CN116064961A - 用于基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光rt-raa检测的产品和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学和病毒检测鉴定技术领域，具体为用于基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光RT‑RAA检测的产品和方法，该产品包括引物组和探针，所述引物组包括引物F1、引物F2、引物F3，所述引物F1的序列如SEQ ID No.1‑2所示，所述引物F2的序列如SEQ ID No.3‑4所示，所述引物F3的序列如SEQ ID No.5‑6所示，所述探针的序列包括FAM荧光基团、BHQ1淬灭基团和C3‑Spacer基团，利用所述引物组和所述探针进行扩增及实时荧光检测，在42℃恒温反应20min即可完成检测，结果不仅可通过荧光监测仪实时读取，还可通过便携式蓝光透射仪肉眼观察。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和病毒检测鉴定技术领域，具体涉及用于基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光RT-RAA检测的产品和方法。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV)隶属套式病毒目、动脉炎病毒科、动脉炎病毒属，为有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组长约15kb，由至少11个开放阅读框(open reading frame,ORF)和两端的非编码区(untranslated region,UTR)构成。PRRSV能够引起以母猪繁殖障碍、仔猪死亡率升高，以及各年龄段猪呼吸障碍为主要症状的猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive andrespiratory syndrome，PRRS)，自1987年在美国首次发现以来，该病毒迅速在世界范围内传播，给全球养猪业造成了巨大的经济损失。我国于1995年首次成功分离PRRSV，2006年爆发高致病性PRRSV(HP-PRRSV)，并很快成为主要流行株；2012年，我国发现与美国NADC30毒株高度同源的类NADC30毒株(NADC30-like PRRSV)，这些毒株致病性差异较大，并且自2016年以来逐渐超过HP-PRRSV成为我国当前主要流行株。PRRSV根据基因组差异可划分为基因1型(欧洲型)和基因2型(美洲型)，目前国内以基因2型为主，包括经典毒株(C-PRRSV)、HP-PRRSV、NADC30-like PRRSV、类NADC34毒株(NADC34-like PRRSV)等亚型。PRRSV易变异、重组，毒株众多，具有复杂的感染和免疫逃逸机制，现有疫苗保护效果欠佳，而且尚无有效的治疗药物，因此难以根除、净化，其防控须依靠疫苗免疫、早期监测、生物安全管理等综合措施，而快速、准确的检测对PRRS诊断和防控具有重要意义。
重组酶介导等温扩增(recombinase-aided isothermal amplification，RAA)是一种新型核酸扩增技术，其核心组分包括重组酶、单链结合蛋白(single-strand DNAbinding protein,SSB)和DNA聚合酶。RAA反应首先由重组酶结合引物形成复合物，并在双链DNA模板中寻找靶序列；待复合物定位靶序列后，引发链置换反应，引物结合到对应模板上，被替换的DNA链与SSB结合，形成稳定的D状环型(D-Loop)结构；最后，由DNA聚合酶从引物3’端启动DNA合成，对靶序列进行指数性扩增。逆转录-重组酶介导等温扩增(reversetranscription recombinase-aided isothermal amplification,RT-RAA)可实现对RNA核酸模板的扩增。该技术不需经历常规PCR的变性、退火、延伸程序，可在37-42℃恒温条件下于15-30min内完成扩增反应，扩增结果可通过琼脂糖凝胶电泳观察；在反应液中加入特制荧光探针后，还可通过荧光信号监测仪判读结果。鉴于该技术快速、简便，近年来被逐渐用于多种病毒的快速或现场检测，如新型冠状病毒、非洲猪瘟病毒、禽流感病毒等。
