CN105648119B - 检测猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒的引物、试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒的引物、试剂盒及方法。所述引物如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述方法为以待检测样品的RNA为模板，进行RT‑PCR扩增反应，电泳鉴定。本发明的检测猪呼吸与繁殖障碍综合症病毒的引物具有很高的特异性和灵敏度，能够检测出猪繁殖与呼吸障碍综合症的新型病毒类NADC30病毒；PCR扩增可以通过扩增片段的大小不同快捷的对PRRSV的经典株、变异株和类NADC30毒株这3类毒株进行鉴别区分，省去测序的步骤，节省了时间和成本，操作简单、实用。

Description

检测猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒的引物、试剂盒及方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，更具体地，本发明涉及一种检测猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒的引物、试剂盒及方法。
背景技术
猪蓝耳病是由猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(Porcine Reproductive andRespirary Syndrome Virus,PRRSV)感染引起的，以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸衰竭为主要症状的传染病，临床症状主要表现为母猪流产、早产、死胎、木乃伊胎、仔猪成活率下降和育成猪呼吸道症状等。该病于1987年在美国首次出现，随后在世界各地迅速蔓延。
猪繁殖与呼吸综合症(PRRS)对养猪业造成了极大的影响，特别是北美和欧洲近年来呈现全球蔓延的趋势，主要有母猪流产、生长期猪肺炎和仔猪死亡率增加等症状，因猪耳朵呈蓝紫状，因此也被称为猪蓝耳病。在我国新出现一种高致病性蓝耳病，除了传统症状外还可见体温明显升高，达41℃以上，皮肤发红、部分猪耳朵出血、淤血呈紫红色等症状，在一个地区流行数月无明显好转，常规疗法无效。
在1990年，美国的11个州和加拿大的11个州检测到这种病毒。接着1990年在德国的明斯特地区发现报道，并且迅速的蔓延到德国的其它地区，这种病当时在德国被称为猪感染晚期流产病(SSS)和地方流行性后期流产病(ESS)。其后在欧洲的其它国家(荷兰，法国，比利时，英格兰和丹麦)相继出现。1990年晚期在北欧的猪场诊断出超过5000头患有此病的猪。尽管这种疾病没有在意大利、波兰、瑞士和澳大利亚报道过，但是在意大利和波兰的猪群中用抗体检测出PRRSV。
这种疾病对经济的影响重大，造成了20-30％的猪死胎，每窝仔猪中损失1.5-2.0只猪。在此疾病爆发时每头母猪上的损失达到250-500美元。在衣阿华州的一份报道中，100英里内的农场中有85,330只死亡，并且造成1060万美元的损失。在西班牙，当PRRS第二次流行时有近3000头猪被屠宰。2006年在中国发现高致病性PRRSV(HP-PRRSV)，影响了超过2000000头猪。这种病毒对所有年龄段的猪都有影响，症状主要是高烧(高于41℃)、高致病率(50-100％)、高死亡率(20-100％)。从2006年到2009年在中国的不同省份分离出了一大批HP-PRRSV，并且和这种疾病的爆发相吻合。
2015年，有学者报道在中国大陆出现一种新的类NADC30毒株。该类型毒株毒力较强，造成爆发母猪流产、死胎以及仔猪呼吸道疾病(死亡率可达30％-50％)(Zhou L,WangZ,Ding Y et al.NADC30-like Strain of Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome Virus,China[J].Emerg Infect Dis.2015Dec；21(12):2256-2257.)。另外有学者通过实验发现新出现的NADC30类毒株具有一定毒力，并且应用目前的防控措施较难控制(Zhao K,Ye C,Chang XB et al.Importation and Recombination Are Responsible forthe Latest Emergence of Highly Pathogenic Porcine Reproductive andRespiratory Syndrome Virus in China[J].J Virol.2015Oct 15；89(20):10712-6.)。
类NADC30毒株的出现给蓝耳病的防控提出了新的挑战。及时、准确的诊断对于疾病的防控十分的重要，类NADC30毒株属于新发流行毒株，目前还未有该类型毒株的PCR诊断方法。
发明内容
基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明通过对猪呼吸与繁殖障碍综合症基因组的分析，提供了一种检测猪呼吸与繁殖障碍综合症病毒的引物、试剂盒及方法，该方法可以对PRRSV经典、变异和新出现的类NADC30毒株进行快捷的鉴别区分。
为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
一种检测猪呼吸与繁殖障碍综合症病毒的引物，所述引物如SEQ ID NO:1和SEQID NO:2所示。
上述检测猪呼吸与繁殖障碍综合症病毒的引物在制备检测猪呼吸与繁殖障碍综合症病毒的试剂盒中的应用。
一种检测猪呼吸与繁殖障碍综合症病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物。
在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括PrimeScript 1step Enzyme Mix，2×1step Buffer，和Rnase Free H2O。
一种检测猪呼吸与繁殖障碍综合症病毒的方法，采用上述引物，包括以下步骤：以待检测样品的RNA为模板，进行RT-PCR扩增反应，电泳鉴定；所述RT-PCR扩增反应的反应体系为：
所述PCR扩增反应的反应程序为：50℃30min进行预变性；然后94℃2min，94℃30s，55℃40s，共进行30次循环；最后72℃延伸1min，72℃延伸10min。
与现有技术相比，本发明具有以下显著效果：
1、本发明的检测猪呼吸与繁殖障碍综合症病毒的引物具有很高的特异性和灵敏度，能够检测出猪繁殖与呼吸障碍综合症的新型病毒类NADC30病毒；
