CN113355450A - 一种用于定量检测土壤中小麦茎基腐病原菌的引物及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于定量检测土壤中小麦茎基腐病原菌的引物及检测方法，属于植物病害检测技术领域。所述的引物基于小麦茎基腐病原菌的RNA聚合酶第二大亚基RPB2设计；所述的引物为如下所示，上游引物：SEQ ID No：1；下游引物：SEQ ID No：2。用于定量检测土壤中小麦茎基腐病原菌的检测方法，包括以下步骤：(1)提取样品中的DNA；(2)以步骤(1)提取的DNA作为待检测DNA模板，采用权利要求1所述的引物进行普通PCR扩增反应或实时荧光定量PCR扩增反应；(3)分析普通PCR扩增产物或实时荧光定量PCR扩增产物。本发明设计的引物及检测方法，表现出特异性强、扩增效率高、灵敏度高、重现性高、实用性好的特点，为小麦茎基腐病原菌的诊断、病害防治和农药减量使用提供新方法，极大提升了土壤中小麦茎基腐病原菌的检测效率。

Description

一种用于定量检测土壤中小麦茎基腐病原菌的引物及检测 方法

技术领域

本发明属于植物病害检测技术领域，具体地说，涉及一种用于定量检测土壤中小麦茎基腐病原菌的引物及检测方法。

背景技术

由假禾谷镰刀菌(Fusarium pseudograminearum)侵染小麦引起的茎基腐病又称小麦冠腐病，该病最早于1951年在澳大利亚被发现，目前，欧洲、美洲、澳洲、亚洲均有该病的报道，我国于2012年首次报道该病，小麦茎基腐病严重威胁世界小麦的生产和粮食安全问题。

假禾谷镰刀菌在小麦的各个生育期均能侵染。苗期植株受到侵染后，茎基部叶鞘及茎秆变褐，严重时可引起整个茎基部的腐烂，最终导致麦苗发黄死亡。成株期一般感染小麦1-2节，有黑色或褐色病斑产生，在潮湿的环境下，发病处可产生白色或红色菌丝。灌浆期，感病植株形成白穗，干瘪甚至没有籽粒。后期随着小麦的生长，若多雨水土壤较为湿润，病原菌迅速扩展，整个植株腐烂。

近年来，由于秸秆还田、少耕免耕等耕作制度的改变，小麦茎基腐病原菌在田间大量积累，一定程度上导致了该病的发病率及危害程度的增加。该病害在冬前即可侵入植株，随着气温降低，潜伏在麦苗中。病原菌侵入早期，植株无明显症状。随着早春气温回升，在适宜的天气条件下，病原菌迅速扩展，最终导致整个植株死亡。因此，小麦茎基腐病的发生只能以预防为主，其在田间的预测预报及早期诊断就尤为重要。同时，由于小麦土传病害种类多(纹枯、全蚀、茎基腐、根腐等)、病原复杂，加上全蚀病、根腐病及茎基腐病等真菌性病害在发生早期症状非常相似，均可引起茎基部、根部等部位褐变等症状，在田间很难将其准确辨别，极易混淆，给病害的防控带来了诸多困难；后期，虽然从症状上较易诊断出病害种类，但防控最佳时期已过，对当季病害防控的指导意义已经不大。而病原检测、鉴定是病害准确诊断和病害测报的依据，也是合理用药、科学防控的前提和基础，因此，开发出快速、准确的病原检测技术对指导病害科学防控具有十分重要的作用。

本发明旨在寻找小麦茎基腐病原菌中新的分子检测靶标基因，并利用该基因设计出茎基腐病菌的特异性检测引物，开发出茎基腐病菌实时定量PCR的检测方法。RNA聚合酶是在生物代谢过程中具有重要作用的催化RNA合成的酶。在真核生物中，共得到3种RNA聚合酶，RNA聚合酶II由12个亚基组成(RPB1-RPB12)，其催化mRNA的合成。RPB2基因在大多数真核生物中只存在一个拷贝，其序列存在保守和变异的位点，有利于引物设计。因此，我们设计出以RPB2作为一个分子检测靶标，通过基因序列比对分析，设计小麦茎基腐病特异性检测引物，并且经试验证实，该引物在小麦茎基腐病的DNA模板下特异性扩增405bp条带。该引物对其他小麦病原菌、土壤中其他微生物及健康小麦植株所提取的DNA不产生扩增条带。在此基础上继续开发小麦茎基腐病实时定量PCR的检测技术，确定了小麦茎基腐病在合适条件下侵染最低量阈值，开展土壤中残留病原菌的定性检测，为病害预警提供依据，为病害的早期防控提供技术支持。

