CN105018575A - 一种多重pcr在败血症真菌检测中的应用 - Google Patents
一种多重pcr在败血症真菌检测中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105018575A CN105018575A CN201410156827.1A CN201410156827A CN105018575A CN 105018575 A CN105018575 A CN 105018575A CN 201410156827 A CN201410156827 A CN 201410156827A CN 105018575 A CN105018575 A CN 105018575A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- upstream
- downstream
- downstream primer
- upstream primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明名称为：一种多重PCR在败血症真菌检测中的应用。本发明涉及分子生物学技术领域。本发明公开了一种多重PCR体系对真菌性败血症进行快速诊断的方法。本发明设计了一种多重PCR体系，能够弥补已有真菌检测方法的不足，为发病急、死亡率高的真菌性败血症及脓毒症临床治疗提供明确的用药信息，从而赢得宝贵的治疗时间。本发明提供了一种多重PCR技术，其特征在于能够快速、准确、高效的检测真菌，技术简便，易于操作和推广，有着非常广阔的应用空间。
Description
技术领域
本发明设计分子生物学技术领域，具体涉及一种多重PCR体系对真菌性败血症进行快速诊断的方法。多重PCR技术，适用于感染性疾病、肿瘤、遗传病的检测。
背景技术
目前对真菌性败血症快速准确诊断，尚缺乏可靠的检测方法，早期快速诊断，对于真菌性败血症的治疗、预后及耐药性预防，都具有重要意义。在普通外科的病人中血液真菌感染病人病死率高达27％～64％。外科危重病人一旦罹患真菌感染，病死率明显上升。念珠菌败血症在医院感染败血症中居第4位，病死率更是高居首位。真菌性败血症的高死亡率是因为其起病急，后果严重，临床诊断比较困难。该病症常无特异症状和体征, 与细菌感染不易区分,易漏诊或误诊为细菌感染而尝试性地使用广谱抗生素，反而易于导致菌群失调加重病情。
真核生物基因组中编码核糖体的基因包括28S rDNA、5S rDNA、18S rDNA和5.8S rDNA 4种，它们在染色体上头尾相连、串联排列，相互之间由间隔区分隔。其中18S、5.8S和28S rDNA基因组成一个转录单元，三者高度保守。其间的间隔区为内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer，ITS)，包括ITSI及ITS2两部分，其进化相对迅速而具多态性。本技术基于rDNA—ITS基因多态性的序列分析，选取真菌的rRNA及转录间区片段作为PCR目的基因，以保守序列设计待测真菌的上游通用引物(5’-GCATCGATGAAGAACG-3’)，以高变区设计下游特异性引物，既减少了所需引物的数量，又保证了检测的高度特异性。
发明内容
本发明的目的是提供一种多重PCR体系对真菌性败血症进行快速诊断的方法。
本发明设计了一种多重PCR体系，该体系能够弥补已有真菌检测方法的不足，为发病急、死亡率高的真菌性败血症及脓毒症临床治疗提供明确的用药信息，从而赢得宝贵的治疗时间。
本发明提供了一种多重PCR技术，其特征在于能够快速、准确、高效的检测真菌，技术简便，易于操作和推广，有着非常广阔的应用空间。
本发明所采用的技术方案的主要内容是：
一种真菌多重PCR检测方法，主要包括以下序列：
体系一：
白假丝酵母：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CGGGTAGTCCTACCTGATTT -5’
近平滑假丝酵母：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CGGGTAGTCCTACCTGATTT -5’
季也蒙假丝酵母：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CGGGTAGTCCTACCTGATTT -5’
热带假丝酵母：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CGGGTAGTCCTACCTGATTT -5’
维斯假丝酵母：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CGGGTAGTCCTACCTGATTT -5’
葡萄牙假丝酵母：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CGGGTAGTCCTACCTGATTT -5’
克柔假丝酵母：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CGGGTAGTCCTACCTGATTT -5’
光滑假丝酵母：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CGGGTAGTCCTACCTGATTT -5’
新生隐球菌：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CGGGTAGTCCTACCTGATTT -5’
米根霉：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CTATAGAAAAACCATAGAGG -5’
少根根霉：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CTATAGAAAAACCATAGAGG -5’
体系二：
克柔假丝酵母：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- TTGTTGTCTCGCAACACTCG -5’
烟曲霉：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CGTTCTTCATCGATGC -5’
土曲霉：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CGTTCTTCATCGATGC -5’
黄曲霉：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CGTTCTTCATCGATGC -5’
