JP7083393B2 - 単一分子配列決定の試料調製のための環化方法 - Google Patents
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Description
一部の実施形態では、本発明は、標的核酸から環状分子を形成する方法であって、アダプター配列を標的核酸の末端に付けて、アダプター付加された標的核酸を形成するステップ;アダプター付加された標的核酸を二本鎖骨格核酸と接触させるステップ;骨格と、アダプター付加された標的核酸との両方に一本鎖オーバーハングを生成するステップ;骨格の一本鎖オーバーハングを、アダプター付加された標的核酸の一本鎖オーバーハングとハイブリダイズするステップ;骨格の末端を、アダプター付加された標的核酸の末端とライゲーションして、環状分子を形成するステップを含む方法である。一部の実施形態では、アダプターは、ライゲーションにより標的核酸の末端に付けられる。他の実施形態では、アダプターは、5’部分にアダプター配列を含む、標的に特異的な2部構成のプライマーの伸長により標的核酸の末端に付けられる。アダプター付加された標的核酸は、骨格と接触される前に増幅される。
一部の実施形態では、本方法は、ライゲーションステップの後に精製ステップをさらに含む。
以下の定義は、本開示の理解を助けるものである。
「試料」という用語は、標的核酸を含有するまたは含有すると推定される任意の組成物を指す。これは、個体、例えば、皮膚、血漿、血清、髄液、リンパ液、滑液、尿、涙液、血球、器官および腫瘍から単離された組織または液体の試料、ならびにまた、ホルマリン固定パラフィン包埋組織(FFPET)およびそれから単離された核酸を含む、個体から採取された細胞から樹立されたin vitro培養物の試料を含む。試料はまた、無細胞性DNA(cfDNA)または循環腫瘍DNA(ctDNA)を含有する無細胞性血液画分などの無細胞材料を含む場合がある。
「ギブソンアセンブリ」という用語は、例えば、Gibsonら、(2009年)、Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases、Nature Methods、6(5):343~348および米国特許第8,968,999号に記載された、等温in vitro組み換え方法である。本方法は、一般的に、エキソヌクレアーゼ消化して少なくとも部分的な付着末端を創出するステップ、末端同士をアニーリングするステップ、ポリメラーゼで埋めるステップおよび末端同士をライゲーションするステップによる、核酸をつなぐ(アセンブルする)ことを含む。
一部の実施形態では、ライゲーションを達成するために他の酵素的ステップが必要とされる場合がある。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドキナーゼを使用して、標的核酸分子およびアダプター分子に5’-ホスフェートを付加する場合がある。
一部の実施形態では、本方法は、標的核酸の2つの鎖のうち一方だけを調べる、または2つの鎖を別々に分析する。本発明は、二本鎖アンプリコンの鎖同士を分離するステップを含む。2つの鎖は、物理的手段、すなわち、アルカリ変性または熱変性により分離される場合がある。
一部の実施形態では、核酸の末端は、リン酸化される。一部の実施形態では、後続のライゲーションステップを可能にするために、一方のプライマーの5’末端がリン酸化される。プライマー、またはアダプターのリン酸化は、例えば、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)などのPNKの使用により行うことができる。
一部の実施形態では、配列決定ステップは、誤差補正のステップを含む配列分析を伴う。一部の実施形態では、配列の整列は、複数の配列、例えば同じバーコード(UID)を有する複数からコンセンサス配列を決定するために使用される。一部の実施形態では バーコード(UID)は、すべてが同一のバーコード(UID)を有する複数の配列からコンセンサスを決定するために使用される。他の実施形態では、バーコード(UID)は、アーチファクト、すなわち同一のバーコード(UID)を有する配列のいくつかに存在するがすべてには存在しない変動を除去するために使用される。PCRの誤差または配列決定の誤差に起因するこのようなアーチファクトは、除去することができる。
細菌全ゲノム配列決定のための一本鎖環状鋳型の生成
