CN102220435A - 一种实时荧光定量rt-pcr检测美洲型prrsv及其变异株的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种实时荧光定量RT-PCR检测美洲型PRRSV及其变异株方法，经过对本发明所建立的方法进行特异性、灵敏度的验证，结果显示可以较好的将PRRSV同PRRSV变异株（NSP21594-1680缺失）以及猪类其他易感病毒区分开，且灵敏度可以达到0.47TCID50。本发明在诊断时间上同传统方法相比自获得待检样品到提取核酸，配制荧光定量RT-PCR反应体系，直到出现反应结果，整个过程可以在2.5h内完成，在保证检验结果的基础上大大缩短了检验所需时间。

Description

一种实时荧光定量RT-PCR检测美洲型PRRSV及其变异株的方法

 技术领域

本发明涉及检测技术领域，特别涉及一种可以精确、特异、快速检测美洲型PRRSV及其变异株的方法。

  

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS），俗称猪蓝耳病，是由PRRSV（猪蓝耳病病毒）感染引起的高度传染性免疫抑制疾病，以成年猪早产、流产和死胎，以及仔猪呼吸异常为特征，常常继发其他病原感染。自1987年美国报道以来，该病已逐渐成为困扰世界各国养猪业的重要疾病，给养猪生产造成了重大经济损失，也是集约化养猪生产中猪病控制的重点和难点。我国1996年首次报道PRRS，关于该病发生、流行以及研究的报告日趋增多。PRRSV分为美洲型和欧洲型，截止目前我国尚未发现由欧洲型毒株感染引起的。2006年5月份以来，在我国多个省份暴发流行并造成仔猪大量死亡的猪“高热病”疫情，经过流行病学调查、病原分离鉴定、动物试验等科技攻关，证实了其病原为美洲型PRRSV变异株（NSP2 1594~1680缺失）。 

传统的PRRS诊断方法有病毒分离、ELISA、免疫过氧化酶单层试验、间接荧光试验、血清中和试验等，以上传统诊断方法曾经在PRRSV的诊断中发挥过重大作用，但随现在生物诊断技术的发展日益凸显出其不足：操作过程繁琐，需时较长，准确度也不能满足目前检测需要且无法区分PRRSV和PRRSV变异株。在实际诊断过程中很容易漏检和误检。 

因此，现有技术还有待于改进和发展。 

  

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种实时荧光定量RT-PCR检测美洲型PRRSV及其变异株的方法，旨在解决现有技术中所存在的问题。 

本发明的技术方案如下： 

一种用于实时荧光定量RT-PCR检测美洲型PRRSV及其变异株的特异性引物，其中，PRRSV群通用型特异性引物序列如SEQ NO.1-2所示；PRRSV 变异株特异性引物序列如SEQ NO.4-5所示。

一种用于实时荧光定量RT-PCR检测美洲型PRRSV及其变异株的特异性探针，其中，PRRSV群通用型特异性探针序列如SEQ NO.3所示；PRRSV 变异株特异性探针序列如SEQ NO.6所示。 

所述的用于实时荧光定量RT-PCR检测美洲型PRRSV及其变异株的特异性探针，其中，所述PRRSV群通用型特异性探针和PRRSV 变异株特异性探针的5'端都标记发光基团FAM，3'端都标记泯灭基团TAMRA。 

一种使用上述的引物和探针的实时荧光定量RT-PCR检测美洲型PRRSV及其变异株方法，其中，包括以下步骤： 

S100、样品的预处理：对采集的样品分别编号进行编号，分别取少量的样品混合青、链霉素双抗溶液，匀浆，取上清，4℃过夜；

S200、RNA提取：对采集的样品提取RNA；

S300、PRRSV群实时荧光定量RT-PCR反应：以上述步骤所提取的RNA为模板，使用PRRSV群通用型特异性引物和PRRSV群通用型特异性探针配制实时荧光定量RT-PCR反应体系进行PCR扩增，先于样品中筛选PRRSV；

S400、PRRSV变异株实时荧光定量RT-PCR反应：对上述PRRSV群通用型特异性引物和PRRSV群通用型特异性探针PCR扩增呈阳性的样品再使用PRRSV 变异株特异性引物和PRRSV 变异株特异性探针进行实时荧光定量RT-PCR反应，以检测是否是属于PRRSV 变异株病毒；

