CN106048083A - 一种猪繁殖与呼吸综合征的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种猪繁殖与呼吸综合征的检测方法，所使用的套式PCR引物组，其引物的序列分别为SEQ ID NO:1‑4。本发明还提供一种检测检测猪繁殖与呼吸综合征的方法，包括1)样品核酸提取和2)套式PCR方法的建立等步骤。本发明方法使用套式PCR检测猪繁殖与呼吸综合征病毒，得到预期的目的条带，该方法重复性好，灵敏度高。
Description
技术领域
本发明属于兽医诊断技术领域，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征的检测方法。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是近年新发现的一种病毒性疾病。1987年首次暴发于美国，随后迅速传播到全球，给养猪业带来严重威胁，并成为当前危害养猪业最为严重的疾病之一。1996年郭宝清等首次报道我国大陆暴发该病并分离到PRRS病毒，该病在中国的流行和分布也日益广泛，危害日趋严重，对养猪业带来严重的经济损失。2007年我国从南到北爆发了高致病性猪生殖与呼吸综合征，给我国养猪业造成巨大经济损失，为了能快速准确检测该病毒的存在，开发使用套式PCR检测猪生殖与呼吸综合征。
目前，国内外已经建立的实验室检测方法有：病毒分离与鉴定、免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)、间接免疫荧光试验(IFA)、间接ELISA等。与常规PCR相比较，套式PCR具有更高的敏感性，可以检出极微量的病毒感染，本方法建立的猪繁殖与呼吸综合征病毒套式RT-PCR诊断技术，为兽医临床诊断猪繁殖与呼吸综合征提供一种快速、准确的方法，为开展大规模的猪繁殖与呼吸综合征流行病学调查与疫情监测提供技术依据。因此，研究开发猪繁殖与呼吸综合征的检测方法，已经是兽医诊断领域一个亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪繁殖与呼吸综合征的检测方法，从而弥补现有技术的不足。
本发明首先提供一种检测猪繁殖与呼吸综合征的套式PCR引物组，其引物的信息如下：
P1：5′—CAC TAC GGT CAA CGG CAC AT—3′(SEQ ID NO:1)、
P2：5′—CCA CAG TGT AAC TTA TCC TCC CT—3′(SEQ ID NO:2)、
P3：5′—AAA GCC TCG TGT TGG GT—3′(SEQ ID NO:3)、
P4：5′—TTG CCT CTG GAC TGG TTT—3′(SEQ ID NO:4)、
本发明还提供一种检测检测猪繁殖与呼吸综合征的方法，包括如下的步骤：
1)样品核酸提取
提取待检测的样品总RNA，溶于无RNA酶的纯净水中，-20℃保存备用；
2)套式PCR方法的建立
将提取的RNA样品作为一次RT模板，在离心管中加入5×Buffer 4μL,2.5mM的dNTPs 4μL,引物P2 1μL,Rnase Inhibitor 0.5μL,AMV反转录酶2μL,DEPC处理水加至20μL，混匀后瞬时离心，室温放置10min，置42℃水浴1h，再置冰上10min或更长时间备用；在PCR管内依次加入10×Buffer 2.5μL，2.5mM的dNTPs 2μL，引物P1、P2各0.5μL，rTaq 0.5μL，使反应体系达25μL；扩增时95℃预变性5min，94℃40s--56℃40s--72℃40s，共35个循环，最后72℃延伸10min；将第一次扩增的产物作为模板进行第二次PCR扩增，是在PCR管内加入10×Buffer 2.5μL，2.5mM dNTPs 2μL，引物P3、P4各0.5μL，rTaq 0.5μL，一扩产物1μL，灭菌三蒸水18μL；95℃预变性5min，94℃40s-51℃40s-72℃30s，共35个循环，最后72℃延伸10min；取6μL PCR产物加1μL上样液混匀后，加入1％琼脂糖凝胶板，100V电泳30min照相，判读试验结果。
本方法使用套式PCR检测猪繁殖与呼吸综合征病毒，得到预期的目的条带，本方法重复性好，灵敏度高。
附图说明
图1：PRRS株套式RT-PCR扩增结果图；
图2：PRRS株RT-PCR灵敏性扩增结果图；
图3：PRRS株RT-PCR特异性扩增结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的方法进行详细的描述
实施例1：引物的设计
