CN102140525A

CN102140525A - 猪繁殖与呼吸综合征病毒rt-pcr检测方法和试剂盒

Info

Publication number: CN102140525A
Application number: CN2010106020833A
Authority: CN
Inventors: 田克恭; 宁昆; 韩雪; 倪建强; 曲萍; 翟新验; 孙明; 陈西钊
Original assignee: CHINA ANIMAL BLIGHT PREVENTION AND CONTROL CENTER
Current assignee: CHINA ANIMAL BLIGHT PREVENTION AND CONTROL CENTER
Priority date: 2010-12-23
Filing date: 2010-12-23
Publication date: 2011-08-03
Anticipated expiration: 2030-12-23
Also published as: CN102140525B

Abstract

本发明公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测的方法，以及该方法在检测猪繁殖与呼吸综合征病毒中的应用。本发明的方法克服了其他同类检测技术中存在的不足，具有快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好的特点，适于猪繁殖与呼吸综合征美洲型毒株和欧洲型毒株的快速检测，为猪繁殖与呼吸综合征病毒疫情的监测、防控提供强有力的技术支持，有很好的应用前景。

Description

猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术，尤其涉及动物疫病的预防控制。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的以母猪发热、流产，断奶前、后的仔猪死亡率升高，不同年龄猪呼吸障碍等为临床特征的疾病。1991年，荷兰学者Terpstra等人在感染猪体内分离到欧洲型PRRSV，命名为Lelystad病毒(Lv)；同年，美国学者Benfield等人分离到美洲型PRRSV，命名为VR-2332。目前猪繁殖与呼吸综合征已经在世界范围内流行，每年造成巨大的经济损失。我国在1995年首次出现PRRS，随后迅速蔓延。2006年我国暴发了由猪繁殖与呼吸综合征高致病性变异毒株(highly pathogenicPRRSV，HP-PRRSV)引起的以体温高、发病率高、死亡率高为主要临床特征的高致病性猪繁殖与呼吸综合征(highly pathogenic PRRS，HP-PRRS)，给我国养猪业造成了极其严重的打击。

传统的PRRSV检测方法主要包括病毒的分离与鉴定、免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)、间接免疫荧光试验(IFA)、间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)和反转录-聚合酶链反应试验(RT-PCR)等，目前较为广泛使用的用来检测PRRSV的方法为RT-PCR，但多数方法在敏感性、特异性等方面存在不足，因此，建立一种特异性强、敏感性高、可靠性好的猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测方法意义重大。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术不足，提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-PCR检测方法。此方法快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好，为猪繁殖与呼吸综合征病毒疫情的监测、防控提供强有力的技术支持。

本申请涉及针对PRRSV美洲型、欧洲型毒株ORF7和3’UTR的引物对，用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒。引物序列如下：

上游引物：5’-GAATGGCCAGCCAGTCAATC-3’

下游引物：5’-GTCGCCCTAATTGAATAGGTGAC-3’

本申请提供一种能够特异、敏感、省时、省力、低成本地检测出PRRSV的RT-PCR试剂盒以及一种检测PRRSV的方法。

具体的，该试剂盒包括：

(1)RNA提取试剂由裂解液6mL、洗液12mL和洗脱液1mL组成。

(2)RT-PCR反应试剂由RT-PCR反应液200μL、酶混合液15μL和矿物油300μL组成。

(3)电泳检测试剂由50×TAE电泳缓冲液20mL、染色液20μL、上样缓冲液50μL组成。

(4)阴性对照350μL、阳性对照350μL。

以上试剂的基本制备方法为：

1)裂解液按下列配方配制：

异硫氰酸胍 11.82g

氯化钠 1.16g

0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液 2mL

灭菌双蒸水加至100mL

2)洗液按下列配方配制：

磷酸氢二钠 71.6g

磷酸二氢钾 31.2g

氯化钠 9g

灭菌双蒸水加至1000mL

3)洗脱液按下列配方配制：

磷酸氢二钠 71.6g

磷酸二氢钾 31.2g

灭菌双蒸水加至1000mL

4)RT-PCR反应液按下列配方配制：

A)无菌DEPC水 12.5μL

B)2.5mmol/L dNTP 2.5μL(购自Promega公司，dATP、dCTP、dGTP、dTTP(统称为dNTP)浓度均为100mmol/L。将dATP、dCTP、dGTP、dTTP等体积混匀后，再用DEPC水稀释10倍，即为制备的2.5mmol/L dNTP)

C)10pmol/μL引物混合液 1.5μL

D)5×Green Go Taq Reaction Buffer 5μL(购自Promega公司5mL/管)