S500、根据PRRSV群实时荧光定量RT-PCR反应结果和PRRSV变异株实时荧光定量RT-PCR反应结果，鉴定诊断是否含有PRRSV或PRRSV变异株。

所述的实时荧光定量RT-PCR检测美洲型PRRSV及其变异株方法，其中，所述步骤S300中的实时荧光定量RT-PCR反应体系为25 μL，其中，每条PRRSV通用型特异性引物终浓度为0.4μmol/L，PRRSV通用型特异性探针浓度为0.2μmol/L； 

实时荧光定量RT-PCR反应条件为42℃ 30min，92℃ 2min，92℃ 10s，55℃ 30s，40个循环。

所述的实时荧光定量RT-PCR检测美洲型PRRSV及其变异株方法，其中，所述步骤S400中的实时荧光定量RT-PCR反应体系为25 μL，其中，每条PRRSV变异株特异性引物终浓度为0.4μmol/L，PRRSV变异株特异性探针浓度为0.2μmol/L； 

实时荧光定量RT-PCR反应条件为42℃ 30min，92℃ 2min，92℃ 10s，55℃ 30s，40个循环。

有益效果：本发明应用Lightcycler2.0荧光PCR仪建立了同时针对PRRSV M基因和NSP2基因的荧光RT-PCR方法，其中针对NSP2基因的诊断方法可区分美洲型PRRSV和PRRSV变异株（NSP2 1594-1680缺失），针对保守的M基因的引物设计策略，还可有效防止因NSP2区突变而造成的漏检。经过对本发明所建立的方法进行了特异性、灵敏度的验证，结果显示可以较好的将PRRSV同PRRSV变异株（NSP2 1594-1680缺失）以及猪类其他易感病毒区分开，且灵敏度可以达到0.47 TCID50。另外，本发明所建立的方法整个反应过程是闭管操作，在最大程度上减少了体系的污染。本发明在诊断时间上同传统方法相比自获得待检样品到提取核酸，配制荧光定量RT-PCR反应体系，直到出现反应结果，整个过程可以在2.5 h内完成，在保证检验结果的基础上大大缩短了检验所需时间。 

  

附图说明

图1是 PRRSV群实时荧光定量RT-PCR特异性扩增荧光曲线。 

图2 是PRRSV变异株实时荧光定量RT-PCR特异性扩增荧光曲线。 

图3 是PRRSV群特异性实时荧光定量RT-PCR检测的灵敏度曲线图，从左到右的曲线的稀释倍数依次是：10⁴、10³、10²、10。 

图4 是PRRSV变异株特异性实时荧光定量RT-PCR检测的灵敏度曲线图，从左到右的曲线的稀释倍数依次是：10⁴、10³、10²、10。 

图5是本发明实施例1中PRRSV群实时荧光定量RT-PCR反应结果图。 

图6是本发明实施例1中PRRSV变异株实时荧光定量RT-PCR反应结果图。 

  

具体实施方式

本发明提供一种实时荧光定量RT-PCR检测美洲型PRRSV及其变异株的方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。 

本发明的目的是提供一种实时荧光定量RT-PCR方法检测美洲型PRRSV及其变异株的方法。本发明方法的灵敏度经验证后可达到0.47 TCID50 。同时可以很好的将美洲型PRRSV及其变异株同猪类其他易感病毒区分开，证明特异性良好。在使用荧光PCR仪Lightcycler实施本发明方法操作简单，污染性小，灵敏快速，从获得模板至检测出结果只需70min，在保证对美洲型PRRSV及其变异株检测准确性的前提下大大缩短了检测时间。 

本发明的用于鉴别诊断美洲型PRRSV及其变异株实时荧光定量RT-PCR方法的确立过程如下： 

1、特异性引物、探针设计：在GenBank中下载多个美洲型PRRSV M基因序列和病毒变异株（NSP2 1594~1680缺失株）NSP2区域基因序列，用CLUSTAL X进行序列分析，找到保守片段用Primer Express 2.0进行特异性引物、探针设计。

2、特异性探针合成：由上海英骏生物技术有限公司合成。 

3、特异性探针处理：在特异性探针的5'端标记发光基团FAM，3'端标记泯灭基团TAMRA。     

4、PRRSV及其变异株、对照病毒核酸的提取：使用Mrcgene公司的TRIzol试剂对提取PRRSV弱毒疫苗株（Ch-1a株、ATCC VR-2332株）和变异PRRSV毒株（GDBY-3株、JX-A1株）、猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、日本乙型脑炎病毒等病毒RNA，使用OMEGA公司DNA提取试剂盒提取猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型基因组DNA，分别提取核酸，方法按照说明书进行。

