BRPI0707626A2

BRPI0707626A2 - identificaÇço e uso de genes alvos para o controle de nematàides parasitas de plantas

Info

Publication number: BRPI0707626A2
Application number: BRPI0707626-6A
Authority: BR
Inventors: Andrey A Boukharov; Zijin Du; Liang Guo; Michelle C Hresko; David K Kovalic; Zhaolong Li; Maolong Lu; James P Mccarter; Nancy M Miller; Mark Vaudin; Deryck J Williams; Wei Wu
Original assignee: Monsanto Technology Llc
Priority date: 2006-02-10
Filing date: 2007-02-09
Publication date: 2011-05-10
Also published as: WO2007095469A8; WO2007095469A3; US9988642B2; EP2044109B1; US20190241906A1; PL2044109T3; US20180312867A1; US9388409B2; US20160376606A1; US20150252366A1; ZA200806328B; US10174340B2; US8519225B2; US10829781B2; US20140004088A1; EP2044109A2; WO2007095469A2; ES2479090T3; US20070250947A1; CA2637665A1

Abstract

IDENTIFICAÇçO E USO DE GENES ALVOS PARA O CONTROLE DE NEMATàIDES PARASITAS DE PLANTAS. A presente invenção refere-se à identificação e à avaliação de sequências codificadoras alvos para o controle de nematóldes parasitas de plantas através da inibição de uma ou mais funções biológicas e ao uso das mesmas. A invenção fornece processos e composições para a identificação de tais sequências e para o controle de uma população de nematóides parasitas de plantas. Através da alimentação de uma ou mais moléculas de RNA de filamento duplo recombinantes fornecidas pela invenção ao nematóide, pode ser obtida uma redução na doença através da supressão da expressão gênica do nematóide. A invenção também está direcionada a processos para a produção de plantas transgênicas que expressam as moléculas de RNA de filamento duplo a às células vegetais e às plantas obtidas dessa maneira.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para"IDENTIFICAÇÃO E USO DE GENES ALVOS PARA O CONTROLE DENEMATÓIDES PARASITAS DE PLANTAS".

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

Este pedido de patente reivindica benefício e prioridade aoPedido de Patente U.S. Provisório 60/772.265, depositado em 10 defevereiro de 2006, que é incorporado aqui como referência em suatotalidade.

1. Campo da Invenção

A presente invenção refere-se de forma geral ao controlegenético de doença de plantas causada por nematóides parasitas deplantas. Mais especificamente, a presente invenção refere-se à identificaçãode seqüências codificadoras alvos e ao uso de tecnologias do DNArecombinante para a repressão pós-transcrição ou para a inibição daexpressão de seqüências codificadoras alvos nas células de um nematóideparasita de plantas para fornecer um efeito protetor da planta.

2. Descrição da Arte Relacionada

As plantas estão sujeitas a vários agentes causadores dedoenças potenciais, incluindo nematóides parasitas de plantas, que sãoorganismos ativos flexíveis alongados que vivem sobre superfícies úmidasou em ambientes líquidos, incluindo filmes de água dentro do solo e tecidosúmidos dentro de outros organismos. Há várias espécies de nematóidesparasitas de plantas, incluindo vários nematóides de cisto (por exemplo,Heterodera sp.), nematóides de galhas de raiz (por exemplo, Meloidogynesp.), nematóides que causam lesões (por exemplo, Pratylenchus sp.),nematóides-adaga (por exemplo, Xiphinema sp.) e nematóides de caule ebulbos (por exemplo, Ditylenchus sp.), entre outros. Os nematóidesTylenchid (membros da ordem Tylenchida), incluindo as famíliasHeteroderidae, Meloidogynidae e Pratylenchidae, constituem o grupo maiore mais importante economicamente de nematóides parasitas de plantas.Outros nematóides parasitas de plantas importantes incluem nematóidesDorylaimid (por exemplo, Xiphinema sp.), entre outros. As espécies denematóides crescem através de uma série de estágios de ciclo de vida emudas. Tipicamente, há cinco estágios e quatro mudas: estágio de ovo; J1(isto é, primeiro estágio juvenil); M1 (isto é, primeira muda); J2 (segundoestágio juvenil; algumas vezes eclosão do ovo); M2; J3; M3; J4; M4; A(adulto). Os estágios juvenis ("J") são também algumas vezes referidoscomo estágios de larva ("L"). A expressão gênica pode ser específica a umou mais estágios de ciclo de vida.

Algumas espécies de nematóides evoluíram como parasitasmuito bem sucedidos tanto de plantas quanto de animais e são responsáveispor perdas econômicas significativas na agricultura e no gado e pelamorbidez e mortalidade em seres humanos. Os parasitas nematóides deplantas podem habitar todas as partes das plantas, incluindo raízes, brotosde flores em desenvolvimento, folhas e caules. Os parasitas de plantas sãoclassificados com base em seus hábitos alimentares nas categorias amplasectoparasitas migratórios, endoparasitas migratórios e endoparasitassedentários. Os endoparasitas sedentários, que incluem os nematóides degalha de raiz (Meloidogyne) e nematóides de cisto (Globodera e Heterodera)induzem sítios de alimentação ("sincícios") e estabelecem infecções emlongo prazo dentro das raízes que estão freqüentemente danificando muitoas plantas de cultivo. É estimado que os nematóides parasitas custam paraas indústrias de horticultura e de agricultura um excesso de $78 bilhões aolongo de todo o mundo durante um ano, com base em uma perda anual de12% média estimada espalhada ao longo de todas as plantas de cultivoprincipais. Por exemplo, é estimado que os nematóides causam perdas paraa soja de aproximadamente $3,2 bilhões anualmente ao longo de todo omundo (Barker e outros, 1994).

Composições, métodos e agentes para o controle de infestaçõespor nematóides foram fornecidos em várias formas. Métodos de controlebiológicos e culturais, incluindo quarentenas de plantas, foram tentados emvários casos. Em algumas plantas de cultivo, foram identificados genes deresistência vegetais que permitem resistência ou tolerância a nematóides.

Composições químicas tais como nematocidas foram tipicamente aplicadasno solo no qual nematóides parasitas de plantas estão presentes.Entretanto, há uma necessidade urgente de controles de nematóidesseguros e eficientes. Fatores que se relacionam às desvantagens daspresentes estratégias de controle incluem preocupação elevada em relaçãoà sustentabilidade da agricultura e novas regras do governo que podemprevenir ou restringir drasticamente o uso de muitos agentes anti-helmínticosquímicos agrícolas disponíveis.

Os agentes químicos não são freqüentemente seletivos eexercem seus efeitos sobre organismos que não são alvos, atrapalhandoeficientemente populações de microorganismos benéficos, durante umperíodo de tempo após a aplicação do agente. Os agentes químicos podempersistir no ambiente e ser apenas lentamente metabolizados. Os agentesde fumigação do solo nematocidas tais como cloropicrina e brometo demetila e compostos relacionados são altamente tóxicos e o brometo demetila foi identificado como um composto de eliminação de ozônio. Assimseu registro para uso nos Estados Unidos da América não foi renovado.Estes agentes também podem ser acumular no nível da água ou na cadeiaalimentar e em espécies de nível trófico superiores. Estes agentes tambémpodem atuar como agentes mutagênicos e/ou agentes carcinogênicos porcausarem modificações genéticas irreversíveis è deletérias. Assim, osmétodos alternativos para o controle de nematóides, tais como métodosgenéticos, estão sendo mais e mais estudados.

O organismo Caenorhabditis elegans, um nematóidebacteríovoros, é o modelo genético de nematóide mais amplamenteestudado. Bancos de dados públicos e privados mantêm uma abundância deinformação sobre sua genética e seu desenvolvimento, mas a aplicaçãoprática desta informação para o controle de nematóides parasitas de plantaspermanece um desafio (McCarter e outros 2003; McCarter 2004). Eraanteriormente impraticável identificar rotineiramente um grande número degenes alvos em nematóides sem ser C. elegans, tais como os nematóidesparasitas de plantas, para análise funcional subseqüente, por exemplo,através da análise de RNAi. Portanto, existia uma necessidade de métodosmelhorados de identificação de genes alvos, supressão da expressão queleva ao controle da infestação por nematóides.

Muitos genes em C. elegans possuem ortólogos em animaismetazoários incluindo insetos e vertebrados assim como outros nematóides.

Nos últimos anos, uma coleção de tags de seqüências expressasenormemente expandidas (EST) foi gerada partindo de mais de 30 espéciesde nematóides parasitas de plantas e de animais (Parkinson e outros, 2004).

Como em 2005 havia aproximadamente 560.874 seqüências denucleotídeos no Genbank provenientes de nematóides sem ser das espéciesde Caenorhabditis e projetos públicos estão a caminho de gerar seqüênciasde "rascunho" de Meloidogyne hapla (nematóide de galha de raiz),Haemonchus contortus (parasita de ovelha), Trichineila spiralis (parasita deseres humanos e outros mamíferos) (430.000 traços de seqüênciassubmetidos) e Pristionchus pacificus (nematóide de vida livre) (149.000traços de seqüências submetidos). 20.109 ESTs estão disponíveisprovenientes de Heterodera glycines representando partes deaproximadamente 9.000 genes (ver, por exemplo, o Pedido de Patente U.S.N9 de Série 11/360.355, depositado em 23 de fevereiro de 2006). Éesperado que genes conservados mantenham freqüentemente as mesmasou funções muito similares em nematóides diferentes. Esta equivalência1 funcional foi demonstrada em alguns casos através da transformação de C.elegans com genes homólogos de outros nematóides (Kwa e outros, 1995;Redmond e outros 2001). Tal equivalência foi mostrada em comparaçõescruzadas de filos em relação a genes conservados e é esperado que sejamais robusta entre espécies dentro de um filo.

A interferência de RNA (RNAi) é um processo que utiliza viascelulares endógenas em que um gene alvo específico de RNA de filamentoduplo (dsRNA) resulta na degradação do mRNA de interesse. Nos últimosanos, o RNAi foi utilizado para realizar "nocaute" gênico em um número deespécies e sistemas experimentais, desde o nematóide C. elegans, atéplantas, até embriões de insetos e células em cultura de tecido (Fire eoutros, 1998; Martinez e outros, 2002; McManus e Sharp, 2002). O RNAifunciona através de uma via endógena que inclui o complexo protéico Dicerque gera RNAs interferentes pequenos (siRNAs) de ~21 nucleotídeospartindo do dsRNA original e o complexo silenciador induzido por RNA(RISC) que utiliza guias de siRNA para reconhecer e degradar os mRNAscorrespondentes. Somente os produtos da transcrição complementares aosiRNA são clivados e degradados e assim o nocaute da expressão domRNA é geralmente específico à seqüência. O efeito de silenciamentogênico do RNAi persiste durante dias e, sob condições experimentais, podelevar a um declínio na abundância do produto da transcrição direcionado de90% ou mais, com o declínio conseqüente nos níveis da proteínacorrespondente.