参照PRRSV ATCC VR-2332株，运用primer5和Oligo 6.0软件设计针对保守区M蛋白基因序列的套式引物，P1、P2为外侧引物，目的片段长度为402bp(一扩产物)；p3、p4为内侧引物，目的片段长度为176bp(二扩产物)。由于PRRS病毒变异较大，不同时间和不同地域的基因序列存在变异，针对PRRS病毒难以检测的现状。本发明在对对猪繁殖与呼吸综合征病毒基因进行充分分析的基础上设计的套式PCR引物设计涵盖了PRRS病毒的保守区域M和N，而外侧引物能最大程度地检测PRRS不同变异毒株，且内侧引物能够保证检测的特异性。因为套式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性(因为与两套引物都互补的引物很少)增加了检测的敏感性；又有两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性。由于第二套引物位于第一轮PCR产物内部，而非目的片断包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物不可能扩增非目的片断，这种套式PCR扩增确保第二轮PCR产物几乎或者完全没有引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。两对引物的序列如下：
P1 5’—CAC TAC GGT CAA CGG CAC AT—3’
P2 5’—CCA CAG TGT AAC TTA TCC TCC CT—3’
P3 5’—AAA GCC TCG TGT TGG GT—3’
P4 5’—TTG CCT CTG GAC TGG TTT—3’
用两对引物对PRRSV MLV株进行一扩和二扩，结果均出现与预期一致的明显的目的条带(见图1)，一扩产物目的片段长度为402bp，二扩产物目的片段长度为176bp。
RT-PCR一扩未稀释模板、1:10、1:100稀释模板出现目的条带，1:1000、1:10000未出现，二扩PCR模板稀释未稀释模板、1:10、1:100、1:1000、1:10000均出现明显的目的条带，表明所建立的方法具有较强的灵敏性(见图2)。
对PRV、PCV-Ⅱ、CSFV以及未接种PRRSV的正常细胞培养液进行PCR操作，电泳检查结果阴性(见图3)，表明所建立方法的特异性好。
按同样的方法分别进行将提取的RNA样品在相同条件下，重复5次RT-PCR扩增，结果均能出现相同的检测结果。表明所建立的方法可重复性好。
针对PRRS病毒保守区域M、N，同样运用primer5和Oligo 6.0软件设计了如下几对引物，无论从检测的灵敏性、特异性和重复性上都不如套式PCR。
PRRSV 1F 5’-GCCTTGGCATTTGATTGTG-3’
1R 5’-CTGTTATGTTTACGGTTCCG-3’
2F 5’-GCTGGCCGGCTCTCTGTAAAG-3’
2R 5’-GAAATGTCTCGGCCGGTCG-3’
3F 5’-GCTGGCCGGCTCTGTAAAG-3’
3R 5’-GAAATGTCTCGGCCGGTCG-3’
4F 5’-GCTGGCCGGCTCTGTAAAG-3’
4R 5’-GAAATGTCTCGGCCGGTCG-3’；
上述其它的引物，不论从检测的灵敏度，还是特异性上都与本发明所提供的引物组具有明显的差异。
实施例2：样品的检测
1.病毒核酸提取
PRRSV的提取按TRIzolRegent使用说明书进行，总RNA溶于适量(20～40μL)无RNA酶水中，-20℃保存备用。
2、套式PCR方法的建立
将250μL提取的PRRSV RNA作为一次RT模板，在离心管中加入5×Buffer 4μL,dNTP(2.5mM)4μL,P2 1μL,Rnase Inhibitor 0.5μL,AMV反转录酶2μL,DEPC处理水加至20μL，混匀后瞬时离心，室温放置10min，置42℃水浴1h，再置冰上10min或更长时间备用。在PCR管内依次加入10×Buffer 2.5μL，dNTP(2.5mM)2μL，P1、P2各0.5μL，rTaq 0.5μL，cDNA分别用1μL、2μL、7μL做不同对比，灭菌三蒸水分别对应添加18μL、17μL、15μL,使反应体系达25μL。混匀后瞬时离心，进行扩增。95℃预变性5min，94℃40s--56℃40s--72℃40s，共35个循环，最后72℃延伸10min。取6μL PCR产物加1μL上样液混匀后，加入1％琼脂糖凝胶板，100V电泳30min后照相。二扩PCR，在PCR管内加入10×Buffer 2.5μL，dNTP(2.5mM)2μL，P3、P4各0.5μL，rTaq 0.5μL，一扩产物1μL，灭菌三蒸水18μL。95℃预变性5min，94℃40s-51℃40s-72℃30s，共35个循环，最后72℃延伸10min。取6μL PCR产物加1μL上样液混匀后，加入1％琼脂糖凝胶板，100V电泳30min照相，判读试验结果。