黑曲霉：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CGTTCTTCATCGATGC -5’
茄病镰刀菌：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CGCTCGAACAGGCATGCCCG -5’
串珠镰刀菌：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CGCTCGAACAGGCATGCCCG -5’
尖胞镰刀菌：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CGCTCGAACAGGCATGCCCG -5’
尖端赛多孢：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CGCTCGAACAGGCATGCCCG -5’
尖端赛多孢：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CGCTGCCTTTCGGGCAG -5’
土曲霉：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- GGTCAACCTGGAAAAATAAA -5’
本发明以保守序列设计待测真菌的上游通用引物，以高变区设计下游特异性引物，从病原真菌的种属角度利用多重PCR技术对真菌进行分组鉴定。同时本发明选用引物是在各引物浓度为6pmol的等摩尔条件下进行扩增，扩增产物通过普通的琼脂糖凝胶电泳即可有效的分开，方法简单易行。灵敏度达到10fg，优越性非常明显。
本发明还涉及一种真菌多重PCR检测方法，包括：
（1）选取引物序列包括（如上所述）
（2）提取真菌和细菌DNA，作为模板，在包括步骤（1）所述引物序列的PCR反应体系中进行PCR反应。
所述PCR反应体系1总体积为30μL，其组成为：
20xPCR Buffer l.5μL
50mM MgCl2 1.0μL
共用上游引物及体系l两条特异性引物 各6pmol
TaqDNA聚合酶 1U
DNA模板 2μL
以双蒸去离子水补足体积
PCR反应条件为：
预变性94℃ 5min；变性94℃ 60s，退火68℃ 60s，延伸72℃ 45s，35个循环；终延伸72℃ 5min。
所述PCR反应体系2总体积为30μL，其组成为：
20xPCR Buffer l.5μL
50mM MgCl2 1.0μL
共用上游引物及体系2两条特异性引物 各6pmol
TaqDNA聚合酶 1U
DNA模板 2μL
以双蒸去离子水补足体积
PCR反应条件为：
预变性94℃ 5min；变性94℃ 60s，退火68℃ 60s，延伸72℃ 45s，35个循环；终延伸72℃ 5min
（3）取PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果是否出现特异性条带，判断是否含有对应真菌。
本发明所检测的真菌基因是目前临床常见的致病真菌，因此本发明具有实用性；其次，本发明的方法可以缩短检测时间，单个样品从样品制备到结果检出只要6个小时；本发明检测所用方法为常规定性PCR和普通琼脂糖凝胶电泳检测，只需要目前常规的分子生物学试剂，成本低；另外本发明检测灵敏度高，能达到10fg水平，同时相比于单引物PCR检测，本发明准确率高，假阳性比率低。通过不同的PCR仪对比检测以及不同的检测人员操作比对均能得到稳定的检测结果。
本发明的有益效果主要体现在：可快速、准确检测多重真菌，灵敏度高，且成本低，准确率高，假阳性率低。
附图说明
图1是RNA基因及转录间隔区示意图；
图2是选取的真菌目的基因相似性对比；
图3是反应体系1的PCR特异性电泳图
（M. DL2000，1.白假丝酵母，2.近平滑假丝酵母，3.光滑假丝酵母，4热带假丝酵母，5.季也蒙假丝酵母，6.克柔假丝酵母，7.葡萄牙假丝酵母，8.维斯假丝酵母，9.新生隐球菌，10.米根霉，11. 少根根霉，12.烟曲霉，13.土曲霉，14.黄曲霉，15.黑曲霉，16.尖端赛多孢，17. 串珠镰刀菌,18. 茄病镰刀菌，19尖胞镰刀菌，20.双蒸去离子水）；
图4是反应体系2的PCR特异性电泳图
（M. DL2000，1.白假丝酵母，2.近平滑假丝酵母，3.光滑假丝酵母，4热带假丝酵母，5.季也蒙假丝酵母，6.克柔假丝酵母，7.葡萄牙假丝酵母，8.维斯假丝酵母，9.新生隐球菌，10.米根霉，11. 少根根霉，12.烟曲霉，13.土曲霉，14.黄曲霉，15.黑曲霉，16.尖端赛多孢，17. 串珠镰刀菌,18. 茄病镰刀菌，19尖胞镰刀菌.,20.双蒸去离子水）；
图5是PCR灵敏度电泳图
（M 为DL2000,1为1ng的DNA，2为100pg的DNA，3为10pg的DNA，4为1pg的DNA，5为100fg的DNA，6为10fg的DNA，7为1fg的DNA，8为双蒸去离子水）。
具体实施方式
实施例1：待检测菌种的基因分析及通用引物的设计
从National Center for Biotechnology Information网站查找待测病原真菌的ITS1, 5.8S rRNA, ITS2, 28S rRNA基因，运用软件进行对比分析。
从对比结果可以看出，待测菌种ITS1, 5.8S rRNA, ITS2, 28S rRNA基因中有一段高度同源序列，可以在此区段设计通用引物。但是由于某些菌株已测出的基因序列有限，且共有序列在ITS1, 5.8S rRNA, ITS2, 28S rRNA基因的中间区段，若以此作为共有的上游或下游通用引物，很难选取在各菌种之间长度差别足够大的PCR目的基因。本发明选取真菌的rRNA及转录间区片段作为PCR目的基因，以保守序列设计待测真菌的上游通用引物(5’-GCATCGATGAAGAACG-3’)，以高变区设计下游特异性引物。
表1、多重PCR对真菌性败血症致病菌种属鉴定所用下游引物
| 体系一下游引物 | 待测菌种 | 产物长度 | 体系二下游引物 | 待测菌种 | 产物长度 |
| CGGGTAGTCCTACCTGATTT | 白假丝酵母 | 308 | TTGTTGTCTCGCAACACTCG | 克柔假丝酵母 | 284 |
| CGGGTAGTCCTACCTGATTT | 近平滑假丝酵母 | 281 | CGTTCTTCATCGATGC | 烟曲霉 | 241 |
| CGGGTAGTCCTACCTGATTT | 季也蒙假丝酵母 | 281 | CGTTCTTCATCGATGC | 土曲霉 | 236 |
| CGGGTAGTCCTACCTGATTT | 热带假丝酵母 | 298 | CGTTCTTCATCGATGC | 黄曲霉 | 238 |