5、RT-PCR扩增：以步骤4中提取的PRRSV及其变异株RNA为模板，使用TaKaRa公司的一步法RT-PCR试剂盒进行扩增，每条特异性引物的终浓度为0.2 μmol/L，反应条件为：50℃ 30 min，94℃ 2 min，94℃ 10s，58℃ 30s，72℃ 30 s，72℃ 7 min，设定为40个循环。电泳结束后取5 μL在1.5%琼脂糖凝胶电泳中检测扩增结果。 

6、目的基因的克隆、构建重组质粒：将步骤5中经RT-PCR扩增后检测到的目的条带胶回收，采用T-A克隆方案克隆至pMD18-T载体。使用QIAGEN公司的质粒DNA抽提纯化试剂盒抽提重组质粒，操作步骤按照说明书进行，重组质粒送广州英骏公司测序，测序鉴定后作为标准阳性品。 

7、实时荧光定量RT-PCR方法的建立：                       

（1）PRRSV群特异性试验：分别以PRRSV弱毒疫苗株（Ch-1a株、ATCC VR-2332株）、PRRSV变异株（GDBY-3株、JXA1株）、猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、日本乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型的核酸为模板做PRRSV群特异性荧光RT-PCR反应，同时用健康猪内脏组织提取的核酸作为阴性对照，使用PRRS V群通用型特异性引物、探针，检测群通用型特异性引物探针的特异性；反应体系使用深圳匹基公司的颗粒酶和珠海科登生物技术有限公司的TaqDNA聚合酶配制，每个反应使用1/4颗粒酶和2 U TaqDNA聚合酶。每条特异性引物终浓度为0.4 μmol/L，特异性探针浓度为0.2 μmol/L，加入DEPC H₂O将每个反应补足到25 μL。反应条件为42℃ 30min，92℃ 2 min，92℃ 10 s，55℃ 30 s，40个循环；PRRSV群特异性试验结果图见图1。

(2)PRRSV变异株特异性试验：分别以PRRSV弱毒疫苗株（Ch-1a株、ATCC VR-2332株）、PRRSV变异株（GDBY-3株、JXA1株）RNA为模板，使用PRRSV变异株特异性引物、探针，检测PRRSV变异株特异性引物探针的特异性，同时用健康猪内脏组织提取的核酸作为阴性对照。反应体系和反应条件同PRRSV群特异性试验。PRRSV变异株特异性试验结果见图2。 

(3)灵敏度试验：对GDBY-3（PRRSV变异毒株）分离株进行10倍倍比稀释，每个稀释度取200 μL提取病毒RNA为模板，配制反应体系在荧光PCR仪上检测进行敏感性试验，检测到的最低浓度作为该方法的灵敏度。PRRSV群特异性实时荧光定量RT-PCR检测的灵敏度试验结果见图3，PRRSV变异株特异性实时荧光RT-PCR检测的灵敏度试验结果见图4，从左到右的曲线稀释倍数依次是：10⁴、10³、10²、10。 

8、临床可疑样品检测：建立的两种荧光RT-PCR检测方法对24份临床可疑样品进行检测，包括猪肺、淋巴结、组织样品和血液。同时使用病毒分离方法进行检测。 

9、用于鉴别诊断美洲型PRRSV及其变异株荧光定量RT-PCR方法确立。 

本发明的用于鉴别诊断美洲型PRRSV及其变异株荧光定量RT-PCR方法具体步骤如下： 

S100、样品的预处理：对采集的样品分别编号进行编号，分别取少量的样品混合青、链霉素双抗溶液，匀浆，取上清，4℃过夜。

S200、RNA提取：使用Invitrogen 公司的TRIzol试剂对采集的样品提取RNA，操作步骤按试剂盒说明书进行。 

S300、PRRSV群实时荧光定量RT-PCR反应：以上述步骤所提取的RNA为模板，使用PRRSV群通用型特异性引物和PRRSV群通用型特异性探针配制实时荧光定量RT-PCR反应体系先于样品中筛选PRRSV。 

其中，PRRSV群通用型特异性引物：F：5’-GATTGCGGCAAATGATA ACCA-3’，R：5’-AACCCGGGCACCAATGT-3’；PRRSV群通用型特异性探针P：FAM-ATTTGTCGTCCGGCGTCCCG-TAMRA。 