5)酶混合液按下列配方配制：

Taq DNA聚合酶(100U/管，5U/μL，购自Promega公司) 1μL

RNA酶抑制剂(250μL/管，50U/μL，购自Promega公司) 0.3μL

AMV反转录酶(1000μL/管，10U/μL，购自Promega公司) 0.2μL

6)上样缓冲液：溴酚蓝0.2g，加双蒸水10mL过夜溶解。50g蔗糖加入50mL水溶解后，移入已溶解的溴酚蓝溶液中，摇匀用双蒸馏水定容至100mL。

7)50×TAE电泳缓冲液按下列配方配制：

三羟甲基氨基甲烷(Tris) 242g

冰乙酸 7.1mL

0.5mol/L EDTA溶液(pH8.0) 100mL

灭菌双蒸水加至1000mL

8)染色液按下列配方配制：

溴化乙锭 0.2g

灭菌双蒸水加至20mL

9)矿物油

购自Sigma公司，500mL/瓶

本申请还提供一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，包括：

样品处理

组织样品处理：采集猪的肺、扁桃体、脑等脏器组织，称取待检组织0.05g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理盐水继续研磨，待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中，8000rmp离心2min，取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中。

细胞培养物处理：取细胞培养物100μL，置1.5mL灭菌离心管中。

血清样品处理：取猪血清100μL，置1.5mL灭菌离心管中。

阳性对照处理：取阳性对照100μL，置1.5mL灭菌离心管中。

阴性对照处理：取阴性对照100μL，置1.5mL灭菌离心管中。

病毒RNA提取

取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入裂解液600μL，充分颠倒混匀，室温静置3～5min。将全部液体吸入吸附柱中，吸附柱要套上收集管，13000rmp离心30s，弃去收集管中液体，套上收集管。向吸附柱中加入600μL洗液，13000rmp离心30s，弃去收集管中液体，套上收集管。向吸附柱中加入600μL洗液，13000rmp离心30s，弃去收集管中液体，套上收集管，13000rmp离心2min。将吸附柱移入新的1.5mL离心管中，在膜中央加入洗脱液25μL，室温静置1min，13000rmp离心30s，获得总RNA。

RT-PCR操作程序

每份总体积20μL。取16.8μL RT-PCR反应液(用前混匀)、1.2μL酶混合液，2μL样品RNA。例如：n份样品(n＜10)，配制n+1份16.8×(n+1)RT-PCR反应液，再加入1.2×(n+1)酶混合液，混匀，取18μL分装成n份，分别加入2μL样品RNA。作好标记，加入矿物油20μL覆盖(有热盖的PCR扩增仪不用加矿物油)，在PCR扩增仪上进行以下循环：42℃45min，95℃3min；扩增条件为94℃30s，55℃30s，72℃30s；35个循环后，72℃延伸10min。

电泳

称3g琼脂糖放于500mL锥形瓶中，加入50倍稀释的TAE电泳缓冲液200mL(取4mL 50倍TAE电泳缓冲液，用双蒸水稀释至200mL)，于微波炉中熔解，再加入10μL染色液混匀。在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后将PCR扩增产物15μL混合3μL上样缓冲液，点样与琼脂糖凝胶孔中，以(110～120)V电压于50倍稀释的TAE电泳缓冲液中电泳，紫外灯下观察结果。

结果判定

在阳性对照出现436bp或401bp扩增带、阴性对照无条带带出现(引物带除外)时，实验结果成立。被检样品出现436bp扩增条带时为美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒，出现401bp扩增条带时为欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒，否则为阴性。

附图说明

图1：PRRSV美洲株扩增序列

图2：PRRSV欧洲株扩增序列

图3：RT-PCR检测PRRSV欧洲株和美洲株电泳结果，注1.NM191株(PRRSV欧洲株)2.VR2332株(PRRSV美洲株)3.Trans2K DNA Marker

图4：RT-PCR检测部分PRRSV样品电泳结果，注1.NM191株(PRRSV欧洲株)2.DX F5(PRRSV欧洲株)3.VR2332株(PRRSV美洲株)4.HB2株(PRRSV美洲株)5.09当阳毒株(PRRSV美洲株)6.09阳谷毒株(PRRSV美洲株)7.06HBB2株(PRRSV美洲株)8.JXA1 F90株(PRRSV美洲株)9.09商丘F5(PRRSV美洲株)10.KT2010009(PRRSV美洲株)11.KY20090914(PRRSV美洲株)12.PRRSV CH-1R疫苗(PRRSV美洲株)13.阴性对照14.阳性对照(PRRSV美洲株)15.Trans2K DNAMarker

