CN102796812A

CN102796812A - 一种同时检测小麦田5种土传真菌病原物的pcr引物及其检测方法

Info

Publication number: CN102796812A
Application number: CN2012101304560A
Authority: CN
Inventors: 李洪连; 陈清清; 孙炳剑; 张煜; 施艳; 袁虹霞; 邢小萍
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2012-04-28
Filing date: 2012-04-28
Publication date: 2012-11-28
Anticipated expiration: 2032-04-28
Also published as: CN102796812B

Abstract

本发明公开了一种同时检测小麦田5种土传真菌病原物的PCR引物，纹枯病菌引物的序列如下：上游引物P1：5′-TCCTCCCGCTTATTGATATGC-3′；下游引物P2：5′-CGGTTGAGCTGGGTCTTTTA-3′。本发明建立的多重PCR检测体系，可以同时检测小麦纹枯病菌、全蚀病菌、禾谷镰刀菌、假禾谷镰刀菌和根腐蠕孢菌等5种病原真菌。本发明扩增产物片段大小与预期结果一致，并且5对引物仅对目标特异，无非特异条带产生，因而能很好的区分5种病原菌。简便快速：4小时完成样品制备和检测，同时检测出小麦纹枯病菌、全蚀病菌、禾谷镰刀菌、假禾谷镰刀菌、根腐蠕孢菌等5种病原物；灵敏度高：可以检测出0.39ng的病原物DNA样品；准确：检测结果准确性高于传统的分离鉴定和症状鉴定方法。

Description

一种同时检测小麦田5种土传真菌病原物的PCR引物及其检测方法

技术领域

本发明属于农作物真菌病原物分子检测新技术，具体涉及采用多重PCR检测小麦田5种土传真菌病原物的方法的建立及应用。

技术背景

小麦土传真菌病害包括纹枯病、全蚀病、根腐病及茎基腐病等，这些病害均可以造成小麦的严重减产，是目前威胁小麦安全生产的重要病害。而且这些病害经常混合发生，引起更大的损失。早期诊断可以为病害的防控提供依据，但是这些真菌病害均属于土壤习居菌，引起症状在苗期很难区分，传统的早期鉴定手段无法快速准确得到结果。分子生物学的发展和PCR技术的诞生为快速、准确检测病原菌提供了基础。根据微生物基因组的保守区段设计特异性引物用于检测病原菌的方法已得到了广泛的应用。根据Fusarium asiaticum和F.graminearum tri6区域和tri3区域序列差异，设计筛选了特异性引物，构建了这两种病原菌的多重PCR检测体系，方便、快捷的将F. asiaticum和F.graminearum区分开来。目前的研究结果表明，引起小麦纹枯病、全蚀病、根腐病及茎基腐病等的病原物主要有小麦纹枯病菌（Rhizoctonia cerealis）、全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis var. tritici）、禾谷镰刀菌（F. graminearum）、假禾谷镰刀菌（F. pseudograminearum）和根腐蠕孢菌（Bipolaris sorokiniana）。

发明内容

本发明提供一种同时快速检测小麦纹枯病菌、全蚀病菌、禾谷镰刀菌、假禾谷镰刀菌和根腐蠕孢菌等5种土传真菌病原的方法，合成同时检测小麦田5种土传真菌病原物的PCR引物，优化了多重PCR反应体系，可以同时特异性检测5种土传真菌病原，此方法具有实验周期短、灵敏度高、准确性高等优点。

