CN105039504A

CN105039504A - 假禾谷镰刀菌lamp的检测引物、反应体系及检测方法

Info

Publication number: CN105039504A
Application number: CN201510176701.5A
Authority: CN
Inventors: 施艳; 李洪连; 王振跃; 史亚娟; 陈琳琳; 孙炳剑
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2015-04-15
Filing date: 2015-04-15
Publication date: 2015-11-11

Abstract

本发明公开了一种假禾谷镰刀菌LAMP的检测引物，所述检测引物的序列如下：外引物FpF35ˊTCCCACAAATCATTCCCTGG3ˊ；外引物FpB35ˊAACATACCAATGACGGTGACA3ˊ；内引物FpFIP5ˊAGGAACCCTTACCGAGCTCGGGCGCATCATCACGTGTCA3ˊ；内引物FpBIP5ˊCAAGCTCAAAGCCGAGCGTGAAGGAGTCTCGAACTTCCAGA3ˊ。本发明所提供的假禾谷镰刀菌LAMP检测方法特异性强，所用的特异引物根据假禾谷镰刀菌的EF1-α区域设计出4条引物，特异性比常规PCR要强。检测时间短，1h左右即可获得检测结果，比常规PCR节省2-4h。仪器设备要求低，不需要普通PCR所需的PCR仪、凝胶电泳成像系统，只需要一个水浴锅即可完成检测。

Description

假禾谷镰刀菌LAMP的检测引物、反应体系及检测方法

技术领域

本发明涉及一种快速灵敏检测技术的建立，特别是涉及一种与假禾谷镰刀菌相关的恒等温扩增技术的建立，本发明还涉及该技术的优化。

背景技术

小麦土传真菌病害主要有纹枯病、全蚀病、根腐病及茎基腐病。在我国小麦产区普遍发生，并有逐年加重的趋势，严重威胁我国粮食生产安全。茎基腐病（crownrot）是由多种病原真菌引起的一种小麦病害，在澳大利亚、欧洲、北美、南非、北非及西亚等小麦生产区均有发生。茎基腐病破坏小麦茎基部，小麦根冠及茎基部产生坏死斑，造成苗枯、根腐、白穗等症状。在澳大利亚茎腐病是冬小麦生产中的一个主要病害，可造成小麦减产，有时可导致产量损失89%。澳大利亚学者认为引起小麦茎基腐病的主要病原为假禾谷镰刀菌（Fusariumpseudograminearum）。Smiley等对美国西北部太平洋沿岸小麦产区病原菌进行分类研究，认为其是由F.pseudograminearum、F.culmorum、F.avenaceum及F.acuminatum混合侵染的。在我国研究报道较少，陈厚德等认为小麦茎基腐病的病原菌是以镰孢菌为主，交链孢次之，而且镰孢菌致病力较强。李洪连等在中国首次报道了F.pseudograminearum引起小麦茎基腐病。

Aoki&O’Donnell通过形态学特征、生理学特征及基因序列差异证明禾谷镰刀菌（F.graminearum）群体1并非禾谷镰刀菌的一个类群，二者在孢子形态、基因序列等方面存在很大差异，故将此命名为假禾谷镰刀菌（Fusariumpseudograminearum），并设计其特异检测引物Fp1-1、Fp1-2，这也是假禾谷镰刀菌首次分子检测的报道。Akinsanmi等分别使用Fg16NF/R、Fp1-1和Fp1-2及其他引物对昆士兰和新南威尔士北部小麦病田F.graminearum、F.pseudograminearum等其他镰孢菌种类进行了鉴定和致病力分析；TigstDemeke等证实PCR检测与琼脂平板法和单端孢霉烯分析结果一致，可用于镰刀菌的种类鉴定；Ophel-Keller等采用TaqManReal-timePCR可对500g土壤中F.graminearum、F.culmorum、F.pseudograminearum及其他病原菌含量进行评估；Hogg等根据Tri5基因和β-actin基因（mjba-1）建立了相对定量PCR检测小麦上Fusarium侵染动态。

