CN101413036A

CN101413036A - 检测猪生殖和呼吸综合症病毒的引物及其应用方法

Info

Publication number: CN101413036A
Application number: CNA2008102195992A
Authority: CN
Inventors: 曹永长; 李强; 薛春宜
Original assignee: National Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University; National Sun Yat Sen University
Priority date: 2008-12-02
Filing date: 2008-12-02
Publication date: 2009-04-22
Anticipated expiration: 2028-12-02
Also published as: CN101413036B

Abstract

本发明涉及用于检测猪生殖和呼吸综合症病毒的引物，所述引物与猪生殖和呼吸综合症病毒的核苷酸序列的一部分或其互补链互补，并能够在DNA聚合酶的作用下特异性地扩增猪生殖和呼吸综合症病毒的核苷酸序列的一部分。本发明的用于检测猪生殖和呼吸综合症病毒的引物灵敏度高、特异性强。本发明还提供一种猪生殖和呼吸综合症病毒的检测方法和一种猪生殖和呼吸综合症病毒的检测试剂盒。

Description

检测猪生殖和呼吸综合症病毒的引物及其应用方法

技术领域

本发明涉及猪感染病毒检测技术领域，特别涉及一组检测猪生殖和呼吸综合症病毒的引物及检测猪生殖和呼吸综合症病毒的方法。

背景技术

猪生殖和呼吸综合症病毒(PRRSV)属于称为动脉病毒的包膜的正链RNA病毒家族，该家族中的其它病毒为原型病毒、马动脉炎病毒(EAV)、乳酸脱氢酶病毒(LDV)和猿出血热病毒(SHFV)。与冠形病毒和动脉病毒共有的显著特征近来导致它们在新产生的序列中的定位，巢病毒、动脉病毒组成的四个成员，基因组结构，复制策略和蛋白的氨基酸序列类似，它们在体内和体外感染巨噬细胞的优先选择也相似。

1987年美国的养猪业经受了对养猪业产生严重经济影响的一种不为人知的传染性疾病。该疾病综合症在欧洲包括德国、比利时、荷兰、西班牙和英国均有报道。该疾病特征在于生殖力衰退、呼吸疾病以及包括食欲不振、发呼吸困难及轻微神经病学症状的各种临床症状。这种综合症的一个主要部分为生殖力衰退，表现为早产、后期流产、初生小猪体弱、死胎、干瘪胎儿、下崽率下降和延迟发情期的恢复。呼吸疾病的临床症状在3周龄以下的小猪中最明显，但据报告存在于各个养殖阶段的猪中。受感染的小猪生长缓慢，皮毛粗糙，呼吸窘迫及死亡率增加。

用金标准(golden standard)分析检测PRRSV是一种合理的诊断方法，该方法可以通过受纳细胞从临床样品中检测出分离株病毒。但是，由于猪肺泡巨噬细胞作为PRRSV的受纳细胞需要从更适合的(无特异性病原的)的6-8周龄猪中收获，所以为了检测PRRSV而进行的病毒学诊断是非常困难的。为寻找替代物，报道了一种使用组织化学法和免疫荧光法检测组织中的PRRSV抗原，但是这些方法非常耗时，并且灵敏度低。

基于聚合酶链反应(PCR)的检测法由于能够实现特异性和灵敏性故已经发展为研究热点，例如，已经使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和巢式-PCR(nested-PCR)检测PRRSV的病毒RNA。并且设计了一种多重PCR检测用于鉴别北美和欧洲PRRSV分离株。此外，还发展了一种用于鉴别和作为疫苗PRRSV分离株的PCR-扩增产物的限制性片段多样性分析。同时，还报道了在自然-感染和攻毒猪中对PRRSV定量的实时PCR(Real-time)方法。但是，为了扩增、精制和检测扩增产物的复杂程序，所有这些基于PCR的检测方法都需要高精密度仪器，所以都不适用于现场检测领域的情况或是发展中国家的原始实验室中。并且这些方法不但繁琐，而且因为低特异性和易交叉污染，往往结果并不可靠，在临床上造成许多窗口期的病原被错检或漏检，很难作为一种临床上的常规方法进行推广。因此，发展一种简便、高特异且灵敏的核酸检测方法对PRRSV的预防和控制工作显得尤为重要。