A supressão gênica mediada por dsRNA através do RNAi podeser conseguida em C. elegans através da alimentação, da imersão dosnematóides em soluções contendo moléculas de RNA de filamento duplo ouinterferentes pequenas e através da injeção das moléculas de dsRNA(Kamath e outros, 200Í; Maeda e outros, 2001). Várias análises em grandeescala dos genes de C. elegans por RNAi foram realizadas de forma que ainformação de nocaute do RNAi está disponível para >90% dos genes de C.elegans (Gonczy e outros, 2000; Fraser e outros, 2000; Piano e outros,2000; Maeda e outros, 2001; Kamath e outros, 2003; Simmer e outros, 2003;Ashrafi e outros, 2003; Sonnichsen e outros, 2005).

Até agora, há apenas informação técnica ou de patentepublicada limitada sobre a supressão gênica mediada por RNAi emnematóides parasitas de plantas, em que as moléculas de filamento duplo(dsRNA) ou interferentes pequenas (siRNA) são coletadas de meios decultivo artificiais (in vitro) ou de tecido vegetal (in planta). Foi observado queo RNAi funciona em vários nematóides parasitas incluindo os parasitas deplantas Heterodera glycines e Globodera pallida (Urwin e outros, 2002;Publicação US US2004/0098761; Publicação US US2003/0150017;Publicação US US2003/0061626; Publicação US US2004/0133943;Fairbairn e outros 2005), Meloidogyne javanica (W02005/019408) eparasitas de mamíferos Nippostrongylus brasiliensis (Hussein e outros,2002), Brugia malayi (Aboobaker e outros, 2003) e Onchocerca volvulus(Lustigman e outros, 2004). A produção de dsRNA específico a parasitas foisugerida como uma estratégia direta para o controle de nematóidesparasitas de plantas incluindo o nematóide de cisto da soja, Heteroderaglycines (por exemplo, Fire e outros, 1998; Publicação US US2004/0098761;WO 03/052110 A2; Publicação US US2005/0188438). A Publicação USUS2006/0037101 descreve o uso de seqüências de H. glycines, tais comode pas5, para modular a expressão do gene SCN. Entretanto, nenhummétodo sistemático para a identificação de genes alvos de nematóides parauso em tais estratégias foi relatado e apenas um número limitado de genesde nematóides parasitas de plantas foi proposto como alvos potenciais paraestudos de supressão gênica mediados por RNAi.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1: Sistema de Classificação de Fenótipo de RNAi de C.elegans

Figura 2: Resultados de estudos de alimentação de RNAi de C.elegans PO

Figura 3A-3D: Lista dos 300 principais dos Alvos Gênicos de H.glycines Baseados em ortólogos de C. elegans

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção está direcionada para composições emétodos para o controle de doenças causadas por nematóides parasitas deplantas. A presente invenção fornece exemplos de composições de ácidosnucléicos que são homólogos a pelo menos uma parte de uma ou maisseqüências de ácidos nucléicos nativas em um nematóide parasita deplantas alvo. Em certas modalidades, o nematóide é selecionado deHeterodera sp., Meloidogyne sp., Globodera sp., Helicotylenchus sp.,Ditylenehus sp., Pratylenehus sp., Paratylenehus sp., Rotylenehus sp.,Tylenchulus sp., Tylenehorhynehus sp., Hoplolaimus sp., Belonolaimus sp.,Anguina sp., Subanguina sp. e Naeobbus sp. Em particular, o nematóidepode ser um Heterodera sp., tal como H. glycines. Exemplos específicos detais ácidos nucléicos fornecidos pela invenção são dados na listagem deseqüências em anexo como SEQ ID NSs: 301-1026, SEQ ID N8s: 1269-1702 eSEQ ID N9s: 1920-1929. Entretanto, em certas modalidades, a invenção nãocompreende as SEQ ID NSs: 525, 569, 797, 1293 ou 1516.

Assim, em um aspecto, a invenção fornece um polinucleotídeoisolado selecionado do grupo que consiste em: (a) um fragmento de pelomenos 21 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de ácido nucléico dequalquer uma das SEQ ID N8s: 301-1026, SEQ ID N8s: 1269-1702 e SEQ IDN?s: 1920-1929, como apresentado na listagem de seqüências, em que acaptação por um nematóide parasita de plantas de uma seqüência deribonucleotídeos de filamento duplo que compreende pelo menos umfilamento que é complementar ao dito fragmento inibe o crescimento do ditonematóide; e (b) um complemento da seqüência de (a). Em um outroaspecto, a invenção fornece este polinucleotídeo isolado, definidoadicionalmente como ligado de forma operacional a um promotor heterólogo.Entretanto, em certas modalidades, a invenção não compreende as SEQ IDN8s: 525, 569, 797, 1293 ou 1516. Ainda em um outro aspecto, a invençãofornece este polinucleotídeo isolado adicionalmente definido comocompreendido em um vetor de transformação vegetal. Como utilizado aqui, acaptação por um nematóide parasita de plantas inclui a ingestão de uma oumais seqüências pelo nematóide, por exemplo, através da alimentação. Emmodalidades não Iimitantes específicas, a captação pode ser conseguidaatravés do contato de um nematóide parasita de plantas com umacomposição que compreende um ou mais ácidos nucléicos de acordo com ainvenção. Por exemplo, a captação pode também ser conseguida através daimersão de nematóides parasitas de plantas em uma solução quecompreende o(s) ácido(s) nucléico(s).

A invenção também está direcionada a uma seqüência deribonucleotídeos de filamento duplo produzida partindo da expressão dopolinucleotídeo anterior, em que a captação da dita seqüência deribonucleotídeos por um nematóide parasita de plantas inibe o crescimentodo dito nematóide. A invenção fornece ainda uma seqüência deribonucleotídeos de filamento duplo produzida através do preparo de umaseqüência de polinucleotídeo recombinante que compreende uma primeira,uma segunda e uma terceira seqüência de polinucleotídeo, em que aprimeira seqüência de polinucleotídeo compreende um polinucleotídeoisolado, cuja captação por um nematóide parasita de plantas inibe ocrescimento, a alimentação ou o desenvolvimento do dito nematóide, emque a terceira seqüência de polinucleotídeo está iigada à primeira seqüênciade polinucleotídeo através da segunda seqüência de polinucleotídeo e emque a terceira seqüência de polinucleotídeo é substancialmente ocomplemento inverso da primeira seqüência de polinucleotídeo de forma quea primeira e a terceira seqüências de polinucleotídeos se hibridizem quandotranscritas em um ácido ribonucléico para formar a molécula deribonucleotídeos de filamento duplo estabilizada pela segunda seqüência deribonucleotídeos ligada. A inibição do crescimento, da alimentação ou dodesenvolvimento do nematóide pode ser realizada através da inibição daexpressão de uma seqüência de nucleotídeos no nematóide parasita deplantas que é substancialmente complementar à seqüência do primeiropolinucleotídeo.

A invenção fornece ainda um vetor de transformação vegetalque compreende a seqüência de nucleotídeos mencionada anteriormente,em que a seqüência está ligada de forma operacional a um promotorheterólogo funcional em uma célula vegetal e às células transformadas pelovetor. As células podem ser procarióticas ou eucarióticas. Em particular,podem ser células vegetais. As plantas e as sementes derivadas de taiscélulas vegetais transformadas também são consideradas. A invençãofornece ainda um produto de consumo obtido partindo de tal planta, em queo dito produto de consumo compreende uma quantidade detectável dopolinucleotídeo da reivindicação 1 ou um ribonucleotídeo expresso partindodo mesmo. Os métodos para a produção de tal produto de consumo tambémsão considerados, através da obtenção de tais plantas transformadas e dapreparação de alimentos ou produtos alimentícios partindo das mesmas. Emparticular, o alimento ou o produto alimentício é definido como óleo, farinhagrossa, proteína, amido, farinha ou ensilagem.A invenção refere-se ainda a métodos para o controle de umapopulação de nematóide parasita de plantas, tal como H. glycines, quecompreende o fornecimento de um agente que compreende uma seqüênciade ribonucleotídeos de filamento duplo que funciona após ser captado pelonematóide inibindo uma função biológica dentro do dito nematóide, em que oagente compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupoque consiste em SEQ ID N?s: 301-1026, SEQ ID N9s: 1269-1702 e SEQ IDNSs: 1920-1929 e complementos das mesmas. Entretanto, em certasmodalidades, a invenção não se refere ao uso das SEQ ID N"s: 525, 569,797, 1293 ou 1516. A seqüência de polinucleotídeo pode exibir deaproximadamente 95 até aproximadamente 100% de identidade deseqüência de nucleotídeos ao longo de pelo menos aproximadamente 19 atéaproximadamente 25 nucleotídeos contíguos a uma seqüência codificadoraalvo derivada do dito nematóide. A seqüência alvo pode codificar umaproteína, cuja função prevista é selecionada do grupo que consiste em:replicação do DNA, controle do ciclo celular, transcrição, processamento deRNA, tradução, função de ribossomo, síntese de tRNA, função de tRNA,tráfego de proteínas, secreção, modificação de proteínas, estabilidade deproteínas, degradação de proteínas, produção de energia, funçãomitocondrial, metabolismo intermediário, estrutura celular, transdução desinal, endocitose, regulação de íons e transporte.

A invenção fornece ainda um método para reduzir o númerode sítios de alimentação de Heterodera estabelecidos no tecido de raiz deuma; planta hospedeira, que compreende o fornecimento para a plantahospedeira de um Heterodera sp. de uma célula vegetal transformada queexpressa uma seqüência de polinucleotídeo de qualquer uma das SEQ IDNSs: 301-1026, SEQ ID N*8: 1269-1702 e SEQ ID NSs: 1920-1929, em que opolinucleotídeo é expresso para produzir um ácido ribonucléico de filamentoduplo que funciona após ser captado pelo Heterodera sp. para inibir aexpressão de uma seqüência alvo dentro do dito nematóide e resulta em umdecréscimo no número de sítios de alimentação estabelecidos, em relaçãoao crescimento em um hospedeiro que não possui a célula vegetaltransformada.

A presente invenção refere-se ainda a um método paraaumentar o rendimento de uma planta de cultivo submetida à infecção pornematóide parasita de plantas, o dito método compreendendo as etapas de:

a) introdução de um polinucleotídeo selecionado das SEQ ID NSs: 301-1026,SEQ ID N9s: 1269-1702 e SEQ ID N's: 1920-1929, dentro da dita planta decultivo; b) cultivo da planta de cultivo para permitir a expressão do ditopolinucleotídeo, em que a expressão do polinucleotídeo inibe a infecção ou ocrescimento do nematóide parasita de plantas e a perda do rendimentocausada pela infecção pelo nematóide parasita de plantas. Entretanto, emcertas modalidades, a invenção não compreende o uso de umpolinucleotídeo selecionado do grupo que consiste das SEQ ID N"s: 525,569, 797, 1293 ou 1516. Em particular, a planta de cultivo pode ser a soja(Glycine max) e o nematóide parasita de plantas é um nematóide Tylenchidtal como H. glycines.