反应体系使用深圳匹基公司的颗粒酶和珠海科登生物技术有限公司的TaqDNA聚合酶配制，每个反应使用1/4颗粒酶和2U TaqDNA聚合酶。每条特异性引物终浓度为0.4μmol/L，特异性探针浓度为0.2μmol/L，加入DEPC H₂O将每个反应补足到25 μL。反应条件为42℃ 30min，92℃ 2min，92℃ 10s，55℃ 30s，40个循环。 

S400、PRRSV变异株实时荧光定量RT-PCR反应：对上述PRRSV群通用型特异性引物、探针扩增呈阳性的样品再使用PRRSV 变异株特异性引物和PRRSV 变异株特异性探针进行实时荧光定量RT-PCR反应，以检测是否是属于PRRSV 变异株病毒。 

其中，PRRSV 变异株特异性引物序列：F：5’-CAGGATGAGCCTC TGGATTTG-3’，R：5’-CCTCCAGGATGCCCATGTT-3’；PRRSV 变异株特异性探针P：FAM-CGGAATATGAGGCTTTCCCCCTAGCA-TAMRA。 

PRRSV变异株实时荧光定量RT-PCR反应的反应体系和反应条件均与PRRSV群实时荧光定量RT-PCR反应相同。 

S500、根据PRRSV群实时荧光定量RT-PCR反应结果和PRRSV变异株实时荧光定量RT-PCR反应结果，鉴定诊断是否含有PRRSV或PRRSV变异株。 

实施例1 

为在一定程度上评估珠海市大型猪场的PRRSV流行情况，我中心实验室共采集了临床可疑样品24份。采用本发明中所建立的荧光定量RT-PCR方法鉴别诊断是否含有PRRSV或PRRSV变异株病毒。

1.样品的预处理：对采集的样品分别编号1-24。分别取少量的样品混合青、链霉素双抗溶液，匀浆，取上清，4℃过夜。 

2.RNA提取：使用Invitrogen 公司的TRIzol试剂对采集的样品提取RNA，操作步骤按试剂盒说明书进行。 

3.PRRSV群实时荧光定量RT-PCR反应：以上述步骤所提取的RNA为模板，使用PRRSV群通用型特异性引物和PRRSV群通用型特异性探针配制实时荧光定量RT-PCR反应体系先于样品中筛选PRRSV。PRRSV群通用型特异性引物序列为：F：5’-GATTGCGGCAAATGATAACCA-3’，R：5’-AACCCGGGCACC AATGT-3’；PRRSV群通用型特异性探针P：FAM-ATTTGTCGTCC GGCGTCCCG-TAMRA。反应体系使用深圳匹基公司的颗粒酶和珠海科登生物技术有限公司的TaqDNA聚合酶配制，每个反应使用1/4颗粒酶和2U TaqDNA聚合酶。每条特异性引物终浓度为0.4μmol/L，特异性探针浓度为0.2μmol/L，加入DEPC H₂O将每个反应体系补足到25 μL。反应条件为42℃ 30min，92℃ 2min，92℃ 10s，55℃ 30s，40个循环。 

1.PRRSV 变异株实时荧光定量RT-PCR反应：对上述PRRSV群通用型特异性引物和探针扩增呈阳性的样品，再使用PRRSV 变异株特异性引物、探针进行实时荧光定量RT-PCR反应，以检测是否是属于PRRSV 变异株病毒。PRRSV 变异株特异性引物序列：F：5’-CAGGATGAGCCTCTGGATTTG-3’，R：5’-CCTCCAGGATGC CCATGTT-3’；PRRSV 变异株特异性探针P：FAM-CGGAATATG AGGCTTTCCCCCTAGCA-TAMRA。反应体系和反应条件均同PRRSV实时荧光定量RT-PCR反应。 

2.结果：PRRSV实时荧光定量RT-PCR反应中出现21份阳性（21/24），PRRSV群实时荧光RT-PCR反应结果如图5所示；对这两份样品进一步以PRRSV变异株实时荧光定量RT-PCR反应确认，结果为全部为阳性（21/21），PRRSV变异株实时荧光定量RT-PCR反应结果如图6所示。 

3.病毒分离：按照常规病毒分理操作。 

结论：本发明中实时荧光定量RT-PCR方法结果同传统病毒分离结果一致。但是却大大缩短了检测时间，并且本发明方法操作简单，污染性小，又可以开展批量普查筛选，便于在实际临床中应用。 

