CN102174650A

CN102174650A - 一种象耳豆根结线虫lamp快速检测方法及应用

Info

Publication number: CN102174650A
Application number: CN2011100349606A
Authority: CN
Inventors: 彭德良; 何旭峰; 彭焕
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2011-02-09
Filing date: 2011-02-09
Publication date: 2011-09-07
Anticipated expiration: 2031-02-09
Also published as: CN102174650B

Abstract

本发明涉及“一种象耳豆根结线虫LAMP快速检测方法及应用”。根据克隆测序的象耳豆根结线虫ITS序列，在其序列保守区域设计了5条LAMP引物MEF3、MEB3、MEFIP、MEBIP和MELB；并配制了LAMP反应体系。通过对象耳豆根结线虫DNA提取，象耳豆根结线虫等温扩增、扩增产物显色检测，从而快速检测出象耳豆根结线虫。本发明的检测方法特异性强、灵敏度高、成本低廉、操作简便，在象耳豆根结线虫现场快速检测和象耳豆根结线虫病的早期诊断方面具有很高的应用价值。

Description

一种象耳豆根结线虫LAMP快速检测方法及应用

技术领域

本发明涉及一种象耳豆根结线虫LAMP快速检测方法及应用，属于生物技术领域。

背景技术

根结线虫(Meloidogyne spp.)属植物根系专性内寄生物，是世界性分布的威胁农业生产的主要病原物和世界各国的植物检疫对象。迄今已记载的根结线虫有70余种，其中南方根结线虫(M.incognita)、爪哇根结线虫(M.javanica)和花生根结线虫(M.arenaria)因其广分布性和多寄主性是最重要的种类。

在我国，这三种根结线虫在大多数省(区)均有发生，侵染农作物达百种以上，致使寄主常年减产15～25％，有时达70％以上(徐建华等.1994)，严重地制约了大棚蔬菜、果树、花卉等作物的生产和出口创汇。据估计，我国农作物的生产每年因根结线虫的为害而遭受的经济损失达数亿元以上。

据调查研究，我国分布最广泛、最常见的根结线虫与世界各地类似，包括南方根结线虫(M.incognita)、爪哇根结线虫(M.javanica)、花生根结线虫(M.arenaria)和北方根结线虫(M.hapla)。近年来，另一种根结线虫-象耳豆根结线虫(M.enterolobii)越来越受到人们的重视。该线虫是1983年在我国海南省儋州市象耳豆树上发现的一个新种。

根结线虫的传统鉴定方法主要根据形态学，主要是根据会阴花纹进行鉴定，但由于不同地理种群之间存在较大的变异性导致有时结果不够准确。象耳豆根结线虫部分会阴花纹形态与南方根结线虫会阴花纹形态相似，仅根据该特征，有可能将象耳豆根结线虫误诊。同时形态特征细微复杂，对专业知识要求高，鉴定过程耗时、费力，且需要大量线虫样本，单头线虫不能鉴定到种。后来发展的同工酶技术虽然能快速准确的鉴定不同的根结线虫种类，它同样需要有大量的雌虫，因而不适用于多数情况下幼虫和卵的检测。

由于形态学和同工酶技术的局限性，上世纪90年代起开始了根结线虫分子鉴定的研究。目前针对根结线虫的PCR诊断法主要基于核糖体DNA(rDNA)的ITS和IGS序列的rDNA-PCR法，基于mtDNA的mtDNA-PCR-RFLP法和基于SCAR的SCAR-PCR法。

真核生物的rDNA在基因组内是以串联重复序列的形式出现，每一串联重复序列包括3个编码区(18SrRNA，5.8SRNA，28SRNA)和两个ITS(Internal Transcribed Spacers)区，两个串联重复序列之间各一段IGS(Intergenetic Spaces)区。ITS是由Gonzalez在1990年提出随后发展起来的全新分子标记，其优点在于拷贝数多，同时包含保守和变异序列，根据保守序列中的变异位点设计特殊引物进行特异性扩增。