具体实施方式：

实施例1

一种快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，按下表组装：

1.病毒株：

病毒株背景：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome Virus，PRRSV)为PRRSV高致病性变异株：由中国动物疫病预防控制中心分离鉴定的NVDC-JXA1毒株，保藏编号为CGMCC No.1964，涉及的专利号为ZL200710086549.7。

阴性对照样品的制备，取灭菌的DEPC水，置-20℃冰箱保存。

阳性对照样品的制备，将Marc-145细胞培养的NVDC-JXA1毒株，60℃灭活30min，用合格的本试剂盒检测，出现特异的扩增带，为阳性。其余的培养毒放于-70℃保存备用。

2试剂盒中主要成分的制备：

2.1裂解液的制备

异硫氰酸胍 11.82g

氯化钠浓度 1.16g

0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液 2mL

灭菌双蒸水加至100mL

2.2洗液的制备

磷酸氢二钠 71.6g

磷酸二氢钾 31.2g

氯化钠 9g

灭菌双蒸水加至1000mL

2.3洗脱液的制备

磷酸氢二钠 71.6g

磷酸二氢钾 31.2g

灭菌双蒸水加至1000mL

2.4酶混合液的制备

按下列配方配制酶混合液

Taq DNA聚合酶(100U/管，5U/μL，购自Promega公司) 1μL

RNA酶抑制剂(250μL/管，50U/μL，购自Promega公司) 0.3μL

AMV反转录酶(1000μL/管，10U/μL，购自Promega公司) 0.2μL

2.5RT-PCR反应液的制备

按下列配方配制RT反应液：

无菌DEPC水 12.5μL

2.5mmol/L dNTP 2.5μL

10pmol/μL引物混合液 1.5μL

5×Green Go Taq Reaction Buffer 5μL

混匀后，用0.22μm滤膜过滤。-20℃保存，检验合格后分装，用于成品试剂盒。

2.650×TAE电泳缓冲液的制备

0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液(pH8.0)配制

EDTA 18.61g

灭菌双蒸水 80mL

氢氧化钠调pH至8.0

灭菌双蒸水加至100mL

50×T AE电泳缓冲液配制

三羟甲基氨基甲烷(Tris) 242g

冰乙酸 57.1mL

0.5mol/L EDTA溶液(pH8.0) 100mL

灭菌双蒸水加至1000mL

使用时灭菌双蒸水稀释50倍。

2.7染色液的制备

溴化乙锭 0.2g

灭菌双蒸水加至20mL

2.8上样缓冲液的制备

溴酚蓝0.2g，加双蒸水10mL过夜溶解。50g蔗糖加入50mL水溶解后，移入已溶解的溴酚蓝溶液中，摇匀用双蒸馏水定容至100mL。

2.9矿物油的制备

购自Sigma公司，500mL/瓶。

实施例2

一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-PCR方法，包括：

1.样品来源

中国动物疫病预防控制中心兽医诊断室(农业部兽医诊断中心)提供如下组织、血清和PRRSV细胞培养物：2006-2010年不同时期高致病性猪繁殖与呼吸综合征野毒细胞培养物6份；美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株细胞培养物3份、欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞培养物2份，各种PRRSV疫苗6份；临床样品7份，包括阳性血清1份，阴性血清4份、阳性组织2份。

2.样品处理

组织样品处理：称取待检组织0.05g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理盐水继续研磨，待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中，8000rmp离心2min，取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中。

血清样品处理：取猪血清100μL，置1.5mL灭菌离心管中。

阳性对照处理：取阳性对照100μL，置1.5mL灭菌离心管中。

阴性对照处理：取阴性对照100μL，置1.5mL灭菌离心管中。

3.病毒RNA提取

4.RT-PCR操作程序

5.电泳

6.结果判定

7.结果

所有样品的判断结果均与样品背景相符合。PRRSV阳性样品的RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳可见特异性扩增片段的条带；PRRSV阴性样品的RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后除引物带外，无其他条带。

实施例3

敏感度试验

1.材料

PRRSV分离株PRRSV/JXA1 F5(TCID₅₀＝5.25)

2.方法

将PRRSV分离株PRRSV/JXA1 F5稀释成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7，用猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测试剂盒检测每个稀释度样品。

3.结果

试剂盒对不同浓度的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV/JXA1 F5(TCID₅₀＝5.25))的检测结果见表2。

表2敏感性试验结果

实施例4

特异性试验

1.材料

其它猪源或异源病毒毒株：马动脉炎病毒(EAV)、猪瘟病毒(CSFV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、PRRSV标准株(VR2332毒株)，由本单位保存。