综上所述，为了解决以上问题，需要发展一种具有理想的特异性和灵敏度的简单、快速、低成本的PRRSV检测法。

发明内容

本发明的主要目的之一在于基于现有技术的不足而提供一组灵敏度高、特异性强的检测猪生殖和呼吸综合症病毒的引物。

本发明的另一个目的是提供一种灵敏度高、特异性强、反应时间短、操作简单的猪生殖和呼吸综合症病毒的检测方法。

本发明的另一个目的在于基于现有技术的不足而提供一种灵敏度高、特异性强、反应时间短、操作简单的猪生殖和呼吸综合症病毒的检测试剂盒。

本发明提供一组用于检测猪生殖和呼吸综合症病毒的引物，所述引物与猪生殖和呼吸综合症病毒的核苷酸序列的一部分或其互补链互补，并能够在DNA聚合酶的作用下特异性地扩增猪生殖和呼吸综合症病毒的核苷酸序列的一部分。

作为本发明优选实施方式，本发明用于检测猪生殖和呼吸综合症病毒的引物，为如下列序列号1～序列号6所示的寡核苷酸，或者序列号1～序列号6所示的寡核苷酸的互补链，其中R和Y均为简并碱基，R＝G+A，Y＝C+T。

上述序列号1～6的引物对应SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6的引物。

本发明的用于检测猪生殖和呼吸综合症病毒引物，灵敏度高、特异性强。6条引物共识别8个区域，充分保证其特异性。其中F3和B3是外引物，在起始扩增反应时起作用；FIP和BIP称为内引物，在整个扩增过程都起作用，是最关键的一对引物，导致产生环状的茎环结构而无限扩增；FL和BL称为环状引物，用于提高反应速率。

本发明提供一种检测猪生殖和呼吸综合症病毒的方法，该方法用于检测样本中是否存在猪生殖和呼吸综合症病毒，所述方法采用可以与猪生殖和呼吸综合症病毒的核苷酸序列的一部分或其互补链互补、并能够在DNA聚合酶的作用下特异性地扩增猪生殖和呼吸综合症病毒的核苷酸序列的一部分的引物，通过环介导等温扩增法，特异性地扩增猪生殖和呼吸综合症病毒的核苷酸序列的一部分，确认是否存在有扩增产物。

作为本发明的优选实施方式，本发明检测猪生殖和呼吸综合症病毒的方法包括如下步骤：

(1)准备检测样本；

(2)提取样本的总RNA；

(3)对步骤(2)的RNA进行逆转录反应，得到cDNA；

(4)对步骤(3)的cDNA进行环介导的等温核酸扩增反应，反应温度为60～65℃，反应时间为10～60分钟；

(5)终止反应；

(6)检测所述扩增引物。

作为本发明优选实施方式，本发明检测猪生殖和呼吸综合症病毒的方法中，所述步骤(3)和步骤(4)合并为步骤(31)：对步骤(2)的RNA进行逆转录反应，在同一个反应体系中立即对cDNA产物进行环介导的等温核酸扩增反应，反应温度为60～65℃，反应时间共为10～60分钟。

作为本发明优选实施方式，本发明检测猪生殖和呼吸综合症病毒的方法中，所述检测样本选自下列样本中的一种或者组合：

(1)猪的肺、肝以及内脏合并器官样本；

(2)公猪精液；

(3)血清；或者

(4)细胞培养物。

作为本发明优选实施方式，本发明检测猪生殖和呼吸综合症病毒的方法中，所述步骤(6)所述的检测是通过选自扩增产物凝胶电泳、扩增产物浊度观测和扩增产物化学发光的检测方法进行的。

本发明提供的猪生殖和呼吸综合症病毒的检测方法，采用的引物灵敏度高、特异性强；采用的环介导等温扩增反应，反应时间短、操作简单。

本发明还提供一种检测生物样品中猪生殖和呼吸综合症病毒的试剂盒，所述试剂盒包含有引物，所述引物与猪生殖和呼吸综合症病毒的核苷酸序列的一部分或其互补链互补，并能够在DNA聚合酶的作用下特异性地扩增猪生殖和呼吸综合症病毒的核酸序列的一部分。