A invenção fornece adicionalmente um método para amodulação da expressão de um gene alvo em uma célula de nematóideparasita de plantas, o método compreendendo: (a) a transformação de umacélula vegetal com um vetor que compreende uma seqüência de ácidonucléico que codifica um dsRNA selecionado do grupo que consiste dasSEQ ID N8s: 301-1026, SEQ ID N*3: 1269-1702 e SEQ ID Ν%: 1920-1929,ligado de forma operacional a um promotor e a uma seqüência de término datranscrição; (b) o cultivo da célula vegetal transformada sob condiçõessuficientes para permitir o desenvolvimento de uma cultura de célulasvegetais compreendendo um grande número de células vegetaistransformadas; (c) a seleção de células vegetais transformadas queintegraram a seqüência de ácido nucléico nos seus genomas; (d) a seleçãodas células vegetais transformadas para a expressão do dsRNA codificadopela seqüência de ácido nucléico; e (e) a seleção de uma célula vegetal queexpressa o dsRNA. Entretanto, em certas modalidades, a invenção não serefere ao uso das SEQ ID N's: 525, 569, 797, 1293 ou 1516. As plantastambém podem ser regeneradas partindo de tais células vegetais. Emparticular, "modulação da expressão" pode compreender a inibição daexpressão.

A invenção considera ainda um método de identificação degenes prováveis que sejam essenciais no ciclo de vida de um nematóidealvo, compreendendo: (a) a classificação de um gene de Caenorhabditiselegans de acordo com um ou mais critérios selecionados do grupo queconsiste em: potência do fenótipo de RNAi relatado; nível de confiança nofenótipo relatado; e probabilidade do efeito do RNAi em vários estágios nociclo de vida de um nematóide, de forma que é obtida uma classificação dofenótipo, em que uma classificação alta indica um gene de C. elegans comuma maior probabilidade de demonstrar um fenótipo de RNAi detectávelcomparada com a probabilidade de tal fenótipo em um gene comclassificação inferior; (b) a identificação de ortólogos possíveis de um genede C. elegans no genoma do nematóide alvo realizando uma busca desimilaridade de seqüência em um banco de dados de proteínas ou de ácidosnucléicos de forma que tal seqüência de proteína ou de ácido nucléico deum nematóide sem ser C. elegans que possui um valor e de BLAST limiar dee'10 quando comparada com uma seqüência de C. elegans é consideradaum ortólogo possível da seqüência de C. elegans·, (c) a identificação, entreos possíveis ortólogos da etapa (b), dos genes de um nematóide sem ser C.elegans que demonstram uma classificação de fenótipo na etapa (a) entre os3,5% principais de todos os genes de C. elegans. Entretanto, em certasmodalidades, a invenção não compreende a identificação das SEQ ID N"s:525, 569, 797, 1293 ou 1516.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A seguir está uma descrição detalhada da invenção fornecidapara auxiliar os peritos na arte na prática da presente invenção. Os peritoscomuns na arte podem fazer modificações e variações nas modalidadesdescritas aqui sem sair do espírito e do âmbito da presente invenção.

A presente invenção fornece métodos e composições para ocontrole genético de infestações por nematóides parasitas de plantas. Sãotambém fornecidos os métodos para a identificação de genes essenciaispara o ciclo de vida de um nematóide parasita de plantas para uso como umalvo para o controle mediado por dsRNA de uma população de nematóides.Os vetores plasmideais de DNA que codificam moléculas de dsRNA sãoplanejados pára suprimir genes de nematóides essenciais para ocrescimento e para o desenvolvimento. Por exemplo, a presente invençãofornece métodos e tecnologias do DNA recombinante para a repressão pós-transcrição ou para a inibição da expressão de uma seqüência codificadoraalvo em um nematóide parasita de plantas para fornecer um efeito protetorpermitindo que o nematóide parasita de plantas ingira uma ou maismoléculas de ácido ribonucléico (RNA) de filamento duplo ou interferentespequenas transcritas partindo de toda ou de uma parte de uma seqüênciacodificadora alvo, controlando assim a infecção. Portanto, a presenteinvenção refere-se à inibição específica à seqüência da expressão deseqüências codificadoras utilizando RNA de filamento duplo (dsRNA),incluindo RNA interferente (siRNA), para atingir os níveis pretendidos decontrole de nematóides.

Em um outro aspecto, a invenção fornece um método paraavaliar a probabilidade de um gene ser útil como um alvo para a supressãogênica mediada por dsRNA com a finalidade de controlar uma população denematóides. Um desafio em conseguir o controle de parasitas através doRNAi é a seleção de alvos gênicos apropriados que resultarão nainterrupção do ciclo de vida do parasita após o nocaute do produto datranscrição. Uma vez que o resultado de sistemas para testar genescandidatos em Heterodera glycines é limitado, é importante a priorização dosalvos antes do teste. As seleções genômicas funcionais baseadas no RNAisão filtros altamente eficientes que podem reduzir as escolhas dos alvos emuma ordem de grandeza ou mais. Em certas modalidades o nematóide é umnematóide parasita de plantas. Em uma outra modalidade, o nematóide é umnematóide parasita de plantas Tylenchid. Em uma outra modalidade onematóide é um Heterodera sp. Ainda em uma outra modalidade, onematóide é o nematóide de cisto da soja (Heterodera glycines).

Um método para a inibição da função do gene alvo dentro donematóide de cisto da soja patogênico para a planta, Heterodera glycines, étambém fornecido pela presente invenção e pode ser realizado através dainterferência do RNA1 resultando na interrupção do ciclo de vida do agentepatogênico. Os genes alvos ótimos para a interrupção incluem genesessenciais para o ciclo de vida em que a interrupção resulta em morte dealta penetrância das populações de parasitas ou "morte genética" através dobloqueio da reprodução com danos de alimentação mínimos para a planta,na redução no número de sítios de alimentação estabelecidos e na fugaviável mínima de larvas que atingem a geração seguinte. Um outro aspectoda presente invenção fornece os ácidos nucléicos de cada um dos 300genes alvos previstos como sendo essenciais para o crescimento e/ou odesenvolvimento de H. glycines (FIG 3). As características utilizadas paraprever tais alvos incluem a ortologia a genes conhecidos de C. elegans comfenótipos de interferência de RNA fortes e que podem ser reproduzidos epadrão de expressão em H. glycines.

Ainda em um outro aspecto da presente invenção, é fornecidoum conjunto de seqüências de nucleotídeos isoladas e purificadas comoapresentado nas SEQ ID NSs: 301-1026, SEQ ID N9s: 1269-1702 e SEQ IDN8s: 1920-1929. Entretanto, em certas modalidades, a invenção nãocompreende as SEQ ID NSs: 525, 569, 797, 1293 ou 1516. A presenteinvenção fornece uma molécula de dsRNA estabilizada para a expressão deum ou mais RNAs para a inibição da expressão de um gene alvo em umnematóide parasita de plantas, expressa partindo destas seqüências efragmentos das mesmas. Um dsRNA estabilizado, incluindo uma moléculade dsRNA ou de siRNA pode compreender pelo menos duas seqüênciascodificadoras que estão dispostas em uma orientação senso e uma anti-senso em relação a pelo menos um promotor, em que a seqüência denucleotídeos que compreende um filamento senso e um filamento anti-sensoestá ligada ou conectada através de uma seqüência espaçadora de pelomenos aproximadamente cinco, até aproximadamente mil nucleotídeos, emque o filamento senso e o filamento anti-senso podem ter um comprimentodiferente e em que cada uma das seqüências codificadoras compartilha pelomenos 80% de identidade de seqüência, pelo menos 90%, pelo menos 95%,pelo menos 98% ou 100% de identidade de seqüência, com qualquer umaou mais seqüências de nucleotídeos apresentadas nas SEQ ID N"s: 301-1026, SEQ ID N9s: 1269-1702 e SEQ ID N9s: 1920-1929.

Ainda em um outro aspecto, a invenção fornece construções deDNA recombinantes que compreendem uma molécula de ácido nucléico quecodifica uma molécula de dsRNA descrita aqui. O dsRNA pode ser formadoatravés da transcrição de um filamento da molécula de dsRNA partindo deuma seqüência de nucleotídeos que é pelo menos de aproximadamente80% até aproximadamente 100% idêntica a uma seqüência de nucleotídeosselecionada do grupo que consiste das SEQ ID N9s: 301-1026, SEQ ID N9s:1269-1702 e SEQ ID NSs: 1920-1929. Tais construções de DNArecombinantes podem ser definidas como moléculas de dsRNA produtorascapazes de inibir a expressão de gene(s) alvo(s) endógeno(s) em uma célulade nematóide parasita de plantas após a ingestão. A construção podecompreender uma seqüência de nucleotídeos da invenção ligada de formaoperacional a uma seqüência promotora que funciona na célula hospedeiratal como uma célula vegetal. Tal promotor pode ser específico ao tecido epode, por exemplo, ser específico a um tipo de tecido que é o objetivo doataque do nematóide parasita de plantas. N9 caso de um agente patogênicode raiz ou foliar, respectivamente, por exemplo, pode ser desejado utilizarum promotor que fornece expressão preferida nas raízes ou nas folhas,respectivamente.

As construções de ácidos nucléicos de acordo com a invençãopodem compreender pelo menos uma seqüência de nucleotídeos que nãoocorre naturalmente que pode ser transcrita em um RNA de filamentosimples capaz de formar uma molécula de dsRNA in vivo através dahibridização intermolecular. Tais seqüências de dsRNA se montam e podemser fornecidas na fonte de nutrição de um nematóide parasita de plantaspara atingir a inibição desejada.

Uma construção de DNA recombinante pode compreender duasseqüências que não ocorrem naturalmente diferentes que, quandoexpressas in vivo na forma de seqüências de dsRNA e fornecidas nostecidos da planta hospedeira de um nematóide parasita de plantas, inibem aexpressão de pelo menos dois genes alvos diferentes no nematóide parasitade plantas. Em certas modalidades, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 8 ou 10 oumais dsRNAs diferentes são produzidos em uma célula ou uma planta quecompreende a célula, que possuem um efeito inibidor de nematóides. OsdsRNAs podem ser expressos partindo de várias construções introduzidasem eventos de transformação diferentes ou poderiam ser introduzidos emuma única molécula de ácido nucléico. Os dsRNAs podem ser expressosutilizando um único promotor ou vários promotores. Em uma modalidade dainvenção, são produzidos dsRNAs isolados que compreendem ácidosnucléicos homólogos a vários Ioci dentro de um nematóide parasita deplantas.