| CGGGTAGTCCTACCTGATTT | 维斯假丝酵母 | 289 | CGTTCTTCATCGATGC | 黑曲霉 | 242 |
| CGGGTAGTCCTACCTGATTT | 葡萄牙假丝酵母 | 225 | CGCTCGAACAGGCATGCCCG | 茄病镰刀菌 | 122 |
| CGGGTAGTCCTACCTGATTT | 克柔假丝酵母 | 317 | CGCTCGAACAGGCATGCCCG | 串珠镰刀菌 | 122 |
| CGGGTAGTCCTACCTGATTT | 光滑假丝酵母 | 389 | CGCTCGAACAGGCATGCCCG | 尖胞镰刀菌 | 122 |
| CGGGTAGTCCTACCTGATTT | 新生隐球菌 | 344 | CGCTCGAACAGGCATGCCCG | 尖端赛多孢 | 122 |
| CTATAGAAAAACCATAGAGG | 米根霉 | 104 | CGCTGCCTTTCGGGCAG | 尖端赛多孢 | 163 |
| CTATAGAAAAACCATAGAGG | 少根根霉 | 104 | GGTCAACCTGGAAAAATAAA | 土曲霉 | 310 |
实施例2：DNA提取
真菌DNA的提取，将待测菌种经培养增菌后，采用快速法提取DNA。
细菌DNA的提取，用接种环从细菌培养基上刮取细菌约0.1g，置于1.5mL Eppendorf管内，加入细菌裂解液0.5mL，95℃水浴15min，10000 rpm离心5mim，直接取上清2μL做PCR扩增的模板。
实施例3：多重PCR检测
两个多重PCR反应体系体积均为30μL。体系l成分包括：20xPCR Buffer l.5μL，50mM MgCl21.0μL,共用上游引物及体系l两条特异性引物各6pmol，TaqDNA聚合酶1U，DNA模板2μL，以双蒸去离子水补足体积。体系2成分除下游引物改为体系2五条特异性引物各6pmol外，其他成分不变。采用热启动PCR技术，体系l的PCR反应参数：预变性94℃ 5min；变性94℃ 60s，退火68℃ 60s，延伸72℃ 45s，35个循环；终延伸72℃ 5min。体系2除退火温度改为65℃外，其他参数不变。PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯观察，凝胶成像系统下照相记录，结果见附图3，附图4。
凝胶成像系统显示，体系1中光滑假丝酵母、新生隐球菌和葡萄牙假丝酵母可分别扩增出389bp、344bp和225bp的特异性条带，其他假丝酵母扩增出的条带长度在281bp到317bp的范围内。米根霉、少根根霉的扩增产物均为104bp。（图3）在体系2中，土曲霉可扩增出210bp和338bp的条带。克柔假丝酵母扩增出的特异性条带长度为284bp。镰刀菌的PCR产物均为122bp，曲霉扩增的条带长度在236bp至242bp。（图 4）两体系均不扩增细菌（大肠埃希菌、绿脓假单胞菌、粘质沙雷菌、肺炎克雷伯菌、溶血不动杆菌、结核杆菌、化脓链球菌、金黄色葡萄球菌）和人血液白细胞及组织细胞的DNA。
实施例3：PCR灵敏度实验
以氯化苄法提取白假丝酵母DNA，以酚、氯仿一异戊醇抽提、纯化，加RNase孵育30min，用紫外分光光度计测定DNA质量浓度，根据测定值将DNA进行10倍系列质量浓度稀释，得到1ng～1fg的7个质量浓度，然后在体系一中进行PCR扩增，以双蒸去离子水为阴性对照。
结果显示，反应体系对质量浓度为1ng～10fg的 DNA扩增结果均为阳性，10fgDNA扩增产物较弱。1fgDNA未扩增出阳性结果。故该多重PCR体系的灵敏度为10fg。
SEQUENCE LISTING
<110> 胡东
<120> 一种多重PCR在败血症真菌检测中的应用
<160> 44
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcatcgatga agaacg
16
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgggtagtcc tacctgattt
20
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcatcgatga agaacg
16
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgggtagtcc tacctgattt
20
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcatcgatga agaacg
16
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cgggtagtcc tacctgattt
20
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gcatcgatga agaacg
16
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cgggtagtcc tacctgattt
20
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gcatcgatga agaacg
16
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cgggtagtcc tacctgattt
20
<210> 11
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gcatcgatga agaacg
16
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cgggtagtcc tacctgattt
20
<210> 13
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gcatcgatga agaacg
16
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
cgggtagtcc tacctgattt
20
<210> 15
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gcatcgatga agaacg
16
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
cgggtagtcc tacctgattt
20
<210> 17
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gcatcgatga agaacg