Zijlstra等(Zijlstra C.，A.E.M.lever，B.J.Uenk，and C.H.Van Silfhout.Differences betweenITS regions of islatoes of root-knot nematodes Meloidogyne hapla and M.chitwoodi[J].Phytopatholgy，1995，85：1260～1268；Zijlstra Carolien.，A fast PCR assay to identifyMeloidogyne hapla，M.chitwoodi，and M.fallax，and to sensitively differentiate them from eachother and from M.incognita in mixtures[J].Fundam.appl.Nematol.，1997，20(5)，505～511.)分析了M.hapla，M.chitwoodi和M.fallax ITS区的差异进行了ITS-PCR-RFLP分析，发现用Aui I、DraI、HinfI可将二者分开，并且还能将二者与M.incognita和M.javanica分开。Pertersen等(Petersen，D.J.，Zijlstra，C.，Wishart，J.，Blok，V.&Vrain，T.C.(1997).Specific probes efficientlydistinguish root-knot nematode species using signature sequence in the ribosomal intergeneticspacer.Fundamental and Applied Nematology 20，619-626.)根据IGS区的差异，设计了5条PCR引物，应用multiplex-PCR同时实现了对M.chitwoodi、M.fallax和M.hapla的鉴定，其灵敏度可达单条幼虫水平。然而Powers等(Powers，T，O.and C.Fleming 1998.Biochemical andmolecular characterization.In Perry，R.N.and D.J.Wright(edts)Free-living and Plant-parasiticnematodes.CABI Publishing 1998.Pp355-380)发现M.incognita、M.javanica和M.arenaria ITS序列一致，Hugall等(1999)通过序列分析发现3种多倍体的主要根结线虫(M.incognita、M.javanica和M.arenaria)ITS区遗传变异较大，因此基于rDNA的鉴别方法无法有效区分主要根结线虫种群。

随机扩增的DNA多态性技术(RAPD，Random Amplified Polymorphic DNA)是依赖一系列不同的随机排列的寡核苷酸作为引物，对所研究的基因组DNA进行扩增，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析，经EB染色检测扩增产物的多态性。Wiliamson等(Williamson，V.M，Caswell-Chen，E.P.，B.B.Westerdahl，F.F.&G.Caryl.1997.A PCR Assay to identify and distinguish singlejuveniles of Meloidogyne hapla and M.chitwoodi.Journal ofNematology，29(1)：9-15.)通过对M.chitwoodi和M.hapla基因组DNA的RAPD分析，筛选出具有M.hapla种鉴定特征的特异性片段，经克隆测序后，设计了一对特异性引物，准确鉴定了M.hapla；Zijlstra等(Zijlstra，C.，2000.Identificationof Meloidogyne chitwoodi，M.fallax and M.hapla based on SCAR-PCR： a powerful way of enabling reliableidentification of populations orindividuals that share common tra

以PCR为基础的分子鉴定方法一定程度上克服了传统形态鉴定上的缺陷。但PCR检测需要PCR仪、凝胶电泳和成像系统(紫外仪)等昂贵的专业仪器和分子生物学试剂，且需要分子生物学专业实验人员操作，以上检测只能在实验室条件下才可以检测，需要较长的时间，限制了PCR检测方法在生产中的推广应用。

循环恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本学者Notomi(2000年)等人开发的一种新型循环恒温核酸扩增技术。反应采用能特异识别靶序列上6个位点的4条引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)，在等温条件下℃(左右)可以高效(30min～1h)和特异的扩增目标DNA。在LAMP反应过程中，从dNTPs中析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的镁离子结合，能产生焦磷酸镁沉淀物，出现浑浊沉淀，因此用肉眼就判定扩增结果，也可通过向其扩增产物中添加荧光染料通过变化来判定结果，也可通过琼脂糖凝胶电泳进行观察可以看到梯形条带，尤其适宜于基层的简洁快速检测。LAMP反应具有简单、快速、高效、经济等特征。因而具有极为广泛的应用前景

目前，LAMP在动物疫病和食品安全方面广泛应用，国内最早报道是在2002年北京奶牛中心运用引进的LAMP法进行胚胎性别的检测。2009年日本Kikuchi开发出松材线虫LAMP快速检测体系，能在1小时内检测到松材线虫。但在象尔豆根结线虫上的尚无相关报道。本发明第一次采用LAMP技术检测象耳豆根结线虫。