PRRSV的实验室常规检测方法主要包括病毒分离、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、间接免疫荧光(indirect immunofluorescenceassay,IFA)、RT-PCR、荧光定量RT-PCR等。RT-PCR、荧光RT-PCR这类核酸检测方法特异性强、灵敏度高，但需要昂贵的热循环扩增设备，并且时间较长(2-5h)，病毒分离和IFA方法须培养PAM或Marc-145细胞，耗时较长，并且有研究表明2016年以来许多PRRSV毒株不再适应PAM或Marc-145细胞；ELISA方法在PRRSV感染早期未产生抗体的阶段难以检出，而特异性引物和探针有助于快速检测，以上现有技术均未根据PRRSV的结构蛋白设计适合RT-RAA反应的专用引物和探针，因此，需设计PRRSV的荧光RT-RAA检测的特异性引物和探针。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了用于基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光RT-RAA检测的产品和方法。
用于基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光RT-RAA检测的产品，包括引物组和探针；
所述引物组包括引物F1、引物F2、引物F3，所述引物F1的序列如SEQ ID No.1-2所示，所述引物F2的序列如SEQ ID No.3-4所示，所述引物F3的序列如SEQ ID No.5-6所示；
所述探针的序列包括FAM荧光基团、BHQ1淬灭基团和C3-Spacer基团。
优选的，所述引物组为引物F1，所述引物F1的序列如SEQ ID No.1-2所示。
优选的，所述探针的序列如SEQ ID No.7所示。
用于基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光RT-RAA检测的方法，提取待测样品的RNA为模板，利用权利要求1所述的引物组和探针进行扩增、荧光检测。
优选的，所述的引物和探针的使用浓度均为10μM。
优选的，反应温度为42℃。
优选的，所述RT-RAA的反应体系为50.6μL，其中包括反应缓冲液29.4μL，10μM上游引物2μL，10μM下游引物2μL，10μM探针0.6μL，无菌水11.5μL，模板2μL，280mM醋酸镁2.5μL。
优选的，所述RT-RAA的反应条件为42℃反应20min。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：PRRSV ORF6基因负责编码囊膜蛋白M蛋白，是PRRSV的主要结构蛋白，编码序列保守度高，本发明根据PRRSV ORF6基因的保守序列，设计并筛选了用于基因2型PRRSV(PRRSV-2)荧光RT-RAA检测的特异性引物和探针，建立了PRRSV-2快速、可视化检测方法，该方法在42℃恒温反应20min即可完成检测，结果可通过荧光仪实时读取，或通过便携式蓝光透射仪肉眼观察，为PRRSV-2诊断提供了一种新的快速、可视化的检测方法。
PRRSV的实验室常规检测方法主要包括病毒分离、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、间接免疫荧光(indirect immunofluorescenceassay,IFA)、RT-PCR、荧光定量RT-PCR等。病毒分离和IFA方法须培养PAM或Marc-145细胞，耗时较长，并且有研究表明2016年以来许多PRRSV毒株不再适应PAM或Marc-145细胞；ELISA方法在PRRSV感染早期未产生抗体的阶段难以检出；RT-PCR、荧光RT-PCR这类核酸检测方法特异性强、灵敏度高，但需要昂贵的热循环扩增设备，并且时间较长(2-5h)。而本发明建立的荧光RT-RAA方法在42℃恒温反应20min即可完成检测，结果可通过荧光仪实时读取，或通过便携式蓝光透射仪肉眼观察，相比上述常规方法，具有操作简便、耗时短、便于现场或野外检测等优势。目前也有研究人员开发了同为恒温扩增的反转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)方法用于PRRSV-2检测，如王凯,杨飞,罗丽华,等.检测猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性和经典毒株可视化RT-LAMP方法的建立[J].中国兽医学报,2019,39(09):1660-1666+1673.在63℃恒温作用1h即可完成PRRSV-2特异性检测，相比而言，本发明的方法温度要求更低、时间更短，引物体系更简单(LAMP反应需要6条引物)。
本发明设计并筛选了用于PRRSV-2分子检测的特异性引物和探针，建立了PRRSV-2荧光RT-RAA快速、可视化检测方法，该方法在42℃恒温反应20min即可完成检测，结果不仅可通过荧光监测仪实时读取，还可通过便携式蓝光透射仪肉眼观察，不仅能够用于常规实验室PRRSV-2检测，也能满足资源贫乏的基层实验室或现场快速检测的需要；该方法灵敏度高，对ORF6基因标准质粒的最低检测限度为101copies/μL(荧光信号读取)和102copies/μL(肉眼观察)；特异性强，和常见的几种猪病病毒无交叉反应；检测结果具有较好的重复性和重现性；相比常规实验室检测方法，本发明提供的荧光RT-RAA具有操作简便、耗时短、便于现场或野外检测等优势，表现出较好的推广应用前景。
