CN107506616A - 象耳豆根转录组数据库、融合蛋白、浸泡体系、沉默体系 - Google Patents

象耳豆根转录组数据库、融合蛋白、浸泡体系、沉默体系 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物信息学分析技术领域，公开了一种象耳豆根转录组数据库、融合蛋白、浸泡体系、沉默体系，为38000多个Unigenes序列，利用生物信息学分析，预测出230余个象耳豆根结线虫潜在的RNAi靶标候选基因。本发明利用原核表达技术，获得ME‑MAPK1、ME‑COL1和MeHsp70重组蛋白，为蛋白特性分析奠定基础；成功构建M.enterolobii离体RNAi浸泡体系和烟草脆裂病毒TRV载体为介导的VIGSRNAi活体沉默体系，诱导Me‑mapk1、Me‑crt1和Me‑cbp1基因下调表达；为M.enterolobii防治，奠定了必要的分子基础。

Description

象耳豆根转录组数据库、融合蛋白、浸泡体系、沉默体系
技术领域
本发明属于生物信息学分析技术领域，尤其涉及一种象耳豆根转录组数据库、融合蛋白、浸泡体系、沉默体系。
背景技术
象耳豆根结线虫(Meloidogyne enterolobii)最早在1983年由杨宝君等在海南儋州的象耳豆树上发现并定名。徐建华等人证明国外学者广泛报道的玛雅根结线虫(M.mayaguensis)为M.enterolobii的异名。该线虫在美洲、非洲、欧洲等均有分布，为世界上公认的危害最大的根结线虫之一。2008年，欧洲首次报道M.enterolobii，同年，EPPO报道中国出口欧洲的玫瑰花上截获到该线虫，EPPO对该线虫进行风险评估，认为对中欧地区作物存在较大威胁。目前，已报道发现该线虫的国家有巴西、越南、中国、古巴、法国、危地马拉、波多黎各、马提尼克、马拉维、塞内加尔、特立尼达拉岛和多巴哥岛、南非、美国、西非、等等国家和地区。EPPO发布有害生物预警，因此估计该种在欧洲温暖地区和温室中可存活。而在来自中国的玫瑰活体植株上也截获到M.enterolobii，表明其在略冷的温度下也可存活。在国内，M.enterolobii近年陆续被报道，目前已遍布海南全岛，广东省也有发现。据调查，在海南岛主要栽培作物葫芦科蔬菜、茄果类蔬菜、南药作物、热带果树等都已经有M.enterolobii的广泛寄生，正逐渐代替南方根结线虫(M.incognita)，成为中国热带亚热带地区最重要的一种根结线虫。与模式线虫秀丽杆线虫(Caenorhabditis elegans)、其它植物寄生线虫北方根结线虫(M.hapla)和南方根结线虫(M.incognita)相比，M.enterolobii功能基因组的研究进展相当缓慢，至今尚未获得其完整的基因组信息。而M.incognita和M.hapla的基因组信息分别于2008年8月和10月公布，这为开发新的针对根结线虫的药物靶标提供了宝贵的基因资源。同时，有研究证实，一些基因在秀丽杆线虫或南方根结线虫中具有RNAi胚致死或不育突变效应。特别是Gunsalus等建立的秀丽杆线虫大规模RNAi分析表型与基因序列相关性网络平台RNAiDB，为开展植物线虫与秀丽杆线虫RNAi相关比较功能基因组生物信息研究提供了分析工具，也使开展象耳豆根结线虫研究对这些已获得的线虫基因组生物信息资源得以充分利用。试验证明植物寄生线虫与秀丽杆线虫具有相同的RNAi作用，可直接进行其功能基因组学研究。并且，根结线虫与孢囊线虫一样同属栖居型内寄生线虫，在孢囊线虫上所建立的RNAi技术，同样适应根结线虫功能基因的鉴定。Bakhetia等利用RNAi研究了M.incognita过氧化酶和NADPH氧化酶基因的功能，实验表明M.incognita中90-95％的个体吸收了编码过氧化物酶的dsRNA，14d后雌虫的数量和大小受到明显抑制，产卵量减少了70％以上。另外，Fanelli等将花生根结线虫的卵浸泡在dsRNA混合液中，将dsRNA导入线虫卵内，成功的抑制了线虫几丁质酶的合成。目前，基于模式线虫秀丽杆线虫RNAi比较功能基因组信息和南方根结线虫、北方根结线虫基因组信息分析，大量与致死效应相关的基因被克隆，并被进行RNAi分析。而M.enterolobii由于不清楚其基因组信息，只能通过同源克隆得到少数几个RNAi表型基因。卓侃等(2011)通过同源克隆首次克隆了M.enterolobii果胶酸裂解酶基因(ME-PEL-1)，该基因与南方根结线虫的果胶酸裂解酶MI-PEL-1和爪哇根结线虫的果胶酸裂解酶MJ-PEL-1相似性最高，且系统进化树显示ME-PEL-1也与它们最为接近。利用RNAi技术对M.enterolobii 2龄幼虫Me-pel-1进行沉默,结果发现Me-pel-1基因被干扰后，M.enterolobii 2龄幼虫对番茄的侵染率显著降低。表明Me-pel-1基因在象耳豆根结线虫侵染寄主的过程中发挥重要作用。练冬梅等(2015)同样通过同源克隆，克隆和表达了M.enterolobii热激蛋白Hsp70基因，发现该基因与M.enterolobii生态适应性机理有关。转录组测序和后续的生物信息学分析以及试验验证是一个挖掘功能基因的重要途径，是基因功能及结构研究的基础和出发点。转录组学相对于基因组学而言，只研究被转录的基因，研究范围缩小，针对性更强。因而，结合转录组数据库、转录组测序、生物信息学预测和后续试验验证，可以得到大量M.enterolobii的RNAi功能基因。为M.enterolobii防治，开辟新的途径。
综上所述，现有技术存在的问题是：象耳豆根结线虫(M.enterolobii)近年来陆续被报道，目前已遍布海南全岛，正逐渐代替南方根结线虫，成为中国热带亚热带地区最重要的一种根结线虫。与模式线虫秀丽杆线虫(Caenorhabditis elegans)、其它植物寄生线虫北方根结线虫(M.hapla)和南方根结线虫(M.incognita)相比，M.enterolobii功能基因组的研究进展相当缓慢，M.incognita和M.hapla基因组信息分别于2008年8月和10月公布，而M.enterolobii基因组信息至今尚未公布。同时，研究证实，一些基因在秀丽杆线虫或南方根结线虫中具有RNAi胚致死或不育突变效应。基于模式线虫秀丽杆线虫RNAi比较功能基因组信息和南方根结线虫、北方根结线虫基因组信息分析，大量与致死效应相关的基因被克隆，并被进行RNAi分析。而M.enterolobii由于不清楚其基因组信息，只能通过同源克隆得到少数几个RNAi表型基因(ME-PEL-1、Hsp70等)。因而，结合转录组数据库、转录组测序、生物信息学预测和后续试验验证，可以得到大量M.enterolobii的RNAi功能基因。转录组测序技术主要是针对转录产物mRNA进行高通量测序，无需了解物种基因组信息，能够对任意物种进行转录组分析，只研究被转录的基因，研究范围缩小，针对性更强。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种象耳豆根转录组数据库、融合蛋白、浸泡体系、沉默体系。
本发明是这样实现的，一种象耳豆根转录组数据库，所述象耳豆根转录组数据库为38000多个Unigenes序列，利用生物信息学分析，预测出包括促分裂原活化蛋白激酶Me-mapk1、胶原蛋白Me-col1、热激蛋白Hsp70、钙网蛋白Me-crt、纤维素结合蛋白Me-cbp-1、果胶酸裂解酶Me-pel2等在内的230余个象耳豆根结线虫潜在的RNAi靶标候选基因。
本发明的另一目的在于提供一种所述象耳豆根转录组数据库的构建方法，所述象耳豆根转录组数据库的构建方法包括：
步骤一，完成M.enterolobii的J2转录组测序，获得8.88Gb Clean Data，Q30碱基百分比为89.55％；De novo组装后共获得38,221条Unigene；其中长度在1kb以上的Unigene有8,074条；
步骤二，对Unigene进行功能注释，包括与NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、GO和Pfam数据库的比对，共获得18,243条Unigene的注释结果。完成基于Unigene库的基因结构分析，其中SSR分析共获得1,927个SSR标记。同时还进行了CDS预测分析；完成基因在样品中的表达量分；