本发明的技术方案是：

一种同时检测小麦田5种土传真菌病原物的PCR引物，

纹枯病菌引物的序列如下：

上游引物 P1：5′- TCCTCCCGCTTATTGATATGC -3′；

下游引物 P2：5′- CGGTTGAGCTGGGTCTTTTA -3′；

假禾谷镰刀菌引物的序列如下：

上游引物 P3：5′- CGGGGTAGTTTCACATTTCCG -3′；

下游引物 P4：5′- GAGAATGTGATGACGACAATA -3′；

小麦全蚀病菌引物的序列如下：

上游引物 P5：5′- TATGTCAGAGCGGTGAACG -3′；

下游引物 P6：5′- TTCGGTGCCTGGATAGTGA -3′；

根腐蠕孢菌引物的序列如下：

上游引物 P7：5′- CGAGCAAGTTGTCAAGGAG -3′；

下游引物 P8：5′- GTGAAAGTCTCAATAGCACCC -3′；

禾谷镰刀菌引物的序列如下：

上游引物 P9：5′- ACAGATGACAAGATTCAGGCACA -3′；

下游引物 P10：5′- TTCTTTGACATCTGTTCAACCCA-3′。

一种同时检测小麦田5种土传真菌病原物的检测方法，提取病原菌的DNA后，进行多重PCR检测，多重PCR反应体系为：10×PCR buffer 2.5μL，3.125UTaq酶，dNTP Mixture 0.4mM，Mg²⁺3mM, P1 0.4μL，P2 0.4μL,P3 1.4μL,P41.4μL, P51.4μL, P61.4μL，P70.7μL, P80.7μL,P9 0.7μL,P10 0.7μL,ddH₂0补至25μL。

多重PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性1min、58.5℃退火1min、72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min；于4℃条件下保存。

本发明的有益效果是：本发明建立的多重PCR检测体系，可以同时检测小麦纹枯病菌、全蚀病菌、禾谷镰刀菌、假禾谷镰刀菌和根腐蠕孢菌等5种病原真菌。本发明扩增产物片段大小与预期结果一致，并且5对引物仅对目标特异，无非特异条带产生，因而能很好的区分5种病原菌。简便快速：4小时完成样品制备和检测，同时检测出小麦纹枯病菌、全蚀病菌、禾谷镰刀菌、假禾谷镰刀菌、根腐蠕孢菌等5种病原物；灵敏度高：可以检测出0.39ng的病原物DNA样品；准确：检测结果准确性高于传统的分离鉴定和症状鉴定方法。

附图说明

图1为五种病原菌单重PCR检测结果，泳道：M：分子量标准DL2000；1,2：禾谷镰刀菌；3，4：纹枯病菌；5，6：假禾谷镰刀菌；7，8：全蚀病菌；9,10 ：根腐蠕孢菌N 空白对照；

图2为多重PCR检测结果，M：分子量, 1，2，3泳道为三次重复多重检测结果，N:阴性对照；

图3 不同浓度DNA多重PCR检测结果，M:分子量标准DL2000,1：1/2 2：1/4， 3：1/8，4:1/16，5:1/32，6:1/64，7:1/128。