附图说明
图1为不同引物的RT-RAA扩增结果，其中M：DL2000 Plus DNA Marker；1、3、5：分别为引物ORF6 F1/R1、ORF6 F2/R2、ORF6 F3/R3的扩增产物；2、4、6：分别为3对引物的阴性对照；
图2为不同浓度引物/探针的扩增结果，其中曲线1-4：分别为引物/探针浓度为2.5μM、5μM、10μM、15μM的扩增结果；曲线5：阴性对照；
图3为不同温度下的荧光RT-RAA扩增结果，其中(A)为36℃，(B)为38℃，(C)为40℃，(D)为42℃；
图4为蓝光透射下的荧光RT-RAA反应结果，其中1-3：阳性反应的3个重复；4-6：阴性对照的3个重复；
图5为特异性试验结果，其中(A)为荧光信号读取结果；(B)为蓝光下的肉眼观察结果；第1-4号曲线或反应管：分别为PRRSV-2 VR-2332株、JS07株、JXA1株和SH1705株的检测结果；第5-10号曲线或反应管：分别为PRV、PEDV、PCV2、TGEV、PPV和阴性对照的检测结果；
图6灵敏度试验结果，其中(A)为荧光监测仪读取的荧光RT-RAA试验结果；(B)为蓝光下肉眼观察的荧光RT-RAA试验结果；C：RT-PCR试验结果。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例
1、引物设计
从NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中下载PRRSV-2不同毒株的ORF6基因序列，利用MegAlign软件进行序列分析，根据其保守区域设计3对特异性引物(表1)，交由上海生工生物工程有限公司合成。
表1 RT-RAA引物序列和探针序列
2、最佳引物筛选
根据RT-RAA(基础型)反应试剂盒(潍坊安普未来生物科技有限公司)操作说明，分别利用上述3对引物，在试剂盒提供的冻干酶粉反应管中配置反应体系，按以下加样次序进行：反应缓冲液29.4μL，如SEQ ID No.1-6所示的上、下游引物(10μM)各2μL，无菌水13.1μL；PRRSV JXA1株RNA模板1μL(阴性对照以无菌水代替)，醋酸镁(280mM)2.5μL。配置完成后将反应管上下颠倒8-10次，以混匀反应液，接着参考试剂盒推荐的反应条件，将反应管置于42℃水浴锅中恒温孵育20min。反应产物经DNA片段纯化试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)纯化后，进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，3对引物均能扩增出较亮的、预期大小的目的条带，分别为161、165、178bp，但是ORF6 F2/R2和ORF6 F3/R3均出现了非特异性杂带，而ORF6F1/R1未产生杂带，故将ORF6 F1/R1作为最佳引物对。
3、探针设计与合成
在最佳引物对ORF6 F1/R1之间设计长度为47bp的荧光探针，序列如SEQ ID No.7所示，具体序列为(5’-3’)：CGATTGCGGCAAATGATAACCACGCATTTG/i6FAMdT//THF/G/iBHQ1dT/CCGGCGTCCCGGCT(C3-Spacer)，其中第31个碱基(T)位置添加FAM荧光基团修饰，第32个碱基(C)位置插入THF位点、替换C碱基，第34个碱基(T)位置添加BHQ1淬灭基团修饰，引物3’端添加阻断基团C3-Spacer。设计完成后交由上海生工生物工程有限公司合成。
4、荧光RT-RAA引物/探针最佳工作浓度筛选
配置浓度为2.5μM、5μM、10μM、15μM的引物/探针，根据RT-RAA(荧光型)反应试剂盒(潍坊安普未来生物科技有限公司)操作说明，利用不同浓度的引物/探针，在试剂盒提供的冻干酶粉反应管中配置反应体系，按以下加样次序进行：反应缓冲液29.4μL，引物ORF 6F1、ORF6 R1各2μL，探针0.6μL，无菌水11.5μL，PRRSV JXA1株RNA模板2μL，醋酸镁(280mM)2.5μL。配置完成后将反应管上下颠倒8-10次，以混匀反应液，接着在WL-16-II恒温荧光检测仪(潍坊安普未来生物科技有限公司)中进行反应，反应条件为：42℃反应20min，每30s采集一次荧光信号。结果如图2所示，当引物/探针浓度为10μM或15μM时，荧光信号相似并且最强，考虑到经济成本，选择10μM作为引物和探针的最佳工作浓度。
5、荧光RT-RAA最佳反应温度筛选