步骤三，与模式秀丽小杆线虫、南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫以及大豆孢囊线虫EST序列进行Blast比对，预测出230余个象耳豆根结线虫潜在的RNAi靶标候选基因；从中筛选出促分裂原活化蛋白激酶基因、胶原蛋白基因、热激蛋白Hsp70、钙网蛋白CRT、纤维素结合蛋白CBP、果胶酸裂解酶PEL 6个相关基因进行全长克隆和RNAi效应分析。
本发明的另一目的在于提供一种由所述象耳豆根转录组数据库克隆的与线虫生长发育和寄生致病密切相关的基因全长序列，所述基因全长序列根据预测的靶标基因序列，克隆了与线虫生长发育和寄生致病密切相关的基因全长序列，包括促分裂原活化蛋白激酶基因Me-mapk1(登录号：KT380882)、胶原蛋白基因Me-col1(登录号：KU350688)、热激蛋白Hsp70(登录号：KF739434)、钙网蛋白Me-crt(登录号：KT874558)、纤维素结合蛋白Me-cbp-1(登录号:KU350655)、果胶酸裂解酶Me-pel2(登录号：KP987180)多个相关基因。
本发明的另一目的在于提供一种由所述象耳豆根转录组数据库获得的融合蛋白，所述融合蛋白结合原核表达，将靶标基因在大肠杆菌中诱导表达成功获得了融合蛋白。基因是DNA上一段特定的碱基序列，三个碱基编码一个氨基酸，不同的碱基序列编码不同的氨基酸序列(即蛋白质的一级结构)，氨基酸间脱水形成肽，肽经一定的盘旋折叠形成具有空间特异性结构的蛋白质。蛋白表达的过程是业内熟悉的。在前期RT-PCR、RACE等技术获得完整基因序列的基础上，设计带酶切位点引物，PCR扩增，连接，转化T载体，涂板，37℃过夜培养，挑阳性克隆，提质粒，部分质粒测序和序列分析，得到前后序列一致，没有缺失和突变，剩余的质粒酶切，商品化的表达载体(我们用的pET32a)用相应的酶酶切，连接，转化宿主菌(BL21)DE3，涂板培养，设计不同的IPTG浓度诱导培养，SDS-PAGE电泳分析，获得差异表达的蛋白条带即为目标融合蛋白。
本发明的另一目的在于提供一种由所述象耳豆根转录组数据库构建与分析所形成的象耳豆根结线虫dsRNA离体浸泡体系和VIGS介导的RNAi沉默体系；
Trizol法提取象耳豆根结线虫二龄幼虫J2总RNA，RNA电泳检测完整性，用带有Oligo(dT)的磁珠富集总RNA，获得富集的mRNA，加入fragmentationbuffer将mRNA打断城段片段，以mRNA为模板，用6碱基随机引物反转录合成第一条cDNA链，随后加入缓冲液、RNaseH、dNTPs和DNApolymerase I合成双链cDNA，经QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复，加poly(A)并连接测序接头，然后电泳进行片段大小筛选，最后PCR扩增，并将该文库送样测序。
dsRNA离体浸泡体系：即用双链RNA浸泡离体条件下的二龄幼虫J2后接种番茄根部，一段时间后观察侵染数、根结形成数、对番茄根系的侵染率等。分别合成了Me-mapk1、Me-crt、Me-cbp-1和Me-col1基因的双链RNA片段，并浸泡处理象耳豆根结线虫二龄幼虫J2后，接种于四叶一心的番茄根部，设非双链RNA和清水对照处理。结果RNAi分析，半定量PCR检测成功诱导Me-mapk1下调表达；经Me-mapk1dsRNA浸泡处理后番茄根结形成数明显减少，发病率下降62％。浸泡法成功诱导Me-crt的下调表达，番茄根系侵染率相比对照下降约20％，发病率下降37％。RT-PCR检测Me-cbp-1基因的沉默效果，发现其dsRNA能特异性降低了二龄幼虫Me-cbp-1基因的表达，但并未完全抑制。用RNAi技术沉默二龄幼虫后，其番茄根系侵染相比对照下降约27％。RNAi技术诱导Me-clo1下调表达不理想，对照组和处理组差异不显著。VIGS介导的RNAi沉默体系：即建立烟草脆裂病毒介导的RNAi活体沉默体系。根据烟草脆裂病毒RNA(TRV)载体上多克隆位点，设计引物，并引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位点及保护碱基，得到特异引物MeMapk1-F-BamHⅠ/MeMapk1-R-HindⅢ。pGM-MeMapk1为模板PCR，得到558bp的MeMapk基因RNAi片段。经连接、反复验证，构建含有MeMapk1基因片段的VIGS沉默载体，命名为pTRV-MeMapk1。然后进行TRV介导的VIGS转化番茄试验，pcr检测TRV是否侵入番茄植株并其体内繁殖。在处理组和TRV空载处理均能扩增出950bp和350bp片段，而清水对照无扩增片段,说明TRV侵入了番茄。qRT-PCR检测TRV-MeMapk1表达情况。处理组植株中收集的线虫中的MeMapk1情况显著低于TRV空载和清水对照(F＝6.58,P＝0.0076)。说明TRV-MeMapk1处理植株中收集的线虫中启动了RNAi。
本发明的优点及积极效果为：本发明构建M.enterolobii二龄幼虫转录组数据库，结合利用生物信息学分析，筛选克隆了与线虫生长发育、寄生致病和适生性密切相关的基因全长序列，包括促分裂原活化蛋白激酶基因Me-mapk1(登录号：KT380882)、胶原蛋白基因Me-col1(登录号：KU350688)、热激蛋白Hsp70(登录号：KF739434)、钙网蛋白Me-crt(登录号：KT874558)、纤维素结合蛋白Me-cbp-1(登录号:KU350655)、果胶酸裂解酶Me-pel2(登录号：KP987180)等多个基因；利用原核表达技术，获得了ME-MAPK1、ME-COL1和MeHsp70重组蛋白，为蛋白特性分析奠定了基础；完成Me-cbp1、Me-crt1和Me-pel2组织表达定位和发育表达类型分析，其中，Me-cbp-1和Me-crt1在亚腹食道腺细胞特异表达；成功构建了M.enterolobii离体RNAi浸泡体系，诱导Me-mapk1、Me-crt1和Me-cbp1基因的下调表达。经Me-mapk1dsRNA浸泡处理后番茄根结形成数明显减少，发病率下降62％。浸泡法成功诱导Me-crt的下调表达，番茄根系侵染率相比对照下降约20％，发病率下降37％。RT-PCR检测Me-cbp-1基因的沉默效果，发现其dsRNA能特异性降低了二龄幼虫Me-cbp-1基因的表达，但并未完全抑制。用RNAi技术沉默二龄幼虫后，其番茄根系侵染相比对照下降约27％。同时也构建了烟草脆裂病毒TRV载体为介导的VIGS RNAi活体沉默体系，经过TRV介导的VIGS转化番茄试验，处理组植株中收集的线虫中的MeMapk1情况显著低于TRV空载和清水对照，发病率下降了68％。因而，为M.enterolobii防治，奠定了必要的分子基础。
附图说明
图1是本发明实施例提供的象耳豆根转录组数据库构建方法流程图。
图2是本发明实施例提供的A:总RNA琼脂糖凝胶电泳；B:M.enterolobii actin基因片段。
图3是本发明实施例提供的M.enterolobii actin基因3′RACE和5′RACE结果示意图。
图4是本发明实施例提供的β-actin和α-actin蛋白的系统进化树示意图。
图5是本发明实施例提供的Me-mapk1cDNA序列及其推导编码的蛋白序列示意图。
图6是本发明实施例提供的ME-MAPK与其它植物线虫促分裂原活化蛋白激酶蛋白多序列比对示意图。
图7是本发明实施例提供的SDS-PAGE电泳检测ME-MAPK重组蛋白示意图。
图8是本发明实施例提供的半定量PCR检测Me-mapk1(A)和β-actin(B)的表达示意图。
图9是本发明实施例提供的M.enterolobii总RNA提取及Me-crtRACE末端扩增电泳图。
图10是本发明实施例提供的Me-crt cDNA编码结构图。
图11是本发明实施例提供的不同植物线虫钙网蛋白多序列比对示意图。
图12是本发明实施例提供的单链探针合成及原位杂交定位Me-crt基因转录物示意图。
图13是本发明实施例提供的M.enterolobii不同发育寄生期虫体及RT-PCR分析Me-crt发育表达类型示意图。
图14是本发明实施例提供的Me-crt dsRNA诱导靶标基因下调表达示意图。
图15是本发明实施例提供的M.enterolobii纤维素结合蛋白基因Me-cbp-1cDNA及其编码氨基酸序列示意图。
