CN102816847B - 用于检测布鲁氏菌的lamp引物及含有该引物的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于检测布鲁氏菌(Brucella)的LAMP引物及含有该引物的试剂盒，所述引物包括2条内引物(FIP、BIP)，2条外引物(F3、B3)和2条环引物（LB、LF）（如Seq ID No.1-6所示）。本发明将LAMP引物恒温扩增技术用于布鲁氏菌病菌的快速检测，可快速、准确、便捷地检测出血清标本中的布鲁氏菌。该方法的特异性和灵敏度均较常规PCR方法更高，对布鲁氏菌的早期预防、病原监测等方面具有重要意义；同时可以免除高昂的仪器投入，更适合用于布鲁氏菌病流调现场或基层卫生防疫。

Description

用于检测布鲁氏菌的LAMP引物及含有该引物的试剂盒

技术领域

本发明涉及布鲁氏菌的检测，具体地说，涉及用于检测布鲁氏菌的LAMP引物及含有该引物的试剂盒。

背景技术

布鲁氏菌（Brucella）是一种无芽孢、无鞭毛的对人畜有致病力的革兰阴性胞内寄生菌，是布鲁氏菌病（brucellosis，简称布病）的病原体。传统的布鲁氏菌种型包括羊种（3个型)、牛种(8个型)、猪种(5个型)、犬种（1个型）、绵羊附睾种（1个型）及沙林鼠种（1个型），共6个种19个型。感染人的布鲁氏菌种以前三种居多。布病患者有发热、多汗、肝脾肿大、关节和全身肌肉痛等症状；布病因误诊误治容易转为慢性期，慢性期布病病程长，易复发或发生再感染，可导致病人劳动力降低甚至丧失。动物感染后可导致流产、不孕、繁殖成活率下降等。在我国，布病被列为乙类传染病，羊种、牛种布鲁氏菌感染量居多，伴有猪种、犬种菌感染。诊断布病的金标准是分离培养布鲁氏菌，然而这种方法风险较大、耗时，阳性率仅为15％～70％。血清学方法虽然是目前国内最普遍的布病检测方法，但在布鲁氏菌感染早期没有抗体产生时，抗体检测方法受限，加之存在血清学交叉反应，所以仅靠血清学方法容易出现布病的误诊和漏诊。分子生物学方法特别是PCR技术能特异性地检测到布鲁氏菌核酸，而且该方法简单快速，将该技术用于布鲁氏菌的检测鉴定，可以提高布病临床诊断的准确性。然而采用常规PCR方法进行布鲁氏菌检测，对仪器设备（如PCR仪、凝胶成像系统）要求高，投入大，给技术的基层推广造成了极大障碍。

发明内容

本发明的目的是提供一种便于基层推广使用的，用于检测布鲁氏菌的LAMP引物及含有该引物的试剂盒。

为了实现本发明目的，本发明的一种用于检测布鲁氏菌（Brucella）的LAMP引物组，其包括：

外侧正向引物F3：5’-GAACGTGTTGGATTGACCT-3’；

外侧反向引物B3：5’-TGCTGTTGTCGATGCTATCG-3’；及

内侧正向引物FIP：5’-GCAGCCTATGATGCCGATCACTTGATCTGAGCCGTTGCCT-3’；

内侧反向引物BIP：5’-CCACACCCTTCAAGCCGGATAGCCGCTGCGAATAAAGCCAA-3’；以及

环引物LB：5’-AAGGCTTGAAGCTTGCGGA-3’；

环引物LF：5’-CCTTCATTGCCAGCAATCTCA-3’。

本发明还提供含有上述LAMP引物组的用于检测布鲁氏菌的试剂盒。

前述试剂盒中还包括dNTPs、Bst DNA聚合酶、甜菜碱、Mg²⁺、反应缓冲液中的一种或多种。

更优选地，前述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明进一步提供上述LAMP引物组或试剂盒在检测布鲁氏菌中的应用，包括步骤：1）提取样品中的DNA；2）以步骤1）中提取的DNA为模板，进行LAMP-PCR扩增反应；3）分析PCR产物，即对上述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳检测结果判定样品中是否含有布鲁氏菌。

其中，LAMP-PCR反应体系以25μl计为：

其中，10×NEB缓冲液的成分为：200mM Tris-HCl、100mM KCl、100mM(NH₄)₂SO₄、60mM MgSO₄和1%Tween 20，以水配制。