在冻干酶粉反应管中配置反应体系，按以下加样次序进行：反应缓冲液29.4μL，引物ORF 6 F1(10μM)、ORF6 R1(10μM)各2μL，探针(10μM)0.6μL，无菌水11.5μL，PRRSV JXA1株RNA模板2μL，醋酸镁(280mM)2.5μL。配置完成后将反应管上下颠倒8-10次，以混匀反应液。接着在WL-16-II恒温荧光检测仪中进行反应，分别在38、40、42、44℃温度下反应20min，每30s采集一次荧光信号。结果如图3所示，当反应温度为42℃时，荧光信号最强，故将42℃作为最佳反应温度。
6、通过蓝光透射仪肉眼观察结果
在冻干酶粉反应管中配置反应体系，按以下加样次序进行：反应缓冲液29.4μL，引物ORF 6 F1(10μM)、ORF6 R1(10μM)各2μL，探针(10μM)0.6μL，无菌水11.5μL，PRRSV JXA1株RNA模板2μL(阴性对照以无菌水代替)，醋酸镁(280mM)2.5μL。配置完成后将反应管上下颠倒8-10次，以混匀反应液，将反应管在42℃水浴锅中恒温孵育20min，进行荧光RT-RAA反应，反应结束后，将反应管置于便携式蓝光透射仪(激发光波长为470nm，北京兰杰柯科技有限公司)，肉眼判读结果。结果如图4所示，阳性反应可见明显的绿色荧光，阴性对照无荧光。说明在不具备荧光监测仪的条件下，也可通过水浴锅和便携式蓝光透射仪开展PRRSV检测，为资源贫乏的基层实验室或现场快速检测提供了支持。
7、特异性试验
分别以PRRSV-2 JXA1株、VR-2332株、JS07株和SH1705株，以及猪伪狂犬病毒(PRV)Bartha-K61株、猪流行性腹泻病毒(PEDV)AJ1102株、猪圆环病毒2型(PCV2)DBN-SX07株、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)WH-1株、猪细小病毒(PPV)S-1株的核酸作为模板，配置反应体系后，通过WL-16-II恒温荧光监测仪进行荧光RT-RAA反应，读取荧光信号；此外，反应结束后，从荧光仪中取出反应管，置于便携式蓝光透射仪上，肉眼读取结果。结果如图5所示，4株PRRSV RNA作为模板时，均出现阳性荧光信号，而其他病毒核酸检测结果均为阴性；此外，蓝光透射下的肉眼读取结果同荧光监测结果一致，4株PRRSV RNA作为模板的反应可见明显的绿色荧光，其他病毒反应管无荧光。说明该方法和除PRRSV外的常见猪源病毒无交叉反应，特异性强。
8、灵敏度试验
以本实验室前期构建保存的不同浓度(分别为105、104、103、102、101、100copies/μL)的pUCm-ORF6质粒分别作为模板，按以下加样次序进行：反应缓冲液29.4μL，引物ORF 6F1(10μM)、ORF6 R1(10μM)各2μL，探针(10μM)0.6μL，无菌水11.5μL，模板2μL(阴性对照以无菌水代替)，醋酸镁(280mM)2.5μL。配置完成后将反应管上下颠倒8-10次，以混匀反应液，将反应管在42℃水浴锅中恒温孵育20min，进行荧光RT-RAA反应。此外，利用相同引物和模板，进行RT-PCR反应，比较二者灵敏度。RT-PCR根据试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)提供的操作说明进行，反应体系：2×Rapid Taq Master Mix 25.0μL，引物ORF 6 F1(10μM)、ORF6 R1(10μM)各2μL，模板2μL，无菌水19μL。反应程序为：95℃3min(预变性)；95℃15sec(变性)，58℃15sec(退火)，72℃5sec(延伸)，共30个循环；72℃5min(终末延伸)；4℃保温。反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳。荧光RT-RAA结果显示，通过荧光信号读取的最低检测限度为101copies/μL(图6A)，通过便携式蓝光透射仪肉眼观察结果的最低检测限度为102copies/μL(图6B)；RT-PCR检测的最低限度为103copies/μL(图6C)。说明荧光RT-RAA(荧光信号读取)检测灵敏度是RT-PCR方法的100倍，荧光RT-RAA(肉眼观察)检测灵敏度是RT-PCR方法的10倍，均高于RT-PCR方法。
9、重复性和重现性试验
分别以103、102、101copies/μL的pUCm-ORF6质粒作为模板，按以下加样次序进行：反应缓冲液29.4μL，引物ORF 6 F1(10μM)、ORF6 R1(10μM)各2μL，探针(10μM)0.6μL，无菌水12.1μL，模板2μL(阴性对照以无菌水代替)，醋酸镁(280mM)2.5μL。配置完成后将反应管上下颠倒8-10次，以混匀反应液，将反应管在42℃水浴锅中恒温孵育20min，进行荧光RT-RAA反应，每个浓度的模板在同一批次反应中做3个重复，反应完成后，记录每个结果的Ct值，计算平均值(Mean)、标准差(SD)和变异系数(Cv)，以评价该方法的组内重复性；此外，每间隔3天，对每个浓度的模板做1次荧光RT-RAA反应，重复3次，记录每个结果的Ct值，计算平均值(Mean)、标准差(SD)和变异系数(Cv)，以评价该方法的组间重现性。结果如表2所示，组内重复性的变异系数为3.66％-5.64％，组间重现性的变异系数为5.47％-6.51％，均低于10％，说明本发明建立的荧光RT-RAA方法具有较好的重复性和重现性。