发明内容

1、要解决的问题

针对小麦茎基腐病原菌尚无有效运用实时荧光定量PCR技术进行检测的问题，本发明提供一种用于定量检测土壤中小麦茎基腐病原菌的引物及检测方法，它可以提高小麦茎基腐病原菌检测的特异性和灵敏度。

2、技术方案

为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案：

一种用于定量检测土壤中小麦茎基腐病原菌的引物，所述的引物基于小麦茎基腐病原菌的RNA聚合酶第二大亚基RPB2设计；

所述的引物为如下所示，

上游引物：SEQ ID No：1；

下游引物：SEQ ID No：2。

上述所述的用于定量检测土壤中小麦茎基腐病原菌的引物中，由SEQ ID No：1和SEQ ID No：2组成的引物对所获得的电泳条带如图2所示。

上述所述的用于定量检测土壤中小麦茎基腐病原菌的引物中，所述的电泳条带的大小为405bp。

一种用于定量检测土壤中小麦茎基腐病原菌的检测方法，包括以下步骤：

(1)提取样品中的DNA；

(2)以步骤(1)提取的DNA作为待检测DNA模板，采用权利要求1所述的引物进行普通PCR扩增反应或实时荧光定量PCR扩增反应；

(3)分析普通PCR扩增产物或实时荧光定量PCR扩增产物。

上述所述的用于定量检测土壤中小麦茎基腐病原菌的检测方法中，步骤(1)中样品来源为植物植株或土壤。

上述所述的用于定量检测土壤中小麦茎基腐病原菌的检测方法中，步骤(2)中普通扩增反应的反应体系或实时荧光定量PCR扩增反应的反应体系包括如权利要求1所述的引物的上游引物和如权利要求1所述的引物的下游引物。

上述所述的用于定量检测土壤中小麦茎基腐病原菌的检测方法中，步骤(2)中普通PCR扩增反应如下，其反应体系以25μL计为：

步骤(2)中实时荧光定量PCR扩增反应的反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min。

上述所述的用于定量检测土壤中小麦茎基腐病原菌的检测方法中，小麦茎基腐病原菌DNA的检测下限为100pg/μL。

上述所述的用于定量检测土壤中小麦茎基腐病原菌的检测方法中，步骤(2)中实时荧光定量PCR扩增反应如下，其反应体系以20μL计为：

步骤(2)中实时荧光定量PCR扩增反应的反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火45s，40个循环；97℃ 10s，65℃60s，97℃ 1s。

上述所述的用于定量检测土壤中小麦茎基腐病原菌的检测方法中，小麦茎基腐病原菌DNA的检测下限为10fg/μL。

3、有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明中用于定量检测土壤中小麦茎基腐病原菌的引物及检测方法，并将实时荧光定量技术应用到小麦茎基腐病原菌的分子检测方面，其采用的特异性引物进行普通PCR扩增及实时荧光定量PCR扩增反应，表现出特异性强、扩增效率高、灵敏度高、重现性高、实用性好的特点，特别是大大降低了样品的检测下限，实现了对低拷贝样本完成准确鉴定的关键创新，为小麦茎基腐病原菌的诊断、病害防治和农药减量使用提供新方法，极大提升了土壤中小麦茎基腐病原菌的检测效率。

附图说明

图1为不同物种RNA聚合酶的RPB2基因组序列比对图，其中划线下部为引物所在序列；

图2为引物的特异性验证；标号1-8：不同地区采集的假禾谷镰刀菌(Fusariumpseudog raminearum)；标号9：禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)；标号10：三线镰刀菌(Fusar ium tricinctum)；标号11：木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)；标号12：燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)；标号13：Fusarium culmorum；标号14：层出镰刀菌(Fusariumproliferatum)；标号15：尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)；标号16：轮枝镰刀菌(Fusarium verticil lioides)；标号17：锐顶镰刀菌(Fusarium acuminatum)；标号18：小麦平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)；标号19：小麦纹枯病菌(Ceratobasidiumcereale)；标号20：小麦雪霉叶枯病菌(Microdochium nivale)；标号21：小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis)，标号22：链格孢(Alternaria spp.)；标号23：腐霉菌(Pythium spp.)；标号M为2000mark；标号N为阴性对照；