作为本发明优选实施方式，本发明的检测生物样品中猪生殖和呼吸综合症病毒的试剂盒包含有引物，所述引物为如下列序列号1～序列号6所示的寡核苷酸，或者序列号1～序列号6所示的寡核苷酸的互补链，其中R和Y均为简并碱基，R＝G+A，Y＝C+T。

上述序列号1～6的引物对应SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6的引物。

本发明提供的猪生殖和呼吸综合症病毒的检测试剂盒，采用的检测引物灵敏度高、特异性强，检测反应时间短、操作简单，能够满足市场的需求。

附图说明

图1表示环介导等温扩增反应产物的特征性梯状条带和酶切鉴定电泳图。其中，泳道M：marker；泳道1：扩增原始产物，表现出特征性的梯状条带，不能通过片段的大小来鉴别是否为非特异性扩增；泳道2：扩增产物用限制性内切酶EcoR I酶切产物，得到320bp，220bp，和and 150bp大小的三条主带；泳道3：扩增产物用限制性内切酶Bam H I酶切产物，得到310bp，270bp和230bp大小的三条主带，说明是特异性扩增；

图2表示不同温度下的等温孵育50分钟的产物含量的电泳图。选取64℃为最优反应温度。泳道M：100bp DNA marker；61～65：反应温度，单位：℃；泳道N：阴性对照，以水替代PRRSV RNA为模板；

图3表示64℃等温孵育不同时间的产物含量的电泳图，在20分钟时就出现了特征性扩增条带，表明20分钟即可完成反应；50分钟出现明亮的条带，选取50分钟为最佳反应时间；泳道M：marker；10～50：反应时间，单位：分钟；泳道N：阴性对照；

图4表示肉眼可视观察的实验结果，省略电泳所需的时间和设备，P1和P2是阳性反应，N1和N2是阴性反应；其中，N2和P2都加了SYBR Green I荧光染料；在P1的体系中，可以看见混浊的白色副产物，稍微离心，可见沉淀聚集于底部；P2中的染料由N2所显示的橙黄色(染料的本色)变为绿色；

图5表示灵敏度实验，泳道M：marker；泳道N：阴性对照；泳道10到0.0001：病毒RNA模板按10倍稀释后的扩增产物；上图是利用F3和B3做一步法RT-PCR的电泳结果，产物为261bp；下图是本发明方法的结果，可得该方法比RT-PCR灵敏100倍左右。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。

实施例1

一组用于检测猪生殖和呼吸综合症病毒的引物，所述引物与猪生殖和呼吸综合症病毒的核苷酸序列的一部分或其互补链互补，并能够在DNA聚合酶的作用下特异性地扩增猪生殖和呼吸综合症病毒核苷酸序列的一部分。所述引物为如下列序列号1～序列号6所示的寡核苷酸，其中R和Y均为简并碱基，R＝G+A，Y＝C+T。

上述序列号1～6的引物对应SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6的引物。

这里所用的“核酸”或“多核苷酸”是指任何长度的含嘌呤和嘧啶的聚合物，可以是多核糖核苷酸，可以是多脱氧核糖核苷酸，或是混合的多核糖-多脱氧核糖核苷酸。它包括单链和双链分子，例如DNA-DNA，DNA-RNA和RNA-RNA杂合体，以及通过与氨基酸主链共轭碱基形成的“蛋白质核酸”(PNA)。它还包括含有修饰碱基的核酸。

这里所用的“引物”是长度约为5个至50个核苷酸的寡核苷酸，优选长度为大约6个至25个核苷酸，特别优选长度为大约6个至18个核苷酸，它与相关的单链核酸序列形成一个双链体，并且可以用例如逆转录酶或DNA聚合酶使互补链发生聚合反应。

实施例2

一组用于检测猪生殖和呼吸综合症病毒的引物，所述引物与猪生殖和呼吸综合症病毒的核酸序列的一部分或其互补链互补，并能够在DNA聚合酶的作用下特异性地扩增猪生殖和呼吸综合症病毒的核酸序列的一部分。所述引物，为实施例1中序列号1～序列号6所示的寡核苷酸的互补链。