图16是本发明实施例提供的ME-CBP-1与其它植物寄生线虫纤维素结合蛋白多序列比对示意图。
图17是本发明实施例提供的M.enterolobiiMe-cbp-1基因组织表达定位示意图。
图18是本发明实施例提供的半定量RT-PCR检测Me-cbp-1(A)和β-actin(B)基因的表达示意图。
图19是本发明实施例提供的Me-PEL2与其它植物线虫果胶酸裂解酶氨基酸多序列比对示意图。
图20是本发明实施例提供的植物寄生线虫和若干细菌、真菌果胶酸裂解酶进化发育树示意图。
图21是本发明实施例提供的象耳豆根结线虫Me-pel2发育表达类型分析示意图。
图22是本发明实施例提供的Me-COL与其它线虫胶原蛋白多序列比对示意图。
图23是本发明实施例提供的SDS-PAGE电泳检测Me-COL1重组蛋白示意图。
图24是本发明实施例提供的M.enterolobii Me-raf1cDNA及其编码氨基酸序列示意图。
图25是本发明实施例提供的A:M.enterolobii Hsp70基因RT-PCR；B:M.enterolobii Hsp703′RACE；C:M.enterolobiiHsp70基因5′RACE。
图26是本发明实施例提供的不同物种的Hsp70基因系统进化分析示意图。
图27是本发明实施例提供的A:MeHsp70-pET30a表达载体的构建与鉴定pET-30a重组质粒的双酶切；B:MeHsp70-pET30a的原核表达。
图28是本发明实施例提供的A:55℃大肠杆菌BL21菌株耐热性测定；B:65℃大肠杆菌BL21菌株耐热性测定示意图。
图29是本发明实施例提供的重组大肠杆菌BL21热激后Hsp70基因mRNA相对表达量示意图。
图30是本发明实施例提供的30℃重组大肠杆菌BL21生长曲线示意图。
图31是本发明实施例提供的qRT-PCR检测TRV-MeMapk1表达情况。处理组植株中收集的线虫中的MeMapk1情况显著低于TRV空载和清水对照(F＝6.58,P＝0.0076)。说明TRV-MeMapk1处理植株中收集的线虫中启动了RNAi。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
M.enterolobii近年来陆续被报道，目前已遍布海南全岛，主要危害葫芦科蔬菜、茄果类蔬菜、南药植物和热带果树等，正逐渐代替南方根结线虫，成为中国热带亚热带地区最重要的植物根结线虫种类。研究与其取食、适生性和存活等生长发育相关基因的功能丧失，造成其无法侵染寄主植物，对于线虫的防治和抗线虫分子育种，具有重要的作用。本发明构建M.enterolobii二龄幼虫转录组数据库，结合利用生物信息学分析，筛选克隆了与线虫生长发育、寄生致病和适生性密切相关的基因全长序列，包括促分裂原活化蛋白激酶基因MAPK、胶原蛋白基因Collogen、热激蛋白Hsp70、钙网蛋白CRT、纤维素结合蛋白CBP、果胶酸裂解酶PEL和肌动蛋白actin等7个相关基因；利用原核表达技术，获得了ME-MAPK1、ME-COL1和MeHsp70重组蛋白，为蛋白特性分析奠定了基础；成功构建了M.enterolobii离体RNAi浸泡体系和烟草脆裂病毒TRV载体为介导的VIGS RNAi活体沉默体系，诱导Me-mapk1、Me-crt1和Me-cbp1基因的下调表达。为M.enterolobii防治，奠定了必要的分子基础。
本发明实施例提供的M.enterolobii促分裂原活化蛋白激酶基因Me-mapk1(登录号：KT380882)序列：SEQ ID NO：1。
本发明实施例提供的M.enterolobii胶原蛋白基因Me-col1(登录号：KU350688)序列：SEQ ID NO：2。
本发明实施例提供的M.enterolobii热激蛋白Hsp70(登录号：KF739434)序列：SEQID NO：3。
本发明实施例提供的M.enterolobii钙网蛋白Me-crt(登录号：KT874558)序列：SEQ ID NO：4。
本发明实施例提供的M.enterolobii纤维素结合蛋白Me-cbp-1(登录号:KU350655)序列：SEQ ID NO：5。
本发明实施例提供的M.enterolobii果胶酸裂解酶Me-pel2(登录号：KP987180)序列：SEQ ID NO：6。
本发明实施例提供的M.enterolobii actin基因(登录号：KF534787)序列：SEQ IDNO：7。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的象耳豆根转录组数据库的构建方法包括以下步骤：
S101：完成M.enterolobii的J2转录组测序，获得8.88Gb Clean Data，Q30碱基百分比为89.55％；De novo组装后共获得38,221条Unigene。其中长度在1kb以上的Unigene有8,074条；
S102：对Unigene进行功能注释，包括与NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、GO和Pfam数据库的比对，共获得18,243条Unigene的注释结果。完成基于Unigene库的基因结构分析，其中SSR分析共获得1,927个SSR标记。同时还进行了CDS预测分析；完成基因在样品中的表达量分析；
S103：与模式秀丽小杆线虫、南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫以及大豆孢囊线虫EST序列进行Blast比对，预测出230余个象耳豆根结线虫潜在的RNAi靶标候选基因。从中筛选出促分裂原活化蛋白激酶基因、胶原蛋白基因、热激蛋白Hsp70、钙网蛋白CRT、纤维素结合蛋白CBP、果胶酸裂解酶PEL等多个相关基因进行全长克隆和RNAi效应分析。
下面结合附图对本发明的应用原理作进一步的描述。
一、方法与分析
象耳豆根转录组数据库、融合蛋白、浸泡体系、沉默体系，以M.enterolobii二龄幼虫(J2)为材料，构建了J2转录组数据库，成功获得38000多个Unigenes序列，结合利用生物信息学分析，预测出230余个象耳豆根结线虫潜在的RNAi靶标候选基因。根据预测的靶标基因序列，克隆了与线虫生长发育和寄生致病密切相关的基因全长序列，包括促分裂原活化蛋白激酶基因MAPK(GenBanK登录号KT380882)、胶原蛋白基因Collogen(GenBanK登录号KU350688)、热激蛋白Hsp70(GenBanK登录号KF739434)、钙网蛋白CRT(GenBank登录号KT874558)、纤维素结合蛋白CBP(GenBanK登录号KT350654)、果胶酸裂解酶PEL(GenBank登录号KP987180)等多个相关基因。结合原核表达，将靶标基因在大肠杆菌中诱导表达成功获得了融合蛋白。构建了象耳豆根结线虫dsRNA离体浸泡体系和VIGS介导的RNAi沉默体系，成功诱导靶标基因下调表达，并通过接种实验获得相应表型。具体研究结果如下：
1.M.enterolobii二龄幼虫转录组测序，获得EST数据库
完成M.enterolobii的J2转录组测序，获得8.88Gb Clean Data，Q30碱基百分比为89.55％。De novo组装后共获得38,221条Unigene。其中长度在1kb以上的Unigene有8,074条。对Unigene进行功能注释，包括与NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、GO和Pfam数据库的比对，共获得18,243条Unigene的注释结果。完成基于Unigene库的基因结构分析，其中SSR分析共获得1,927个SSR标记。同时还进行了CDS预测分析。完成基因在样品中的表达量分析。在此基础上，与模式秀丽小杆线虫、南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫以及大豆孢囊线虫EST序列进行Blast比对，预测出230余个象耳豆根结线虫潜在的RNAi靶标候选基因。从中筛选出促分裂原活化蛋白激酶基因、胶原蛋白基因、热激蛋白Hsp70、钙网蛋白CRT、纤维素结合蛋白CBP、果胶酸裂解酶PEL等多个相关基因进行全长克隆和RNAi效应分析。
2.M.enterolobii actin基因克隆、序列分析和系统进化分析
