剂具有一定的耐受性，并且可以不同的生物样品(如血清、粪便、尿液、血浆、动物组织、鼻拭子等)，从而降低了对样品的制备需求；5、RPA具有多种结果呈现形式，可以通过琼脂糖凝胶电泳、实时荧光检测或试纸条形式进行结果判定；6、RPA属于等温扩增，无需复杂的升降温控制。
目前，核酸等温扩增技术由于其操作简单、快速和成本低的特点，成为PCR检测技术的代替者。相比较于其他等温扩增技术，RPA无需在反应开始时升温解链模板DNA，一直处于等温过程中实现对靶基因的指数扩增。由于RPA的简便性(简单的操作)、多样性(用于核酸检测的不同商业化试剂盒)和快速(5-20min)，RPA可能是最适于传染病田间和现场检测的方法。目前针对PRRSV的检测，也建立了多个RT-LAMP方法。不同于RT-RPA，在RT-LAMP方法建立过程中需要设计特异性强、性能良好的4-6引物，这对于易于变异的PRRSV来说，是非常困难的。同时LAMP对引物碱基错配的耐受性尚不明确。另外，上述建立的RT-LAMP方法反应时间均为40-50min，远远长于RT-RPA反应时间。
RPA属于等温扩增技术，除了可以应用于环境设备良好的实验室外，还可以被广泛应用于不发达地区实验室，甚至是现场检测。本研究中所使用检测设备的小巧、轻便、便携，结合荧光RT-RPA操作的简便性、试剂无需冷链保存的特点，所建立的荧光RT-RPA方法具有田间应用的巨大优势和潜力，可以应用于现场诊断和田间监测，特别是猪场所在的偏远地区。
总之，本发明建立了一种基于exo探针的能够有效检测C-PRRSV和HP-PRRSV的荧光RT-RPA方法。综合反应敏感性和检测时间而言，该方法要优于OIE推荐的荧光RT-PCR方法。本发明建立针对PRRSV荧光RT-RPA方法的便携性好(Genie III,规格：25cm×16.5cm×8.5cm，重量：1.75kg)，能够使之在疫病发生现场、口岸和检疫一线使用，对于我国PRRSV的防控具有重要意义。
根据上述的实施例对本发明作了详细描述。需说明的是，以上的实施例仅为了举例说明发明而已。在不偏离本发明的精神和实质的前提下，本领域技术人员可以设计出本发明的多种替换方案和改进方案，其均应被理解为在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120> 一种美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光RT-RPA特异性检测
<130> /
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
CGGAGAAGCC CCATTTCCCT CTAGCGACTG 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
TGCGTCGGCA AACTAAACTC CACAGTGTAA 30
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
CAATTGTGTC TGTCGTCGAT CCAGACTGCC TTCATCAGGG CGCTGGAACC 50

Claims (4)

1.一种用于美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光RT-RPA特异性检测的引物和exo探针组合，其特征在于，其正向引物序列如SEQ ID No.1所示；反向引物序列如SEQ ID No.2所示；exo探针序列如SEQ ID No.3所示。
2.一种美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光RT-RPA特异性检测的方法，其特征在于，提取待测样品的RNA为模板，利用权利要求1所述的引物及exo探针组合进行扩增及实时荧光检测。
3.根据权利要求2所述的特异性检测的方法，其特征在于，向50μL实时RT-RPA反应体系中加入浓度均为10μM的正向引物和反向引物各2.1μL；浓度为10μM的exo探针0.6μL；RNA模板1μL；扩增程序为：使用RPA扩增仪于42℃下反应20分钟，并在扩增过程中实时收集检测荧光信号。
4.一种用于美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光RT-RPA特异性检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含权利要求1所述的引物和exo探针组合。
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