表2荧光RT-RAA的重复性和重现性分析
临床检测性能评价
从江苏地区养殖场送检的87份疑似PRRSV感染的临床样品(肺、淋巴结、肝、肾、血清)中提取总RNA，通过RNAiso试剂盒(北京Takara生物科技有限公司)进行。利用本研究建立的方法进行荧光RT-RAA检测，在冻干酶粉反应管中配置反应体系，按以下加样次序进行：反应缓冲液29.4μL，引物ORF6F1(10μM)、ORF6 R1(10μM)各2μL，探针(10μM)0.6μL，无菌水12.1μL，样品RNA模板2μL，醋酸镁(280mM)2.5μL。配置完成后将反应管上下颠倒8-10次，以混匀反应液；接着在WL-16-II恒温荧光检测仪中进行反应，反应条件为：42℃反应20min，每30s采集一次荧光信号。反应结束后，将反应管置于便携式蓝光透射仪，肉眼判读结果。此外，利用商品化PRRSV-2荧光RT-PCR试剂盒，同时对87份样品进行荧光RT-PCR检测，将二者检测结果进行对比。结果如表3所示，在87份临床样品中，荧光RT-RAA(荧光信号读取)、荧光RT-RAA(肉眼观察)、荧光RT-PCR的阳性/阴性检测数量分别为46/41，44/43，46/41。其中，荧光RT-RAA(荧光信号读取)和荧光RT-PCR的检测结果完全一致，符合率为100％；荧光RT-RAA(肉眼观察)和荧光RT-PCR的检测结果符合率为97.7％。说明本发明建立的荧光RT-RAA方法能够用于PRRSV感染临床检测实践。
表3临床样品的检测结果
需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (8)
1.用于基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光RT-RAA检测的产品，其特征在于，包括引物组和探针；
所述引物组包括引物F1、引物F2或引物F3，所述引物F1的序列如SEQ ID No.1-2所示，所述引物F2的序列如SEQ ID No.3-4所示，所述引物F3的序列如SEQ ID No.5-6所示；
所述探针的序列包括FAM荧光基团、BHQ1淬灭基团和C3-Spacer基团。
2.根据权利要求1所述的产品，其特征在于，所述引物组为引物F1，所述引物F1的序列如SEQ ID No.1-2所示。
3.根据权利要求1所述的产品，其特征在于，所述探针的序列如SEQ ID No.7所示。
4.用于基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光RT-RAA检测的方法，其特征在于，提取待测样品的RNA为模板，利用权利要求1所述的引物组和探针进行扩增、荧光检测。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的引物和探针的使用浓度均为10μM。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，反应温度为42℃。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述RT-RAA的反应体系为50.0μL，其中包括反应缓冲液29.4μL，10μM上游引物2μL，10μM下游引物2μL，10μM探针0.6μL，无菌水11.5μL，模板2μL，280mM醋酸镁2.5μL。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述RT-RAA的反应条件为42℃反应20min。
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Citations (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005035794A2 (en) * | 2003-10-09 | 2005-04-21 | Tetracore, Inc. | Detection of prrsv |
| CN101343672A (zh) * | 2008-07-09 | 2009-01-14 | 中国农业大学 | 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒及其应用 |
| CN102220435A (zh) * | 2011-04-06 | 2011-10-19 | 珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 一种实时荧光定量rt-pcr检测美洲型prrsv及其变异株的方法 |