这里所用的核酸序列的“互补链”是指参与与原始序列沃森-克里克碱基配对的反义序列。

实施例3

一种检测猪生殖和呼吸综合症病毒的方法，该方法用于检测样本中是否存在猪生殖和呼吸综合症病毒，所述方法采用如下列序列号1～序列号6所示的寡核苷酸组成的引物组，通过环介导等温扩增法(LAMP)，特异性地扩增猪生殖和呼吸综合症病毒的核苷酸序列的一部分，确认是否存在有扩增产物。

上述序列号1～6的引物对应SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6的引物。

LAMP扩增主要利用了Bst DNA聚合酶大片段的两大特性：一是DNA聚合酶具有5′→3′DNA聚合酶活性，能在恒温状态下扩增DNA核酸；二是Bst DNA聚合酶不具有5′→3′外切核酸酶活性，能将新合成的核酸单链从新生成的DNA双链上置换(取代)下来，形成两条独立的核酸单链以开启下一轮的DNA核酸合成；进而免去了每次扩增前的DNA变性环节。在此基础上，巧妙地设计能识别6个(或8个)独立DNA序列的LAMP引物组(4引物组或6引物组)，使得Bst DNA聚合酶的两大特性充分发挥。其中，内引物(BIP、FIP)的设计是LAMP引物设计的亮点、难点。

Bst DNA聚合酶大片段是Bacillus stearothermophilus DNA聚合酶的一部分，来源于E.coli菌株，此菌株含有来自Bacillus stearothermophilus DNA聚合酶的基因，该基因不具有5′→3′外切核酸酶活性。应用基因重组技术，将麦芽糖结合蛋白(MBP)基因与该基因融合表达，纯化后再去除麦芽糖结合蛋白。

1.扩增

第一阶段：扩增始发物形成

步骤1：当双链DNA处于65℃左右的动态平衡中时，引物组中的BIP引物就能通过互补结合到目标DNA双链上，在Bst DNA聚合酶作用下，启动DNA合成。

步骤2：从BIP的B2区域3’端开始合成DNA模板的互补链至F3C；

步骤3：B3引物退火结合到模板DNA的互补区域B3C，启动链取代合成，同时释放由BIP引物引导合成的互补链。

步骤4：释放的DNA的B1C区域结合B1区域，形成茎环结构；1.3步释放的DNA链作为FIP引物以及F3引物的模板，按BIP端相同的模式启动DNA的合成及链取代，释放的DNA链在FIP端同样形成茎环结构。进而，形成哑铃形结构扩增始发物。

第二阶段：延伸

步骤5：哑铃结构通过自引导DNA合成迅速转换成茎环结构DNA；

步骤6：BIP引物与茎环结构的环状单链区域结合并开始新的DNA合成，由于F1及F1C的互补关系，再次形成茎环结构，先前合成的DNA链得以释放；

步骤7：FIP引物同样与对应的茎环结构的环状单链区域结合，由于B1及B1C的互补关系，再次形成茎环结构，先前合成的DNA链得以释放；

步骤8：如此周而复始扩增，最终形成不同长度(目的片断长度的自然数倍)花椰菜cauliflower状的反向重复序列。

2.引物设计：

LAMP引物的设计比常规PCR要复杂的多。一个反应至少包括4条引物，包括一对内引物(FIP和BIP，各约40bp)和一对外引物(F3和B3，各约25bp)；如果添加一对环引物(loop primer)，反应便可以加速，反应时间减半，大大增加扩增检测的效率。Primer Explorer version 3软件可以专门设计各种特异LAMP引物，用户只需按要求提交目的片断序列，设置相关参数，系统便能产生多种引物组合供用户选择。此外，LAMP引物可以人工设计，各引物的组成(请见表1)，引物设计的其他技术细节及注意事项可参考相关文献(Tsugunori Notomi等，2000；K.Nagamine等，2002)。