16
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cgggtagtcc tacctgattt
20
<210> 19
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gcatcgatga agaacg
16
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ctatagaaaa accatagagg
20
<210> 21
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
gcatcgatga agaacg
16
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ctatagaaaa accatagagg
20
<210> 23
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gcatcgatga agaacg
16
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ttgttgtctc gcaacactcg
20
<210> 25
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gcatcgatga agaacg
16
<210> 26
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
cgttcttcat cgatgc
16
<210> 27
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
gcatcgatga agaacg
16
<210> 28
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
cgttcttcat cgatgc
16
<210> 29
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
gcatcgatga agaacg
16
<210> 30
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
cgttcttcat cgatgc
16
<210> 31
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
gcatcgatga agaacg
16
<210> 32
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
cgttcttcat cgatgc
16
<210> 33
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
gcatcgatga agaacg
16
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
cgctcgaaca ggcatgcccg
20
<210> 35
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
gcatcgatga agaacg
16
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
cgctcgaaca ggcatgcccg
20
<210> 37
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
gcatcgatga agaacg
16
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
cgctcgaaca ggcatgcccg
20
<210> 39
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
gcatcgatga agaacg
16
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
cgctcgaaca ggcatgcccg
20
<210> 41
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
gcatcgatga agaacg
16
<210> 42
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
cgctgccttt cgggcag
17
<210> 43
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
gcatcgatga agaacg
16
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
ggtcaacctg gaaaaataaa
20
Claims (6)
1. 一种多重PCR体系对真菌性败血症进行快速诊断的方法，适用于感染性疾病、肿瘤、遗传病的检测。
2.根据权利要求书1的PCR体系，该体系能够弥补已有真菌检测方法的不足，为发病急、死亡率高的真菌性败血症及脓毒症临床治疗提供明确的用药信息，从而赢得宝贵的治疗时间。
3.根据权利要求书1的PCR检测方法，主要包括以下序列：
体系一：
白假丝酵母：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CGGGTAGTCCTACCTGATTT -5’
近平滑假丝酵母：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CGGGTAGTCCTACCTGATTT -5’
季也蒙假丝酵母：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CGGGTAGTCCTACCTGATTT -5’
热带假丝酵母：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CGGGTAGTCCTACCTGATTT -5’
维斯假丝酵母：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CGGGTAGTCCTACCTGATTT -5’
葡萄牙假丝酵母：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CGGGTAGTCCTACCTGATTT -5’