Ainda em um outro aspecto, a invenção fornece uma célulahospedeira recombinante que possui em seu genoma pelo menos umaseqüência de DNA recombinante que é transcrita para produzir pelo menosuma molécula de dsRNA que funciona quando ingerida por um nematóideparasita de plantas para inibir a expressão de um gene alvo no nematóide. Amolécula de dsRNA pode ser codificada por qualquer um dos ácidosnucléicos descritos aqui e que são apresentados na listagem de seqüências.

A presente invenção fornece ainda uma célula vegetal transformada quepossui em seu genoma pelo menos uma seqüência de DNA recombinantedescrita aqui. Plantas transgênicas que compreendem tal célula vegetaltransformada também são fornecidas, incluindo plantas de progênie dequalquer geração, sementes e produtos vegetais, cada um compreendendoo DNA recombinante. As moléculas de dsRNA da presente invenção podemser encontradas na célula vegetal transgênica, por exemplo, no citoplasma.Também podem ser encontradas em um espaço apoplástico.

A invenção fornece ainda uma ou mais seqüênciasestabilizadoras ou "grampos", que podem não ser relacionados ao gene deinteresse. Um grampo compreende preferencialmente uma região rica emGC que serve para estabilizar termodinamicamente a molécula de dsRNA epode aumentar o silenciamento gênico.

É adicionalmente fornecido pela invenção um fragmento de umaseqüência de ácido nucléico selecionada do grupo que consiste das SEQ IDNSs: 301-1026, SEQ ID N9s: 1269-1702 e SEQ ID N9s: 1920-1929. Ofragmento pode ser definido como causador da morte, da inibição docrescimento ou da interrupção da infecção ou alimentação por um nematóideparasita de plantas, quando expresso na forma de um dsRNA e captado pelonematóide. O fragmento pode, por exemplo, compreender pelo menosaproximadamente 19, 21, 23, 25, 40, 60, 80, 100, 125 ou mais nucleotídeoscontíguos de qualquer uma ou mais das seqüências nas SEQ ID N"s: 301-1026, SEQ ID NSs: 1269-1702 e SEQ ID N8®: 1920-1929 ou um complementodas mesmas. Entretanto, em certas modalidades, a invenção nãocompreende um fragmento ou um complemento das SEQ ID N"s: 525, 569,797, 1293 ou 1516. Um segmento de DNA benéfico para uso na presenteinvenção tem pelo menos aproximadamente 19 até aproximadamente 23 ouaproximadamente 23 até aproximadamente 100 nucleotídeos, mas menosque aproximadamente 2000 nucleotídeos, de comprimento. Serãoparticularmente úteis as seqüências de dsRNA que incluemaproximadamente 23 até aproximadamente 300 nucleotídeos homólogos auma seqüência alvo de nematóide. A invenção fornece ainda um ácido1 ribonucléico expresso partindo de qualquer uma de tais seqüências incluindoum dsRNA. Uma seqüência selecionada para uso na expressão de umagente de supressão gênica pode ser construída partindo de uma seqüênciaisolada derivada de uma ou mais espécies alvos de nematóides parasitas deplantas e pretendida para uso na expressão de um RNA que funciona nasupressão de um único gene ou de uma família de genes em um ou maisagentes patogênicos alvos ou que a seqüência de DNA pode ser construídana forma de uma quimera partindo de um grande número de seqüências deDNA.

Em uma outra modalidade, a invenção fornece um método paraa modulação da expressão de um gene alvo em uma célula de nematóide, ométodo compreendendo: (a) a transformação de uma célula vegetal com umvetor que compreende uma seqüência de ácido nucléico que codifica umdsRNA ligado de forma operacional a um promotor e uma seqüência detérmino da transcrição; (b) o cultivo da célula vegetal transformada sobcondições suficientes para permitir o desenvolvimento de uma cultura decélulas vegetais que compreende um grande número de células vegetaistransformadas; (c) a seleção de células vegetais transformadas queintegraram o vetor dentro de seus genomas; (d) a seleção das célulasvegetais transformadas para a expressão do dsRNA codificado pelo vetor;(e) a seleção de uma célula vegetal que expressa o dsRNA; (f) aregeneração opcional de uma planta partindo da célula vegetal que expressao dsRNA; em que a expressão do gene na planta é suficiente para modular aexpressão de um gene alvo em uma célula de um nematóide parasita deplantas que entra em contato com a planta ou a célula vegetal transformada.

A modulação da expressão gênica pode incluir a supressão parcial oucompleta de tal expressão.

Ainda em um outro aspecto, a invenção fornece um método paraa supressão da expressão gênica em um nematóide parasita de plantas, quecompreende o fornecimento para o tecido do hospedeiro do nematóide deuma quantidade supressora do gene de pelo menos uma molécula dedsRNA transcrita partindo de uma seqüência de nucleotídeos que é descritaaqui, cujo pelo menos um segmento é complementar a uma seqüência demRNA dentro das células do nematóide parasita de plantas. O método podecompreender ainda a observação da morte ou da inibição do crescimento donematóide parasita de plantas e do grau de sintomatologia do hospedeiro.

Uma molécula de dsRNA, incluindo sua forma modificada tal como umamolécula de siRNA, ingerida por um microorganismo patogênico de acordocom a invenção pode ser pelo menos aproximadamente 80, 81, 82, 83, 84,85, 86, 87, 88 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou aproximadamente100% idêntica a uma molécula de RNA transcrita partindo de uma seqüênciade nucleotídeos selecionada do grupo que consiste das SEQ ID N"s: 301-1026, SEQ ID N8s: 1269-1702 e SEQ ID N8s: 1920-1929.

São, portanto, fornecidas moléculas de ácidos nucléicos isoladase substancialmente purificadas incluindo, mas não limitadas a seqüências denucleotídeos e construções de DNA recombinantes que não ocorremnaturalmente para a transcrição de moléculas de dsRNA da presenteinvenção, que suprimem ou inibem a expressão de uma seqüênciacodificadora endógena ou uma seqüência codificadora alvo no nematóideparasita de plantas quando introduzidas no mesmo. São tambémconsideradas as plantas transgênicas que (a) contêm seqüências denucleotídeos que codificam as moléculas de ácidos nucléicos isoladas esubstancialmente purificadas e as construções de DNA recombinantes quenão ocorrem naturalmente para a transcrição das moléculas de dsRNA parao controle de infecções por nematóides parasitas de plantas e (b) exibemresistência e/ou maior tolerância às infecções. São também incluídas ascomposições que contêm as seqüências de nucleotídeos de dsRNA dapresente invenção para uso em aplicações tópicas sobre plantas ou sobreanimais ou dentro do ambiente de um animal para conseguir a eliminação oua redução da infecção por nematóides parasitas de plantas.

As seqüências de cDNA que codificam proteínas ou partes deproteínas essenciais para a sobrevivência, tais como as seqüências deaminoácidos envolvidas em várias vias bioquímicas metabólicas oucatabólicas, divisão celular, reprodução, metabolismo de energia, digestão esimilares podem ser selecionadas para uso na preparação de moléculas deRNA de filamento duplo para serem fornecidas na planta hospedeira de umnematóide parasita de plantas. Como descrito aqui, a ingestão decomposições por um organismo alvo que contém um ou mais dsRNAs, cujopelo menos um segmento corresponde a pelo menos um segmentosubstancialmente idêntico do RNA produzido nas células do agentepatogênico alvo, pode resultar na morte ou em outra inibição do alvo. Estesresultados indicam que uma seqüência de nucleotídeos, seja de DNA ou deRNA1 derivada de um nematóide parasita de plantas pode ser utilizada paraconstruir células vegetais resistentes à infestação pelo nematóide. A plantahospedeira do nematóide, por exemplo, pode ser transformada para conteruma ou mais das seqüências de nucleotídeos derivadas do nematóide que éfornecido aqui. A seqüência de nucleotídeos transformada dentro dohospedeiro pode codificar um ou mais RNAs que formam uma seqüência dedsRNA nas células ou nos fluidos biológicos dentro do hospedeirotransformado, tornando assim o dsRNA disponível se/quando o nematóideparasita de plantas tiver uma relação nutricional com o hospedeirotransgênico. Isto pode resultar na supressão da expressão de um ou maisgenes nas células do nematóide parasita de plantas e, em última análise, namorte ou na inibição de seu crescimento ou desenvolvimento.

A presente invenção refere-se de forma geral ao controlegenético de nematóides parasitas de plantas nos organismos hospedeiros.Mais particularmente, a presente invenção inclui métodos para ofornecimento de agentes de controle de nematóides a nematóides parasitasde plantas. Tais agentes de controle causam/diretamente ou indiretamente,uma falha na capacidade do nematóide parasita de plantas de se alimentar,crescer ou de outra maneira causar doença em um hospedeiro alvo. Apresente invenção fornece em uma modalidade um método que compreendeo fornecimento de moléculas de dsRNA estabilizadas a nematóidesparasitas de plantas como um meio para suprimir genes alvos no nematóideparasita de plantas, atingindo assim o controle desejado de doença deplantas no hospedeiro do nematóide.

Na realização do que foi descrito acima, a presente invençãofornece um método de inibição da expressão de um gene alvo em umnematóide parasita de plantas, resultando na interrupção do crescimento, dodesenvolvimento, da reprodução e/ou da alimentação e eventualmente poderesultar na morte do nematóide parasita de plantas. O método compreendeem uma modalidade a introdução de moléculas de nucleotídeos de RNA defilamento duplo (dsRNA) parcialmente ou completamente estabilizadas,incluindo suas formas modificadas tais como seqüências de RNA (siRNA)interferentes pequenas, em uma composição nutricional para o nematóideparasita de plantas e tornando a composição nutricional ou a fonte dealimento disponível para o nematóide parasita de plantas. A ingestão dacomposição nutricional contendo as moléculas de filamento duplo ou desiRNA resulta na captação das moléculas pelas células do nematóide,resultando na inibição da expressão de pelo menos um gene alvo nascélulas do nematóide. A inibição do gene alvo exerce um efeito deletériosobre o nematóide. Os métodos e as composições associadas podem serutilizados para a limitação ou para a eliminação da infecção ou doparasitismo de uma planta ou de uma célula vegetal por um nematóide, emou sobre qualquer tecido ou ambiente do hospedeiro em que o nematóideestá presente através do fornecimento de uma ou mais composições quecompreendem as moléculas de dsRNA descritas aqui no hospedeiro donematóide.