发明内容

本发明的目的是建立循环恒温扩增技术(LAMP)检测象耳豆根结线虫的LAMP快速检测方法。

同时提供该检测方法所用的试剂盒。

一种象耳豆根结线虫LAMP快速检测方法，其特征在于：其中LAMP反应体系所使用的引物是：

①MEF3：5’-GGCTGTATATGTGGTGACAT-3’，

②MEB3：5’-AGTTCGCAAAACTTATCGC-3’，

③MEFIP：5’-GAAAAAAAGAGTGCTGGCGTCCGTTAGGACTAAATGAGTTTAAGACT-3’，

④MEBIP：5’-AACAAAATTCCTAGCCTTTCCGGAGTTTGCTGCGTTCTTCA-3’，

⑤MELB：5’-TGGATCACTAGGCTCGTGGATCG-3’。

其中的LAMP反应体系包括：

1)引物混合液：外引物MEF3和MEB3各0.2μmol/L，内引物MEFIP和MEBIP各1.6μmol/L，环引物MELB为0.4μmol/L；

2)反应混合液：10mmol/L dNTP，20mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，10mmol/L KCl，5mmol/L MgSO₄，10mmol/L(NH₄)₂SO₄，0.1％Triton x-100，0.1mol/L甜菜碱，8U Bst DNA聚合酶大片段，

3)1μlDNA模板；

加灭菌双蒸馏水补全到25μl。

其中LAMP反应条件如下：将引物混合液和反应混合液混合均匀后加入1μl DNA模板，61～65℃保温30～90min，82℃保温10min。

其中LAMP反应的最终产物中加入有显色剂，轻甩离心管观察。

所述显色剂为SYBR green I与PCR级DMSO的混合物，其体积比为1∶9。

所述DNA模板的提取方法为：挑取单头象耳豆根结线虫放入装有10μlddH₂O的0.2mL离心管中，加入8μl的LB溶液，2μl的20mg/ml蛋白酶K溶液，点动离心后，放入液氮中，再放入37℃水浴锅中，待融化后放入液氮中，重复6～7次，然后在-80℃下冷冻30min；然后将离心管在65℃下温育90min，95℃反应10min处理后上清液作为线虫DNA模板直接用于LAMP和PCR反应，所述LB溶液为500mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl，15mmol/LMgCl₂，1.0mmol/L DTT，4.5％Tween20，等体积混匀，过滤灭菌。

一种象耳豆根结线虫LAMP快速检测试剂盒，包括反应混合液和引物混合液，所述引物混合液为：外引物MEF3和MEB3各0.2μmol/L，内引物MEFIP和BIP各1.6μmol/L，环引物MELB为0.4μmol/L，所述反应混合液为10mmol/L dNTP，20mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，10mmol/L KCl，5mmol/L MgSO₄，10mmol/L(NH₄)₂SO₄，0.1％Triton x-100，0.1mol/L betaine，和单独包装的8U Bst DNA聚合酶大片段，所述引物混合液中的引物序列分别为：

①MEF3：5’-GGCTGTATATGTGGTGACAT-3’，

②MEB3：5’-AGTTCGCAAAACTTATCGC-3’，

③MEFIP：5’-GAAAAAAAGAGTGCTGGCGTCCGTTAGGACTAAATGAGTTTAAGACT-3’，

④MEBIP：5’-AACAAAATTCCTAGCCTTTCCGGAGTTTGCTGCGTTCTTCA-3’，

⑤MELB：5’-TGGATCACTAGGCTCGTGGATCG-3’。

所述试剂盒还包括显色剂，所述显色剂为SYBR green I与PCR级DMSO的混合物，其体积比为1∶9。

所述试剂盒还包括DNA提取试剂，所述DNA提取试剂包括1)8μl的LB(Lysis Buffer)溶液：500mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl，15mmol/L MgCl₂，1.0mmol/L DTT，4.5％Tween20，等体积混匀，2)2μl的蛋白酶K：20mg/ml蛋白酶K。

上述任一检测方法或上述任一试剂盒在诊断植物、土壤的象耳豆根结线虫感染情况或鉴别象耳豆根结线虫中的应用。

本发明利用循环恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)建立针对象耳豆根结线虫的检测方法。本方法具有多条引物的扩增，并在两端形成了带有引物功能的环状结构，这种多引物结合和可自产生引物的原理使其具有了灵敏度高、特异性强等特点，由于LAMP反应操作步骤简单及反应产物中包含大量核酸和焦磷酸镁的沉淀，荧光剂显色后可以用肉眼观察判定反应结果，适用于各种实验条件下检测工作的使用，也适合在实验条件不足的室外检测。