LAMP-PCR反应条件为：63℃ 50分钟，80℃ 5分钟，冰上终止反应。

用上述引物组对待测样品DNA进行恒温扩增，若电泳检测结果出现梯状DNA条带，则该样品含有布鲁氏菌病菌，若没有扩增出条带，则该样品中不含布鲁氏菌病菌。

本发明采用的环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermalamplification，LAMP），其作为一种新型的核酸扩增方法，摆脱了特殊扩增仪器和繁琐检测过程的约束，能在60~65℃左右利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶和4／6特异性引物（针对目的片段的6／8区域）对核酸进行高效扩增。与传统的PCR技术相比，LAMP技术的特异性和灵敏性都更胜一筹。其原理是60~65℃是双链DNA复性和延伸的最佳温度范围，在65℃左右DNA合成处于一种动态平衡状态，因此该温度下有新合成的DNA。LAMP技术依靠4种特异引物和一种活性较高的链置换DNA聚合酶（Bst DNA聚合酶），使链置换DNA反应处于一种动态循环中。扩增主要分为两个阶段，一是LAMP反应中起始结构的合成阶段，二是后续扩增循环阶段。任何引物与双链DNA中的任一条链进行碱基互补配对延伸时，另一条链就会解离成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合，在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链。FIP上的F1c与此单链上的Fl为互补结构。自我碱基配对形成环状结构。以此链为模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3’末端的Fl区段为起点．以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构，自此完成反应的第一阶段。第二阶段是扩增循环阶段，以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的B 1区段为起点，以自身为模板。进行DNA合成延伸及链置换。形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交。启动新一轮扩增。且产物DNA长度增加一倍。为增加灵敏性在反应体系中可以另外添加2条环状引物LF和LB，它们分别与茎环状结构结合启动链置换合成，反复循环。扩增的最后产物是包括不同数量茎环结构和长度各异DNA的混合物，且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。环介导等温扩增方法结果判定方法包括：①肉眼观察法：核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子和反应溶液中的子（Mg²⁺）结合，生成副产物焦磷酸镁白色沉淀物。依据此原理，通过肉眼观察副产物焦磷酸镁白色沉淀是否产生从而判断扩增是否发生。②荧光染料法：通过肉眼观察白色沉淀是否产生来判断扩增是否发生存在一定的视觉误差，而通过添加荧光染料例如SYBR Green I、溴化乙锭（EB）等进行呈色反应，结果更易判定。例如，SYBR Green I荧光染料特异性的与双链DNA的小沟结合后发出比原来强800~1000倍的荧光。在核酸大量合成时，SYBR Green I会自动掺入双链DNA中，如果发生扩增反应，反应结束时混合液由橙色变成绿色，并伴有白色沉淀的产生；反之，反应结束时颜色依然保持SYBR Green I的橙色不变。③琼脂糖凝胶电泳法：根据LAMP原理，LAMP反应的最终产物含有若干倍茎长度的茎环结构和类似花椰菜的结构。所以，产物在琼脂糖凝胶上电泳呈现的不是单一条带，而是典型的梯状条带。④浊度仪检测：利用日本荣研株式会社研制的针对LAMP的实时监控终点浊度仪对LAMP反应结束后生成的白色沉淀——副产物焦磷酸镁进行全程监控，不仅可以使扩增和检测一管一步完成，而且使扩增过程更加直观，可以对产物进行定量。

本发明将LAMP引物恒温扩增技术用于布鲁氏菌病菌的快速检测，可快速、准确、便捷地检测出血清标本中的布鲁氏菌。该方法的特异性和灵敏度均较常规PCR方法更高，对布鲁氏菌的早期预防、病原监测等方面具有重要意义；同时可以免除高昂的仪器投入，更适合用于布鲁氏菌病流调现场或基层卫生防疫。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

（一）所选靶序列使得检测更敏感，更特异。布鲁氏菌插入序列IS711在不同布鲁氏菌种型中有多个插入位点和不同的拷贝数，而且比较稳定。在布鲁氏菌主要流行菌种中，羊种布鲁氏菌、猪种布鲁氏菌均有7个完整的IS711拷贝，牛种菌有6个完整拷贝和1个不完整拷贝。而绵羊附睾种布鲁氏菌更有多达38个IS711拷贝。本发明选取该序列作为靶基因，不仅在目的序列的拷贝数上优于其它序列，而且序列中CG含量（50%以上）以及Tm值都非常适合LAMP的引物设计要求。通过对10倍梯度稀释的布鲁氏菌不同种型基因组DNA进行扩增，显示出灵敏度上的差异，其中对绵羊附睾种布鲁氏菌的灵敏度最低。