| CN102676691A (zh) * | 2011-10-31 | 2012-09-19 | 武汉大学 | H1n1、prrsv、o-fmdv四重检测试剂盒 |
| CN103276104A (zh) * | 2013-04-27 | 2013-09-04 | 华南农业大学 | 检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的rt-lamp核酸试纸条试剂盒及应用 |
| CN103509880A (zh) * | 2013-10-15 | 2014-01-15 | 江苏省农业科学院 | 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的lamp检测试剂盒 |
| CN106048083A (zh) * | 2016-05-27 | 2016-10-26 | 尹国友 | 一种猪繁殖与呼吸综合征的检测方法 |
| CN107236824A (zh) * | 2017-06-29 | 2017-10-10 | 新希望六和股份有限公司 | 一种用于猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性检测的荧光定量rt‑pcr试剂盒及应用 |
| CN110055352A (zh) * | 2019-02-26 | 2019-07-26 | 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 | 一种快速检测非洲猪瘟的试剂盒 |
| CN110358867A (zh) * | 2019-08-21 | 2019-10-22 | 郑州中道生物技术有限公司 | 非洲猪瘟病毒荧光型raa检测试剂盒 |
| CN111593139A (zh) * | 2020-05-13 | 2020-08-28 | 中国农业大学 | 检测猪瘟病毒的rt-raa引物、探针和试剂盒及应用 |
| CN113684318A (zh) * | 2021-09-16 | 2021-11-23 | 天津农学院 | 猪繁殖与呼吸综合征病毒m蛋白基因的荧光pcr检测试剂盒 |
| CN113930547A (zh) * | 2021-10-25 | 2022-01-14 | 华南农业大学 | 猪流行性腹泻病毒n基因的rt-raa荧光法检测引物对、试剂盒及检测方法 |
| CN115232888A (zh) * | 2022-07-20 | 2022-10-25 | 江苏农林职业技术学院 | 快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物、试剂盒及方法 |
| CN115261519A (zh) * | 2022-09-01 | 2022-11-01 | 广州海关技术中心 | 一种用于马病毒性动脉炎病毒核酸检测的rt-raa扩增引物探针、试剂盒和方法 |
-
2022
- 2022-11-14 CN CN202211431892.1A patent/CN116064961A/zh active Pending
Patent Citations (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005035794A2 (en) * | 2003-10-09 | 2005-04-21 | Tetracore, Inc. | Detection of prrsv |
| US20050170335A1 (en) * | 2003-10-09 | 2005-08-04 | Tetracore, Inc. | Detection of PRRSV |
| CN101343672A (zh) * | 2008-07-09 | 2009-01-14 | 中国农业大学 | 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒及其应用 |
| CN102220435A (zh) * | 2011-04-06 | 2011-10-19 | 珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 一种实时荧光定量rt-pcr检测美洲型prrsv及其变异株的方法 |
| CN102676691A (zh) * | 2011-10-31 | 2012-09-19 | 武汉大学 | H1n1、prrsv、o-fmdv四重检测试剂盒 |
| CN103276104A (zh) * | 2013-04-27 | 2013-09-04 | 华南农业大学 | 检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的rt-lamp核酸试纸条试剂盒及应用 |