本发明的方案具体实施步骤如下：

1.线虫DNA提取试剂配制

1)LB(Lysis Buffer)溶液：500mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl，15mmol/L MgCl₂，1.0mmol/LDTT，4.5％Tween20，等体积混匀，过滤灭菌。

2)蛋白酶K：20mg/ml蛋白酶K。

2.DNA的提取

挑取单头根结线虫放入装有10μlddH₂O的0.2ml离心管中，加入8μl的LB(lysis buffer)溶液，2μl蛋白酶K溶液，点动离心后，放入液氮中，再放入3℃水浴锅中，待融后放入液氮中，重复6～7次，然后在-8℃下冷冻30min。然后将离心管取出，在6℃下温育90min，℃9反应10min处理后作为线虫DNA模板直接用于LAMP和PCR反应。

3.象耳豆根结线虫rDNA-ITS扩增及序列分析

采用ITS区的通用引物rDNA1(5’-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3’)和rDNA2(5’-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3’)扩增两种象耳豆根结线虫种群ITS区片段。PCR扩增反应体系为50μl，PCR反应体系为10×Buffer(含Mg2+)5μl，10mM dNTP 4μl，引物rDNA1和rDNA2(10μmol/L)各1μl，Taq酶(5U/μl，Takara)0.5μl，模板DNA 5μl，灭菌ddH₂O补足至50μl。PCR扩增条件为：℃9预变性5min，℃5退火30sec，72℃延伸1min；9℃变性45sec，℃5退火30sec，7℃延伸1min，35个循环；7℃再次延伸10min，4℃保存。PCR扩增后，取5μl扩增产物加1μl加样缓冲液在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并照相回收、克隆和测序如SEQ ID NO1，序列测定由上海生工生物工程有限公司完成。

4.象耳豆根结线虫LAMP引物设计

根据象耳豆根结线虫ITS测序结果为模板，设计以下5条引物，序列如下：

①MEF3：5’-GGCTGTATATGTGGTGACAT-3’

②MEB3：5’-AGTTCGCAAAACTTATCGC-3’

③MEFIP：5’-GAAAAAAAGAGTGCTGGCGTCCGTTAGGACTAAATGAGTTTAAGACT-3’

④MEBIP：5’-AACAAAATTCCTAGCCTTTCCGGAGTTTGCTGCGTTCTTCA-3’

⑤MELB：5’-TGGATCACTAGGCTCGTGGATCG-3’

5.LAMP反应体系配置：外引物MEF3和MEB3各0.2μmol/L，内引物MEFIP和BIP各1.6μmol/L，环引物MELB为0.4μmol/L，10mmol/L dNTP，20mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，10mmol/LKCl，5mmol/L MgSO₄，10mmol/L(NH₄)₂SO₄，0.1％Triton x-100，0.1mol/L betaine，8U BstDNA聚合酶大片段，1μl DNA模板，用灭菌双蒸馏水补全到25μl。

6LAMP反应扩增条件：将以上各成分(Bst DNA聚合酶先不加)加入反应管中混合后，置于95℃反应5min，然后冰浴3min，加入1μl的Bst DNA聚合酶，然后置于65℃恒温水浴中等温扩增60min，再82℃保温5min，反应结束后加入2μl配制好的显色剂混匀后观察结果。