Em certas modalidades, as moléculas de dsRNA fornecidas pelainvenção compreendem seqüências de nucleotídeos complementares a umaseqüência que é apresentada em qualquer uma das SEQ ID N"s: 301-1026,SEQ ID NSs: 1269-1702 e SEQ ID NSs: 1920-1929, cuja inibição em umnematóide parasita de plantas resulta na redução ou na remoção de umagente protéico ou de seqüência de nucleotídeos que é essencial para ocrescimento e para o desenvolvimento ou outra função biológica donematóide. A seqüência de nucleotídeos selecionada pode exibir deaproximadamente 80% até aproximadamente 100% de identidade deseqüência a uma das seqüências de nucleotídeos que são apresentadas nasSEQ ID N*8: 301-1026, SEQ ID N8s: 1269-1702 e SEQ ID N*5: 1920-1929,incluindo o complemento das mesmas. Entretanto, em certas modalidades, ainvenção não compreende uma seqüência que exibe 80-100% de identidadecom as SEQ ID N9s: 525, 569, 797, 1293 ou 1516. Tal inibição pode serdescrita como específica no fato de que uma seqüência de nucleotídeosproveniente de uma parte do gene alvo é escolhida daquela partindo da qualo dsRNA ou o siRNA inibidor é transcrito. O método é eficiente na inibiçãoda expressão de pelo menos um gene alvo e pode ser utilizado para inibirmuitos tipos diferentes de genes alvos no nematóide parasita de plantas.

As seqüências identificadas como possuindo um efeito protetorao nematóide podem ser facilmente expressas na forma de moléculas dedsRNA através da criação de construções de expressão apropriadas. Porexemplo, tais seqüências podem ser expressas na forma de um grampo eestrutura em haste e laço pegando um primeiro segmento correspondente auma seqüência selecionada das SEQ ID N8s: 301-1026, SEQ ID Nes: 1269-1702 e SEQ ID NSs:1920-1929 ou um fragmento da mesma, ligando estaseqüência com uma região espaçadora do segundo segmento que não éhomóloga ou complementar ao primeiro segmento e ligando esta com umterceiro segmento que transcreve um RNA, em que pelo menos uma partedo terceiro segmento é substancialmente complementar ao primeirosegmento. Tal construção forma uma estrutura de haste e laço através dahibridização do primeiro segmento com o terceiro segmento e é formadauma estrutura em laço que compreende o segundo segmento (W094/01550,W098/05770, US 2002/0048814A1 e US 2003/0018993A1). O dsRNA podeser gerado, por exemplo, na forma de uma estrutura de filamento duplo talcomo uma estrutura em laço e haste (por exemplo, grampo), em que aprodução do siRNA direcionado para uma seqüência de nematóide éaumentada através da co-expressão de um fragmento do gene alvo, porexemplo, sobre um cassete que pode ser expresso em plantas adicional,que leva à maior produção de siRNA ou reduz a metilação para prevenir osilenciamento gênico transcricional do promotor em grampo de dsRNA (porexemplo, W005/019408).

Os métodos e as composições da presente invenção podem seraplicados em qualquer planta monocotiledônea e dicotiledônea, dependendodo controle do agente patogênico (por exemplo, nematóide) desejado. Osexemplos de tais plantas incluem, sem limitação, plantas de alfalfa,alcachofra, aspargo, cevada, feijão, beterraba, brócolis, repolho, canola,cenoura, mandioca, couve-flor, milho, algodão, pepino, videira, aveia,cebola, ervilha, amendoim, batata, arroz, centeio, sorgo, soja, espinafre,abóbora, beterraba-de-açúcar, cana-de-açúcar, girassol, tabaco, tomate,turfa e trigo.

Os exemplos de nematóides parasitas de plantas dos quais asplantas podem ser protegidas pela presente invenção e suas plantascorrespondentes, incluem, mas não estão limitados a: alfalfa: Ditylenchusdipsaci, Meloidogyne hapla, Meloidogyne incógnita, Meloidogyne javanica,Pratylenchus spp., Paratylenchus spp., Xiphinema spp.; banana: Radopholussimilis, Helicotylenchus multieinetus, M. incógnita, M. arenaria, M. javanica,Pratylenchus coffeae, Rotylenchulus reniformis; feijões e ervilhas:Meloidogyne spp., Heterodera spp., Belonolaimus spp., Helicotylenchusspp., Rotylenchulus reniformis, Paratrichodorus anemones, Trichodorus spp.;mandioca: Rotylenchuíus reniformis, Meloidogyne spp.; cereais: Anguinatritici (espécie de trigo (Triticum dicoccum), centeio, espelta), Bidera avenae(aveia, trigo), Ditylenehus dipsaci (centeio, aveia), Subanguina radicicola(aveia, cevada, trigo, centeio), Meloidogyne naasi (cevada, trigo, centeio),Pratylenchus spp. (aveia, trigo, cevada, centeio), Paratylenchus spp. (trigo),Tylenchorhynchus spp. (trigo, aveia); grão-de-bico: Heterodera cajani,Rotylenchuíus reniformis, Hoplolaimus seinhorsti, Meloidogyne spp.,Pratylenchus spp.; frutas cítricas: Tylenchulus semipenetrans, Radopholussimilis, Radopholus citrophilus, Hemicycliophora arenaria, Pratylenchus spp.,Meloidogyne spp., Bolonolaimus longicaudatus, Trichodorus spp.,Paratrichodorus spp., Xiphinema spp.; trevo: Meloidogyne spp., Heteroderatrifolii; milho: Pratylenchus spp., Paratrichodorus minor, Longidorus spp.,Hoplolaimus columbus; algodão: Meloidogyne incógnita, Belonolaimuslongicaudatus, Rotylenchuíus reniformis, Hoplolaimus galeatus, Pratylenchusspp., Tylenchorhynchus spp., Paratrichodorus minor; videiras: Xiphinemaspp., Pratylenchus vulnus, Meloidogyne spp., Tylenchulus semipenetrans,Rotylenchuíus reniformis; gramíneas: Pratylenchus spp., Longidorus spp.,Paratriehodorus christiei, Xiphinema spp., Ditylenchus spp.; amendoim:Pratylenchus spp., Meloidogyne hapla., Meloidogyne arenaria, Criconemellaspp., Belonolaimus longicaudatus; guandu: Heterodera cajani, Rotylenchuíusreniformis, Hoplolaimus seinhorsti, Meloidogyne spp., Pratylenchus spp.;batata: Globodera rostochiensis, Globodera pallida, Meloidogyne spp.,Pratylenchus spp., Trichodorus primitivus, Ditylenchus spp., Paratrichodorusspp., Nacobbus aberrans; arroz: Aphelenchiodes besseyi, Ditylenchusangustus, Hirchmanniella spp., Heterodera oryzae, Meloidogyne spp.; frutospequenos: Meloidogyne spp.; Pratylenchus spp., Xiphinema spp., Longidorusspp., Paratrichodorus christiei, Aphelenchoides spp.; soja: Heteroderaglycines, Meloidogyne incógnita, Meloidogyne javanica, Belonolaimus spp.,Hoplolaimus columbus; beterraba-de-açúcar: Heterodera schachtii,Ditylenchus dipsaci, Meloidogyne spp., Nacobbus aberrans, Triehodorusspp., Longidorus spp., Paratriehodorus spp.; cana-de-açúcar: Meloidogynespp., Pratylenehus spp., Radopholus spp., Heterodera spp., Hoplolaimusspp., Helieotylenehus spp., Seutellonema spp., Belonolaimus spp.,Tylenehorhynehus spp., Xiphinema spp., Longidorus spp., Paratriehodorusspp.; tabaco: Meloidogyne spp., Pratylenehus spp., Tylenehorhynehuselaytoni, Globodera tabaeum, Triehodorus spp., Xiphinema amerieanum,Ditylenehus dipsaci, Paratrichodorus spp.; e tomate: Pratylenchus spp.,Meloidogyne spp.

A invenção fornece ainda combinações de métodos ecomposições para o controle da infecção por nematóides parasitas deplantas. Um meio fornece um método de dsRNA que é descrito aqui para aproteção de plantas de nematóides parasitas de plantas junto com um oumais agentes químicos que exibem características diferentes das exibidaspelos métodos e composições de dsRNA e pode interferir no crescimento ouno desenvolvimento do nematóide.

A. Composições e Construções de Ácidos Nucléicos

A invenção fornece construções de DNA recombinantes parauso para conseguir a transformação estável de alvos hospedeirosparticulares. Os alvos hospedeiros transformados podem expressar níveiseficientes de moléculas de dsRNA ou de siRNA preferidas partindo dasconstruções de DNA recombinantes. Os pares de seqüências denucleotídeos isoladas e purificadas podem ser fornecidos partindo dainformação de bibliotecas de cDNA e/ou de bibliotecas genômicas. Os paresde seqüências de nucleotídeos podem ser derivados de qualquer nematóidepara uso como iniciadores para amplificação térmica para gerar asmoléculas de dsRNA e de siRNA da presente invenção.

Como utilizado aqui, o termo "ácido nucléico" se refere a umpolímero de filamento simples ou duplo de bases de desoxirribonucleotídeosou de ribonucleotídeos lidas da extremidade 5' para a 3'. O "ácido nucléico"pode também conter opcionalmente bases de nucleotídeos que não ocorremnaturalmente ou alteradas que permitem a leitura correta através de umapolimerase e não reduzem a expressão de um polipeptídeo codificado por talácido nucléico. O termo "seqüência de nucleotídeos" ou "seqüência de ácidonucléico" se refere tanto a filamentos senso quanto anti-senso de um ácidonucléico na forma de filamentos isolados individuais ou no duplex. O termo"ácido ribonucléico" (RNA) inclui RNAi (RNA inibidor), dsRNA (RNA defilamento duplo), siRNA (RNA interferente pequeno), mRNA (RNAmensageiro), miRNA (micro-RNA), tRNA (RNA transportador, seja carregadoou descarregado com um aminoácido acilado correspondente) e cRNA (RNAcomplementar) e o termo "ácido desoxirribonucléico" (DNA) inclui cDNA eDNA genômico e híbridos de DNA-RNA. As expressões "segmento de ácidonucléico", "segmento de seqüência de nucleotídeos" ou de forma mais geral"segmento" serão entendidas pelos peritos na arte como um termo funcionalque inclui tanto seqüências genômicas, seqüências de RNA ribossomal,seqüências de RNA transportador, seqüências de RNA mensageiro,seqüências de operon e seqüências de nucleotídeos engenheiradasmenores que expressam ou podem ser adaptadas para expressaremproteínas, polipeptídeos ou peptídeos.

São fornecidas de acordo com a invenção as seqüências denucleotídeos, cuja expressão resulta em uma seqüência de RNA que ésubstancialmente homóloga a toda ou a uma parte de uma molécula de RNAde um gene alvo em um nematóide parasita de plantas que compreendeuma seqüência de RNA codificada por uma seqüência de nucleotídeosdentro do genoma do nematóide. Assim, após a ingestão da seqüência deRNA estabilizada, a regulação para menos da seqüência de nucleotídeos dogene alvo nas células do nematóide parasita de plantas pode ser obtidaresultando em um efeito deletério sobre o crescimento, a viabilidade, aproliferação ou a reprodução do nematóide.