具体实施方式

一种同时检测小麦田5种土传真菌病原物的PCR引物，

纹枯病菌引物的序列如下：

上游引物 P1：5′- TCCTCCCGCTTATTGATATGC -3′；

下游引物 P2：5′- CGGTTGAGCTGGGTCTTTTA -3′；

假禾谷镰刀菌引物的序列如下：

上游引物 P3：5′- CGGGGTAGTTTCACATTTCCG -3′；

下游引物 P4：5′- GAGAATGTGATGACGACAATA -3′；

小麦全蚀病菌引物的序列如下：

上游引物 P5：5′- TATGTCAGAGCGGTGAACG -3′；

下游引物 P6：5′- TTCGGTGCCTGGATAGTGA -3′；

根腐蠕孢菌引物的序列如下：

上游引物 P7：5′- CGAGCAAGTTGTCAAGGAG -3′；

下游引物 P8：5′- GTGAAAGTCTCAATAGCACCC -3′；

禾谷镰刀菌引物的序列如下：

上游引物 P9：5′- ACAGATGACAAGATTCAGGCACA -3′；

下游引物 P10：5′- TTCTTTGACATCTGTTCAACCCA-3′。

本发明具体操作如下：

1. 材料和方法

1.1实验材料

1.1.1菌株：5种菌株都由河南农业大学农业生物技术重点实验室和河南农业大学植物病理学科实验室提供。

1.1.2 试剂：Taq酶、dNTP、Mg²⁺均购自TaKaRa Bio公司，引物由Invitrogen试剂公司合成。

1.1.3 仪器：美国ABI Veriti 96孔热循环仪-梯度PCR仪，DYY 6C电泳仪，凝胶成象分析系统UVI

1.2 实验方法

1.2.1 病原菌培养取保存的菌株接种于PDA平板上， 25℃下生长3 d，挑新鲜菌丝。接种于250mL装有1／3体积PDB的三角瓶中。25℃ 120 r／min,培养3-4天，至生成大量菌丝团为止。双层纱布过滤，100ml蒸馏水连续冲洗，滤纸吸干水分，置于1.5ml离心管-20℃保存备用。

1.2.2 病原菌DNA的提取采取传统的CTAB法，做适当改动。取100mg左右吸干的新鲜菌丝，液氮研磨，移入1.5ml离心管中，加入700μL65℃预热的CTAB溶液，65℃水浴1h。之后加入等积极的抽提液I（苯酚：氯仿：异戊醇=25:24:1）12000rpm离心10min，吸上清，重复1次。加入600微升氯仿：异戊醇 24:1，轻轻颠倒几次，12000rpm,4度，离心10min,吸上清；再加入-20℃预冷的异丙醇，-20℃沉淀1h, 12000rpm离心10min，倒上清，用75%酒精洗涤沉淀3次，超净工作台上风干20min, 在吹干的离心管中加入20-200微升ddH₂O，4度保存备用。

1.2.3引物设计禾谷镰刀菌及假禾谷镰刀菌引物参考Nicholson及 Aoki &O’Donnel，禾谷丝核菌引物参考陆琼娴。根据β-tubulin基因设计全蚀病菌引物，约440bp，根据ITS区设计根腐蠕孢菌引物，约372bp。如表1所示。

表1 小麦茎基常见真菌病菌PCR引物

禾谷镰刀菌及假禾谷镰刀菌引物参考Nicholson及 Aoki &O’Donnel，禾谷丝核菌引物参考陆琼娴。根据β-tubulin基因设计全蚀病菌引物，约440bp，根据ITS区设计根腐蠕孢菌引物，约372bp。

1.2.4 PCR扩增

（1）单重PCR反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，0.625U Taq 酶，dNTP Mixture 0.4mM,Mg²⁺3mM,上游引物和下游引物各1μL，DNA模板1μL，ddH₂0补至25μL。

（2）多重PCR反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，3.125UTaq酶，dNTP Mixture 0.4mM，Mg²⁺3mM, HgR 0.4μL，HgF 0.4μL,Fp1-1 1.4μL,Fp1-2 1.4μL,RBR 0.7μL,RBF 0.7μL,Fg16NR 0.7μL,Fg16NF 0.7μL,TAR 1.4μL,TAF 1.4μL，ddH₂0补至25μL。

（3）PCR反应条件：94℃预变性4min；94℃变性1min、58.5℃退火1min、72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min；于4℃下保存。

（4）PCR产物的电泳检测：扩增产物于1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，80V，2h,UVI凝胶成像系统分析结果。

1.2.5 引物的特异性验证

5种病原真菌DNA混合后，分别用每一种真菌特异引物进行单重PCR，评价和验证引物的特异性。反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，0.625U Taq 酶，dNTP Mixture 0.4mM,Mg²⁺3mM,上游引物和下游引物各1μL，DNA模板1μL，ddH₂0补至25μL。PCR反应条件：94℃预变性4min；94℃变性1min、58.5℃退火1min、72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min；于4℃下保存。