7LAMP结果检测：结果可以采用以下三种检测方法：

1)将上述反应完的体系中加入2μl的显色剂。轻晃混匀，即可观察；

2)取2μl扩增产物在2％琼脂糖凝胶电泳中电泳可观察到梯形带；

3)将反应后的离心管3000rpm离心30sec，阳性的管底可观察到白色沉淀。

本发明所提供的象耳豆根结线虫LAMP快速检测方法具有以下优点：

一、灵敏度高，对象耳豆根结线虫的检测极限可达到1/200000条幼虫水平，比常规PCR检测象耳豆根结线虫的检测灵敏度高100倍。

二、特异性强，所用的特异引物根据象耳豆根结线虫的ITS六个不同区域设计出5条引物，特异性比常规PCR要强。

三、检测时间短，1小时左右可获得检测结果，比常规PCR检测缩短2～4h。

四、不需要PCR仪，对仪器设备要求低，不需要任何PCR仪、凝胶电泳和成像系统，只需要一个水浴锅或者保温瓶就可以完成检测。

五、操作简单、结果明显，整个检测过程不涉及复杂仪器和设备，一般技术人员即可完成检测，结果容易辨别，通过不同颜色，肉眼即可观察结果，不需要繁琐的电泳和紫外观察。

六、对人和环境友好，检测过程不需要使用EB等有毒试剂，对人和环境非常安全。

综上所述，本发明具有比现有PCR技术检测象耳豆根结线虫的方法具有更高的特异性、灵敏度和便携性。可以在实际生产中现场应用检测。该技术可应用于对象耳豆根结线虫田间土壤样品及植物上象耳豆根结线虫病发生的早期快速分子检测，具有实际的应用价值。

附图说明

图1为象耳豆根结线虫ITS序列的LAMP引物设计示意图，

图2为象耳豆根结线虫LAMP方法检测

A为加荧光染料检测结果，1：阳性结果，具有绿色荧光，2：阴性对照，为深褐色。

B检测结果为电泳图，M：D2000DNA标准分子量(Takara)1：阳性结果，为LAMP扩增梯形条带，2：阴性对照，无扩增产物。

图3为象耳豆根结线虫LAMP检测方法对不同地理种群的检测结果图，

A为加荧光染料检测结果，1：MEXED，2：MEDT，3：阴性对照。

B为电泳检测结果，M：D2000DNA标准分子量(Takara)，1：MEXED，2：MEDT，3：阴性对照，

图4为象耳豆根结线虫LAMP检测方法特异性检测结果图

A为LAMP加荧光染料检测结果图，1～13分别为：MEXED、MIDX、MHYJ、MJYN、MAYN、RSAM、、PLD、GS-14、GS-11、DdCL、BD和阴性对照。

B为LAMP检测结果电泳图，M：D2000DNA标准分子量(Takara)，1～13分别为：MEXED、MIDX、MHYJ、MJYN、MAYN、RSAM、、PLD、GS-14、GS-11、DdCL、BD和阴性对照。

图5为象耳豆根结线虫灵敏度检测结果

A为LAMP加荧光染料检测结果图，1～7分别为：单头线虫，10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和阴性对照。

B为LAMP检测结果电泳图，M：D2000DNA标准分子量(Takara)，1～7分别为：单头线虫，10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和阴性对照。

C为普通PCR法检测结果电泳图，M：D2000DNA标准分子量(Takara)，1～7分别为：单头线虫，10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、阴性对照。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明。

所述试剂均为市售，所用根结线虫本申请人实验室均有保存，可以免费向公众发放。

实验材料

共收集2个象耳豆根结线虫种群(DT和XED)(见表1)。

表1供试象耳豆根结线虫种群及其来源

主要试剂：Taq DNA聚合酶购自天根公司；DNAmarker购自TaKaRa公司；引物由上海生工生物技术有限公司合成；pGEM-T Easy Vector购于美国promega Pro K(蛋白酶K)购自Roche公司；Bst DNA聚合酶大片段购自New England Biolabs公司；SYBR green I购自Invitrogen公司。

实施例1象耳豆根结线虫DNA的提取、rDNA-ITS扩增及序列分析

1.1象耳豆根结线虫DNA的提取

1.2象耳豆根结线虫rDNA-ITS扩增及序列分析

利用ITS区的通用引物rDNA1(5’-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3’)和rDNA2(5’-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3’)扩增两种象耳豆根结线虫种群ITS区片段。PCR扩增反应体系为50μl，PCR反应体系为10×Buffer(含Mg2+)5μl，10mM dNTP 4μl，引物rDNA1和rDNA2(10μmol/L)各1μl，Taq酶(5U/μl，Takara)0.5μl，模板DNA 5μl，灭菌ddH₂O补足至50μl。PCR扩增条件为：℃9预变性5min，℃5退火30sec，7℃延伸1min；9℃变性45sec，℃5退火30sec，7℃延伸1min，35个循环；7℃再次延伸10min，4℃保存。PCR扩增后，取5μl扩增产物加1μl加样缓冲液在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并照相回收、克隆和测序如SEQ ID NO1所示，序列测定由上海生工生物工程有限公司完成。