克柔假丝酵母：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CGGGTAGTCCTACCTGATTT -5’
光滑假丝酵母：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CGGGTAGTCCTACCTGATTT -5’
新生隐球菌：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CGGGTAGTCCTACCTGATTT -5’
米根霉：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CTATAGAAAAACCATAGAGG -5’
少根根霉：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CTATAGAAAAACCATAGAGG -5’
体系二：
克柔假丝酵母：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- TTGTTGTCTCGCAACACTCG -5’
烟曲霉：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CGTTCTTCATCGATGC -5’
土曲霉：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CGTTCTTCATCGATGC -5’
黄曲霉：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CGTTCTTCATCGATGC -5’
黑曲霉：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CGTTCTTCATCGATGC -5’
茄病镰刀菌：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CGCTCGAACAGGCATGCCCG -5’
串珠镰刀菌：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CGCTCGAACAGGCATGCCCG -5’
尖胞镰刀菌：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CGCTCGAACAGGCATGCCCG -5’
尖端赛多孢：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CGCTCGAACAGGCATGCCCG -5’
尖端赛多孢：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- CGCTGCCTTTCGGGCAG -5’
土曲霉：上游引物：5’- GCATCGATGAAGAACG -3’
下游引物：3’- GGTCAACCTGGAAAAATAAA -5’
根据权利要求1的PCR体系，本发明以保守序列设计待测真菌的上游通用引物，以高变区设计下游特异性引物，从病原真菌的种属角度利用多重PCR技术对真菌进行分组鉴定。
4.同时本发明选用引物是在各引物浓度为6pmol的等摩尔条件下进行扩增，扩增产物通过普通的琼脂糖凝胶电泳即可有效的分开，方法简单易行。
5.灵敏度达到10fg，优越性非常明显。
6.根据权利要求1的PCR技术，其特征在于能够快速、准确、高效的检测真菌，技术简便，易于操作和推广，有着非常广阔的应用空间。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410156827.1A CN105018575A (zh) | 2014-04-18 | 2014-04-18 | 一种多重pcr在败血症真菌检测中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410156827.1A CN105018575A (zh) | 2014-04-18 | 2014-04-18 | 一种多重pcr在败血症真菌检测中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105018575A true CN105018575A (zh) | 2015-11-04 |
Family
ID=54408874
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410156827.1A Pending CN105018575A (zh) | 2014-04-18 | 2014-04-18 | 一种多重pcr在败血症真菌检测中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105018575A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2561555A (en) * | 2017-04-12 | 2018-10-24 | Momentum Bioscience Ltd | Detection and delineation of microorganisms |
| CN112725508A (zh) * | 2021-02-02 | 2021-04-30 | 上海捷诺生物科技有限公司 | 用于肺毛霉菌病致病菌检测的试剂盒及其使用方法和用途 |
| CN114908084A (zh) * | 2022-04-07 | 2022-08-16 | 领航基因科技（杭州）有限公司 | 尖端赛多孢子菌、土曲霉、构巢曲霉的引物探针及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1496413A (zh) * | 2003-05-09 | 2004-05-12 | 清华大学 | 用于多重pcr条件优化的方法和组分 |
| CN102796812A (zh) * | 2012-04-28 | 2012-11-28 | 河南农业大学 | 一种同时检测小麦田5种土传真菌病原物的pcr引物及其检测方法 |
-
2014
- 2014-04-18 CN CN201410156827.1A patent/CN105018575A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1496413A (zh) * | 2003-05-09 | 2004-05-12 | 清华大学 | 用于多重pcr条件优化的方法和组分 |