表1 LAMP引物组成

3.反应体系及设备：

25ul LAMP反应的基本体系如下：内引物FIP、BIP各0.8mM，外引物F3、B3各0.2mM，(需要时，环引物LF、LB各0.4mM)，1.6mM dNTPs，1M betaine甜菜碱(Sigma)，反应缓冲液(20mM Tris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，4mM MgSO₄，0.1％ Triton X-100)，8个单位Bst DNApolymerase largefragment(New England Biolabs)以及模板DNA。模板DNA在恒温扩增前95℃孵育5mins(Tsugunori Notomi等，2000)，但后续研究表明，未经95℃变性的DNA模板可以直接进入恒温扩增(60～65℃ for 45～60mins)。为防止非特异扩增，须80℃孵育2～5mins。

由于LAMP反应无需循环变温，所以仅需水浴锅或其他恒温加热器便可。

4.扩增结果判定

扩增结果有三种判定方法：1)核酸的琼脂糖凝胶电泳，染料可以是EB也可以是SYBR Green I，琼脂糖凝胶的浓度以2℅为宜，缓冲液采用TBE缓冲液。2)肉眼直接观测副产物焦磷酸镁沉淀。产物呈阳性的反应，管内液体浑浊，离心或由白色沉淀集于管底，阴性反应则无此现象。3)SYBR Green I荧光染料直接对产物进行染色，也可以通过肉眼直接观察。产物呈阳性的反应，加染料后呈绿色，阴性反应则呈橙红色。

实施例4

一种检测猪生殖和呼吸综合症病毒的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)准备检测样本：感染PRRSV的Marc-145细胞可直接用于总RNA的抽提；新鲜或者用磷酸盐缓冲液冻存于-80℃的病料，充分匀浆后10000rpm离心10～30min，取上清液用于总RNA的抽提；

(2)提取样本的总RNA：使用RNAiso抽提试剂(大连宝生物工程公司产品)，按照试剂的说明书操作；

(3)对步骤(2)的RNA进行逆转录反应，使用AMV逆转录酶(大连宝生物工程公司产品)得到cDNA，反应温度可以在60～65℃；

(4)对步骤(3)的cDNA进行环介导的等温核酸扩增反应，使用Bst大片段DNA聚合酶(纽英兰公司产品)，反应温度为60～65℃，反应时间为10～60分钟；

其中，(3)和(4)两步可以合并为一步，将逆转录酶和DNA聚合酶加在一个离心管中，逆转录和等温扩增在相同温度下(60～65℃)同时进行，大大缩短了反应时间。即，逆转录和等温扩增两步就可以在20-60分钟完成(图2)；

(5)终止反应；80℃持续5分钟；

(6)检测所述扩增引物：有三种方法可供选择。其一、产物可以通过电泳来观察是否有特征性梯状条带出现(见图1)。其二、产物如果出现混浊、经简短离心有白色沉淀，即可判为阳性；用浊度仪能更方便地判定。其三、加SYBRGreen I染料到产物中，阴性反应仍然为原本的橙黄色，而阳性则变为绿色(见图4)。

为阐明LAMP扩增技术在检测灵敏度方面的优势，特选择灵敏度较高的RT-PCR作为比较对象。病毒RNA模板按10倍稀释后，利用F3和B3做一步法RT-PCR，同时采用本发明的检测方法进行实验。由图5可知，一步法RT-PCR的检测极限为0.1TCID₅₀，本发明检测方法的检测极限为0.001 TCID₅₀，可得该方法比RT-PCR灵敏100倍左右。

在本发明的其他实施例中，样本的来源还可以是选自下列样本中的一种或者组合：

(1)猪的肺、肝以及内脏合并器官样本；

(2)公猪精液；

(3)血清；或者

(4)细胞培养物。

对样本的准备可以参照美国冷泉港实验室出版社的《分子克隆实验指南》的实验方法进行准备。

实施例5

一种检测生物样品中猪生殖和呼吸综合症病毒的试剂盒，所述试剂盒包含有用于检测猪生殖和呼吸综合症病毒的引物，所述引物为实施例1中序列号1～序列号6所示的寡核苷酸。

实施例6

一种检测生物样品中猪生殖和呼吸综合症病毒的试剂盒，所述试剂盒包含有用于检测猪生殖和呼吸综合症病毒的引物，所述引物为实施例1中序列号1～序列号6所示的寡核苷酸的互补链。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110>中山大学