病害的准确诊断是病害防控的基础，目前诊断病原真菌的方法有形态学鉴定和分子生物学鉴定。利用形态特征进行分类鉴定是最直观、最常用的分类方法，但其耗时长，操作繁琐，且对于形态特征相似物种难以确定。近些年来，分子生物学技术的发展使得对病害的快速检测成为可能，同时分子生物学技术具有方法简单、检测快速、灵敏度高等优点，现已广泛应用于病原菌的分类、鉴定、病害的诊断及检测等方面。

以PCR为基础的分子鉴定方法在一定程度上克服了传统形态学鉴定的缺陷，但PCR检测需要专业、昂贵的仪器设备，并且需要专业的实验人员操作，检测仅限在实验室条件下进行，需要较长时间，限制了PCR检测方法在生产上的推广应用。

环介导恒等温扩增技术（loopmediatedisothermalamplification,LAMP）是一种在一般恒温条件下进行的扩增技术，所用设备简单、花费少，普通水浴锅或其他有稳定热源的装置就可以采用，不需要PCR仪和电泳仪等昂贵设备，同时它的检测灵敏度高，特异性强，结果肉眼课件，能够快速检测病原物。所以，建立假禾谷镰刀菌的LAMP检测体系有利于田间病害发生的快速检测。

发明内容

本发明的目的是建立LAMP检测假禾谷镰刀菌的快速检测方法。

一种假禾谷镰刀菌LAMP快速检测方法，所述检测引物的序列如下：

外引物FpF35'TCCCACAAATCATTCCCTGG3'

外引物FpB35'AACATACCAATGACGGTGACA3'

内引物FpFIP5'AGGAACCCTTACCGAGCTCGGGCGCATCATCACGTGTCA3'

内引物FpBIP5'CAAGCTCAAAGCCGAGCGTGAAGGAGTCTCGAACTTCCAGA3'。

利用权利要求1所述的假禾谷镰刀菌LAMP的检测引物进行LAMP反应的反应体系，25μl反应体系中：

（1）引物混合液：0.2μmol/L外引物FpB3、0.2μmol/L外引物FpF3，1.6μmol/L内引物FpFIP、1.6μmol/L内引物FpBIP；

（2）反应混合液：10mmol/LdNTP、20mmol/LTris-HCl(pH8.8)、10mmol/LKCl、5mmol/LMgSO₄、10mmol/L(NH₄)₂SO₄、0.1%Trintonx-100、0.1mol/L甜菜碱、8UBstDNA聚合酶大片段；

（3）1μl模板DNA，加灭菌双蒸馏水补全到25μl。

所述的假禾谷镰刀菌LAMP的反应体系的检测方法：将引物混合液和反应混合液混匀后加入1μl模板DNA，加灭菌双蒸馏水补全到25μl，61~66℃保温30~90min，82℃保温10min，得到的产物中加入有显色剂，轻甩离心管观察，所述显色剂为SYBRGreenI与PCR级DMSO的混合物，SYBRGreenI与PCR级DMSO的体积比为1：9。

所述的假禾谷镰刀菌LAMP的检测方法在诊断植物的假禾谷镰刀菌感染情况或鉴别假禾谷镰刀菌中的应用。

本发明的有益效果是：本发明利用环介导恒等温扩增技术建立假禾谷镰刀菌的检测方法，本方法具有多条引物的扩增，并在两端形成具有引物作用的环状结构，这种多引物结合的原理使其具有了高灵敏度和特异性的特点，鉴于LAMP反应操作步骤简单以及反应产物产生大量核酸和焦磷酸镁的沉淀，通过荧光剂显色后可以用肉眼观察判定反应结果，无需专业的仪器设备，适用于各种实验条件下的使用。