2、使用本发明的检测猪呼吸与繁殖障碍综合症病毒的引物进行PCR扩增，可以通过扩增片段的大小不同快捷的对PRRSV的经典株、变异株和类NADC30毒株这3类毒株进行鉴别区分，省去测序的步骤，节省了时间和成本，操作简单、实用。
附图说明
图1为本发明实施例1中对样品扩增的电泳图，其中泳道1为NADC30株，泳道2为经典株，泳道3为类变异毒株，泳道4为样品A扩增结果，泳道5为样品B扩增结果，泳道6为阴性对照；
图2为本发明试验例1的特异性检验结果，其中泳道1为经典株，泳道2为变异株，泳道3为类NADC30毒株，4-9分别为猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒，10为阴性对照；
图3为本发明试验例2的灵敏度检验结果，其中，泳道1、2、3、4、5、6、7代表的RNA浓度分别为1.32μg、0.132μg、0.0132μg、1.32ng、0.132ng、0.0132ng、1.32pg。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
以下实施例中涉及的实验材料如无特殊说明，均来源于市售，以下实施例中所采用的操作均为本领域技术人员所熟知的常规操作。
实施例1 检测猪呼吸与繁殖障碍综合症病毒的引物和方法
1、引物设计
根据NCBI登陆的猪呼吸与繁殖障碍综合症病毒序列，登录号：变异毒株(EU864233,EF112445,FJ548853)、经典毒株(EU864233,EF536003,AF066183)和类NADC30毒株(JN654459，KP861625)提供的信息，经过比对分析，设计了PCR引物，分别为F、R：
上游引物F：ACCTCCTTTGAYTGGRATGTTGTGT(SEQ ID NO:1)；
下游引物R：CTTGAGCYGAGTAYTTYGGGCG(SEQ ID NO:2)
(兼并碱基Y代表C或T；R代表A或G)
检测方法
包括以下步骤：
(1)待检样品RNA提取
200μL细胞培养液(感染自主分离毒株ZW，分离于发病猪肺脏，属于自主分离毒株，该毒株经鉴定为类NADC30毒株)、200μL细胞培养液(感染自主分离经典毒株SHB，分离于发病猪淋巴结，属于自主分离毒株，该毒株经鉴定为经典PRRSV)、200μL细胞培养液(感染自主分离变异毒株TP，分离于发病猪肺脏，属于自主分离毒株，该毒株经鉴定为变异PRRSV)。采自有呼吸道症状表现的不同猪只肺脏病料A 100mg和肺脏病料B 100mg(病料未知是否感染病毒)以及DMEM(细胞培养基，不含PEDV，为阴性对照)作为待检样品，分别进行以下操作：
加入1mL PBS缓冲液进行充分研磨，-20℃反复冻融3次，8000rpm离心10min，取上清液200μL，加入0.2mL氯仿，震荡混匀15s后在室温(15℃～30℃)下放置2～3min后，12000g(2℃～8℃)离心15min；取上层水相置于新EP管中，加入0.5mL异丙醇，在室温(15℃～30℃)下放置10min，12000g(2℃～8℃)离心10min；弃上清，加入1mL 75％乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g(2℃～8℃)离心5min，弃上清；让沉淀的RNA在室温下自然干燥后加入20μLRNase-Free H2O溶解，即为RNA模板。提取的RNA放于-80℃保存。
(2)提取的RNA加入到一步法RT-PCR反应体系中进行PCR扩增(试剂PrimeScript1Step Enzyme Mix和2×1Step Buffer购自TaKaRa公司)。
其中，反应体系如下：
试剂 使用量
PrimeScript 1Step Enzyme Mix 1μL
2×1Step Buffer 12.5μL
引物F 0.5μL
引物R 0.5μL
RNA模板 8μL
Rnase Free H<sub>2</sub>O 2.5μL
扩增条件如下：
(3)取5μL PCR反应产物在1％(质量比)的琼脂糖凝胶上进行电泳鉴定，如果扩增出的片段大小在1050bp左右的为经典株，片段大小在960bp左右的为变异株，扩增长度在657bp的为类NADC30毒株。
检测结果见表1。
表1待检样品检测结果
待检样品 扩增结果判定
细胞培养液(感染毒株ZW) 类NADC30
细胞培养液(感染毒株SHB) 经典株
细胞培养液(感染毒株TP) 变异株
肺脏病料A 变异株
肺脏病料B 类NADC30
DMEM细胞培养基 无
试验例1 特异性检验
以存在猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒的经典株(毒株SHB)、变异株(毒株TP)和类NADC30株(毒株ZW)的细胞培养液作为阳性对照，猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒的培养液进行特异性检测，使用实施例1的方法与引物，结果除阳性对照外均没有扩增，阳性对照经过PCR扩增分别在1050bp、960bp和657bp处有条带(见图2)。
试验例2 灵敏度检验
用实施例1中类NADC30株提取得到的RNA用RNase Free H2O做10倍的梯度稀释，RNA含量分别为1.32μg、0.132μg、0.0132μg、1.32ng、0.132ng、0.0132ng、1.32pg作为模板，每个稀释度各取8μL作为模板，按实施例1方法进行检测，观察阳性条带，以出现阳性预期条带所用模板量的最高稀释度计算其敏感性，结果表明最小检出量为0.0132ng(见图3)。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (4)

1.一种检测猪呼吸与繁殖障碍综合症病毒的引物，其特征在于，所述引物如SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示。
2.权利要求1所述的引物在制备检测猪呼吸与繁殖障碍综合症病毒的试剂盒中的应用。
3.一种检测猪呼吸与繁殖障碍综合症病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的检测猪呼吸与繁殖障碍综合症病毒的引物。
4.根据权利要求3所述的检测猪呼吸与繁殖障碍综合症病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PrimeScript 1step Enzyme Mix，2×1step Buffer，和Rnase Free H2O。
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