CN102925578B - 一种气单胞菌属细菌的检测试剂盒和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种气单胞菌属细菌的检测试剂盒，包含序列如SEQ IDNO：1~2所示的引物对1，扩增来自气单胞菌属细菌的基因。本发明还公开了一种气单胞菌属细菌的检测方法。本发明检测试剂盒和检测方法可以准确、有效的检测气单胞菌属细菌，且特异性强、灵敏度高、耗时短，检测快速，可以用于养殖水体的快速检测和预测，预防鱼病的发生，提高经济效益。

Description

一种气单胞菌属细菌的检测试剂盒和检测方法

技术领域

本发明涉及一种细菌的检测技术，特别是气单胞菌属细菌的检测试剂盒和检测方法。 

背景技术

随着现代分子遗传学的发展，气单胞菌属(Aeromonas)到目前已扩展到包括嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophil)、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)、 

温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、中间气单胞菌(Aeromonas media)、维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)、简氏气单胞菌(Aeromonas jandaei)等l4个气单胞菌表型种和16个基因种，其模式种为嗜水气单胞菌，豚鼠气单胞菌是极常见的气单胞菌。 

气单胞菌属细菌在临床和环境中都分布很广，水、土壤、空气中都有分布。由气单胞菌属细菌引起的水产养殖动物疾病种类繁多，不仅给水产养殖业带来严重的经济损失，还可通过水产动物和水产品感染人畜，导致人畜腹泻和食物中毒，影响人类健康。因此，建立气单胞菌属细菌的检测方法，对于监控该属病原的繁殖、疾病发生和流行以及疾病的及时防治都具有十分重要的意义。 

传统的生理生化检测方法可以准确鉴定待检菌株，但是操作复杂，成本高，耗时长。潘晓艺等，“气单胞菌和嗜水气单胞菌双重PCR检测方法的建立”，华中农业大学学报，2011,30(6):759-763.公开的PCR检测可以克服生理生化检测方法的缺陷，但该方法没有提供可供参考和借鉴的检测灵敏度，所使用的两对引物其检测灵敏度是否一致也不能被证明，因此在病原诊断和疾病流行学研究方面存在缺陷。 

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的气单胞菌属细菌的检测试剂盒和检测方法。 

本发明气单胞菌属细菌的检测试剂盒，包含序列如SEQ ID NO：1~2所示的引物对1，扩增来自气单胞菌属细菌的基因。 

本发明气单胞菌属细菌的检测方法，包括如下步骤： 

a，提取样本DNA：提取待检样本中的DNA； 

b，基因扩增：用权利要求1所述的试剂盒对待检样本中的DNA进行扩增； 

c，结果检测：对DNA扩增结果进行检测。 

其中，步骤a所述的样本为养殖水体。 

本发明还提供了SEQ ID NO：1～2所示的寡核苷酸序列的用途，其用于扩增或检测来自气单胞菌属细菌的基因。 

本发明提供的试剂盒和方法可以扩增气单胞菌属细菌的甘油磷脂胆固醇酰基转移酶基因的基因片段，特异性强、灵敏度高、耗时短，用于快速检测养殖水体，可及时有效地预防鱼病的发生，具有良好的应用前景。 

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明权利要求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。 

附图说明

图1本发明引物扩增气单胞菌的电泳图谱。1：空白对照；2：嗜水气单胞菌；3：豚鼠气单胞菌；M：DNA maker I； 

图216S rDNA特异性引物扩增结果图谱。M:DNAmaker I；1:60℃；2:65℃；3:68℃；4：空白对照； 

图3特异性检测结果。0：空白对照；1：无乳链球菌；2：蜡状芽孢杆菌；3：荧光假单胞菌；4：海豚链球菌；5：爱德华氏菌；6：DNAmaker I；7：柱状黄杆菌；8：鼠伤寒沙门氏菌；9：河流弧菌；10：粪肠球菌；11：金黄色葡萄球菌；12：嗜水气单胞菌；13：豚鼠气单胞菌； 