本发明所提供的假禾谷镰刀菌LAMP检测方法具有以下优点：

特异性强，所用的特异引物根据假禾谷镰刀菌的EF1-α区域设计出4条引物，特异性比常规PCR要强。

检测时间短，1h左右即可获得检测结果，比常规PCR节省2-4h。

仪器设备要求低，不需要普通PCR所需的PCR仪、凝胶电泳成像系统，只需要一个水浴锅即可完成检测。

操作简单、结果明显，整个检测过程不需要使用复杂的仪器设备，结果肉眼可见。

综上所述，本发明具有比现有PCR技术检测假禾谷镰刀菌更高的灵敏度，更强的特异性，可以在实际生产中现场应用检测。该技术可应用于对假禾谷镰刀菌田间土壤样品及植物上假禾谷镰刀菌病发生的早期快速分子检测，具有实际的应用价值。

附图说明

图1为假禾谷镰刀菌ITS序列的LAMP引物设计示意图，其中A为假禾谷镰刀菌LAMP引物的位点，B为假禾谷镰刀菌LAMP引物设计示意图；

图2为不同反应温度下假禾谷镰刀菌LAMP方法电泳检测

M:DL200标准分子量（Takara）.1-6:反应温度61℃-66℃.7:阴性对照，无扩增产物。

具体实施方式

实验材料：实验室分离的假禾谷镰刀菌。

主要试剂：TaqDNA聚合酶、DNAmarker购自Takara公司；引物由南京金斯瑞生物技术有限公司合成；蛋白酶K购自Roche公司；BstDNA聚合酶大片段购自NEB公司；SYBRGreenI购自Invitrogen公司。

1真菌菌丝的收集

取保存的菌株接种于PDA平板上，25℃下生长3d，挑新鲜菌丝，接种于装有1／3体积PDB的250mL三角瓶中。25℃120r/min，培养3-4d，至生成大量菌丝团为止。双层纱布过滤，蒸馏水连续冲洗，滤纸吸干水分，置于1.5mL离心管-20℃保存备用。

2真菌DNA的提取

采用改进的CTAB法提取真菌菌丝DNA，具体步骤如下：

（1）取适量的菌丝（约0.5g）于研钵中，加液氮快速磨成粉末（至少加液氮研磨3次）；

（2）将样品粉末用灭菌的药匙转移到1.5mL的离心管中，加700μL在65℃水浴锅中预热的CTAB提取缓冲液，然后将离心管放在65℃的恒温水浴中保持45min，每隔10min轻轻的颠倒几次，使粉末和缓冲液混合均匀；

（3）12000rpm，4℃离心10min，吸取上清液；

（4）加入700μL抽提液I（苯酚：氯仿：异戊醇=25：24：1），轻轻颠倒数次至溶液混匀；

（5）12000rpm，4℃离心10min，吸取上清液；

（6）加入700μL抽提液I，轻轻颠倒数次至溶液混匀；

（7）12000rpm，4℃离心10min，吸取上清液；

（8）加入600μL抽提液Ⅱ（氯仿：异戊醇=24：1），反复混匀；

（9）12000rpm，4℃离心10min，吸取上清液；

（10）加入600μL预冷的异丙醇，轻轻摇匀，放在冰上30min；

（11）弃上清，并加入600μL70%的乙醇洗涤沉淀两次；

（12）置于无菌操作台上，吹干（约20min）；

（13）加入20-200μLddH₂O，溶解DNA；

（14）使用分光光度计检测DNA浓度，并将浓度调整为约100ng/μL，-20℃保存备用。

3.假禾谷孢囊线虫LAMP引物设计

根据假禾谷镰刀菌EF1-α序列，设计并筛选下述LAMP引物（图1），其中包括两条外引物（F3和B3），两条内引物（FIP和BIP），FIP由F1c-F2组成，BIP由B1c-B2组成，F1c和B1c分别是F1和B1的互补序列。引物由南京金斯瑞生物技术有限公司合成。序列如下：