参考actin引物actinF和actinR，扩增M.enterolobii的actin基因片段。收集M.enterolobii(约50μl)，Trizol法提取RNA(图2A)。以紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测RNA浓度和纯度，A260/A280是1.92，表明所提取的RNA完整性以及纯度均可满足后续实验的要求。以此为模板，actinF和actinR为引物进行RT-PCR反应，扩增得到400bp左右的cDNA片段，将该片段回收，与pEASY-T1载体相连，菌落PCR检测后测序。经测序，得到398bp序列(图2B)。
以M.enterolobii总RNA为模板，运用RACE法得到actin基因的全长cDNA序列。并在NCBI中登录，获得核酸序列登录号：KF534787。序列分析表明：该序列共1298个碱基，包含一个全长1125bp的开放阅读框ORF，起始密码子在82位，终止密码子在1207位，共编码375个氨基酸，蛋白质分子量为107.66KDa，理论等电点为4.826，具有2个核输出信号位点(NES1，170-181；NES2，212-222)，为亮氨酸(Leueine)丰富区域，对蛋白质在细胞核和细胞质间的运输具有重要作用。与GenBank中注册的actin基因序列的相似性均在80％以上，与其他肌动蛋白的氨基酸序列相似性达90％以上，符合actin基因氨基酸编码区高度保守特点，表明真核生物的肌动蛋白基因的高度保守性。
经Blastx分析，发现根据该cDNA推导的蛋白序列与马铃薯腐烂茎线虫、松材线虫、秀丽杆线虫和人类的actin蛋白序列存在很高的相似性，相似度在97％以上。利用DNAMAN软件分析，象耳豆根结线虫actin蛋白质的序列与马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchusdestructor)和松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)相似性分别为为99.20％和98.67％，与秀丽杆线虫(Caenorhabditis elegans)和人类(Homo sapiens)相似性分别达到98.67％和97.33％。
将本发明中M.enterolobii actin蛋白的氨基酸全长序列与Gen Bank中注册的B.xylophilus、Panagrellus redivivus、C.elegans、Brugia malayi等6个物种的β-actin，以及H.sapiens、斑马鱼(Danio rerio)等5个物种的α-actin，采用MEGA4，以邻位相连法(Neighbor-Joining，NJ)构建进化树，多序列比对等参数的设置采用默认设置值。β-actin和α-actin蛋白各成一支，本试验中得到的M.enterolobii actin cDNA推导的氨基酸序列聚类于β-actin类群，可推测本试验中所得actin可能是属于β-actin(图4)。
3.M.enterolobii促分裂原活化蛋白激酶MAPK基因克隆、表达及RNAi分析促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinase，MAPK)是线虫体内信号转导的重要组分，在生长发育过程中具有重要作用。用RACE技术分别克隆获得了象耳豆根结线虫Me-mapk1cDNA的5'末端和3'末端序列，其长度分别为960bp和505bp，拼接后全长序列为1369bp。Me-mapk1cDNA全长序列包含长度为27bp的5'非编码区、157bp的3'非编码区(包括24个碱基polyA尾巴)和一个1185bp的完整开放阅读框，推导编码一个含394aa的蛋白序列(图5)。Me-mapk1cDNA在NCBI GenBank上提交注册登录号为KT380882。
ME-MAPK1蛋白序列由394个氨基酸残基组成，预测分子量大小为45.39kDa，等电点pI＝6.39。BlastP同源性搜索及多序列比对显示ME-MAPK1与南方根结线虫M.incognita(ABI96897)促分裂原活化蛋白激酶MI-MPK1有99％的一致性，与甘蓝根结线虫M.artiellia(CAD56894)、松材线虫Bursaphelenchus xylophilus(ACT46908)和马来丝线虫Brugiamalayi(XP_001900759)等其它线虫促分裂原活化蛋白激酶具有86-93％的一致性(图3)。蛋白保守结构域分析表明，ME-MAPK1第43-331位氨基酸包含11个保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶亚结构域，并且在第VII和第VIII亚结构域间具有胞外信号调节激酶保守的TEY基序序列(图6)。
将构建好的重组表达载体质粒pET-32a-MAPK转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)进行原核表达。SDS-PAGE电泳检测结果表明，在IPTG的诱导下ME-MAPK1融合蛋白成功诱导表达，获得大小约为70kDa的特异条带，与预测大小相符(包括大小约26kDa的标签序列)(图7)。而未经IPTG诱导的重组子及空载体对照无ME-MAPK1融合蛋白条带(图7)。
通过引入T7启动子序列的Me-mapk1基因特异引物M-I1/M-I2扩增获得Me-mapk1靶标片段，随后在反转录酶的作用下合成了长度为332bp的dsRNA。分别提取Me-mapk1dsRNA、不含dsRNA的缓冲液和清水浸泡处理24h的J2总RNA，反转录RT-PCR扩增Me-mapk1和对照基因β-actin。电泳检测结果显示，经Me-mapk1dsRNA浸泡处理后的J2Me-mapk1转录丰度明显低于无dsRNA和清水浸泡处理后的Me-mapk1转录水平(图8A)，而非靶标基因β-actin经以上三个处理后其转录丰度未发生相对变化(图8B)。
将经各浸泡处理的M.enterolobii J2接种至番茄幼苗根部，30d后统计番茄根结形成数量并计算根结指数。结果表明，象耳豆根结线虫J2经Me-mapk1dsRNA浸泡处理后导致番茄根结形成数量比对照明显减少，30d后其平均根结形成数为21.5±8.9(平均±SD)(表1)。不含dsRNA的PBS缓冲液和清水对照处理形成平均根结数分别为61.8±13.5(平均±SD)和63.1±10.6(平均±SD)，对照之间差异不显著(表1)。同时，J2经Me-mapk1dsRNA浸泡处理接种后的番茄根结指数为16.7，而不含dsRNA的PBS缓冲液和清水对照处理的番茄根结指数分别为44.4和47.2(表1)。本发明结果表明Me-mapk1可作为抑制M.enterolobii危害的一个候选靶标基因，具有潜在的应用价值。
表1 dsRNA处理的M.enterolobii接种30d后番茄根结形成数量
4.M.enterolobii钙网蛋白CRT基因克隆及RNAi分析
钙网蛋白(Calreticulin，CRT)是一类在动植物体内高度保守存在的内质网钙离子结合伴侣蛋白，通过调节细胞内钙离子平衡或者直接与信号蛋白互作，参与细胞粘附、mRNA降解、蛋白输送、细胞生长分化、操控基因表达和免疫反应等多种生物学功能途径。根据EST序列设计Me-crt基因末端扩增特异引物，结合RACE技术克隆获得Me-crt基因的3’末端和5’末端序列。根据末端序列设计基因全长特异引物，PCR扩增获得Me-crtcDNA全长序列(图9)。
Me-crtcDNA全长1567bp，包括长度为76bp的5'UTR序列、243bp的3'UTR(包括20个碱基polyA尾巴)和一个1248bp的完整开放阅读框，推导编码一个415aa的蛋白序列(图10)。Me-crtcDNA在NCBI GenBank上提交注册，登录号为KT874558。
预测蛋白Me-CRT由415个氨基酸残基组成，分子量大小为48.62kDa，等电点pI4.37。保守结构域搜索比对结果表明Me-CRT属于钙网蛋白家族成员，含有家族典型的保守结构域(25-335aa)。BlastP同源性搜索及多序列比对显示Me-CRT与南方根结线虫钙网蛋白Mi-CRT有98％的一致性，而与香蕉穿孔线虫、松材线虫和等其它植物线虫钙网蛋白具有73-84％的一致性(图8)。同时，SignalP4.0在线信号肽预测分析表明Me-CRT氨基端含有一个长度为22aa信号肽序列，且无跨膜结构域，表明其为一种分泌蛋白。