Como utilizado aqui, o termo "substancialmente homóloga" ou"homologia substancial", com referência a uma seqüência de ácido nucléico,inclui uma seqüência de nucleotídeos que se hibridiza sob condiçõesrigorosas com a seqüência codificadora de qualquer uma das SEQ ID N"s:301-1026, SEQ ID N*8: 1269-1702 e SEQ ID N*5: 1920-1929, que sãoapresentadas na listagem de seqüências ou complementos das mesmas. Asseqüências que se hibridizam sob condições rigorosas com qualquer umadas SEQ ID NSs: 301-1026, SEQ ID N9s: 1269-1702 e SEQ ID N8s: 1920-1929ou com os complementos das mesmas, são aquelas que permitem que umalinhamento antiparalelo ocorra entre as duas seqüências e as duasseqüências são então capazes, sob condições rigorosas, de formar ligaçõesde hidrogênio com as bases correspondentes no filamento oposto paraformar uma molécula em duplex que é suficientemente estável sob ascondições rigorosas para poder ser detectada utilizando métodos bemconhecidos na arte. As seqüências substancialmente homólogas possuempreferencialmente de aproximadamente 70% até aproximadamente 80% deidentidade de seqüência ou mais preferencialmente de aproximadamente80% até aproximadamente 85% de identidade de seqüência ou maispreferencialmente de aproximadamente 90% até aproximadamente 95% deidentidade de seqüência, até aproximadamente 99% de identidade deseqüência, com as seqüências de nucleotídeos referentes que sãoapresentadas em qualquer uma das SEQ ID N9s: 301-1026, SEQ ID NSs:1269-1702 e SEQ ID NSs: 1920-1929, na listagem de seqüências ou com oscomplementos das mesmas.

Como utilizado aqui, o termo "ortólogo" se refere a um gene emduas ou mais espécies que evoluiu partindo de uma seqüência denucleotídeos ancestral comum e pode manter a mesma função nas duas oumais espécies.

Como utilizado aqui, o termo "identidade de seqüência","similaridade de seqüência" ou "homologia" é utilizado para descrever asrelações de seqüência entre duas ou mais seqüências de nucleotídeos. Aporcentagem de "identidade de seqüência" entre duas seqüências édeterminada através da comparação de duas seqüências alinhadas de formaótima ao longo de uma janela de comparação, em que a parte da seqüênciana janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é,espaços) quando comparada com a seqüência de referência (que nãocompreende adições ou deleções) para o alinhamento ótimo das duasseqüências. A porcentagem é calculada através da determinação do númerode posições em que a base de ácido nucléico ou o resíduo de aminoácidoidêntico ocorre em ambas as seqüências para fornecer o número deposições combinadas, dividindo o número de posições combinadas pelonúmero total de posições na janela de comparação e multiplicando oresultado por 100 para fornecer a porcentagem de identidade de seqüência.

É dito que uma seqüência que é idêntica em cada posição em comparaçãocom uma seqüência de referência é idêntica à seqüência de referência evice-versa. É dito que uma primeira seqüência de nucleotídeos quandoobservada na direção 5' para 3' é um "complemento" de ou é complementara uma segunda seqüência de nucleotídeos ou de referência observada nadireção 3' para 5' se a primeira seqüência de nucleotídeos exibircomplementaridade completa com a segunda seqüência ou de referência.Como utilizado aqui, é dito que as moléculas de seqüências de ácidosnucléicos exibem "complementaridade completa" quando cada nucleotídeode uma das seqüências lida 5' para 3' for complementar a cada nucleotídeoda outra seqüência quando lida 3' para 5'. Uma seqüência de nucleotídeosque é complementar a uma seqüência de nucleotídeos de referência exibiráuma seqüência idêntica à seqüência complementar inversa da seqüência denucleotídeos de referência. Estes termos e descrições são bem definidos naarte e são facilmente entendidos pelos peritos comuns na arte.

Como utilizado aqui, uma "janela de comparação" se refere a umsegmento conceituai de pelo menos 6 posições contíguas, geralmente deaproximadamente 50 até aproximadamente 100, mais geralmente deaproximadamente 100 até aproximadamente 150, em que uma seqüência écomparada com uma seqüência de referência do mesmo número deposições contíguas após as duas seqüências serem alinhadas de formaótima. A janela de comparação pode compreender adições ou deleções (istoé, espaços) de aproximadamente 20% ou menos quando comparada com aseqüência de referência (que não compreende adições ou deleções) para oalinhamento ótimo das duas seqüências. Os peritos na arte devem recorreraos métodos detalhados utilizados para o alinhamento de seqüências noWisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics ComputerGroup, 575 Science Drive Madison, Wis., USA) ou recorrer a Ausubel eoutros (1998) para uma discussão detalhada da análise de seqüência.

A presente invenção fornece seqüências de DNA capazes deserem expressas na forma de um RNA em uma célula ou em ummicroorganismo para inibir a expressão do gene alvo em uma célula, umtecido ou um órgão de um nematóide parasita de plantas. As seqüênciascompreendem uma molécula de DNA que codifica uma ou mais seqüênciasde nucleotídeos diferentes, em que cada uma das seqüências denucleotídeos diferentes compreende uma seqüência de nucleotídeos sensoe uma seqüência de nucleotídeos anti-senso. As seqüências podem serligadas através de uma seqüência espaçadora que codifica uma molécula dedsRNA da presente invenção. A seqüência espaçadora pode constituir parteda seqüência de nucleotídeos senso ou da seqüência de nucleotídeos anti-senso e ser formada dentro da molécula de dsRNA entre as seqüênciassenso e anti-senso. A seqüência de nucleotídeos senso ou a seqüência denucleotídeos anti-senso é substancialmente idêntica à seqüência denucleotídeos do gene alvo ou de um derivado da mesma ou de umaseqüência complementar à mesma. A molécula de dsDNA pode sercolocada de forma operacional sob o controle de uma seqüência promotoraque funciona na célula, no tecido ou no órgão do hospedeiro expressando odsDNA para produzir moléculas de dsRNA. Em uma modalidade, aseqüência de DNA pode ser derivada de uma seqüência de nucleotídeosque é apresentada nas SEQ ID NSs: 301-1026, SEQ ID NSs: 1269-1702 eSEQ ID N9s: 1920-1929, na listagem de seqüências.

A invenção fornece ainda uma seqüência de DNA para aexpressão em uma célula de uma planta que, após a expressão do DNA emRNA e da ingestão por um nematóide parasita de plantas atinge a supressãode um gene alvo em uma célula, um tecido ou um órgão de um nematóideparasita de plantas. O dsRNA pode compreender uma ou várias seqüênciasde genes estruturais, em que cada uma das seqüências de genes estruturaiscompreende uma seqüência de nucleotídeos senso e uma seqüência denucleotídeos ánti-senso que podem ser ligadas por uma seqüênciaespaçadora que forma um laço dentro das seqüências complementares eanti-senso. A seqüência de nucleotídeos senso ou a seqüência denucleotídeos anti-senso é substancialmente idêntica à seqüência denucleotídeos do gene alvo, derivada da mesma ou seqüência complementarà mesma. A uma ou mais seqüências de genes estruturais podem sercolocadas de forma operacional sob o controle de uma ou mais seqüênciaspromotoras, das quais pelo menos uma é operacional na célula, no tecido ouno órgão de um organismo procariótico ou eucariótico, particularmente umacélula vegetal. Os métodos para a expressão de uma molécula de supressãogênica em plantas são conhecidos (por exemplo, W006073727 A2;

Publicação US 2006/0200878 A1) e podem ser utilizados para a expressãode uma seqüência de nucleotídeos da presente invenção.

Uma seqüência ou um fragmento gênico para o controle denematóides parasitas de plantas de acordo com a invenção pode serclonado entre dois promotores específicos ao tecido, tais como doispromotores específicos à raiz que são operacionais em uma célula vegetaltransgênica e expresso ali para a produção de mRNA na célula vegetaltransgênicá que produz moléculas de dsRNA para o mesmo. Os exemplosde promotores específicos à raiz são conhecidos na arte (por exemplo, opromotor RB7 induzido por nematóide; Patente U.S. Nq 5.459.252;Opperman e outros 1994). As moléculas de dsRNA contidas nos tecidosvegetais são ingeridas por um nematóide parasita de plantas de forma que asupressão pretendida da expressão do gene alvo é conseguida.

O promotor 35S do vírus mosaico da couve-flor, um promotorforte arquétipo comum nas aplicações de plantas transgênicas ou umpromotor relacionado tal como o promotor E35S ou FMV, pode serempregado para controlar os genes de resistência a nematóides,particularmente para nematóides de cisto (ver o Exemplo 8). Também foramidentificados promotores que direcionam a expressão gênica em estruturasde alimentação induzidas por nematóides dentro de uma planta (porexemplo, Gheysen e Fenoll1 2002). Assim, pode ser utilizado um promotoridentificado dentre os genes que podem ser expressos de forma que podeser reproduzida nos sítios de alimentação. Os exemplos de genes reguladospara mais nos sítios de alimentação (sincícios) formados por nematóidesincluem Hs1pro-1 (Thurau e outros 2003), AtSUC2 normalmente expressoem células companheiras (Juergensen e outros 2003), At17.1 expresso emtecidos vasculares e extremidades de raiz (Mazarei e outros 2004), FGAMsintase (fosforribosilformil-glicinamidina sintase) (Vaghchhipawala e outros2004) e ABI3 (De Meutter e outros 2005), entre outros. Os sincíciosformados em resposta aos nematóides de cisto foram descritos comoisolados simplasticamente não possuindo plasmodesmata em tecidoscircundantes (Bockenhoff e Grundler 1994; Bockenhoff e outros 1996),entretanto, foi mostrado que macromoléculas de até 30 kD podem se moverdesde as células companheiras do floema para dentro do sincício (Hoth eoutros 2005). Portanto, a supressão gênica no floema também pode seradequada para o fornecimento de moléculas efetoras dentro dos sítios dealimentação.

Uma seqüência de nucleotídeos fornecida pela presenteinvenção pode compreender uma repetição invertida separada por uma"seqüência espaçadora". A seqüência espaçadora pode ser uma região quecompreende qualquer seqüência de nucleotídeos que facilita a formação deestruturas secundárias entre cada repetição, quando isto for necessário. Emuma modalidade da presente invenção, a seqüência espaçadora faz parte daseqüência codificadora senso ou anti-senso de mRNA. A seqüênciaespaçadora pode compreender alternativamente qualquer combinação denucleotídeos ou homólogos dos mesmos que são capazes de serem ligadosde forma covalente a uma molécula de ácido nucléico. A seqüênciaespaçadora pode compreender, por exemplo, uma seqüência denucleotídeos de pelo menos aproximadamente 10-100 nucleotídeos decomprimento ou alternativamente pelo menos aproximadamente 100-200nucleotídeos de comprimento, pelo menos aproximadamente 200-400nucleotídeos de comprimento ou pelo menos aproximadamente 400-500nucleotídeos de comprimento.

