CN101736073B - 一种气单胞菌和嗜水气单胞菌双重pcr快速检测试剂盒和检测方法 - Google Patents

Abstract

一种气单胞菌和嗜水气单胞菌双重PCR快速检测试剂盒，包括：(1)DNA提取试剂：TE缓冲液，5-15mM Tris，0.5-1.5mM EDTA；10-20mg/mL溶菌酶水溶液；10-20mg/mL蛋白酶K水溶液；Tris饱和酚；2-5mol/L乙酸钠水溶液；95％乙醇；(2)PCR反应试剂管：PCR反应液49μL，包括10×PCR反应缓冲液5μL，dNTPs(10uM/L)0.5μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，特异性寡核苷酸引物引物1、引物2、引物3、引物4，用灭菌去离子水定容。一种气单胞菌和嗜水气单胞菌双重PCR快速检测方法：(1)DNA抽提，(2)PCR扩增反应，(3)被检测样品目的PCR扩增产物和电泳检验。本发明适用于水产生物致病菌的快速检测。

Description

一种气单胞菌和嗜水气单胞菌双重PCR快速检测试剂盒和检测方法

技术领域

本发明涉及靶DNA片断的检测技术，具体涉及一种气单胞菌和嗜水气单胞菌双重PCR快速检测试剂盒和检测方法。

背景技术

气单胞菌属(Aeromonas)细菌是常见的腐物寄生菌，在自然界分布很广，水和土壤中都有存在，在健康人的粪便中偶尔可以分离出，嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是该属的代表种。由气单胞菌引起的水产养殖动物疾病种类繁多，如鲢鳙腐皮病、草鱼出血性肠炎、异育银鲫溶血性腹水病、鲤鱼红斑病和竖鳞病、鳗鱼赤鳍病和鳖穿孔病等。自从1959年，中科院水生生物研究所发现气单胞菌能引起烂鳃病和赤皮病，直到八十年代中后期，气单胞菌病才在我国大面积流行。这些疾病的发生不仅给水产养殖业带来严重的经济损失，还可通过水产动物和水产品感染人畜，导致人畜腹泻和食物中毒，影响人类健康。特别是该菌属中的嗜水气单胞菌，是多种水产动物的主要致病菌，也是人-畜-水产动物共患病病原菌。因此，气单胞菌特别是嗜水气单胞菌已引起水产界、医学界和兽医学界的高度重视。传统的细菌鉴定方法主要是通过细菌生理生化特性进行分类，既费时，正确率又低。因此，本发明采用双重PCR技术，检测气单胞菌属共有的甘油磷脂胆固醇酰基转移酶基因(GCAT)保守区来鉴定气单胞菌，并同时检测嗜水气单胞菌的16SrDNA的保守区，来进一步鉴定嗜水气单胞菌，这在国内外尚无报道。该方法的建立为水产动物气单胞菌的快速诊断和病原调查提供技术支撑。

发明内容

为解决传统的细菌鉴定方法费时、准确率低的问题，本发明提供一种气单胞菌和嗜水气单胞菌双重PCR快速检测试剂盒和检测方法。运用双重PCR技术同时检测气单胞菌和嗜水气单胞菌的方法，提高了检测效率和检测的准确度，本发明通过分析特异性DNA检测气单胞菌和嗜水气单胞菌，不需要像生化鉴定那样进行多组实验，可大大节省时间、劳动力和检验成本，结果重现性好，检测精确。

本发明提供的气单胞菌和嗜水气单胞菌双重PCR快速检测试剂盒，其特殊之处是包括：

1)DNA提取试剂：TE缓冲液(5-15mM Tris，0.5-1.5mM EDTA，pH8.0)；溶菌酶水溶液(浓度10-20mg/mL，pH8.0)；蛋白酶K水溶液(浓度10-20mg/mL，pH8.0)；Tris饱和酚(pH8.0)；乙酸钠水溶液(浓度2-5mol/1)；乙醇(浓度95％)；

2)PCR试剂管成分为：PCR反应液，49μL，包括10×PCR反应缓冲液5μL；dNTPs(10uM/L)0.5μL；Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL；特异性寡核苷酸引物：引物1、引物2、引物3、引物4；用灭菌去离子水定容；

所述的特异性寡核苷酸引物包括下述的特异性寡核苷酸引物与该特异性寡核苷酸引物互补的寡核苷酸序列，特异性寡核苷酸引物与该特异性寡核苷酸引物互补的寡核苷酸序列的差别不大于八个碱基，所述引物为：