根据Me-crt cDNA序列，选择适宜的区域片段设计杂交探针引物，以cDNA为模板结合利用单链PCR技术，分别合成地高辛标记的正义单链探针和反义单链探针。杂交显色后，Me-crt反义探针信号特异地出现在象耳豆根结线虫J2的两个亚腹食道腺细胞中，而对照正义探针无杂交信号(图12)，说明Me-crt在亚腹食道腺细胞中的特异表达。
取接种J2(约100000头)第2d、第7d和第13d后的番茄病根，采用酶裂解法分离收集根内不同发育阶段的幼虫虫体(侵染期二龄幼虫、三龄幼虫、四龄幼虫)。取接种二龄幼虫35d后的番茄病根，在解剖镜下用挑针直接从根内分离获得雌成虫。运用RT-PCR分析Me-crt在卵期、侵染前二龄幼虫、侵染期二龄幼虫、三龄幼虫、四龄幼虫、雌成虫等虫态的发育表达特征，以M.enterolobii在各虫态稳定表达的持家基因β-actin为对照。电泳检测结果显示，Me-crt在M.enterolobii迁移性二龄幼虫(侵染前二龄幼虫、侵染期二龄幼虫)以及固着性寄生阶段(三龄幼虫、四龄幼虫)均有表达，而雌成虫期未检测到转录信号(图13)。本发明结果表明了Me-crt可能在迁移、取食寄生阶段均起着重要作用。
体外反转录合成Me-crt dsRNA片段，在神经刺激剂间苯二酚的作用下采用浸泡法将Me-crt dsRNA导入至M.enterolobii二龄幼虫体内，成功诱导了特异靶标基因Me-crt的下调表达(图14)。
进行接种实验，将经dsRNA处理的二龄幼虫接种于番茄，同时设置对照实验(未经dsRNA处理)，观察统计M.enterolobii的侵染能力及根结指数等表型变化。结果表明，经Me-crt dsRNA处理并诱导靶标基因下调表达的M.enterolobii诱导番茄根系根结指数比对照的下降约20％(表2)。
表2 dsRNA和non-dsRNA处理的线虫浸染数和番茄根根结指数
在完成M.enterolobii二龄幼虫转录组序列的基础上，进一步利用RACE技术结合RT-PCR克隆获得了M.enterolobii钙网蛋白效应子基因Me-crt cDNA全长序列，GenBank登录号为KT874558。原位杂交显示Me-crt在二龄幼虫的亚腹食道腺细胞特异表达及含有信号肽序列，表明其具有效应子基因的典型特征。发育表达类型分析结果显示Me-crt基因在M.enterolobii侵染寄生阶段稳定表达，而在非寄生阶段不表达，表明其在寄生致病过程中扮演了重要的角色。通过RNAi对Me-crt基因进行沉默诱导后，可导致M.enterolobii的致病能力下降，表现为二龄幼虫侵染数与根结指数比对照的明显降低。以上结果为阐明M.enterolobii寄生致病过程中机理提供了重要分子数据，同时表明Me-crt基因可作为防治M.enterolobii的一种候选靶标基因，具有潜在的良好应用价值。
5.M.enterolobii CBP基因克隆、表达组织定位和RNAi分析
为获得M.enterolobii CBP蛋白序列信息并分析其在线虫寄生致病过程中的功能地位，利用已构建的M.enterolobii二龄幼虫转录组数据库，结合RACE技术克隆了M.enterolobii纤维素结合蛋白基因Me-cbp-1(登录号:KU350655)cDNA全长序列。生物信息学分析表明，Me-cbp-1cDNA全长809bp，其5′末端和3′末端的非编码区长度分别为43bp和139bp，以及含有1个长度为627bp的完整开放阅读框(ORF)，推导编码208个氨基酸。预测蛋白ME-CBP-1含有起分泌功能的信号肽结构和纤维素结合结构域。同源性搜索比对分析表明，ME-CBP-1与南方根结线虫(M.incognita)、爪哇根结线虫(M.javanica)以及花生根结线虫(M.arenaria)纤维素结合蛋白具有88％～91％的相似性。原位杂交显示Me-cbp-1在象耳豆根结线虫二龄幼虫的亚腹食道腺细胞特异表达。利用RNAi技术对象耳豆根结线虫二龄幼虫的Me-cbp-1基因进行沉默后，导致二龄幼虫的侵染率显著降低。本实验结果初步证明了纤维素结合蛋白在M.enterolobii二龄幼虫侵染寄主的过程中具有重要的地位，推测其通过与细胞壁主要成分纤维素结合，促进植物细胞壁的软化和降解，从而有利于提高线虫的侵染和寄生能力。研究结果为揭示M.enterolobii分子寄生致病机制以及研究根结线虫防控新技术提供了理论基础。
利用RACE技术分别克隆获得了Me-cbp-1cDNA的5′末端和3'末端序列，拼接后获得的全长序列为809bp(GenBank登录号:KU350655)。Me-cbp-1cDNA由5'非编码区、3'非编码区和一个完整的开放阅读框组成，其中5'非编码区长度为43bp、开放阅读框长度为627bp，以及3'非编码区长度为139bp(含PolyA尾)(图15)。
Me-cbp-1开放阅读框推导编码一个由208氨基酸残基组成的蛋白Me-CBP-1，DNAMAN软件预测其分子量为22.2kD，等电点4.0。Signal P 4.0在线软件预测Me-CBP-1蛋白氨基端(N)含有一个起分泌功能的信号肽前体序列，长度为20个氨基酸。BlastP同源性搜索显示Me-CBP-1蛋白羧基端(C)含有一个保守的纤维素结合结构域(CBD-II)，位于谷氨酸Glu116至天冬氨酸Asp163之间。序列分析比对表明象耳豆根结线虫纤维素结合蛋白Me-CBP-1与南方根结线虫、爪哇根结线虫以及花生根结线虫的纤维素结合蛋白具有88％～91％的相似性(图14)。此外，与孢囊线虫(Heterodera spp.)不同的是，在根结线虫纤维素结合蛋白序列N端还含有70多个氨基酸，该段序列与数据库中的其它蛋白无任何相似性，且功能未知(图16)。
通过PCR法分别合成了地高辛标记的Me-cbp-1基因正义单链探针和反义单链探针。杂交显色后，反义探针信号特异的出现在M.enterolobii二龄幼虫的两个亚腹食道腺细胞，而对照正义探针无杂交信号(图17)，结果表明，Me-cbp-1基因在二龄幼虫亚腹食道腺细胞特异表达。
通过引入T7启动子序列，体外反转录合成了Me-cbp-1(404bp)和gfp(408bp)同源dsRNA片段。象耳豆根结线虫二龄幼虫分别用Me-cbp-1dsRNA、gfp dsRNA和清水浸泡处理24h后，RT-PCR检测Me-cbp-1基因的沉默效果。PCR扩增30个循环时，Me-cbp-1dsRNA、gfpdsRNA和清水处理都可检测出特异条带，但经Me-cbp-1dsRNA浸泡处理后的条带亮度明显低于gfp dsRNA和清水浸泡处理(图18A)。相对应的是，非靶标内参基因β-actin在不同处理条件下均稳定表达(图18B)。因此，以上结果说明Me-cbp-1dsRNA特异性降低了二龄幼虫Me-cbp-1基因的表达，但并未完全抑制。
将经各浸泡处理的M.enterolobii二龄幼虫接种至番茄幼苗根部，10d后取番茄根系进行酸性品红染色，显微镜下观察统计二龄幼虫的侵染率。结果显示，象耳豆根结线虫二龄幼虫经Me-cbp-1dsRNA浸泡处理后其侵染率比对照gfp dsRNA处理的减少约27％。其中，经Me-cbp-1dsRNA浸泡处理后的M.enterolobii二龄幼虫平均侵染率为26.8％，而gfpdsRNA和不含dsRNA的缓冲液对照浸泡处理后的二龄幼虫平均侵染率分别为36.4％和36.6％，且对照之间差异不显著(表3)。因此，利用RNAi技术对M.enterolobii二龄幼虫的Me-cbp-1基因进行沉默后，导致二龄幼虫的侵染率显著降低，原因很可能是Me-cbp-1基因的下调表达影响了线虫对纤维素的降解能力，该结果也进一步表明，Me-cbp-1基因在M.enterolobii在早期侵染过程中的重要地位。
表3 Me-cbp-1dsRNA浸泡处理M.enterolobii J2接种10d后的侵染数
6.M.enterolobii果胶酸裂解酶PEL基因克隆及分析
利用EST分析结合RACE方法从M.enterolobii中克隆了一个新的Me-pel2(登录号KP987180)。相似性搜索比对(Blastx)显示，该cDNA与NCBI数据库中根结线虫、孢囊线虫等植物寄生线虫以及一些真菌和细菌的果胶酸裂解酶基因同源，一致性在16％～54％之间。同时，该cDNA编码的氨基酸序列含有一个果胶酸裂解酶保守结构域，位于亮氨酸Leu73至缬氨酸Val244之间。