<120>检测猪生殖和呼吸综合症病毒的引物及其应用方法

<160>6

<170>PatentIn version3.3

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

<210>2

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

<210>3

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

<210>4

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

<210>6

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

Claims

1.用于检测猪生殖和呼吸综合症病毒的引物，其特征在于，所述引物与猪生殖和呼吸综合症病毒的核苷酸序列的一部分或其互补链互补，并能够在DNA聚合酶的作用下特异性地扩增猪生殖和呼吸综合症病毒的核苷酸序列的一部分。

2.如权利要求1所述的用于检测猪生殖和呼吸综合症病毒的引物，其特征在于，所述引物为如下列序列号1～序列号6所示的寡核苷酸，

序列号1 5′-GCTCACTATGGGAGCAGTAG-3′<SEQ ID NO.1>、

序列号2 5′-TCTGCCACCCAACACG-3′<SEQ ID NO.2>、

序列号3 5′-AATGTACTTGCGGCCTAGCGAATTCAGCCATAGAAACCTGGA-3′

<SEQ ID NO.3>、

序列号4 5′-GGCAAATGATAACCACGCAGGATCCGTTGACCGTAGTGGAG-3′

<SEQ ID NO.4>、

序列号5 5′-CGGCATCTGGAGGTGATG-3′<SEQ ID NO.5>、

序列号6 5′-TGTCGTCCGGCGTCC-3′<SEQ ID NO.6>，

或者序列号1～序列号6所示的寡核苷酸的互补链。

3.一种检测猪生殖和呼吸综合症病毒的方法，其特征在于，所述方法采用如权利要求1所述的引物，通过环介导等温扩增法，特异性地扩增猪生殖和呼吸综合症病毒的核苷酸序列的一部分，确认是否存在有扩增产物。

4.如权利要求3所述的检测猪生殖和呼吸综合症病毒的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)准备检测样本；

(2)提取样本的总RNA；

(3)对步骤(2)的RNA进行逆转录反应，得到cDNA；

(5)终止反应；

(6)检测所述扩增引物。

5.如权利要求4所述的检测猪生殖和呼吸综合症病毒的方法，其特征在于，所述方法的步骤(3)和步骤(4)合并为

步骤(31)：对步骤(2)的RNA进行逆转录反应，得到cDNA后立即在同一个反应体系中对cDNA进行环介导的等温核酸扩增反应，两步的反应温度均为60～65℃，反应时间共为10～60分钟。

6.如权利要求3所述的检测猪生殖和呼吸综合症病毒的方法，其特征在于，所述检测样本选自下列样本中的一种或者组合：

(1)猪的肺、肝以及内脏合并器官样本；

(2)公猪精液；

(3)血清；或者

(4)细胞培养物。

7.如权利要求4所述的检测猪生殖和呼吸综合症病毒的方法，其特征在于，所述方法的步骤(6)所述的检测是通过选自扩增产物凝胶电泳、扩增产物浊度观测和扩增产物化学发光的检测方法进行的。

8.一种检测生物样品中猪生殖和呼吸综合症病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含有权利要求1所述的引物。

9.如权利要求8所述的检测生物样品中猪生殖和呼吸综合症病毒的试剂盒，其特征在于，所述引物为如下列序列号1～序列号6所示的寡核苷酸，

序列号1 5′-GCTCACTATGGGAGCAGTAG-3′<SEQ ID NO.1>、

序列号2 5′-TCTGCCACCCAACACG-3′<SEQ ID NO.2>、

序列号3 5′-AATGTACTTGCGGCCTAGCGAATTCAGCCATAGAAACCTGGA-3′

<SEQ ID NO.3>、

序列号4 5′-GGCAAATGATAACCACGCAGGATCCGTTGACCGTAGTGGAG-3′

<SEQ ID NO.4>、

序列号5 5′-CGGCATCTGGAGGTGATG-3′<SEQ ID NO.5>、

序列号6 5′-TGTCGTCCGGCGTCC-3′<SEQ ID NO.6>、

或者序列号1～序列号6所示的寡核苷酸的互补链。