| CN103509880A (zh) * | 2013-10-15 | 2014-01-15 | 江苏省农业科学院 | 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的lamp检测试剂盒 |
| CN106048083A (zh) * | 2016-05-27 | 2016-10-26 | 尹国友 | 一种猪繁殖与呼吸综合征的检测方法 |
| CN107236824A (zh) * | 2017-06-29 | 2017-10-10 | 新希望六和股份有限公司 | 一种用于猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性检测的荧光定量rt‑pcr试剂盒及应用 |
| CN110055352A (zh) * | 2019-02-26 | 2019-07-26 | 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 | 一种快速检测非洲猪瘟的试剂盒 |
| CN110358867A (zh) * | 2019-08-21 | 2019-10-22 | 郑州中道生物技术有限公司 | 非洲猪瘟病毒荧光型raa检测试剂盒 |
| CN111593139A (zh) * | 2020-05-13 | 2020-08-28 | 中国农业大学 | 检测猪瘟病毒的rt-raa引物、探针和试剂盒及应用 |
| CN113684318A (zh) * | 2021-09-16 | 2021-11-23 | 天津农学院 | 猪繁殖与呼吸综合征病毒m蛋白基因的荧光pcr检测试剂盒 |
| CN113930547A (zh) * | 2021-10-25 | 2022-01-14 | 华南农业大学 | 猪流行性腹泻病毒n基因的rt-raa荧光法检测引物对、试剂盒及检测方法 |
| CN115232888A (zh) * | 2022-07-20 | 2022-10-25 | 江苏农林职业技术学院 | 快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物、试剂盒及方法 |
| CN115261519A (zh) * | 2022-09-01 | 2022-11-01 | 广州海关技术中心 | 一种用于马病毒性动脉炎病毒核酸检测的rt-raa扩增引物探针、试剂盒和方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| TIAN XX等: "Rapid visual detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus via recombinase polymerase amplification combined with a lateral flow dipstick", 《ARCH VIROL》, vol. 167, no. 2, 7 January 2022 (2022-01-07), pages 493 - 499, XP037691900, DOI: 10.1007/s00705-021-05349-8 * |
| YANG Y等: "Rapid detection of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus by a fluorescent probe-based isothermal recombinase polymerase amplification assay", 《VIRUS GENES.》, vol. 52, no. 6, 17 August 2016 (2016-08-17), pages 883 - 886, XP036085830, DOI: 10.1007/s11262-016-1378-y * |
| 查帆等: "美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量PCR检测方法的建立", 《中国预防兽医学报》, vol. 44, no. 7, 31 July 2022 (2022-07-31), pages 731 - 736 * |
| 陈耀等: "反转录-重组酶介导等温扩增（RT-RAA）快速检测基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒", 《中国动物检疫》, vol. 40, no. 1, 31 January 2023 (2023-01-31), pages 121 - 127 * |
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