As moléculas de ácidos nucléicos ou os fragmentos dasmoléculas de ácidos nucléicos ou outras moléculas de ácidos nucléicos nalistagem de seqüências são capazes de se hibridizar especificamente comoutras moléculas de ácidos nucléicos sob certas circunstâncias. Comoutilizado aqui, é dito que duas moléculas de ácidos nucléicos são capazesde se hibridizar especificamente com uma outra se as duas moléculas foremcapazes de formar uma estrutura de ácido nucléico de filamento duploantiparalela. É dito que uma molécula de ácido nucléico é o complemento deuma outra molécula de ácido nucléico se exibirem complementaridadecompleta. É dito que duas moléculas são "minimamente complementares" sepuderem se hibridizar uma com uma outra com estabilidade suficiente parapermitir que permaneçam aneladas com uma outra sob condições "de baixaestringência" pelo menos convencionais. Similarmente, é dito que asmoléculas são complementares se puderem se hibridizar com uma outracom estabilidade suficiente para permitir que permaneçam aneladas comuma outra sob condições "de alta estringência" convencionais. As condiçõesestringentes convencionais são descritas por Sambrook e outros (1989) epor Haymes e outros (1985).

São, portanto, permissíveis afastamentos da complementaridadecompleta, contanto que tais afastamentos não impeçam a capacidade dasmoléculas de formar uma estrutura de filamento duplo. Assim, com afinalidade de uma molécula de ácido nucléico ou de um fragmento damolécula de ácido nucléico servir como um iniciador ou uma sonda esteprecisa apenas ser suficientemente complementar em seqüência para sercapaz de formar uma estrutura de filamento duplo estável sob asconcentrações de solvente e de sais particulares empregadas.

As condições estringentes apropriadas que promovem ahibridização do DNA são, por exemplo, 6,0 χ cloreto de sódio/citrato de sódio(SSC) a aproximadamente 45°C, seguido por uma lavagem de 2,0 χ SSC a50°C e são conhecidas pelos peritos na arte ou podem ser encontradas emCurrent Protocols in Molecular Biology (1989). Por exemplo, a concentraçãode sais na etapa de lavagem pode ser selecionada de uma baixaestringência de aproximadamente 2,0 χ SSC a 50°C até uma altaestringência de aproximadamente 0,2 χ SSC a 50°C. Em adição, atemperatura na etapa de lavagem pode ser aumentada de condições debaixa estringência à temperatura ambiente, aproximadamente 22°C, atécondições de alta estringência a aproximadamente 65°C. Tanto atemperatura quanto o sal podem ser variados ou a temperatura ou aconcentração dé sais pode ser mantida enquanto a outra variável é alterada.

Um ácido nucléico para uso na presente invenção pode se hibridizarespecificamente com uma ou mais das moléculas de ácidos nucléicos de umnematóide ou complementos das mesmas sob tais condições.

Preferencialmente, um ácido nucléico para uso na presente invenção exibirápelo menos aproximadamente 80% ou pelo menos aproximadamente 90%ou pelo menos aproximadamente 95% ou pelo menos aproximadamente98% ou ainda aproximadamente 100% de identidade de seqüência com umaou mais moléculas de ácidos nucléicos que são apresentadas nas SEQ IDN8s: 301-1026, SEQ ID N*8: 1269-1702 e SEQ ID N8*: 1920-1929, na listagemde seqüências.

Os ácidos nucléicos da presente invenção também podem sersintetizados, completamente ou em parte, especialmente quando fordesejado para fornecer seqüências preferidas pelas plantas, através dosmétodos conhecidos na arte. Assim, todo ou uma parte dos ácidos nucléicosda presente invenção pode ser sintetizada utilizando códons preferidos porum hospedeiro selecionado. Os códons preferidos pelas espécies podem serdeterminados, por exemplo, partindo dos códons utilizados maisfreqüentemente nas proteínas expressas em uma espécie hospedeiraparticular. Outras modificações das seqüências de nucleotídeos podemresultar em mutantes que possuem atividade ligeiramente alterada.

As seqüências de nucleotídeos de dsRNA ou de siRNAcompreendem filamentos duplos de ribonucleotídeo polimerizado e podemincluir modificações na estrutura de fosfato-açúcar ou no nucleosídeo. Asmodificações na estrutura do RNA podem ser feitas cuidadosamente parapermitir a inibição genética específica. Em uma modalidade, as moléculas dedsRNA podem ser modificadas através de um processo enzimático de formaque moléculas de siRNA possam ser geradas. O siRNA pode mediareficientemente o efeito de regulação para menos para alguns genes alvosem alguns agentes patogênicos. Este processo enzimático pode serrealizado utilizando uma enzima RNAse Ill ou uma enzima DICER, presentenas células de um inseto, de um animal vertebrado, de um fungo ou de umaplanta na via de RNAi eucariótica (Elbashir e outros, 2001; Hamilton eBaulcombe, 1999). Este processo pode utilizar ainda uma DICER ou umaRNAse Ill recombinante introduzida nas células de um inseto alvo através detécnicas do DNA recombinante que são rapidamente conhecidas pelosperitos na arte. Tanto a enzima DICER quanto a RNAse III, que sãonaturalmente ocorrentes em um agente patogênico ou que são produzidasatravés de técnicas do DNA recombinante, clivam filamentos de dsRNAmaiores em oligonucleotídeos menores. As enzimas DICER cortamespecificamente as moléculas de dsRNA em pedaços de siRNA dos quaiscada um possui aproximadamente 19-25 nucleotídeos de comprimentoenquanto as enzimas RNAse Ill clivam normalmente as moléculas de dsRNAem siRNA de 12-15 pares de bases. As moléculas de siRNA produzidasatravés de qualquer uma das enzimas possuem pontas soltas a 3' de 2 até 3e terminais fosfato a 5' e hidroxila a 3'. As moléculas de siRNA geradas pelaenzima RNAse Ill são as mesmas que as produzidas pelas enzimas Dicer navia de RNAi eucariótica e são, conseqüentemente, então direcionadas edegradadas através de um mecanismo de degradação de RNA celularinerente após serem subseqüentemente desenoveladas, separadas em RNAde filamento simples e se hibridizam com as seqüências de RNA transcritaspelo gene alvo. Este processo resulta na degradação ou na remoçãoeficiente da seqüência de RNA codificada pela seqüência de nucleotídeos dogene alvo no agente patogênico. O resultado é o silenciamento de umaseqüência de nucleotídeos particularmente direcionada dentro do agentepatogênico. As descrições detalhadas dos processos enzimáticos podem serencontradas em Hannon (2002).

Uma seqüência de nucleotídeos da presente invenção pode serregistrada em um meio que pode ser lido no computador. Como utilizadoaqui, "meio que pode ser lido no computador" se refere a qualquer meiotangível de expressão que pode ser lido e acessado diretamente por umcomputador. Tais meios incluem, mas não estão limitados a: meios dearmazenamento magnético, tais como disquetes, disco rígido, meio dearmazenamento e fita magnética: meios de armazenamento ótico tal comoCD-ROM; meios de armazenamento elétrico tais como RAM e ROM;arquivos de computador formatados para o reconhecimento de caracteresópticos e híbridos destas categorias tais como meios de armazenamentomagnético/óptico. Um perito na arte pode facilmente considerar que qualquerum dos meios que podem ser lidos no computador conhecidos atualmentepode ser utilizado para criar um produto que compreende um meio que podeser lido no computador que possui registrado no mesmo uma seqüência denucleotídeos da presente invenção.

Como utilizado aqui, "gravado" se refere a um processo dearmazenamento de informação no meio que pode ser lido no computador.Um perito na arte pode facilmente adaptar qualquer um dos métodosconhecidos atualmente para gravar a informação no meio que pode ser lidono computador para gerar meios que compreendem a informação daseqüência de nucleotídeos da presente invenção. Uma variedade deestruturas de armazenamento de dados está disponível para um perito naarte para criar um meio que pode ser lido no computador que possui gravadono mesmo uma seqüência de nucleotídeos da presente invenção. A escolhada estrutura de armazenamento de dados geralmente será baseada nosmeios escolhidos para acessar a informação armazenada. Em adição, umavariedade de programas e formatos de processamento de dados pode serutilizada para armazenar a informação da seqüência de nucleotídeos dapresente invenção no meio que pode ser lido no computador. A informaçãode seqüência pode ser representada em um arquivo de texto deprocessamento de palavras (word), formatado em um software disponívelcomercialmente tal como WordPerfect e Microsoft Word ou representado naforma de um arquivo de texto ASCII, armazenado em uma aplicação debanco de dados, tal como DB2, Sybase, Oracle ou similar. O perito na artepode facilmente adaptar qualquer número de formatos de estruturação doprocessador de dados (por exemplo, arquivo de texto ou banco de dados)com a finalidade de ser obtido um meio que pode ser lido no computadorque possui gravado no mesmo a informação da seqüência de nucleotídeosda presente invenção.

Está disponível publicamente um software de computador quepermite que um perito na arte acesse a informação de seqüência fornecidaem um meio que pode ser lido no computador. O software que executa osalgoritmos de busca de BLAST (Altschul e outros, 1990) e de BLAZE(Brutlag e outros, 1993) em um sistema Sybase pode ser utilizado para aidentificação de quadros abertos de leitura (ORFs) dentro de seqüências taiscomo Unigenes e EST's que são fornecidas aqui e que contêm homologiacom os ORFs ou proteínas de outros organismos. Tais ORFs sãofragmentos que codificam proteínas dentro das seqüências da presenteinvenção e são úteis na produção de proteínas comercialmente importantestais como enzimas utilizadas na biossíntese de aminoácidos, nometabolismo, na transcrição, na tradução, no processamento de RNA, nadegradação de ácidos nucléicos e de proteínas, na modificação de proteínase na replicação, na restrição, na modificação, na recombinação e no reparodo DNA.

A presente invenção fornece ainda sistemas, particularmentesistemas baseados no computador, que contêm a informação de seqüênciadescrita aqui. Tais sistemas são planejados para a identificação defragmentos comercialmente importantes da molécula de ácido nucléico dapresente invenção. Como utilizado aqui, "um sistema baseado nocomputador" se refere a meios de hardware, meios de software e meios dearmazenamento de dados utilizados para analisar a informação daseqüência de nucleotídeos da presente invenção. Os meios de hardwaremínimos dos sistemas baseados no computador da presente invençãocompreendem uma unidade de processamento central (CPU), meios deentrada, meios de saída e meios de armazenamento de dados. Um perito naarte pode facilmente considerar que qualquer um dos sistemas baseados nocomputador disponíveis atualmente é adequado para uso na presenteinvenção.

Como utilizado aqui, "um motivo estrutural alvo" ou um "motivoalvo", se refere a qualquer seqüência ou combinação de seqüênciasselecionada de fôrma racional em que as seqüências são escolhidas combase em uma configuração tridimensional que é formada após o dobramentodo motivo alvo. Há uma variedade de motivos alvos conhecidos na arte. Osmotivos alvos de proteína incluem, mas não estão limitados a sítios ativosenzimáticos e seqüências sinal. Os motivos alvos de ácido nucléico incluem,mas não estão limitados a seqüências promotoras, elementos em eis,estruturas em grampo e elementos de expressão que podem ser induzidos(seqüências de ligação de proteínas).

