CN111088394A - 小麦根腐病菌索氏平脐蠕孢lamp检测引物组及其应用 - Google Patents
小麦根腐病菌索氏平脐蠕孢lamp检测引物组及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及小麦根腐病菌索氏平脐蠕孢LAMP检测引物组及其应用，属于基因工程技术领域，本发明以该病原菌的ITS为靶序列，建立索氏平脐蠕孢寄主的LAMP检测技术，采用的引物特异性强，反应体系的灵敏度高；通过对发病组织的检测，所述反应体系能够准确快速地从发病小麦组织中检测出小麦根腐病。该检测方法简单、快速和灵敏，并且不需要昂贵仪器，有利于在基层植保站大面积推广和使用，为小麦根腐病的早期、精准防控提供技术支持。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体地，涉及小麦根腐病菌索氏平脐蠕孢LAMP检测引物组及其应用。
背景技术
小麦根腐病是小麦生产上的一种重要病害，在我国各个麦区均有发生。该病害苗期至成株期均可发病，主要侵染小麦的茎基部和根系，引起茎基腐和根腐，严重时导致整株枯死。近年来，随着实行秸秆还田技术小麦根腐病的发生呈现上升趋势，对小麦安全生产造成一定威胁。目前，在我国小麦根腐病主要由索氏平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana和镰孢菌属Fusarium spp.等多种真菌侵染引起，同时小麦根腐病早期症状与小麦纹枯病、小麦全蚀病容易混淆，因此早期准确诊断是否是小麦根腐病及是由哪一种真菌引起对于小麦根腐病的防控十分重要。
环介导等温扩增 ( Loop mediated isothermal amplification，LAMP) 技术是一种恒温体外核酸扩增技术。通过针对靶序列的６个区域设计一组４个特异引物，利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在60～65℃恒温条件下60 min就可扩增出109拷贝靶序列。相比常规PCR检测技术，该技术具有特异性强、灵敏度高、快速简便且成本低 廉的特点，已广泛应用于病原微生物的检测。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明的目的在于提供小麦根腐病菌索氏平脐蠕孢LAMP检测引物组及其应用，采用所述引物组检测小麦根腐病，特异性强，灵敏度高，能准确区分检测索氏平脐蠕孢或其他病原菌。
为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：
小麦根腐病菌索氏平脐蠕孢LAMP检测引物组，其特征在于：包括四条特异性引物，具体如下：
GF-FIP：GGCGCAATGTGCGTTCAAAGATGAACGCAGCGAAATGCGATA；
GF-BIP：TGGTATTCCAAAGGGCATGCCTCCCAACACCAAGCAAAGCT；
GF-F3：TCTCTTGGTTCTGGCATCGA；
GF-B3：TCCCAGAAAGAGGGAGACAA；
所述四条特异引物的靶标基因为小麦根腐病菌索氏平脐蠕孢的ITS。
本发明还提供所述LAMP检测引物组在检测小麦根腐病菌方面的应用。
有益效果：
本发明是基于小麦根腐病原菌的ITS为靶序列和所述的四个特异性引物建立的小麦根腐病菌索氏平脐蠕孢的LAMP检测技术，其特异性很强，使用LAMP引物（GF-FIP、GF-BIP、GF-F3和GF-B3）对索氏平脐蠕孢、小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌、小麦赤霉病菌、小麦条锈病菌、小麦叶锈病菌、小麦白粉病菌、整齐小核、立枯丝核、链格孢菌、固执腐霉、瓜果腐霉、大豆疫霉和烟草疫霉等14种病原菌的DNA进行LAMP扩增，结果显示只有索氏平脐蠕孢的LAMP反应呈黄绿色的阳性反应。此外，将所述引物应用于小麦根腐病的检测，其检测灵敏度仅为1pg。通过对发病组织的检测，发现所述反应体系在寄主植物DNA干扰条件下仍能够准确检测出索氏平脐蠕孢。能准确区分检测出索氏平脐蠕孢或其他病原菌侵染。本发明所述技术为小麦根腐病的早期、精准防控提供技术支持。
附图说明