本実施例では、培養細菌単離株からDNAを抽出し、最初にDNA損傷修復に供し、続いて機械的または酵素的断片化を行う。断片化したDNAは、サイズ選択される場合またはされない場合がある。断片化に続き、DNAを末端修復し、A尾部を付加し、ギブソンアセンブリ配列を有するT尾部のアダプター(スティッチ)および配列決定プライマー結合部位を各末端にライゲーションする。次いで、アダプターとライゲーションした挿入部を、挿入分子中に存在する配列と相補的なギブソンアセンブリアダプターに挟まれた二本鎖DNA骨格と混合する。ギブソンアセンブリの間、エキソヌクレアーゼは、骨格および挿入部の5’末端を連続的に切断し、相補的なギブソンアセンブリアダプター末端を露出させる。骨格および挿入分子の2つの末端をアニーリングさせ、次いでDNAポリメラーゼでギャップを埋め、DNAリガーゼによるライゲーションによって共有結合で連結し、両方の鎖に配列決定プライマー結合部位を有する二本鎖環状分子を生成する。次いで、二本鎖DNAを熱変性させて、単一分子配列決定プラットフォームを用いた配列決定の準備が整った一本鎖分子を創出する。
PCRアンプリコンからの単一分子配列決定のための一本鎖環状鋳型の生成
本実施例では、PCRアンプリコンから開始して、単一分子配列決定プラットフォームを用いた配列決定のための一本鎖ライブラリーを生成する。DNA損傷修復および断片化は、典型的には、PCRアンプリコンのために必要なく、ライブラリーの調製プロセスは、末端修復およびA尾部付加に続く、各末端へのギブソンアセンブリ配列(スティッチ)および配列決定プライマー結合部位を有するT尾部のアダプターのライゲーションからなる。次いで、アダプターとライゲーションした挿入部を、挿入分子中に存在する配列と相補的なギブソンアセンブリアダプターに挟まれた二本鎖DNA骨格と混合する。ギブソンアセンブリの間、エキソヌクレアーゼは、骨格および挿入部の5’末端を連続的に除去し、相補的なギブソンアセンブリアダプター末端を露出させる。骨格および挿入分子の2つの末端をアニーリングさせ、次いでDNAポリメラーゼでギャップを埋め、DNAリガーゼによるライゲーションにより共有結合で連結し、両方の鎖に配列決定プライマー結合部位を有する二本鎖環状分子を生成する。次いで、二本鎖DNAを変性させて、配列決定の準備が整った一本鎖分子を創出する。
Claims (7)
- 標的核酸を配列決定する方法であって、
a)アダプター配列を標的二本鎖核酸の5’末端および3’末端に付けて、アダプター付加された標的二本鎖核酸を形成するステップであって、ここでアダプターが、ライゲーションにより標的二本鎖核酸の5’末端および3’末端に付けられる、ステップ;
b)アダプター付加された標的二本鎖核酸を二本鎖骨格核酸と接触させるステップ;
c)二本鎖骨格核酸と、アダプター付加された標的二本鎖核酸との両方に一本鎖オーバーハングを生成するステップ;
d)二本鎖骨格核酸の一本鎖オーバーハングを、アダプター付加された標的二本鎖核酸の一本鎖オーバーハングとハイブリダイズするステップ;
e)二本鎖骨格核酸の末端を、アダプター付加された標的二本鎖核酸の末端とライゲーションして、環状分子を形成するステップ;
f)環状分子の鎖同士を分離して、一本鎖環状分子を生成するステップ;
g)配列決定プライマーを一本鎖環状分子のそれぞれとアニーリングするステップ;および
h)アニーリングされた配列決定プライマーを伸長し、それにより標的二本鎖核酸を配列決定するステップ
を含む方法。 - アダプターが、配列決定プライマー結合部位を含む、請求項1に記載の方法。
- アダプターまたは二本鎖骨格核酸が、少なくとも1つのバーコードを含む、請求項1または2に記載の方法。
- ステップf)における鎖同士が、熱または化学的手段により分離される、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- ステップf)における鎖同士が、一方の鎖に切れ目を入れることおよび切れ目が入った鎖をエキソヌクレアーゼ消化により除去することにより分離される、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 二本鎖骨格核酸が、捕捉部分に対するリガンドを含み、ステップf)における鎖が、固体支持体上に捕捉される、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- ステップh)における配列決定するステップが、ナノポアデバイスを利用する、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
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