图3为小麦茎基腐病菌基因组和其它病原菌基因组及小麦基因组混合后的特异性检测；标号1：Fpg+Fg；标号2：Fpg+wheat；标号3：Fpg+Fg+Bs+Gg+Rs；标号4：Fpg+Fg+Bs+Gg+Rs+Wheat；标号5：Fg+Bs+Gg+Rs+Wheat(CK)；标号M为2000mark；标号N为阴性对照；

图4为引物的灵敏度验证；标号1-9对应的PCR模版浓度分别为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL；标号M为2000mark；标号N为阴性对照；

图5为定量PCR按照梯度浓度稀释后的扩增曲线及对应的回归方程；

图6为小麦茎基腐病菌室内接种发病情况；标号1-6：分别表示接种1g、2g、4g、8g、16g、32g含有假禾谷镰刀菌的菌粉的情况；

图7为室内接种小麦茎基腐病菌后提取土壤基因组用于定量扩增的曲线及溶解曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

近年来，随着秸秆还田耕作制度等的改变，导致小麦茎基腐病菌在土壤中残留量加大，危害程度增加，且该病害在发生早期潜伏期长，症状不明显，早期症状与其他小麦症状相似，一直以来是小麦生产上的难题。本研究通过生物信息学分析对比，以编码RNA聚合酶的基因RPB2作为靶标，设计特异性引物，通过试验进一步筛选，进而得到特异性强、灵敏度高的分子检测引物。进一步建立定性定量检测技术和方法，为病害早期诊断，小麦病原菌的鉴定，土壤中病原菌残留量的检测提供技术支持。在此基础上，利用定量检测技术，确立了小麦茎基腐病原菌在合适的条件下侵染小麦的最低阈值，开展土壤病原菌残留定量检测，为病害预警提供依据，为我国小麦生产丰产保驾护航。

本发明的技术方案如下：

一种用于定量检测土壤中小麦茎基腐病原菌的引物，所述的引物基于小麦茎基腐病原菌的RNA聚合酶第二大亚基RPB2设计；

所述的引物为如下所示，

上游引物：SEQ ID No：1；

下游引物：SEQ ID No：2。

上述所述的用于定量检测土壤中小麦茎基腐病原菌的引物中，由SEQ ID No：1和SEQ ID No：2组成的引物对所获得的电泳条带如图2所示。

上述所述的用于定量检测土壤中小麦茎基腐病原菌的引物中，所述的电泳条带的大小为405bp。

一种用于定量检测土壤中小麦茎基腐病原菌的检测方法，包括以下步骤：

(1)提取样品中的DNA；

(2)以步骤(1)提取的DNA作为待检测DNA模板，采用权利要求1所述的引物进行普通PCR扩增反应或实时荧光定量PCR扩增反应；

(3)分析普通PCR扩增产物或实时荧光定量PCR扩增产物。

上述所述的用于定量检测土壤中小麦茎基腐病原菌的检测方法中，步骤(1)中样品来源为植物植株或土壤。

上述所述的用于定量检测土壤中小麦茎基腐病原菌的检测方法中，步骤(2)中普通扩增反应的反应体系或实时荧光定量PCR扩增反应的反应体系包括如权利要求1所述的引物的上游引物和如权利要求1所述的引物的下游引物。

上述所述的用于定量检测土壤中小麦茎基腐病原菌的检测方法中，步骤(2)中普通PCR扩增反应如下，其反应体系以25μL计为：

步骤(2)中实时荧光定量PCR扩增反应的反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min。

上述所述的用于定量检测土壤中小麦茎基腐病原菌的检测方法中，小麦茎基腐病原菌DNA的检测下限为100pg/μL。

上述所述的用于定量检测土壤中小麦茎基腐病原菌的检测方法中，步骤(2)中实时荧光定量PCR扩增反应如下，其反应体系以20μL计为：

步骤(2)中实时荧光定量PCR扩增反应的反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火45s，40个循环；97℃10s，65℃60s，97℃1s。