图4实际样品的检测。1：阳性对照；2：阴性对照；3：水样；4：尾鳍；5：鳃；6-7：患病组织块；M：DNA maker I； 

图5患病组织的扩增产物测序图。 

具体实施方式

一、实验材料和仪器 

1、试验菌株 

试验菌种表 

2、主要试剂和器材 

1、器材：常规PCR仪(Bio-Rad)、电泳仪(Bio-Rad)、凝胶成像系统 

(Bio-Rad)、生物安全柜(海尔)、离心机(科大中佳)、移液器(Eppendorf)；吸头、离心管； 

2、引物BHI、NB、细菌基因组DNA提取试剂盒、2×PCR mix。 

实施例1引物设计 

一、实验方法 

1、PCR引物设计与合成 

根据经验，以气单胞菌属共有的甘油磷脂胆固醇酰基转移酶基因(基因号：HM245310.1、HM245308.1、GQ856318.1、CP000644.1、AF268080.1)和16s rRNA(基因号：HM245310.1、HM245308.1、GQ856318.1、CP000644.1、AF268080.1)分别设计两对引物，经Blast比对后送上海生工合成。 

表1PCR引物资料 

2、模板制备 

将-20℃保存的嗜水气单胞菌TW-YYS-26和豚鼠气单胞菌ATCC15468划线接种于LB固体培养基平板，28℃培养，长出单菌落后挑取单菌落接种至LB液体培养基，28℃摇床培养过夜，以活化细菌。取细菌培养液，使用基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN）提取DNA，作为PCR检测模板。 

3、PCR扩增 

分别以步骤2提取的嗜水气单胞菌基因组DNA和豚鼠气单胞菌基因组DNA作为模板，阴性对照的模板为ddH₂O，取步骤1中的两对引物按照下列体系和程序分别扩增： 

PCR反应体系(20μl)： 

PCR反应程序： 

4、结果检测 

取5μL扩增产物，采用1%的琼脂糖凝胶，在恒压80V条件下电泳60min，置于凝胶成像系统下观察PCR扩增结果。 

二、结果 

引物对F1/R1的实验结果如图1所示，空白对照无扩增条带，而气单胞菌属的模式种嗜水气单胞菌，以及气单胞菌属的常见种豚鼠气单胞菌都能扩增出长度为269bp的PCR产物。如图2所示，引物对F2/R2有多个非特异性产物生成，即使提高退火温度，问题依然存在。 

实验证明，本发明引物对1：F1/R1可以准确扩增气单胞菌属细菌的基因。 

实施例2引物特异性试验 

一、试验方法 

1、PCR引物 

取实施例1中的引物对1。 

2、模板制备： 

试验前用培养基分别活化表1所示细菌。细菌活化后，根据细菌基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN）操作说明书提取DNA，作为PCR检测模板。 

3、PCR扩增 

分别取步骤2得到的基因组DNA作模板，阴性对照的模板为ddH₂O，按照实施例1中扩增程序进行扩增。 

4、结果检测 

取5μL扩增产物，采用1%的琼脂糖凝胶，在恒压80V条件下电泳60min，置于凝胶成像系统下观察PCR扩增结果。 

二、结果 

结果如图2所示，仅气单胞菌属的嗜水气单胞菌和豚鼠气单胞菌出现目标条带，大小为269bp，而其他菌株和阴性对照均未扩增得到任何条带。 

实验证明本发明提供的检测方法特异性强，可以准确地将气单胞菌属细菌与其他细菌区别开。 

实施例3引物灵敏度试验 

一、试验方法 

1、PCR引物 

取实施例1中的引物对1。 

2、模板制备： 

用培养基分别活化嗜水气单胞菌TW-YYS-26、豚鼠气单胞菌ATCC15468。细菌活化后，根据细菌基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN）操作说明书提取DNA； 

测定DNA样品的浓度，并对DNA样品依次按照10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9进行梯度稀释。 