引物1：5′TCCCAAGTATCAGGTCATCAACA3′，

引物2：5′GAGGCAAACGGCTTCCACA3′，

引物3：5′AGGTTGATGCCTAATACGTA3′，

引物4：5′CGTGCTGGCAACAAAGGACAG3′，

所述引物1、引物2为所述气单胞菌GCAT基因保守区的引物，引物3、引物4为所述嗜水气单胞菌16S rDNA保守区的引物，

其中引物1、引物2浓度为200nmol/L，引物3、引物4浓度为40nmol/L。

本发明一种气单胞菌和嗜水气单胞菌双重PCR快速检测方法，为使用气单胞菌和嗜水气单胞菌双重PCR快速检测试剂盒的检测方法，其程序如下：

一)DNA抽提

挑取纯化的菌落若干加入到pH8.0的100μL所述TE缓冲液中振荡混匀，加入100μL所述溶菌酶溶液，37℃保温10分钟，再加所述蛋白酶K溶液10μL于55℃保温1-2小时，加250μL所述Tris饱和酚，强烈振荡，12000rpm离心5分钟，取上清液，重复酚抽提，取上清液，加入该上清液的0.1倍体积的乙酸钠水溶液(3mol/L)，混匀，再加等体积的冰乙醇，混匀后低温静置30分钟，12000rpm离心5分钟，弃上清，加70％冷乙醇洗涤一次，室温下12000rpm离心5分钟，弃上清，加入50μL所述TE溶液，置-20℃保存；

二)双重PCR扩增

1)在PCR反应试剂管中加入提取的DNA样品1μL，混匀。

2)PCR方法中扩增程序

(1)95℃     4分钟

(2)94℃     50秒

(3)54℃     50秒

(4)72℃     50秒

(5)回到第2步，重复30次

(6)72℃     8分钟

三)被检测样品目的PCR扩增和电泳检验

PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳后用溴化乙锭染色。电泳结果在紫外分析仪下观察，如果发现有特异性扩增产生的DNA片段，471bp的特异片段，说明样品有气单胞菌属的细菌，同时有683bp的特异片段，说明样品有嗜水气单胞菌，反之则没有。

本发明利用气单胞菌属的特异性基因和嗜水气单胞菌的保守基因，使用两对特异性引物通过PCR方法产生多个特异性片段，在已试验的18种不同种或同种的细菌进行了双重PCR反应，结果都符合预期。

本发明与现有技术相比的优点在于：基于DNA的鉴定方法适用于直接从患病水产动物含菌体液、组织等临床样品中直接运用双重PCR方法扩增多个特异性靶基因，从而检测气单胞菌和嗜水气单胞菌。PCR方法具有检测准确、特异性强的特点，可以快速、准确地鉴定特异的目标细菌。首先，它用双重PCR的方法扩增细菌多个特异性靶基因，避免了反复培养，冗长的一系列生化反应，节约时间，劳动力和成本；PCR鉴定方法不受培养条件和细菌生理状态的影响，较生理生化鉴定方法更为准确；能够排除一些生理生化鉴定方法不能排除的干扰菌。

附图说明

图1为引物特异性测试图；

图2为嗜水气单胞菌感染的疾病的本发明检测成像结果照片。

图1中：

M.DL2000 DNA Marker；1.嗜水气单胞菌ATCC7966；2.嗜水气单胞菌BSK-10；3.嗜水气单胞菌TPS-30；4.嗜水气单胞菌PPL0711；5.嗜水气单胞菌BJK0805；6.温和气单胞菌ATCC43979；7.豚鼠气单胞菌ATCC15468；8.兽生气单胞菌ATCC51108；9.异嗜糖气单胞菌ATCC51208；10.中间气单胞菌ATCC33907；11.嗜泉气单胞菌ATCC23309；12.小鱼气单胞菌ATCC49904；13.大肠杆菌ATCC25922；14.金黄色葡萄球菌ATCC25923；15.铜绿假单胞菌ATCC27853；16.哈维氏弧菌ATCC33842；17.副溶血弧菌ATCC33847；18.A溶藻弧菌TCC17749；19.阴性对照

图2中：

M.DL2000 DNA Marker；1.嗜水气单胞菌感染样品；2.气单胞菌感染样品；3.嗜水气单胞菌感染样品；4.气单胞菌感染样品；5.阴性对照

具体实施方式

实施例1：各种细菌纯培养物

一)DNA抽提

挑取疑似菌落加入到0.4mL TE缓冲液(pH8.0)中振荡混匀。加入100μL溶菌酶溶液，37℃保温10分钟，再加蛋白酶K溶液10μL于55℃保温1-2小时，加同体积Tris饱和酚(pH8.0)，强烈振荡，11000g离心3分钟，取上清液，重复酚抽提；取上清液，加入0.1倍体积的乙酸钠(3mol/L)，混匀，再加等体积的冰乙醇，混匀后低温静置30分钟，15000g离心5分钟，弃上清，加70％冷乙醇洗涤一次，室温下15000g离心5分钟，弃上清，加入50μL TE溶液，置-20℃保存。