M.enterolobii果胶酸裂解酶Me-PEL2蛋白序列由277个氨基酸残基组成，预测分子量为29.86kDa，等电点pI为8.67。Signal P软件预测Me-PEL2蛋白N端含有一个起分泌功能的信号肽前体序列，长度为16个氨基酸残基，剪切位点位于丙氨酸Ala16与异亮氨酸Ile17之间。BlastP搜索结果显示Me-PEL2与南方根结线虫M.incognita果胶酸裂解酶Mi-pel3(GenBankNo:AY861685)具有最高的一致性，为54％。Me-PEL2与植物线虫的其它果胶酸裂解酶一致性均较低，其中与孢囊线虫果胶酸裂解酶一致性在30％～33％之间，而与象耳豆根结线虫果胶酸裂解酶Me-pel1(HQ180169)的一致性仅为23％。保守结构域搜索及多序列比对结果表明，Me-PEL2属于多糖裂解酶第III家族，具有第III家族典型特征的四个高度保守区域，且含多个保守的半胱氨酸残基和带正电荷残基，为果胶酸裂解酶的活性位点(图19)。
从GeneBank中选取与Me-PEL2具有同源性的30个植物寄生线虫、细菌和真菌的果胶酸裂解酶氨基酸序列，运用MEGA6.0软件邻接法进行系统发育树构建。结果显示，植物寄生线虫的果胶酸裂解酶聚为4个进化分支，分别为Nematode I、Nematode II、Nematode III和Nematode IV。象耳豆根结线虫Me-PEL1和Me-PEL2属于不同分支，其中Me-PEL1与南方根结线虫Mi-PEL1、爪哇根结线虫Mj-PEL1形成一个小的分支(Nematode I)，并且与来自细菌和真菌的果胶酸裂解酶聚为一个较大的分支。Me-PEL2与南方根结线虫Mi-PEL2和Mi-PEL3，以及拟禾本科根结线虫Mg-PEL1聚为一个小的独立分支(Nematode III)图20，。多个孢囊线虫果胶酸裂解酶基因包括大豆孢囊线虫Hg-PEL1，Hg-PEL2和Hg-PEL5、甜菜孢囊线虫Hs-PEL1、马铃薯白线虫Gp-PEL、马铃薯金线虫Gr-PEL1以及烟草孢囊线虫Gts-PEL1和Gv-PEL1聚为一个大的分支(Nematode IV)。其余植物线虫果胶酸裂解酶包括甜菜孢囊线虫Hs-PEL2、马铃薯金线虫Gr-PEL2、燕麦真滑刃线虫Aa-PEL1和Aa-PEL2、松材线虫Bx-PEL1和Bx-PEL以及拟松材线虫Bm-PEL1和Bm-PEL2则构成另外一个较大的分支Nematode PEL3-II。
通过运用RT-PCR分析象耳豆根结线虫果胶酸裂解酶基因Me-pel2在卵期、侵染前二龄幼虫、侵染期二龄幼虫、三龄幼虫、四龄幼虫、雌成虫及雄虫等虫态的发育表达特征。电泳检测结果显示，Me-pel2在M.enterolobii各虫态均有转录表达，但表达丰度不同(图21)。以象耳豆根结线虫在各虫态稳定表达的持家基因β-actin为对照，Me-pel2在侵染前和侵染期二龄幼虫中以及雄虫阶段表达量相对最高，电泳条带清晰明显，而在卵期表达量次之。在3龄幼虫、四龄幼虫以及雌成虫期，Me-pel2转录丰度显著降低，电泳检测信号微弱。
半定量PCR研究表明M.enterolobii果胶酸裂解酶基因Me-pel2在迁移性幼虫和雄虫期表达丰度最高，而在固着期寄生阶段转录水平急剧下降，该结果与南方根结线虫3个果胶酸裂解酶基因的发育表达类型一致。M.enterolobii属于专性固着性内寄生，仅在侵染性二龄幼虫和雄虫期具有迁移能力，Me-pel2在二龄幼虫和雄虫期高丰度表达表明其蛋白产物主要在迁移性寄生阶段起作用，通过降解寄主细胞壁果胶质成分，协助线虫侵入寄主(二龄幼虫)以及在寄主体内迁移(二龄幼虫和雄虫)。在三龄幼虫、四龄幼虫和雌成虫期，M.enterolobii呈固着态从取食位点攫取营养物质，这些发育阶段Me-pel2表达量显著降低表明其蛋白产物在寄生阶段后期的发育过程不具有重要作用。此外，Me-pel2在卵期表达量也相对较高，推测可能是已有卵块即将蜕皮发育成侵染性二龄幼虫，Me-pel2开始诱导表达有助于孵化后能够立即侵染寄主植物。
7.M.enterolobii胶原蛋白COL基因克隆及分析
克隆获得M.enterolobii胶原蛋白基因(Me-col1)cDNA全长序列，全长1211bp，包括长度为71bp的5'UTR序列、93bp的3'UTR(包括20个碱基polyA尾巴)和一个1047bp的完整开放阅读框，推导编码一个348aa的蛋白序列。Me-col1cDNA在NCBI GenBank上提交注册，登录号为KU350688。
预测蛋白Me-COL1由394个氨基酸残基组成，预测分子量大小为35.08kDa，等电点pI＝6.30。BlastP同源性搜索及多序列比对显示ME-COL与南方根结线虫M.incognita(AOG74800)胶原蛋白有99％的相似性，与爪哇结线虫M.javanica(AAK83075)、Pristionchus pacificus(KKA73542)及Toxocara canis(KHN75644)等其它线虫胶原蛋白具70-91％相似性。Me-COL1富含甘氨酸、脯氨酸，具显著的胶原蛋白结构域(图22)。
完成Me-col1外源诱导表达，获得重组蛋白。将Me-col1编码序列克隆至表达载体PET-32a中，成功构建了融合蛋白表达重组子。电泳结果表明，Me-COL1融合蛋白成功诱导表达，大小约65kDa(含约20kDa的标签序列)，与预测大小相符。如图23。
8.M.enterolobii丝氨酸苏氨酸激酶RAF基因克隆及分析
克隆获得丝氨酸苏氨酸激酶RAF基因(Me-raf1)cDNA全长序列，含一个1728bp的完整开放阅读框，推导编码一个575aa的蛋白序列，预测分子量大小为62.64kDa，等电点pI＝9.27(图24)。BlastP同源性搜索及多序列比对显示Me-RAF与南方根结线虫MeloidogyneincogntiaMAP3K(ADF45513)有99％的一致性，与甘蓝根结线虫Meloidogyne artielliaRAF(CAD56892)有88％的一致性，与松材线虫Bursaphelenchus xylophilusRAF(ADI24876)有70％的一致性。
9.M.enterolobiiHsp70基因片段的克隆、表达和部分功能分析
采用RT-PCR和RACE法，以M.enterolobii cDNA为模板，用设计的简并引物进行PCR扩增，结果获得880bp的片段。测序结果通过BLAST比对分析表明，与其它生物的Hsp70序列有较高的同源性。进而通过RACE-PCR技术分别获得1385bp的3′端序列和544bp的5′端序列。最后利用DNAMAN软件将相互重叠的3段序列进行拼接，得到2203bp的M.enterolobii全长cDNA序列，并命名为MeHsp70(登录号：KF739434)。如图25。
MeHsp70全长cDNA为2203bp，5′末端有49bp的非翻译区，3′末端有195bp非翻译区并含有一个短的polyA尾巴，ORF长度为1959bp，预测编码蛋白质的分子量为71.09kD，等电点为5.29。氨基酸序列中含有真核生物Hsp70家族蛋白的三个标签序列(9-16位的IDLGTTYS，198-211位的IFDLGGGTFDVSIL，335-348位的IVLVGGSTRIPKVQ)和胞质型Hsp70所特有的末端高度保守序列EEVD。MeHsp70与大豆包囊线虫(Heterodera glycines)、腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)、松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)、拟松材线虫(Bursaphelenchus mucronatus)、秀丽杆线虫(Caenorhabditis elegans)、果蝇(Drosophila melanogaster)和酵母(Saccharomycescerevisiae)的同源性分别为92.07％、90.06％、88.21％、88.51％、86.37％、77.95％和75.04％。