图1是LAMP引物的特异性试验结果图；其中，1-索氏平脐蠕孢，2-小麦纹枯病菌，3-小麦全蚀病菌，4-小麦赤霉病菌，5-小麦叶锈病菌，6-小麦条锈病菌，7-小麦白粉病菌，8-整齐小核，9-立枯丝核，10-链格孢菌，11-固执腐霉，12-瓜果腐霉，13-大豆疫霉，14-烟草疫霉，15-阴性对照；
图2是LAMP引物的灵敏度试验结果图；其中，N为阴性对照；
图3是LAMP检测小麦发病组织试验结果图；其中，N为阴性对照，P为阳性对照。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
供试菌株共14种植物病原菌，均为小麦的重要病原菌和常见的土传病原菌，其中小麦根腐病菌索氏平脐蠕孢8株，其它种类病原菌各1株，具体信息见表1。
表 
用于LAMP检测菌株的信息
1.2 供试培养基
供试培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）和V8汁琼脂培养基（V8 juice agar, V8A）。PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉15 g、蒸馏水1L；V8A培养基：V8汁200 mL，碳酸钙3 g，琼脂粉15 g、蒸馏水800 mL；液培菌株时，所用的培养基为不添加琼脂粉的对应液体培养基。
1.3 引物的设计与合成
索氏平脐蠕孢B. sorokiniana的ITS序列（MH538292.1）从GenBank网站下载，使用PrimerExplore在线软件设计LAMP引物，选定3套引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成，通过预试验筛选出1套符合要求的LAMP引物（表2），-20℃冰箱保存备用。其中，GF-FIP的引物序列如SEQ ID NO：1所示；GF-BIP的引物序列如SEQ ID NO：2所示；GF-F3的引物序列如SEQ ID NO：3所示；GF-B3的引物序列如SEQ ID NO：4所示。
表
LAMP引物序列
1.4 基因组DNA的提取
液体培养病原菌3 d，滤纸过滤收集菌丝（小麦条锈病菌、小麦叶锈病菌和小麦白粉病菌等专性寄生菌直接从小麦发病部位收集孢子堆），使用植物基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）进行基因组DNA的提取，提取后使用NanoDrop 1000超微量分光光度计测定DNA的浓度和纯度。
1.5 LAMP反应体系与程序
通过预试验确定LAMP反应体系为：2.5 μL 10×ThermoPol Buffer，1.5 μL 100 mMMgSO4、3.5 μL 10 mM dNTPs、10 μM GF-FIP和GF-BIP各4 μL、10 μM GF-F3和GF-B3各0.5 μL、１μL 8000U/mL Bst DNA Polymerase和１μL模板DNA，灭菌超纯水补足25 μL。
反应程序：上述试剂混均匀后，置恒温64℃水浴锅中反应60 min，然后向反应体系中加入 1μL核酸染料SYBR Green I，混匀后观察反应体系颜色的变化，蓝光切胶仪照射下（波长440～485 nm）阳性为荧光黄绿色，阴性为橙色。
1.6 LAMP引物特异性与灵敏度的检测
为检测LAMP引物的特异性，使用小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌、小麦赤霉病菌、小麦条锈病菌、小麦叶锈病菌、小麦白粉病菌、整齐小核、立枯丝核、链格孢菌、固执腐霉、瓜果腐霉、大豆疫霉和烟草疫霉等13种小麦重要病原菌和常见土传病原菌作为参考菌株，以索氏平脐蠕孢为目标菌株，以灭菌超纯水为阴性对照，进行LAMP反应。
为检测LAMP引物的灵敏度，将索氏平脐蠕孢DNA稀释成10 ng/μL、1 ng/μL、100pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL和1 fg/μL，添加１μL到体系中进行LAMP反应。以灭菌超纯水为阴性对照。
1.7 发病组织与田间样品的检测
平板培养索氏平脐蠕孢3d，切取菌丝快接种到小麦茎基部，保湿3 h、6 h、12 h、24 h和48 h后，截取小麦接种部位组织，使用植物基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取小麦组织DNA，将其作为 DNA模板用于LAMP检测，以索氏平脐蠕孢DNA作为阳性对照，以健康小麦组织DNA作为阴性对照。