实施例2LAMP技术检测象耳豆根结线虫方法的建立

2.1LAMP引物设计

根据象耳豆根结线虫ITS序列测序结果，设计并筛选下述LAMP引物，引物交上海生物工程技术服务有限公司合成。引物序列如下：

①MF3：5’-GGCTGTATATGTGGTGACAT-3’

②MB3：5’-AGTTCGCAAAACTTATCGC-3’

③MFIP：5’-GAAAAAAAGAGTGCTGGCGTCCGTTAGGACTAAATGAGTTT-AAGACT-3’

④MBIP：5’-AACAAAATTCCTAGCCTTTCCGGAGTTTGCTGCGTTCTTCA-3’

⑤MELB：5’-TGGATCACTAGGCTCGTGGATCG-3’

2.2LAMP反应体系配置：

引物混合液：外引物MEF3和MEB3各0.2μmol/L，内引物MEFIP和MEBIP各1.6μmol/L，环引物MELB为0.4μmol/L，

反应混合液：10mmol/L dNTP，20mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，10mmol/L KCl，5mmol/LMgSO₄，10mmol/L(NH₄)₂SO₄，0.1％Triton x-100，0.1mol/L betaine，8U Bst DNA聚合酶大片段，1μl DNA模板，用灭菌双蒸馏水补全到25μl。

2.3LAMP反应扩增条件：将以上各成分(Bst DNA聚合酶先不加)加入反应管中混合后，置于95℃反应5min，然后冰浴3min，加入1μl的Bst DNA聚合酶，然后置于65℃恒温水浴中等温扩增60min，再82℃保温5min，反应结束后加入2μl配制好的显色剂混匀后观察结果(如图2中的A所示)。取2μl产物在2％琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并照相(如图2中的B所示)，可看到有LAMP的特征性梯形带。

实施例3LAMP法检测不同地理种群象耳豆根结线虫

将本实验室采集的两种象耳豆根结线虫进行LAMP检测，将上述的引物混合液和反应混合液混合均匀后，加入1μl模板DNA，按2.3的反应条件进行，反应结束后加入2μl配制好的显色剂混匀后，观察颜色变化(如图3中的A所示)，加有象耳豆根结线虫DNA的管中能看到绿色荧光，阴性对照则为红褐色。取2μl产物在2％琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并照相(如图3中的B所示)，可看到1～2泳道有LAMP的特征性梯形带，阴性对照没有发现有扩增产物。

实施例4象耳豆根结线虫LAMP特异性检测

收集南方根结线虫、北方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫、香蕉穿孔线虫、短体线虫、甘薯茎线虫、大豆孢囊线虫、禾谷孢囊线虫、豆伞滑刃线虫(见表2)，分别提取其DNA作为模板与象耳豆根结线虫DNA模板一起进行LAMP检测，以检测象耳豆根结线虫LAMP检测方法的特异性。

表2供试的其它植物线虫群体样品代码及来源

将上述引物混合液和反应缓冲混合液混合均匀后，加入1μl模板DNA，按2.3的反应条件进行，反应结束后加入2μl配制好的显色剂混匀后，观察颜色变化(如图4中A所示)，第一管为象耳豆根结线虫DNA，可以观察到绿色荧光，其他管的线虫和阴性对照均为红褐色。取2μl产物在2％琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并照相(如图4中的B所示)，可看到第一泳道有LAMP的特征性梯形带，其他泳道均未发现有扩增产物。结果表明上述LAMP引物和反应体系在检测象耳豆根结线虫时具有很高的特异性。

实施例6象耳豆根结线虫LAMP灵敏度检测

将单头象耳豆根结线虫MEXED种群提取的DNA模板按10倍稀释成1～1.0×10^-56个浓度，各取1μl DNA做模板，将上述的引物混合液和反应混合液混合均匀后，按2.3反应条件进行，反应结束后加入2μl配制好的显色剂混匀后，观察颜色变化(如图5中的A所示)，1～5管均可以看到绿色荧光。取2μl产物在2％琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并照相(如图5中的B所示)，可以看出1～5泳道均有LAMP的特征性梯形带，灵敏度能达到1/200000头线虫。同时以上述稀释DNA为模板，以MEF3和MEB3为引物，进行常规PCR检测，体系如下：2.5μl 10×PCR Buffer(含Mg²⁺)，2μl10mM dNTP(2.5mM)，1μl引物对ME-F3/ME-B3(10uM)，0.25μl Taq DNA聚合酶(5U/ul)，1μl模板DNA，灭菌ddH₂O补足至25μl，采用无线虫DNA模板为阴性对照。凝胶电泳观察结果(如图5中的C所示)。结果表明在DNA稀释到10^-2倍时，能够观察到扩增条带，再稀释时常规PCR则不能检测。