MeHsp70氨基酸全长序列与H.glycines、D.destructor、马来丝虫(Brugiamalayi)、班氏吴策丝虫(Wuchereria bancrofti)和指状腹腔丝虫(Setaria digitata)等真核生物的Hsp70，弗氏志贺菌(Shigella flexneri)、鼠疫杆菌(Yersiniapestis)和大肠杆菌(Escherichia coli)等原核生物，采用MEGA4，以邻位相连法(Neighbor-Joining，NJ)构建进化树(图26)。结果来自真核生物的Hsp70聚为一支，来自原核生物的Hsp70形成另一支；在真核生物中，动物寄生线虫Hsp70聚为一支，而同属于植物寄生线虫的B.xylophilus、B.mucronatus未与D.destructor、M.enterolobii、H.glycines形成一支。
构建了MeHsp70基因原核表达载体。重组表达载体质粒的PCR产物约为2kb，Hsp70基因片段已正确插入了表达载体的插入位点，ORF完整，未发生碱基丢失或移码。从阳性克隆中提取质粒DNA，经EcoR V和Kpn I双酶切后释放出目的基因，说明MeHsp70-pET30a表达载体构建成功(图27A)。SDS-PAGE分析(图27B)，IPTG终浓度0.4、0.8mmol/L、1.0mmol/L时，显著诱导重组质粒表达出约70kD左右的融合蛋白。
pEASY-E1-MeHsp70和pET30a-MeHsp70两个原核表达载体通过热激转化分别转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21进行表达。在55℃、65℃进行热稳定性测定，结果发现，转入pET30a-MeHsp70基因的大肠杆菌BL21生存时间较长，热稳定性相对较好；而转入pEASY-E1-MeHsp70的大肠杆菌BL21、转入空载pET30a的大肠杆菌BL21、转入空载pEASY-E1的大肠杆菌BL21和大肠杆菌BL21原始菌株的生存时间都相对较短，热稳定性相对较差，如图28。
通过SDS-PAGE凝胶电泳测定发现，MeHsp70基因均上调表达，转入pET30a-MeHsp70基因的大肠杆菌Hsp70蛋白表达量高于其它菌株。通过实时荧光定量PCR分析表明，MeHsp70基因确实有一定量的上调表达，说明大肠杆菌BL21的热稳定性提升与MeHsp70基因的上调表达有直接关系。如图29。
MeHsp70基因转入大肠杆菌BL21之后能够提升其耐热性，并且与Hsp70基因表达量存在正相关。
转入pEASY-E1-MeHsp70和pET30a-MeHsp70两个原核表达载体的大肠杆菌BL21、只转入空载pEASY-E1和pET30a的大肠杆菌BL21、大肠杆菌BL21原始菌株之间生长速率在各个阶段基本保持一致。将转入pET30a-MeHsp70和转入pET30a的大肠杆菌BL21生长曲线单独列出并分析发现，转入pET30a-MeHsp70比转入空载pET30a的菌株进入对数期相对较晚。经过多次生长曲线测定发现，转入pET30a-MeHsp70的大肠杆菌BL21进入对数期的时间平均增加了约30min，到达稳定期的时间也增加了约30min。到达稳定期后转入pET30a-MeHsp70的大肠杆菌BL21的菌液浓度与其他菌株基本相同，没有太大差异。30℃时大肠杆菌的生长速率低于37℃时大肠杆菌的生长速率，30℃大肠杆菌的最大菌液浓度也要略高于37℃大肠杆菌的最大菌液浓度。如图30。
MeHsp70基因转入大肠杆菌BL21之后能够延长大肠杆菌BL21的准备期，使大肠杆菌BL21生长曲线推迟进入对数期，延长到达稳定期的时间。大肠杆菌BL21感受态细胞E.coli BL21(DE3)是商品化的，购置于北京全式金生物技术有限公司。
本发明构建了M.enterolobii二龄幼虫转录组数据库，成功获得38000多个Unigenes序列，结合利用生物信息学分析，与模式秀丽小杆线虫、南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫以及大豆孢囊线虫的RANi效应基因比对，预测出230余个象耳豆根结线虫潜在的RNAi靶标候选基因；
本发明筛选克隆了与线虫生长发育、寄生致病和适生性密切相关的基因全长序列，包括促分裂原活化蛋白激酶基因MAPK(登录号KT380882)、胶原蛋白基因Collogen(登录号KU350688)、钙网蛋白CRT(登录号KT874558)、纤维素结合蛋白CBP(登录号KT350654)、果胶酸裂解酶PEL(登录号KP987180)、肌动蛋白actin(登录号KF534787)和热激蛋白Hsp70(登录号KF739434)多个相关基因，并进行了氨基酸序列和系统进化分析；
本发明利用原核表达技术，构建了原核表达载体，获得ME-MAPK1、ME-COL1和MeHsp70重组蛋白，为蛋白特性分析奠定了基础。完成Me-cbp1、Me-crt1和Me-pel2组织表达定位和发育表达类型分析；
本发明构建了M.enterolobii离体RNAi浸泡体系，成功诱导Me-mapk1、Me-crt1和Me-cbp1基因的下调表达。研究结果表明，象耳豆根结线虫二龄幼虫经Me-mapk1和Me-crt1dsRNA浸泡处理后导致番茄根结形成数相比对照明显减少，病情指数分别下降62％、37％。而经Me-cbp1dsRNA浸泡处理后可导致象耳豆根结线虫二龄幼虫侵染率下降27％，本发明结果表明以上三种基因可作为抑制象耳豆根结线虫危害的候选靶标基因，具有潜在的应用价值；
本发明MeHsp70基因转入大肠杆菌BL21能够提升其耐热性，并且与Hsp70基因表达量存在正相关的关系。同时，能够延长大肠杆菌BL21的准备期，使大肠杆菌BL21生长曲线推迟进入对数期，延长到达稳定期的时间。构建了烟草脆裂病毒TRV载体为介导的VIGS RNAi活体沉默体系。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等、均应包含在本发明的保护范围之内。
<110> 海南省农业科学院植物保护研究所
<120>象耳豆根转录组数据库、融合蛋白、浸泡体系、沉默体系
<160> 7
<210> 1
<211> 1369
<212> PRT
<213> M.enterolobii促分裂原活化蛋白激酶基因Me-mapk1
<400>氨基酸序列
CAAGTTTGAGATTATTTGTAAAAAAATATGGCTGCAGCCAACACTGTGCAGCATTCTCAACAACCACAAT
CAGCCCCCACAACAGCAGTAGAGCTCCCGCAGCAAAAAATTGTTGAGGAAGTTCATGGACAAATTTTTGA
AGTTAGTCCTCGTTATGTGAATTTATCTTATATTGGAGAAGGTGCTTATGGAATGGTTGTTTCTGCTCTT
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GGACACTTCGAGAAATAAAAATTCTTTCTCGCTTCAAACACGAAAATATCATTAATATACAAGCTATAAT
TCGGGCTCCCAGCATTGAACAAATGAAAGACATATATATTGTGCAGTGTTTGATGGAAACAGACTTATAT
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TTCTAACATGTTTACAGAAATAGGTTTTTTTGATTTTTCTCGTACCTTGTTTAATATTAACCAAATAAAA
TAAATGTTAAATTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
<210> 2
<211> 545
<212> PRT
<213> M.enterolobii胶原蛋白基因Me-col1
<400>氨基酸序列
CGAAATCGGTAGACGCTACGGACTTAATTGGATTGAGCCTTAGTACGGAAACCTACTAAGTGATAACTTT
CAAACTCAGAGAAACCCTGGAATAACAGAGGGGCAATCCTGAGCCAAATCCTTTTTTACGAAAATAAAAA
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TGAAATTTATAGTAAGAGGAAAATCCGTCGATGTTAAAAATCGTGAGGGTTCAAG
<210>3
<211> 2203
<212> PRT
<213> M.enterolobii热激蛋白Hsp70