2019 年3月，从河南省洛阳市采集疑似小麦根腐病样品45份，选取根和茎基部，使用植物基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取样品 DNA，以索氏平脐蠕孢DNA作为阳性对照，以健康小麦组织DNA作为阴性对照，进行LAMP检测，每个样品重复检测3次。
2 结果与分析
2.1 LAMP引物的特异性
使用LAMP引物（GF-FIP、GF-BIP、GF-F3和GF-B3）对索氏平脐蠕孢、小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌、小麦赤霉病菌、小麦条锈病菌、小麦叶锈病菌、小麦白粉病菌、整齐小核、立枯丝核、链格孢菌、固执腐霉、瓜果腐霉、大豆疫霉和烟草疫霉等14种病原菌的DNA进行LAMP扩增，结果显示只有索氏平脐蠕孢的LAMP反应呈黄绿色的阳性反应，其它病原菌的LAMP反应均呈橙色的阴性反应（图1），说明该反应体系具有很强的特异性。
2.2 LAMP引物的灵敏度
以10倍梯度稀释的索氏平脐蠕孢DNA为模板进行LAMP扩增，结果显示当DNA模板的量为10 ng、1 ng、100 pg、10 pg和1 pg时LAMP反应呈黄绿色的阳性反应，而DNA模板的量为100fg、10 fg和1 fg时LAMP反应呈橙色的阴性反应（图2），说明该反应体系的灵敏度为1 pg。
2.3 发病组织的检测
提取接种索氏平脐蠕孢3 h、6 h、12 h、24 h和48 h的小麦组织DNA，进行LAMP扩增，结果显示DNA模板为接种3 h和6 h的小麦组织DNA时LAMP反应呈橙色的阴性反应，DNA模板为接种12 、24h和48 h的小麦组织DNA时LAMP反应呈黄绿色的阳性反应（图3），说明该反应体系在寄主植物DNA干扰条件下能够准确检测出索氏平脐蠕孢，检出时间为侵染12 h以上。
2.4 田间小麦样品的检测
使用选定的LAMP引物对从洛阳采集的45份疑似小麦根腐病样品进行了LAMP检测，结果发现22份样品呈阳性反应，检出率为48.89%，说明这个地区索氏平脐蠕孢是导致小麦发生根腐的主要原因，但是也存在其它病原菌侵染的情况。
需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南科技大学
<120> 小麦根腐病菌索氏平脐蠕孢LAMP检测引物组及其应用
<130> 1
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ggcgcaatgt gcgttcaaag atgaacgcag cgaaatgcga ta 42
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
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<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
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<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
tcccagaaag agggagacaa 20
Claims (2)
1.小麦根腐病菌索氏平脐蠕孢LAMP检测引物组，其特征在于：包括四条特异性引物，具体如下：
GF-FIP：GGCGCAATGTGCGTTCAAAGATGAACGCAGCGAAATGCGATA；
GF-BIP：TGGTATTCCAAAGGGCATGCCTCCCAACACCAAGCAAAGCT；
GF-F3：TCTCTTGGTTCTGGCATCGA；
GF-B3：TCCCAGAAAGAGGGAGACAA；
所述四条特异引物的靶标基因为小麦根腐病菌索氏平脐蠕孢的ITS。
2.根据权利要求1所述的LAMP检测引物组在检测小麦根腐病菌方面的应用。
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