| CN102796812A (zh) * | 2012-04-28 | 2012-11-28 | 河南农业大学 | 一种同时检测小麦田5种土传真菌病原物的pcr引物及其检测方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 杨小康等: "多重PCR快速鉴定19种致病真菌", 《临床检验杂志》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2561555A (en) * | 2017-04-12 | 2018-10-24 | Momentum Bioscience Ltd | Detection and delineation of microorganisms |
| CN112725508A (zh) * | 2021-02-02 | 2021-04-30 | 上海捷诺生物科技有限公司 | 用于肺毛霉菌病致病菌检测的试剂盒及其使用方法和用途 |
| CN112725508B (zh) * | 2021-02-02 | 2021-10-15 | 上海捷诺生物科技有限公司 | 用于肺毛霉菌病致病菌检测的试剂盒及其使用方法和用途 |
| CN114908084A (zh) * | 2022-04-07 | 2022-08-16 | 领航基因科技（杭州）有限公司 | 尖端赛多孢子菌、土曲霉、构巢曲霉的引物探针及其应用 |
| CN114908084B (zh) * | 2022-04-07 | 2024-06-14 | 领航基因科技（杭州）有限公司 | 尖端赛多孢子菌、土曲霉、构巢曲霉的引物探针及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Jamal et al. | Comparative evaluation of two matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) systems for the identification of clinically significant yeasts | |
| Niessen | Current state and future perspectives of loop-mediated isothermal amplification (LAMP)-based diagnosis of filamentous fungi and yeasts | |
| Babu et al. | Quantitative real-time PCR assay for rapid detection of plant and human pathogenic Macrophomina phaseolina from field and environmental samples | |
| CN106893782B (zh) | 一种检测并鉴定隐球菌的靶基因、引物和探针及试剂盒 | |
| CN104450936B (zh) | 检测常见致病真菌的荧光定量pcr引物、探针及试剂盒 | |
| Vivant et al. | Survival of Listeria monocytogenes in soil requires AgrA-mediated regulation | |
| CN102154497B (zh) | 食品中霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的m-PCR引物和探针及检测方法 | |
| Foongladda et al. | Multi-probe real-time PCR identification of four common Candida species in blood culture broth | |
| CN104263813A (zh) | 用于鉴定茄病镰刀菌或/和尖孢镰刀菌的引物序列、试剂盒及其方法 | |
| CN102367475A (zh) | 不同血清型霍乱弧菌的m-PCR检测试剂盒及检测方法 | |
| CN105018575A (zh) | 一种多重pcr在败血症真菌检测中的应用 | |
| Behrens et al. | Evaluation of different phyllosphere sample types for parallel metabarcoding of Fungi and Oomycetes in Vitis vinifera | |
| CN102952881B (zh) | 一种阴沟肠杆菌特异性pcr检测引物 | |
| CN106801103B (zh) | 一种无乳链球菌的检测引物组、检测试剂盒和多重pcr检测方法 | |
| CN103966341A (zh) | 无乳链球菌快速检测引物及其方法 | |
| CN101586157B (zh) | 一种鱼类病原菌海豚链球菌分子诊断试剂盒及检测方法 | |
| Liebe et al. | Development of a DNA microarray-based assay for the detection of sugar beet root rot pathogens | |
| Urubschurov et al. | Development and evaluation of qPCR assay for quantitation of Kazachstania slooffiae and total yeasts occurring in the porcine gut | |
| CN101760554B (zh) | 检测灰霉病菌群体对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂抗性频率的引物序列及方法 | |
| CN104004842A (zh) | 一种同时检测水生动物败血症三种致病菌的多重pcr引物组及检测方法 | |
| WO2015018156A1 (zh) | 一种弧菌属细菌的检测试剂盒和检测方法 | |
| CN107447049B (zh) | 一种快速检测土壤中病原微生物的方法 | |
| CN103497999B (zh) | 一种用于肉毒杆菌lamp核酸检测引物组和试剂盒 | |
| CN105886643A (zh) | 一种烟曲霉菌的pcr检测的引物及方法 | |
| CN105177138A (zh) | 一种用于检测橡胶树白粉菌的引物、方法及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20151104 |