2. 结果与分析

2.1引物的特异性验证

在收集的全部菌株的范围内进行单重PCR，进一步评价和验证引物的特异性。五种病原菌单重引物检测结果如图1所示，结果表明，扩增产物片段大小与预期结果一致，并且5对引物仅对目标特异，无非特异条带产生，因而能很好的区分5种病原菌。

2.2 多重PCR检测

分别向同一体系中加入5种病菌DNA（约100ng/uL）及五种引物，进行多重PCR检测，结果如图2所示，自上而下依次为638bp,520bp，440bp,372bp,280bp，表明可以同时特异检测出5种小麦田土传真菌病原。

2.3多重PCR灵敏度检测

将原有DNA 2倍稀释后得到7个处理(1／2 X、1／4×、1／8×、1／16×、1／32 X、1／64 X、1／128 X）,采用优化好的扩增体系及程序，分别扩增，检测，结果如图3所示。由图3可知，25ng-3.125ng（稀释16倍）均能扩增出清晰的多重PCR条带(泳道1-4)，而稀释64倍、128倍后扩增的条带也隐约可见（泳道6、7），说明此方法检测的灵敏度非常高，约0.39ng，可见该方法可靠。

<110> 河南农业大学

<120>一种同时检测小麦田5种土传真菌病原物的PCR引物及其检测方法

<140> 2012101304560

<141> 2012-04-28

<160> 10

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)...(21)

<400> 1

tcctcccgcttattgatatgc 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)...(20)

<400> 2

cggttgagctgggtctttta 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)...(21)

<400> 3

cggggtagtttcacatttccg 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)...(21)

<400> 4

gagaatgtgatgacgacaata 21

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)...(19)

<400> 5

tatgtcagagcggtgaacg 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)...(19)

<400> 6

ttcggtgcctggatagtga 19

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)...(19)

<400> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<400> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<400> 9

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<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

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<221> misc_feature

<222> (1)...(23)

<400> 10ttctttgacatctgttcaaccca 23

Claims

1. 一种同时检测小麦田5种土传真菌病原物的PCR引物，其特征在于：

纹枯病菌引物的序列如下：

上游引物 P1：5′- TCCTCCCGCTTATTGATATGC -3′；

下游引物 P2：5′- CGGTTGAGCTGGGTCTTTTA -3′；

假禾谷镰刀菌引物的序列如下：

上游引物 P3：5′- CGGGGTAGTTTCACATTTCCG -3′；

下游引物 P4：5′- GAGAATGTGATGACGACAATA -3′；

小麦全蚀病菌引物的序列如下：

上游引物 P5：5′- TATGTCAGAGCGGTGAACG -3′；

下游引物 P6：5′- TTCGGTGCCTGGATAGTGA -3′；

根腐蠕孢菌引物的序列如下：

上游引物 P7：5′- CGAGCAAGTTGTCAAGGAG -3′；

下游引物 P8：5′- GTGAAAGTCTCAATAGCACCC -3′；

禾谷镰刀菌引物的序列如下：

上游引物 P9：5′- ACAGATGACAAGATTCAGGCACA -3′；

下游引物 P10：5′- TTCTTTGACATCTGTTCAACCCA-3′。

2. 一种同时检测小麦田5种土传真菌病原物的检测方法，提取病原菌的DNA后，进行多重PCR检测，其特征在于，多重PCR反应体系为：10×PCR buffer 2.5μL，3.125UTaq酶，dNTP Mixture 0.4mM，Mg²⁺3mM, P1 0.4μL，P2 0.4μL,P3 1.4μL,P41.4μL, P51.4μL, P61.4μL，P70.7μL, P80.7μL,P9 0.7μL,P10 0.7μL,ddH₂0补至25μL。

3. 根据权利要求2所述的同时检测小麦田5种土传真菌病原物的检测方法，其特征在于，多重PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性1min、58.5℃退火1min、72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min；于4℃条件下保存。