二)双重PCR扩增

在PCR试剂管内加入：

1)PCR反应混合物成分，体系均为50μL体系

成分体系中各组分最终浓度

PCR缓冲液10mM Tris-HCl，50mM KCl

MgCl2                  2.5mmol/L

Taq DNA聚合酶1.5u

引物1                  200nmol/L

引物2                  200nmol/L

引物3                  40nmol/L

引物4                  40nmol/L

dNTPs每种100nmol/L

DNA样品50ng

双蒸水35.3μL

2)PCR方法中扩增程序

(1)95℃     4分钟

(2)94℃     50秒

(3)54℃     50秒

(4)72℃     50秒

(5)回到第2步，重复30次

(6)72℃     8分钟

(7)4℃      5分钟。

三)被检测样品目的PCR扩增和电泳检验

PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳后用溴化乙锭染色。电泳结果在紫外分析仪下观察，可发现有特异性扩增产生的DNA片段，471bp的特异片段，说明样品有气单胞菌属的细菌，同时有683bp的特异片段，说明样品有嗜水气单胞菌。

图1引物特异性测试图(气单胞菌属的多个种的细菌，以及以常见病原细菌的纯培养物DNA作为阴性对照，没有发现非特异性扩增)。

M.DL2000 DNA Marker；1.嗜水气单胞菌ATCC7966；2.嗜水气单胞菌BSK-10；3.嗜水气单胞菌TPS-30；4.嗜水气单胞菌PPL0711；5.嗜水气单胞菌BJK0805；6.温和气单胞菌ATCC43979；7.豚鼠气单胞菌ATCC15468；8.兽生气单胞菌ATCC51108；9.异嗜糖气单胞菌ATCC51208；10.中间气单胞菌ATCC33907；11.嗜泉气单胞菌ATCC23309；12.小鱼气单胞菌ATCC49904；13.大肠杆菌ATCC25922；14.金黄色葡萄球菌ATCC25923；15.铜绿假单胞菌ATCC27853；16.哈维氏弧菌ATCC33842；17.副溶血弧菌ATCC33847；18.A溶藻弧菌TCC17749；19.阴性对照

实施例2：临床病样的检测

一)DNA抽提

挑取疑似菌落加入到0.4mL TE缓冲液(pH8.0)中振荡混匀。加入100μL溶菌酶溶液，37℃保温10分钟，再加蛋白酶K溶液10μL于55℃保温1-2小时，加同体积Tris饱和酚(pH8.0)，强烈振荡，11000g离心3分钟，取上清液，重复酚抽提；取上清液，加入0.1倍体积的乙酸钠(3mol/L)，混匀，再加等体积的冰乙醇，混匀后低温静置30分钟，15000g离心5分钟，弃上清，加70％冷乙醇洗涤一次，室温下15000g离心5分钟，弃上清，加入50μL TE溶液，置-20℃保存。

二)双重PCR扩增

在PCR试剂管内加入：

1)PCR反应混合物成分，体系均为50μL体系

成分体系中各组分最终浓度

PCR缓冲液10mM Tris-HCl，50mM KCl

MgCl2                 2.5mmol/L

Taq DNA聚合酶1.5u

引物1                 200nmol/L

引物2                 200nmol/L

引物3                 40nmol/L

引物4                 40nmol/L

dNTPs每种100nmol/L

DNA样品50ng

双蒸水35.3μL

2)PCR方法中扩增程序

(1)95℃     4分钟

(2)94℃     50秒

(3)54℃     50秒

(4)72℃     50秒

(5)回到第2步，重复30次

(6)72℃     8分钟

(7)4℃      5分钟。

三)被检测样品目的PCR扩增和电泳检验

PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳后用溴化乙锭染色。电泳结果在紫外分析仪下观察，发现样品1和3有471bp和683bp两个，说明样品1和样品3中有嗜水气单胞菌感染；样品2和样品4都只有471bp的特异性条带，说明样品2和样品3中有气单胞菌属的细菌感染；而样品5没有扩增带，说明没有气单胞菌感染。

Claims (1)

1.一种气单胞菌和嗜水气单胞菌双重PCR快速检测试剂盒，其特征是它包括：

(1)DNA提取试剂：成分为5-15mM Tris、0.5-1.5mM EDTA的pH 8.0的TE缓冲液；溶菌酶水溶液，浓度10-20mg/mL，pH8.0；蛋白酶K水溶液，浓度10-20mg/mL，pH8.0；Tris饱和酚，pH8.0；乙酸钠水溶液，浓度2-5mol/L；乙醇，浓度95％；

(2)PCR反应试剂管：PCR反应液，49μL，包括10×PCR反应缓冲液5μL，浓度为10μM的dNTPs 0.5μL；浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶0.5μL；特异性寡核苷酸引物引物1、引物2、引物3、引物4，用灭菌去离子水定容，

所述引物1、引物2为所述气单胞菌GCAT基因保守区的引物，引物3、引物4为所述嗜水气单胞菌16S rDNA保守区的引物，其中，

引物1：5’-TCCCAAGTATCAGGTCATCAACA-3’，

引物2：5’-GAGGCAAACGGCTTCCACA-3’，

引物3：5’-AGGTTGATGCCTAATACGTA-3’，

引物4：5’-CGTGCTGGCAACAAAGGACAG-3’，

其中引物1、引物2浓度为200nmol/L，引物3、引物4浓度为40nmol/L。

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