上述所述的用于定量检测土壤中小麦茎基腐病原菌的检测方法中，小麦茎基腐病原菌DNA的检测下限为10fg/μL。

实施例1

小麦茎基腐病原菌引物的设计

利用生物信息学，在Genbank、Ensemblfungi等基因组数据库分别获得小麦假禾谷镰刀菌(Fusarium pseudograminearum)，小麦禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)，轮枝镰刀菌(Fusarium verticillioides)，尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，黄色镰刀菌(Fusarium cul morum)，Fusarium venenatum，Fusarium fujikuroi，立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，小麦根腐平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)，链格孢菌(Alternaria alternata)，全蚀病菌(Gae umannomyces tritici)等病原菌的编码RNA聚合酶的RPB2基因组序列。再利用Bioedit软件对所下载的序列进行基因组序列比对。通过序列比对，设计小麦茎基腐病菌特异性引物(如图1所示)，其基因序列为：

上游引物SEQ ID No：1(Fpg-RPB-F1)：5’-TTGCTATCGACAAAGAGATCC-3’；

下游引物SEQ ID No：2(Fpg-RPB-R2)：5’-ATATAAGACGCGAACCCTTTT-3’。

实施例2

普通PCR扩增反应检测方法的建立及特异性验证

为进一步探究引物对Fpg-RPB-F1和Fpg-RPB-R2对F.pseudograminearum的特异性。将其他镰刀菌和小麦其他病原菌与小麦茎基腐病菌进行交叉反应试验。分别选取从不同地区田间分离的小麦茎基腐病原菌，小麦上常见病原菌，禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)，三线镰刀菌(Fusarium tricinctum)，木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)，燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)，黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)，层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)，尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，轮枝镰刀菌(Fusariumverticillioides)，小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)，小麦平脐蠕孢菌(Bipolarissorokiniana)，小麦纹枯病菌(Ceratobasidium cereale)，小麦雪霉叶枯病菌(Microdochium nivale)，小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis)，链格孢(Alternariaspp.)，腐霉菌(Pythium spp.)等病原菌。将上述病原菌在培养基上活化后，收取菌丝用于提取基因组。提取基因组使用TIANGEN公司的试剂盒(货号：DP171206)，具体方法参考试剂盒说明书。

在25μL的反应体系中进行PCR反应。反应混合物包含Taq Mix 12.5μL，DNA模板1μL，上游引物和下游引物各1μL，无菌水9.5μL。PCR循环参数为：(1)94℃初始变性4min，(2)94℃变性30s，(3)56℃退火30s，(4)72℃延伸60s，(5)程序(2)-(4)循环35次，最后在72℃延伸，10min。PCR产物(10μL)在含有明胶的1％琼脂糖凝胶上经电泳分离，并在UV透光仪下显影。使用引物ITS1和ITS4对所有供试菌株进行PCR扩增，以检查其在PCR中的完整性，并确保其上一步所得到的扩增均由引物特异性引起，以及其他镰刀菌和小麦病原菌均为阴性扩增。若在紫外光下，小麦茎基腐病菌存在分子量约为400bp的目的条带，而其他病原菌未检测到条带，同时使用引物对ITS1和ITS4的PCR产物也可在紫外光下检测到目的条带，则说明上一步中所有的阴性扩增均由引物特异性引起。试验结果表明所有茎基腐病菌均产生阳性扩增，而其他病原菌为阴性扩增(如图2所示)。该结果表明试验所用的引物及方法具有较高的特异性。

实施例3

多病害混合侵染的特异性验证

通过将小麦茎基病菌、其它小麦病菌以及小麦基因组混合后进行PCR扩增，确定该特异性引物在多种小麦病原菌存在的情况下的可行性。所选择的DNA组合为：(1)F.pseudogra minearum+F.graminearum；(2)F.pseudograminearum+wheat；(3)F.pseudograminear um+F.graminearum+B.sorokiniana+G.graminis+R.cerealis；(4)F.pseudogramine arum+F.graminearum+B.sorokiniana+G.graminis+R.cerealis+wheat；(5)F.gra minearum+B.sorokiniana+G.graminis+R.cerealis+wheat(CK)。以不加任何DNA的为阴性对照。在25μL的反应体系中进行PCR反应。反应混合物包含Taq Mix 12.5μL，DNA模板1μL，上游引物和下游引物各1μL，其后加入无菌水补充至25μL进行PCR反应。反应循环参数同上。试验结果表明(1)-(4)的组合中，含有小麦茎基腐病原菌的DNA混合物均能扩增出目的条带，而其他未含有茎基腐病原菌的混合物及小麦DNA未扩增出目的条带(如图3所示)。该实验表明，所设计的引物具有较高的特异性，且不受外界干扰。