（二）反应时间更短。通过在LAMP体系中添加环引物，使反应时间缩短近半，反应最快在20min便能出现条带，而不加入环引物，反应时间至少需要30min。

（三）本发明构建的LAMP体系不仅可用于布鲁氏菌菌株检测，还可用于临床标本的早期检测。

（四）本发明提供的LAMP检测方法成本低、设备简单、使用方便，适合基层大规模的布病筛查工作。

附图说明

图1为本发明实施例2的向LAMP产物中加入SYBR Green I染料后肉眼观察结果；其中，1~6管为布鲁氏菌倍比稀释后扩增结果（呈绿色），7管为阴性对照（呈橙色）。

图2为本发明实施例3的LAMP法和常规PCR法的灵敏度检测电泳结果；其中，M为100bp DNA Marker；1~6分别为浓度范围100pg／μl-1fg／μl的l0倍梯度稀释质粒标准品扩增结果；N为空白对照；7~12分别为浓度范围100pg／μl-1fg／μl的常规PCR 10倍梯度稀释质粒标准品扩增结果。

图3为本发明实施例4的LAMP特异性电泳检测结果；其中，M为100bp DNA Marker；1~10分别对应的菌株为汉赛巴尔通体、霍乱弧菌、土拉弗朗西斯菌、大肠杆菌O:157、大肠杆菌O:16、小肠结肠耶尔森菌O:9、金黄葡萄球菌、布鲁氏菌544A、16M和1330S。

图4为本发明实施例4的布鲁氏菌6个种19个型标准菌株LAMP检测电泳结果；其中，M为100bp DNA Marker；1~19分别对应布鲁氏菌牛8个型，羊3个型，猪5个型，犬、绵羊附睾和沙林鼠各1个型。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（New York:Gold Spring Harbor Laboratory Press,1989）中所述的操作技术规程，或按照制造厂商所建议的实验条件。

实施例1用于检测布鲁氏菌的LAMP引物组的合成

在GenBank中选择布鲁氏菌（Brucella）特异性保守基因--插入序列IS711作为目的基因（GenBank中编号为DQ845343.1），根据第141080~141282位的序列通过在线工具http://primerexplorer.jp/e/V4设计、筛选并合成一套参数符合LAMP引物设计要求的引物。其中包括2条内引物(FIP、BIP)，2条外引物(F3、B3)和2条环引物（LB、LF）。序列见表1：

表1布鲁氏菌LAMP检测方法引物序列

实施例2LAMP反应体系的构建及反应参数的优化

1.1标准品的制备

用外引物（F3、B3）扩增羊种布鲁氏菌标准菌株16M（购自中国疾病预防控制中心传染病所布鲁氏菌菌种保存库）的DNA，经切胶回收后将目的片段连接到PUCm18-T载体（购自上海生工生物工程技术服务有限公司）上，制成质粒标准品。

1.2LAMP试验参数的优化

以阳性质粒标准品DNA为模板，分别对体系中Mg²⁺浓度、内外引物比例、Bst酶浓度、dNTP浓度、甜菜碱浓度、反应温度和反应时间进行优化后，确定最佳的LAMP反应参数。

1.3Mg²⁺浓度的优化

将浓度为100mM的MgSO₄按0、0.5μl、1.0μl、1.5μl、2.0μl、2.5μl的体积加到25μl的LAMP反应体系中，以出现最佳条带为依据确定最佳Mg²⁺浓度。

1.4引物浓度比例的优化

将外引物(F3／B3）和内引物(FIP／BIP)分别按1:4、1:5、1:6、1:7、1:8的比例加入到反应体系中，以出现最佳条带为依据确定最佳引物比例。

1.5Bst酶浓度的优化

分别将浓度为8U／μl的Bst酶按0、0.2μl、0.4μl、0.6μl、0.8μl、1.0μl的体积加入到体系中，以出现最佳条带而Bst酶用量最低为依据确定适宜的酶浓度。

1.6反应温度的优化

将配制好的LAMP体系分别置于60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃共六个温度条件下进行反应，以出现最佳条带为依据确定体系的最佳反应温度。

1.7反应时间的优化

将LAMP体系反应时间设为0、10min、20min、30min、40min、50min、60min共七个时间梯度，以出现条带早并且条带清晰为依据确定最佳反应时间。

1.8dNTP浓度的优化

将不同浓度的dNTP Mix 0、0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM分别加入到LAMP反应体系中，以出现最佳条带和dNTP用量最少为依据确定适宜dNTP浓度。

1.9甜菜碱浓度的优化

将浓度为100mM的甜菜碱按0、0.5μl、1.0μl、1.5μl、2.0μl、2.5μl、3.0μl的体积分别加到25μl的LAMP反应体系中，以出现最佳条带为依据确定最佳甜菜碱浓度。