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。 

<110>  珠海出入境检验检疫局

 

<120>  一种实时荧光定量RT-PCR检测美洲型PRRSV及其变异株的方法

 

<130>  20080502

 

<160>  6    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  21

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  PRRSV 群通用型特异性引物

 

<400>  1

gattgcggca aatgataacc a                                                 21

 

 

<210>  2

<211>  17

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  PRRSV 群通用型特异性引物

 

<400>  2

aacccgggca ccaatgt                                                      17

 

 

<210>  3

<211>  20

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  PRRSV 群通用型特异性探针序列

 

<400>  3

atttgtcgtc cggcgtcccg                                                   20

 

 

<210>  4

<211>  21

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  PRRSV变异株特异性引物

 

<400>  4

caggatgagc ctctggattt g                                                 21

 

 

<210>  5

<211>  19

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  PRRSV变异株特异性引物

 

<400>  5

cctccaggat gcccatgtt                                                    19

 

 

<210>  6

<211>  26

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  PRRSV变异株特异性探针序列

 

<400>  6

cggaatatga ggctttcccc ctagca                                            26

 

 

Claims (6)

1.一种用于实时荧光定量RT-PCR检测美洲型PRRSV及其变异株的特异性引物，其特征在于，PRRSV群通用型特异性引物序列如SEQ NO.1-2所示；PRRSV 变异株特异性引物序列如SEQ NO.4-5所示。

2.一种用于实时荧光定量RT-PCR检测美洲型PRRSV及其变异株的特异性探针，其特征在于，PRRSV群通用型特异性探针序列如SEQ NO.3所示；PRRSV 变异株特异性探针序列如SEQ NO.6所示。

3.根据权利要求2所述的用于实时荧光定量RT-PCR检测美洲型PRRSV及其变异株的特异性探针，其特征在于，所述PRRSV群通用型特异性探针和PRRSV 变异株特异性探针的5'端都标记发光基团FAM，3'端都标记泯灭基团TAMRA。

4.一种使用如权利要求1所述的特异性引物和如权利要求2所述的特异性探针的实时荧光定量RT-PCR检测美洲型PRRSV及其变异株方法，其特征在于，包括以下步骤：

S100、样品的预处理：对采集的样品分别编号进行编号，分别取少量的样品混合青、链霉素双抗溶液，匀浆，取上清，4℃过夜；

S200、RNA提取：对采集的样品提取RNA；

S300、PRRSV群实时荧光定量RT-PCR反应：以上述步骤所提取的RNA为模板，使用PRRSV群通用型特异性引物和PRRSV群通用型特异性探针配制实时荧光定量RT-PCR反应体系进行PCR扩增，先于样品中筛选PRRSV；

S400、PRRSV变异株实时荧光定量RT-PCR反应：对上述PRRSV通用型特异性引物和PRRSV通用型特异性探针PCR扩增呈阳性的样品，再使用PRRSV 变异株特异性引物和PRRSV 变异株特异性探针进行实时荧光定量RT-PCR反应，以检测是否是属于PRRSV 变异株病毒；

S500、根据PRRSV群实时荧光定量RT-PCR反应结果和PRRSV变异株实时荧光定量RT-PCR反应结果，鉴定诊断是否含有PRRSV或PRRSV变异株。

5.根据权利要求4所述的实时荧光定量RT-PCR检测美洲型PRRSV及其变异株方法，其特征在于，所述步骤S300中的实时荧光定量RT-PCR反应体系为25 μL，其中，每条PRRSV群通用型特异性引物终浓度为0.4μmol/L，PRRSV群通用型特异性探针浓度为0.2μmol/L；

实时荧光定量RT-PCR反应条件为42℃ 30min，92℃ 2min，92℃ 10s，55℃ 30s，40个循环。

6.根据权利要求4所述的实时荧光定量RT-PCR检测美洲型PRRSV及其变异株方法，其特征在于，所述步骤S400中的实时荧光定量RT-PCR反应体系为25 μL，其中，每条PRRSV变异株特异性引物终浓度为0.4μmol/L，PRRSV变异株特异性探针浓度为0.2μmol/L；

实时荧光定量RT-PCR反应条件为42℃ 30min，92℃ 2min，92℃ 10s，55℃ 30s，40个循环。

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