实施例4

引物灵敏度验证

为了确定小麦茎基腐病菌特异性检测引物在PCR中成功检测时所需的最低阈值，用不同浓度的小麦茎基腐病菌DNA进行了9次PCR检测。DNA浓度分别设定为100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg和1fg。以不含DNA模板的PCR为阴性对照。在25ml反应中进行PCR扩增。反应体系及反应参数如上所述。该扩增结果表明，普通PCR扩增所用引物及方法可以最低检测为100pg的基因组量(如图4所示，上述对应浓度的编号为1-9)，同时该实验也结果表明在普通PCR模式下，参与该反应的最低检测浓度为100pg/μL。

实施例5

实时定量PCR及回归方程的建立。

采用SYBR Green I法实时荧光定量PCR(绝对定量)计算样本靶基因拷贝数。所用PCR试剂盒为：Takara TB

Premix Ex Taq^TMII(Tli RNaseH Plus)(货号：RR820)；检测仪器：Roche LightCycler 96荧光PCR仪。取绝对定量的小麦茎基腐病菌DNA作为标准品，依次按照10倍梯度进行稀释，在定量PCR反应体系中，每孔加1uL稀释后的病原菌DNA作为模版，每个反应体系中，对应的原始基因组浓度分别为，3.1×10³g，3.1×10²pg，3.1×10pg，3.1×10^-1pg，3.1×10^-2pg。其反应体系为：10μL的2×SYBR Premix EX-Taq Mi x缓冲液、引物QF/QR(10μmol/L)各0.5μL、1μL基因组模版，灭菌超纯水将体系补充至20μL。循环参数如下：(1)95℃变性30s，(2)95℃变性5s，(3)60℃退火45s，程序(2)-(3)循环40次，(4)97℃10s；(5)溶解曲线为：65℃60s，97℃1s。

实验结果表明，本研究的引物具有良好的特异性，其扩增方法也具有较高的扩增效率(如图5的A/B图所示)，其检测效率为87.5％，R2＝1.0，得到的标准曲线方程为：Y＝-4.1212*lgX+34.55，Y为定量PCR扩增的CT值，X为每孔原始的基因组浓度含量。该标准曲线方程的建立，为小麦茎基腐病菌检测提供科学平台。

实施例6

人工接种小麦茎基腐病菌及侵染阈值的检测

将高粱粒用纯净水浸泡12小时过夜，分别称取150g置于瓶中高压灭菌3次(121℃，20min)，接入活化后在PDA平板上生长3天、2×2cm大小的小麦茎基腐病菌的菌丝体，于25℃恒温箱培养，每隔2d摇晃三角瓶一次，待菌株长满后置于30℃烘箱自然烘干。烘干后将高粱粒粉碎，置于容器中搅拌均匀，再与灭菌后的土壤进行混匀，分别将1g、2g、4g、8g、16g、32g、64g菌粉与500g灭菌土均匀混合后，置于塑料培养钵中，播种小麦(所用小麦品种为安农0711)。放置与25℃温室中恒温培养，两周后观察其发病情况。试验结果表明，接入1g土壤的菌粉中，小麦正常生长，未发现明显症状。接入2g-8g菌粉的土壤，小麦出现明显发病，茎基部发黑，出现明显矮化现象，茎基部有明显黑色病斑。接入16g-32g菌粉土壤，小麦出苗率明显降低，部分植株出苗后死亡。接入64g菌粉，小麦直接苗死苗枯。

将上述接种发病后的土壤，混匀后称取250mg用于DNA提取，所用试剂盒为：生工生物“磁珠法土壤基因组DNA抽提试剂盒”(编号：B618763)，提取方法详见说明书，最终用50μL TE buffer溶解土壤病原菌基因组。上述所得基因组分别取1μL用于定量PCR检测，检测结果及对应的每克土壤中含有的小麦茎基腐病菌基因组量如表1所示，扩增曲线及溶解温度见图7的A/B图。实验结果表明，室内接种小麦茎基腐病菌土壤，提取基因组后，病原菌含量大于200pg/g土壤，在适宜的条件下，可引起小麦茎基腐病的发生(参见图6、图7及表1)。