<400>氨基酸序列
GGTTTAATTACCCAAGTTTGAGCTATCATTTTAAAAAAATCTTTTAAAAATGTCTAAAGCTAACGCTGTC
GGAATTGATCTTGGCACAACTTATTCGTGCGTTGGTGTATTCCAGCATGGAAAAGTTGAAATCATTGCTA
ATGATCAAGGAAATCGCACGACTCCATCGTATGTTGCCTTTACGGACACCGAGCGTCTGATTGGCGACGC
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CCTCTCTCTATCCTCCCCCGACATATACACAATTTATCTATAAAATTGTTTTTTCCGATATGATCGTTAT
GTTTTTTGAGTAAAATTATTTTGTTTTAAAAAA
<210>4
<211> 1567
<212> PRT
<213> M.enterolobii热激蛋白Hsp70
<400>氨基酸序列
ATTAATTTATTTTTAATTTTTTAGATTTAAAAACCTTTAAATTTTAAAAAATCGTTGTTTGTATTCAACA
GTAGAAATGGTGAGCAGGTTTTGTTTTGTATCCTTGCTGATAGCTTGTTGGTCAATTTTTGGAGCTTTTG
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CTATTATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
<210>5
<211>809
<212> PRT
<213> M.enterolobii纤维素结合蛋白Me-cbp-1
<400>氨基酸序列
ATCCACAATCCAAAAAACTTTCTAATAAAAATCCTCTTCTAAAATGTCATCCTTTTTTTATTTTTTATTT
ATTTCTGTTAGTCTTTTGATTATTGCTAATGCTGATGATGCTGGTAGTTATCCTTCAGGGGATGATTTAG
TTGAAGGTACTACTGATGCTCGACTTCATGCGTCCTCCGACCTACCAGACGATGATGAAGAAGAGTGTGA
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AAGATATAAAAATTATTAAAGATTGTGAATATTAAAATTTTTGGCAATTTAAAAAATAATGGCAGAATAT
AAAATACAGTGTGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
<210>6
<211> 834
<212> PRT
<213> M.enterolobii果胶酸裂解酶Me-pel2
<400>氨基酸序列
ATGCTTAATATATTAATTTTAATTATTTCATTTATATCATCCCTGGCGATAAACCAGGACGGAGCCACAT
TTTGTAATTTCCCAAAGCCTTCAAGTACAAATTATACAAAGACCGGTTCAGTCATTAGTGGCTACAATGA
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TGGAAAGGCTGGAACTGGTAGTTCTTGTAATTACCCAGCTTCCGCATTTAAAGTGGTCAATTGA
<210>7
<211> 1298
<212> PRT
<213> M.enterolobii actin基因
<400>氨基酸序列
GGTTTAATTACCCAAGTTTGAGAGAAAACTCTTATTAAATATTTTTATTTTCTTCAAACCAACGATCAAT
AAAACATCGCCATGGACGAAGAGGTCGCCGCACTTGTTGTTGATAATGGCAGTGGCATGTGTAAGGCTGG
ATTTGCTGGTGATGATGCTCCTCGTGCCGTTTTTCCAAGTATTGTTGGACGCCCTCGACACCAGGGTGTC
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GCACACAGTTCCAATCTATGAAGGTTATGCTTTGCCACACGCAATCTTGCGTCTTGACTTAGCGGGCCGT
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AGATTGTCCGTGACATCAAGGAGAAGCTTTGCTATGTTGCTTTGGACTTTGAGCAAGAGATGGCTACAGC
TGCTTCGTCTTCTTCTTTGGAAAAGAGCTATGAATTGCCTGACGGTCAAGTCATTACTGTTGGAAACGAG
CGCTTCCGTTGTCCAGAATCTCTCTTCCAGCCATCTTTCTTGGGTATGGAATCTGCTGGTATCCACGAGA
CTTCTTACAACTCGATCATGAAGTGCGACATTGACATCCGTAAAGACCTTTACGCCAACACTGTCCTTTC
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CTTCATTGTCTACCTTCCAGCAAATGTGGATCAGCAAGCAAGAGTATGACGAATCTGGTCCATCTATTGT
TCACCGTAAATGCTTCTAAGCGCAAAAGAGGAAAAGGAGGAAGAAAAAGAGGAAAAAATGGTTGGAAAAC
AAGAAAAAAGAGAGGGAAAATTTAATAATAAAAAAAAA

Claims (5)

1.一种象耳豆根转录组数据库，其特征在于，所述象耳豆根转录组数据库为38000多个Unigenes序列，利用生物信息学分析，预测出230余个象耳豆根结线虫潜在的RNAi靶标候选基因。
2.一种如权利要求1所述象耳豆根转录组数据库的构建方法，其特征在于，所述象耳豆根转录组数据库的构建方法包括：
步骤一，完成M.enterolobii的J2转录组测序，获得8.88Gb Clean Data，Q30碱基百分比为89.55％；De novo组装后共获得38,221条Unigene；其中长度在1kb以上的Unigene有8,074条；
步骤二，对Unigene进行功能注释，包括与NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、GO和Pfam数据库的比对，共获得18,243条Unigene的注释结果；完成基于Unigene库的基因结构分析，其中SSR分析共获得1,927个SSR标记；同时还进行了CDS预测分析；完成基因在样品中的表达量分析；
步骤三，与模式秀丽小杆线虫、南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫以及大豆孢囊线虫EST序列进行Blast比对，预测出230余个象耳豆根结线虫潜在的RNAi靶标候选基因；从中筛选出促分裂原活化蛋白激酶基因、胶原蛋白基因、热激蛋白Hsp70、钙网蛋白CRT、纤维素结合蛋白CBP、果胶酸裂解酶PEL 6个相关基因进行全长克隆和RNAi效应分析。
3.一种由权利要求1所述象耳豆根转录组数据库克隆的与线虫生长发育和寄生致病密切相关的基因全长序列，其特征在于，所述基因全长序列根据预测的靶标基因序列，克隆了与线虫生长发育和寄生致病密切相关的基因全长序列，包括促分裂原活化蛋白激酶基因MAPK、胶原蛋白基因Collogen、热激蛋白Hsp70、钙网蛋白CRT、纤维素结合蛋白CBP、果胶酸裂解酶PEL多个相关基因。
4.一种由权利要求1所述象耳豆根转录组数据库获得的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白结合原核表达，将靶标基因在大肠杆菌中诱导表达成功获得了融合蛋白。
5.一种由权利要求1所述象耳豆根转录组数据库构建的象耳豆根结线虫dsRNA离体浸泡体系和VIGS介导的RNAi沉默体系。
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