外引物FpF35'TCCCACAAATCATTCCCTGG3'

外引物FpB35'AACATACCAATGACGGTGACA3'

内引物FpFIP5'AGGAACCCTTACCGAGCTCGGGCGCATCATCACGTGTCA3'

内引物FpBIP5'CAAGCTCAAAGCCGAGCGTGAAGGAGTCTCGAACTTCCAGA3'

4.LAMP反应体系配制：外引物FpB3和FpF3各0.2μmol/L，内引物FpFIP和FpBIP各1.6μmol/L；10mmol/LdNTP，20mmol/LTris-HCl(pH8.8),10mmol/LKCl,5mmol/LMgSO₄,10mmol/L(NH₄)₂SO₄,0.1%Trintonx-100,0.1mol/L甜菜碱，8UBstDNA聚合酶大片段。

1μl模板DNA；加灭菌双蒸馏水补全到25μl。

5.LAMP反应体系扩增条件：将以上反应成分加入离心管混合后，置于60~65℃恒温水浴中30~90min，82℃保温10min。

6.LAMP结果检测：结果可以采用以下两种检测方法：

1）将上述反应完的体系中加入2μl的显色剂，轻晃混匀，即可肉眼观察。

2）取2μl扩增产物在2%琼脂糖凝胶电泳中电泳观察梯形条带。

检测结果：阳性结果，具有绿色荧光；阴性对照，为深褐色。

<110>河南农业大学

<120>假禾谷镰刀菌LAMP的检测引物、反应体系及检测方法

<140>2015101767015

<140>2015-04-15

<160>4

<210>1

<211>

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(20)

<400>1

tcccacaaatcattccctgg20

<210>2

<211>

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(21)

<400>2

aacataccaatgacggtgaca21

<210>3

<211>

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(39)

<400>3

aggaacccttaccgagctcgggcgcatcatcacgtgtca39

<210>4

<211>

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(41)

<400>4

caagctcaaagccgagcgtgaaggagtctcgaacttccaga41

Claims

1.一种假禾谷镰刀菌LAMP的检测引物，其特征在于：所述检测引物的序列如下：

外引物FpF35'TCCCACAAATCATTCCCTGG3'

外引物FpB35'AACATACCAATGACGGTGACA3'

内引物FpFIP5'AGGAACCCTTACCGAGCTCGGGCGCATCATCACGTGTCA3'

内引物FpBIP5'CAAGCTCAAAGCCGAGCGTGAAGGAGTCTCGAACTTCCAGA3'。

2.利用权利要求1所述的假禾谷镰刀菌LAMP的检测引物进行LAMP反应的反应体系，其特征在于，25μl反应体系中：

引物混合液：0.2μmol/L外引物FpB3、0.2μmol/L外引物FpF3，1.6μmol/L内引物FpFIP、1.6μmol/L内引物FpBIP；

反应混合液：10mmol/LdNTP、20mmol/LTris-HCl(pH8.8)、10mmol/LKCl、5mmol/LMgSO₄、10mmol/L(NH₄)₂SO₄、0.1%Trintonx-100、0.1mol/L甜菜碱、8UBstDNA聚合酶大片段；

1μl模板DNA，加灭菌双蒸馏水补全到25μl。

3.如权利要求2所述的假禾谷镰刀菌LAMP的反应体系的检测方法，其特征在于：将引物混合液和反应混合液混匀后加入1μl模板DNA，加灭菌双蒸馏水补全到25μl，61~66℃保温30~90min，82℃保温10min，得到的产物中加入有显色剂，轻甩离心管观察，所述显色剂为SYBRGreenI与PCR级DMSO的混合物，SYBRGreenI与PCR级DMSO的体积比为1：9。

4.如权利要求3所述的假禾谷镰刀菌LAMP的检测方法在诊断植物的假禾谷镰刀菌感染情况或鉴别假禾谷镰刀菌中的应用。