3、PCR扩增 

取梯度稀释的嗜水气单胞菌和豚鼠气单胞菌基因组DNA作模板，按照实施例1中扩增程序进行扩增。 

4、结果检测 

取5μL扩增产物，采用1%的琼脂糖凝胶，在恒压80V条件下电泳60min，置于凝胶成像系统下观察PCR扩增结果。 

二、结果 

嗜水气单胞菌和豚鼠气单胞菌的DNA浓度测定结果均为66μg/μl，并按照66×10^-1μg/μl、66×10^-2μg/μl、66×10^-3μg/μl、66×10^-4μg/μl、66×10^-5μg/μl、66×10^-6μg/μl、66×10^-7μg/μl、66×10^-8μg/μl、66×10^-9μg/μl依次进行梯度稀释。 

结果如图3所示，模板浓度为66×10^-6μg/μl时能出现清晰条带，模板浓度小于66×10^-6μg/μl时无条带出现，因此准确检测嗜水气单胞菌和豚鼠气单 胞菌的最低模板浓度为66×10^-6μg/μl，使用本发明提供的试剂盒检测待检样本，可准确检测气单胞菌属细菌DNA不低于66×10^-6μg/μl的待检样本。 

实验证明本发明气单胞菌属细菌检测方法的灵敏度高。 

实施例4组织及水样中气单胞菌属细菌的检测 

一、实验方法 

待检样本：取出患病死亡的鲤鱼，在患病溃烂处挑取组织块2份以及尾鳍、鳃，同时取患病鱼的养殖水体。组织块、尾鳍及鳃置于已加有200μl去离子水的1.5ml离心管（已灭菌）中捣碎，得组织悬液。养殖水体无需处理。 

1、PCR检测 

（1）PCR引物 

取实施例1中的引物对1。 

（2）模板制备 

取各组织悬液及养殖水体50μl加入200μl chelex-100（6%）中混匀，56℃保温20min，剧烈振荡后于100℃保温8min，剧烈振荡后于12000r/min离心3min，取上清作为PCR检测的模板。 

（3）PCR扩增 

分别取上述DNA作为模板，设阳性对照和阴性对照，阳性对照的模板为嗜水气单胞菌TW-YYS-26，阴性对照的模板为ddH₂O，按照实施例2中扩增程序进行扩增。 

（4）结果检测 

取5μl扩增产物，采用1%的琼脂糖凝胶，在恒压80V条件下电泳60min，置于凝胶成像系统下观察PCR扩增结果。 

2、测序以及传统方法检测 

取患病组织的扩增产物送上海生工测序。 

二、结果 

1、PCR检测结果 

结果如图3所示，阳性对照出现目标条带，阴性对照未出现目标条带，待检的患病组织出现目标条带，而尾鳍与鳃的组织悬液和养殖水无靶标条带生成。 

2、测序 

将患病组织的扩增产物送上海生工测序，如图4所示，测序结果表明，产物条带的序列与气单胞菌属细菌的gcaT基因序列的同源性为100%，鉴定为气单胞菌属细菌。实验结果说明患病组织处存在气单胞菌属细菌。 

本发明PCR检测结果与测序方法的结果一致，说明PCR方法能够有效的 从实际待检样品中检测出气单胞菌属的细菌。 

综上，本发明提供的检测试剂盒和检测方法可以特异扩增气单胞菌属细菌，特异性强、敏感性高、耗时短，检测快速，具有良好的应用前景。 

Claims (3)

1.一种气单胞菌属细菌的检测试剂盒，其特征在于：包含序列如SEQ ID NO：1~2所示的引物对1，扩增来自气单胞菌属细菌的基因。

2.一种气单胞菌属细菌的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

a，提取样本DNA：提取待检样本中的DNA；

b，基因扩增：用权利要求1所述的试剂盒对待检样本中的DNA进行扩增；

c，结果检测：对DNA扩增结果进行检测；

步骤a所述的样本为养殖水体。

3.SEQ ID NO：1～2所示的寡核苷酸序列的用途，其特征在于：用于扩增或检测来自养殖水体的气单胞菌属细菌的基因。

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