2.方法

用猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测试剂盒检测4株其它猪源或异源病毒毒株4份，1份PRRSV标准株VR2332毒株，以考查试剂盒检测不同样品的特异性。

3.结果

用猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测试剂盒其它猪源或异源病毒毒株，结果均为阴性，结果见表3。

表3特异性试验结果

序列表

<110>中国动物疫病预防控制中心

<120>猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测方法和试剂盒

<130>1

<160>4

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>上游引物

<400>1

GAATGGCCAGCCAGTCAATC

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>下游引物

<400>1

GTCGCCCTAATTGAATAGGTGAC

<210>3

<211>437

<212>DNA

<213>PRRSV美洲株扩增序列

<400>1

GCAATGGCCAGCCAGTCAATCAGCTGTGCCAGATGCTGGGTAAGATCATCGCCCAACAAAACCAGTCCAGAGG

CAAGGGACCGGGCAAGAAAAATAAGAAGAAAAGCCCGGAGAAGCCCGATTTTCCTCTAGCGACCGAAGATGA

CGTCAGGCATCACTTCACCCGTAGTGAGCGGCAATTGTGTCTGTCGTCGATCCAGACTGCCTTTAACCAGGGCG

CCGGAACTTGTACCCTGTCAGATTCAGGGAGGATAAGTTACACTGTGGAGTTTAGTTTGCCGACGCATCATACT

GTGCGCCTGATCCGCGTCACAGCATCACCCTCAGCATGATGGGCTGGTATTCTTTGGGCACCTCAGTGTTAGAA

TTGGGAGAATGTGTGGTGAATGGCACTGATTGACACTGTGCCTCTAAGTCACCTATTCAATTAGGGCGAC

<210>4

<211>402

<212>DNA

<213>PRRSV欧洲株扩增序列

<400>1

GGAATGGCCAGCCAGTCAATCAACTGTGCCAGTTGCTGGGTGCAATGATAAAGTCCCAGCGCCAGCAACCTAG

GGGAGGACAGGCAAAAAAAAGAAAGCCTGAGAAGCCACATTTTCCCCTAGCTGCTGAAGATGACATTCGGCA

CCACCTCACCCAGACCGAACGTTCCCTCTGCTTGCAATCGATCCAGACGGCTTTTAATCAAGGCGCAGGAACTG

CGTCGCTTTCATCCAGCGGGAAGGTCAGTTTTCAGGTTGAGTTCATGCTGCCGGTTGCTCATACAGTGCGCCTG

ATTCGCGTGACTTCTACATCCGCCAGTCAGGGTGCAAATTAATTTGACAGTCAGGTGAATGGCCGCGATTGACG

TGTGGCCTCTAAGTCACCTATTCAATTAGGGCGAT

Claims

1.一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物对，其特征在于引物序列如下：

上游引物：5’-GAATGGCCAGCCAGTCAATC-3’

下游引物：5’-GTCGCCCTAATTGAATAGGTGAC-3’

2.一种快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，其特征在于包括如权利要求1所述的引物对。

3.如权利要求2所述的快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，其特征在于上述试剂盒还包括：RNA提取试剂、RT-PCR反应试剂、电泳检测试剂、阴性对照、阳性对照。

4.如权利要求2-3之一所述的试剂盒，其特征在于：

(1)RNA提取试剂由裂解液6mL、洗液12mL和洗脱液1mL组成

(2)RT-PCR反应试剂由RT-PCR反应液200μL、酶混合液15μL和矿物油300μL组成

(3)电泳检测试剂由50×TAE电泳缓冲液20mL、染色液20μL、上样缓冲液50μL组成

(4)阴性对照350μL、阳性对照350μL。

5.权利要求2-4任一项所述的试剂盒在检测猪繁殖与呼吸综合征病毒中的用途。

6.利用权利要求2-4任一项的试剂盒检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，包括：

(1)样品处理

组织样品处理：采集猪的肺、扁桃体、脑等脏器组织，称取待检组织0.5g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理盐水继续研磨，待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中，8000rmp离心2min，取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中。

血清样品处理：取猪血清100μL，置1.5mL灭菌离心管中。

阳性对照处理：取阳性对照100μL，置1.5mL灭菌离心管中。

阴性对照处理：取阴性对照100μL，置1.5mL灭菌离心管中。

(2)病毒RNA提取

(3)RT-PCR操作程序

(4)电泳

(5)结果判定

7.权利要求6所述的方法在检测猪繁殖与呼吸综合征病毒中的用途。