1.10LAMP体系的确立

根据优化结果，最终LAMP体系为：外引物F3、B3各0.2μM，内引物FIP、BIP各1.6μM，环引物LF、LB各0.8μM，MgSO₄ 4.0mM，Betaine 4.0mM，dNTP Mix 1mM，NEB 1×缓冲液（20mM Tris-HCl,10mM KCl,10mM(NH₄)₂SO₄,6mM MgSO₄,0.1%Tween 20），8U BstDNA聚合酶，DNA模版1μl，ddH₂O补足至25μl；扩增参数为：63℃50min，80℃延伸5min。对LAMP产物可进行2%琼脂糖凝胶电泳成像或添加荧光染料后用肉眼直接观察。电泳结果以出现梯状DNA条带为阳性，而添加SYBR Green I染料后直接用肉眼观察绿色即为阳性，橙色为阴性（图1）。

实施例3利用LAMP引物组检测布鲁氏菌的灵敏度分析

将稀释成不同浓度梯度的质粒标准品分别加入到优化好的反应体系中，然后进行LAMP反应，将产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳并成像，以出现目的条带的质粒最高稀释度作为灵敏度的评价指标，确定LAMP方法的检测下限。

对10倍梯度稀释的布鲁氏菌质粒DNA标准品分别进行LAMP和常规PCR检测，结果表明LAMP最低可检测到10fg级别的布鲁氏菌质粒标准品，是常规PCR检测灵敏度（100fg级别）的10倍（图2）。

实施例4利用LAMP引物组检测布鲁氏菌的特异性分析

将与布鲁氏菌有血清学交叉反应或与布鲁氏菌种源相近的汉赛巴尔通体、霍乱弧菌、土拉弗朗西斯菌、大肠杆菌O:157、大肠杆菌O:16、小肠结肠耶尔森菌O:9、金黄葡萄球菌（这些菌株保存于中国疾病预防控制中心传染病所）作为样本，进行特异性检验，按照实施例2中优化好的LAMP反应体系进行扩增，结果显示除布鲁氏菌羊16M、牛544A、猪1330S布鲁氏菌标准株对照外，均没有扩增条带。鉴定布鲁氏菌标准株6个种19个型的菌株DNA均有典型的阳性扩增条带。（图3和图4）

实施例4利用LAMP引物组检测地方菌株和临床标本

分别对分离于不同年代和地域的已经用多种鉴定方法证实的100株布鲁氏菌地方菌株DNA、100份布病患者的血清DNA以及对照菌株或血清（确认为非布鲁氏菌病病人和健康人）DNA进行检测。在对布鲁氏菌菌株的检测中，LAMP方法（实施例2）、PCR方法以均与传统鉴定方法100%符合，在临床血清标本的检测中，两种方法的阳性检出率见表2(“+”代表阳性)，LAMP最高为89%，而常规PCR阳性检出率仅为62%。但对照菌株和血清均为布鲁氏菌检测阴性，符合率为100%。

表2地方菌株和临床标本检测结果

为快速、准确、便捷的检测和鉴定布鲁氏菌，本发明利用LAMP技术的原理，首次以布鲁氏菌多拷贝的插入序列IS711为靶基因设计引物，包括2条内引物(FIP、BIP)，2条外引物(F3、B3)和2条环引物（LB、LF）。用构建的质粒标准品对体系进行优化，确定该法的检测下限即灵敏度；将与布鲁氏菌有血清学交叉反应和种源相近的菌株DNA作为对照评价了该方法的特异性。并对病人血清进行了检测，这也是国内首次将血清标本用于布鲁氏菌的分子生物学方法检测。该法因不需要专用的设备仪器，更适合用于布鲁氏菌病流调现场或基层卫生防疫。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.用于检测布鲁氏菌（Brucella）的LAMP引物组，其特征在于，其包括：

外侧正向引物F3：5’-GAACGTGTTGGATTGACCT-3’；

外侧反向引物B3：5’-TGCTGTTGTCGATGCTATCG-3’；及

内侧正向引物FIP：5’-GCAGCCTATGATGCCGATCACTTGATCTGAGCCGTTGCCT-3；’

内侧反向引物BIP：5’-CCACACCCTTCAAGCCGGATAGCCGCTGCGAATAAAGCCAA-3’；以及

环引物LB：5’-AAGGCTTGAAGCTTGCGGA-3；’

环引物LF：5’-CCTTCATTGCCAGCAATCTCA-3’。

2.含有权利要求1所述LAMP引物组的用于检测布鲁氏菌的试剂盒。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Bst DNA聚合酶、甜菜碱、Mg²⁺、反应缓冲液中的一种或多种。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。