将250μL提取的PRRSV MLV RNA模板依次作1:10、1:100、1:1000、1:10000倍稀释，按上述方法做PCR一扩和二扩，验证上述方法敏感性。
将提取的PRRSV MLV RNA在相同条件下，重复进行5次以上检测，以验证该方法的可重复性。结果表明本发明的方法完全能够重复，与细胞培养检测的结果一致。
以上实施例仅用于说明本发明的优选实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在所述领域普通技术人员所具备的知识范围内，本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替代和改进等，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围之内。
Claims (5)
1.一种PCR引物组，其特征在于，所述的引物组，其引物的信息如下：
P1：5′—CAC TAC GGT CAA CGG CAC AT—3′、
P2：5′—CCA CAG TGT AAC TTA TCC TCC CT—3′、
P3：5′—AAA GCC TCG TGT TGG GT—3′、
P4：5′—TTG CCT CTG GAC TGG TTT—3′。
2.权利要求1所述的引物组在检测猪繁殖与呼吸综合征中的应用。
3.权利要求1所述的引物组在制备检测猪繁殖与呼吸综合征的制品中应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的制品为检测试剂盒。
5.一种检测检测猪繁殖与呼吸综合征的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：
1)样品核酸提取
提取待检测的样品总RNA，溶于无RNA酶的纯净水中，-20℃保存备用；
2)套式PCR方法的建立
将提取的RNA样品作为一次RT模板，在离心管中加入5×Buffer 4μL,2.5mM的dNTPs 4μL,权利要求1所述的引物P2 1μL,Rnase Inhibitor 0.5μL,AMV反转录酶2μL,DEPC处理水加至20μL，混匀后瞬时离心，室温放置10min，置42℃水浴1h，再置冰上10min或更长时间备用；在PCR管内依次加入10×Buffer2.5μL，2.5mM的dNTPs 2μL，引物P1、P2各0.5μL，rTaq 0.5μL，使反应体系达25μL；扩增时95℃预变性5min，94℃40s--56℃40s--72℃40s，共35个循环，最后72℃延伸10min；将第一次扩增的产物作为模板进行第二次PCR扩增，是在PCR管内加入10×Buffer 2.5μL，2.5mM dNTPs 2μL，引物P3、P4各0.5μL，rTaq 0.5μL，一扩产物1μL，灭菌三蒸水18μL；95℃预变性5min，94℃40s-51℃40s-72℃30s，共35个循环，最后72℃延伸10min；取6μL PCR产物加1μL上样液混匀后，加入1％琼脂糖凝胶板，100V电泳30min照相，判读试验结果。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116064961A (zh) * | 2022-11-14 | 2023-05-05 | 盐城师范学院 | 用于基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光rt-raa检测的产品和方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103627816A (zh) * | 2013-08-26 | 2014-03-12 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重rt-pcr检测试剂盒及其应用 |
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 张勇: "《生物样本库建设与实践》", 31 October 2013, 中山大学出版社 * |
| 李和平等: "三种猪繁殖障碍疾病的流行病学调查", 《中国农学通报》 * |
| 李和平等: "猪繁殖与呼吸综合征的套式PCR方法建立及应用", 《华北农学报》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116064961A (zh) * | 2022-11-14 | 2023-05-05 | 盐城师范学院 | 用于基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光rt-raa检测的产品和方法 |
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