表1利用回归方程计算出的每克土壤所含有的病原菌基因组量

实施例7

小麦茎基腐病的田间采样检测。

在的河南、山东、江苏、安徽小麦种植区定点采集土壤，采集时间为土地翻耕平整后、播种前，每份土壤在约1亩地范围内，按照5点采样法，分别采集约100g土，将5个点均匀混合后，取250mg土壤用于DNA提取，方法同上。然后利用上述定量PCR方法进行定量检测，利用回归方程计算土壤中小麦全蚀病菌的含量。同时，取200g土用于种植小麦，2-3周后观察其是否发病，具体数据见表2。实验结果表明，田间检测的土壤中，小麦茎基腐病基因组含量基腐病菌的基因组含量在200pg/g左右的土壤田块，其发病率显著提高。

表2从不同地区采集的土壤中含有的小麦茎基腐病菌的定量检测结果及使用该土壤在室内栽培小麦的发病情况

综上所述，由实施例1-7可见，本发明中用于定量检测土壤中小麦茎基腐病原菌的引物及检测方法，表现出特异性强、扩增效率高、灵敏度高、重现性高、实用性好的特点，为小麦茎基腐病原菌的诊断、病害防治和农药减量使用提供新方法，极大提升了土壤中小麦茎基腐病原菌的检测效率。目前，小麦茎基腐病在我国发生呈增加趋势，危害越来越严重，针对该现象，本研究依据小麦茎基腐病菌RPB2基因，设计特异性检测引物，提出了小麦茎基腐病菌实时定量PCR的检测方法，确定了该病菌在合适条件下侵染最低阈值，开展土壤中残留病原菌的定性检测，为病害的预警提供依据。

以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。

序列表

<110> 安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所

<120> 一种用于定量检测土壤中小麦茎基腐病原菌的分子靶标及引物

<130> HFHX-117-286

<141> 2021-07-04

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 假禾谷镰刀菌(Fusarium pseudograminearum)

<400> 1

ttgctatcga caaagagatc c 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 假禾谷镰刀菌(Fusarium pseudograminearum)

<400> 2

atataagacg cgaacccttt t 21

Claims (10)

1.一种用于定量检测土壤中小麦茎基腐病原菌的引物，其特征在于：

所述的引物基于小麦茎基腐病原菌的RNA聚合酶第二大亚基RPB2设计；

所述的引物为如下所示，

上游引物：SEQ ID No：1；

下游引物：SEQ ID No：2。

2.根据权利要求1所述的用于定量检测土壤中小麦茎基腐病原菌的引物，其特征在于：

由SEQ ID No：1和SEQ ID No：2组成的引物对所获得的电泳条带如图2所示。

3.根据权利要求2所述的用于定量检测土壤中小麦茎基腐病原菌的引物，其特征在于：

所述的电泳条带的大小为405bp。

4.一种用于定量检测土壤中小麦茎基腐病原菌的检测方法，包括以下步骤：

(1)提取样品中的DNA；

(2)以步骤(1)提取的DNA作为待检测DNA模板，采用权利要求1所述的引物进行普通PCR扩增反应或实时荧光定量PCR扩增反应；

(3)分析普通PCR扩增产物或实时荧光定量PCR扩增产物。

5.根据权利要求4所述的用于定量检测土壤中小麦茎基腐病原菌的检测方法，其特征在于：

步骤(1)中样品来源为植物植株或土壤。

6.根据权利要求4所述的用于定量检测土壤中小麦茎基腐病原菌的检测方法，其特征在于：

步骤(2)中普通扩增反应的反应体系或实时荧光定量PCR扩增反应的反应体系包括如权利要求1所述的引物的上游引物和如权利要求1所述的引物的下游引物。

7.根据权利要求4所述的用于定量检测土壤中小麦茎基腐病原菌的检测方法，其特征在于：

步骤(2)中普通PCR扩增反应如下，其反应体系以25μL计为：

步骤(2)中实时荧光定量PCR扩增反应的反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min。

8.根据权利要求7所述的用于定量检测土壤中小麦茎基腐病原菌的检测方法，其特征在于：

小麦茎基腐病原菌DNA的检测下限为100pg/μL。

9.根据权利要求4所述的用于定量检测土壤中小麦茎基腐病原菌的检测方法，其特征在于：

步骤(2)中实时荧光定量PCR扩增反应如下，其反应体系以20μL计为：

步骤(2)中实时荧光定量PCR扩增反应的反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火45s，40个循环；97℃10s，65℃60s，97℃1s。

10.根据权利要求9所述的用于定量检测土壤中小麦茎基腐病原菌的检测方法，其特征在于：

小麦茎基腐病原菌DNA的检测下限为10fg/μL。

Images