以上结果说明：上述LAMP检测体系能够检测到1/200000头象耳豆根结线虫。具有极高的灵敏度，比常规PCR检测灵敏100倍。

Claims

1.一种象耳豆根结线虫LAMP快速检测方法，其特征在于：其中LAMP反应体系所使用的引物是：

①MEF3：5’-GGCTGTATATGTGGTGACAT-3’，

②MEB3：5’-AGTTCGCAAAACTTATCGC-3’，

③MEFIP：5’-GAAAAAAAGAGTGCTGGCGTCCGTTAGGACTAAATGAGTTTAAGACT-3’，

④MEBIP：5’-AACAAAATTCCTAGCCTTTCCGGAGTTTGCTGCGTTCTTCA-3’，

⑤MELB：5’-TGGATCACTAGGCTCGTGGATCG-3’

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：其中的LAMP反应体系包括：

2)反应混合液：10mmol/L dNTP，20mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，10mmol/L KCl，5mmol/L MgSO₄，10mmol/L(NH₄)₂SO₄，0.1％Triton x-100，0.1mol/L甜菜碱，8U Bst DNA聚合酶大片段；

3)1μl DNA模板；

加灭菌双蒸馏水补全到25μl。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其中LAMP反应条件如下：将引物混合液和反应混合液混合均匀后加入1μl DNA模板后，61～65℃温育30～90min，82℃保温10min。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其中LAMP反应的最终产物中加入有显色剂，轻甩离心管观察即可。

5.根据权利要求4所述的检测方法，所述显色剂为SYBR green I与PCR级DMSO的混合物，其体积比为1∶9。

6.根据权利要求3所述的检测方法，所述DNA模板的提取方法为：挑取单头象耳豆根结线虫放入装有10μl ddH₂O的0.2mL离心管中，加入8μl的LB溶液，2μl的20mg/ml蛋白酶K溶液，点动离心后，放入液氮中，再放入37℃水浴锅中，待融化后放入液氮中，重复6～7次，然后在-80℃下冷冻30min。然后将离心管在65℃下温育90min，95℃反应10min处理后上清液作为线虫DNA模板直接用于LAMP和PCR反应，所述LB溶液为500mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl，15mmol/L MgCl₂，1.0mmol/L DTT，4.5％Tween20，等体积混匀，过滤灭菌。

7.一种象耳豆根结线虫LAMP快速检测试剂盒，包括反应混合液和引物混合液，所述引物混合液为：外引物MEF3和MEB3各0.2μmol/L，内引物MEFIP和BIP各1.6μmol/L，环引物MELB为0.4μmol/L，所述反应混合液为10mmol/L dNTP，20mmol/L Tris-HCl(pH8.8)，10mmol/L KCl，5mmol/L MgSO₄，10mmol/L(NH₄)₂SO₄，0.1％Triton x-100，0.1mol/L betaine和单独包装的8U Bst DNA聚合酶大片段，所述引物混合液中的引物序列分别为：

①MEF3：5’-GGCTGTATATGTGGTGACAT-3’，

②MEB3：5’-AGTTCGCAAAACTTATCGC-3’，

③MEFIP：5’-GAAAAAAAGAGTGCTGGCGTCCGTTAGGACTAAATGAGTTTAAGACT-3’，

④MEBIP：5’-AACAAAATTCCTAGCCTTTCCGGAGTTTGCTGCGTTCTTCA-3’，

⑤MELB：5’-TGGATCACTAGGCTCGTGGATCG-3’。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，还包括显色剂，所述显色剂为SYBR green I与PCR级DMSO的混合物，其体积比为1∶9。

9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，还包括DNA提取试剂，所述DNA提取试剂包括：

1)LB溶液：500mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl，15mmol/L MgCl₂，1.0mmol/L DTT，4.5％Tween20，等体积混匀，2)20mg/ml蛋白酶K。

10.权利要求1-6所述任一检测方法或7-9所述任一试剂盒在诊断植物、土壤的象耳豆根结线虫感染情况或鉴别象耳豆根结线虫中的应用。