B. Vetores Recombinantes e Transformação de Células Hospedeiras

Um vetor de DNA recombinante pode, por exemplo, ser umplasmídeo linear oü circular fechado. O sistema de vetor pode ser um vetorou um plasmídeo isolado ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que juntoscontêm o DNA total que será introduzido dentro do genoma do hospedeirobacteriano. Em adição, um vetor bacteriano pode ser um vetor de expressão.As moléculas de ácidos nucléicos que são apresentadas nas SEQ ID N"s:301-1026 SEQ ID NSs: 1269-1702 e SEQ ID N"s: 1920-1929 ou fragmentosdas mesmas, podem, por exemplo, ser adequadamente inseridas dentro deum vetor sob o controle de um promotor adequado que funciona em um oumais hospedeiros microbianos para controlar a expressão de uma seqüênciacodificadora ligada ou outra seqüência de DNA. Muitos vetores estãodisponíveis para esta finalidade e a seleção do vetor apropriado dependeprincipalmente do tamanho do ácido nucléico que será inserido dentro dovetor e da célula hospedeira particular que será transformada com o vetor.Cada vetor contém vários componentes dependendo de sua função(amplificação do DNA ou expressão do DNA) e da célula hospedeiraparticular com a qual é compatível. Os componentes do vetor para atransformação bacteriana incluem geralmente, mas não estão limitados a umou mais dos séguintes: uma seqüência sinal, uma origem de replicação, umou mais genes marcadores que podem ser selecionados e um promotor quepode ser induzido que permite a expressão do DNA exógeno.

Os vetores de expressão e de clonagem contêm geralmente umgene de seleção, também referido como um marcador que pode serselecionado. Este gene codifica uma proteína necessária para asobrevivência ou o crescimento de células hospedeiras transformadascultivadas em um meio de cultura seletivo. Os genes típicos de seleçãocodificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outrastoxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, (b)complementam deficiências auxotróficas ou (c) fornecem nutrientes críticosnão disponíveis partindo de meios complexos, por exemplo, o gene quecodifica a D-alanina racemase para Bacilli. Tais células que sãotransformadas de forma bem sucedida com uma proteína heteróloga ou umfragmento da mesma produzem uma proteína que confere resistência adrogas e assim sobrevivem ao regime de seleção.

Um vetor de expressão para a produção de um mRNA também1 pode conter um promotor que pode ser induzido que é reconhecido por umorganismo bacteriano hospedeiro e está ligado de forma operacional com oácido nucléico. Os promotores que podem ser induzidos para uso comhospedeiros bacterianos incluem o promotor da β-lactamase, os promotoresPL e PR do fago λ de E colie o promotor da galactose de E coli, o promotorda arabinose, o promotor da fosfatase alcalina, o promotor de triptofano (trp)e o promotor do operon da Iactose e variações dos mesmos e promotoreshíbridos tal como o promotor TAC. Entretanto, outros promotores que podemser induzidos em bactérias são adequados.

O termo "ligada de forma operacional", quando utilizado emreferência a uma seqüência reguladora ou a uma seqüência de nucleotídeosestrutural, significa que a seqüência reguladora causa a expressão reguladada seqüência de nucleotídeos estrutural ligada. "Seqüências reguladoras" ou"elementos de controle" se refere às seqüências de nucleotídeos localizadasa montante (seqüências não codificadoras a 5'), dentro ou a jusante(seqüências não traduzidas a 3') de uma seqüência de nucleotídeosestrutural e que influenciam a sincronia e o nível ou a quantidade detranscrição, de processamento do RNA ou de estabilidade ou de tradução daseqüência de nucleotídeos estrutural associada. As seqüências reguladoraspodem incluir promotores, seqüências líderes de tradução, íntrons,intensificadores, estruturas de haste-laço, seqüências de ligação repressorase seqüências de reconhecimento de poliadenilação e similares.

A construção de vetores adequados contendo um ou maiscomponentes listados anteriormente emprega técnicas do DNArecombinante padronizadas. Os plasmídeos ou os fragmentos de DNAisolados são clivados, ajustados e religados na forma desejada para gerar osplasmídeos requeridos. Os exemplos de vetores de expressão bacterianosdisponíveis incluem, mas não estão limitados a vetores de clonagem e deexpressão de E. coli multifuncionais tal como Bluescript™ (Stratagene, LaJolla, CA), em que, por exemplo, um ácido nucléico ou um fragmento domesmo, mostrado na FIG 3 pode ser ligado dentro do vetor em quadro comseqüências para a Met amino-terminal e os 7 resíduos subseqüentes de β-galactosidase de forma que uma proteína híbrida é produzida; os vetorespIN (Van Heeke e Schuster, 1989); e similares.

A presente invenção considera ainda a transformação de umaseqüência de nucleotídeos da presente invenção em uma planta para atingirníveis inibidores de nematóides de expressão de uma ou mais moléculas dedsRNA. Um vetor de transformação pode ser facilmente preparado utilizandoos métodos disponíveis na arte. O vetor de transformação compreende umaou mais seqüências de nucleotídeos que são capazes de serem transcritasem uma molécula de RNA e que são substancialmente homólogas e/oucomplementares a uma ou mais seqüências de nucleotídeos codificadaspelo genoma do nematóide alvo, deforma que após a captação do RNAtranscrito partindo de uma ou mais seqüências de nucleotídeos pelonematóide parasita de plantas alvo, ocorre uma regulação para menos daexpressão de pelo menos uma das respectivas seqüências de nucleotídeosdo genoma do nematóide.

O vetor de transformação pode ser denominado uma construçãode dsDNA e pode também ser definido como uma molécula recombinante,um agente de controle de doenças, uma molécula genética ou umaconstrução genética quimérica. Uma construção genética quimérica dapresente invenção pode compreender, por exemplo, seqüências denucleotídeos que codificam um ou mais produtos da transcrição anti-senso,um ou mais produtos da transcrição senso, um ou mais dos mencionadosanteriormente, em que todo ou parte de um produto da transcrição dosmesmos é homólogo a toda ou parde de uma molécula de RNA quecompreende uma seqüência de RNA codificada por uma seqüência denucleotídeos dentro do genoma de um agente patogênico.

Em uma modalidade um vetor de transformação vegetalcompreende uma molécula de DNA isolada e purificada que compreende umpromotor heterólogo ligado de forma operacional a uma ou mais seqüênciasde nucleotídeos da presente invenção. A seqüência de nucleotídeos éselecionada do grupo que consiste das SEQ ID N9s: 301-1026, SEQ ID NSs:1269-1702 e SEQ ID NSs: 1920-1929, que são apresentadas na listagem deseqüências. A seqüência de nucleotídeos inclui um segmento que codificatodo ou parte de um RNA presente dentro de um produto da transcrição deRNA do nematóide alvo e pode compreender repetições invertidas de todoou de uma parte de um RNA do nematóide alvo. A molécula de DNA quecompreende o vetor de expressão pode conter ainda uma seqüênciaintrônica funcional posicionada a montante da seqüência codificadora ou atémesmo dentro da seqüência codificadora e pode ainda conter umaseqüência líder não traduzida a cinco primo (5') (isto é, uma UTR ou 5'-UTR)posicionada entre o promotor e o ponto de início da tradução.

Um vetor de transformação vegetal pode conter seqüências demais de um gene, permitindo assim a produção de mais de um dsRNA paraa inibição da expressão de dois ou mais genes nas células de um nematóidealvo. Um perito na arte considerará rapidamente que segmentos de DNAcuja seqüência corresponde àquela presente em genes diferentes podemser combinados em um único segmento de DNA compósito para aexpressão em uma planta transgênica. Alternativamente, um plasmídeo dapresente invenção que já contém pelo menos um segmento de DNA podeser modificado através da inserção seqüencial de segmentos de DNAadicionais entre as seqüências intensificadoras e promotoras eterminadoras. N9 agente de controle de doenças da presente invençãoplanejado para a inibição de vários genes, os genes que serão inibidospodem ser obtidos partindo das mesmas espécies de nematóides parasitasde plantas com a finalidade de aumentar a eficiência do agente de controle.Em certas modalidades, os genes podem ser derivados de nematóidesparasitas de plantas diferentes com a finalidade de ampliar a faixa denematóides contra os quais o(s) agente(s) é/são eficiente(s). Quando váriosgenes são direcionados para a supressão ou uma combinação de expressãoe supressão, um elemento de DNA policistrônico pode ser fabricado comoilustrado e divulgado na Publicação US No. US 2004-0029283.

Os promotores que funcionam em espécies de plantas diferentestambém são bem conhecidos na arte. Os promotores úteis para a expressãode polipeptídeos em plantas incluem aqueles que pode ser induzidos, virais,sintéticos ou constitutivos como descrito em Odell e outros (1985) e/oupromotores que são regulados de forma temporal, regulados de formaespacial e regulados de forma espaço-temporal. Os promotores preferidosincluem os promotores intensificados de CaMV35S e o promotor FMV35S.

Um fragmento do promotor CaMV35S que exibe especificidade à raiztambém pode ser preferido. Para a finalidade da presente invenção, podeser preferível atingir os níveis mais altos de expressão destes genes dentrodos tecidos de raiz das plantas. Um número de promotores específicos à raizfoi identificado e é conhecido na arte (por exemplo, Patentes U.S. N-5.110.732; 5.837.848; 5.459.252; Hirel e outros 1992).

Um vetor ou uma construção de DNA recombinante da presenteinvenção pode compreender um marcador que pode ser selecionado queconfere um fenótipo que pode ser selecionado em células vegetais. Osmarcadores que podem ser selecionados também podem ser utilizados paraselecionar plantas ou células vegetais que contêm os ácidos nucléicosexógenos que codificam polipeptídeos ou proteínas da presente invenção. Omarcador pode codificar resistência a biocidas, resistência a antibióticos (porexemplo, canamicina, G418 bleomicina, higromicina etc.) ou resistência aherbicidas (por exemplo, glifosato etc.). Os exemplos de marcadores quepodem ser selecionados incluem, mas não estão limitados a um gene neoque codifica resistência à canamicina e pode ser selecionado para autilização de canamicina, G418 etc., um gene bar que codifica resistência abialafos; um gene da EPSP sintase mutante que codifica resistência aoglifosato; um gene da nitrilase que confere resistência a bromoxinila; umgene da acetolactate sintase (ALS) mutante que confere resistência àimidazolinona ou à sulfoniluréia; e um gene DHFR resistente ao metotrexato.

Estão disponíveis vários marcadores que podem ser selecionados queconferem resistência a ampicilina, bleomicina, cloramfenicol, gentamicina,higromicina, canamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina,espectinomicina, rifampicina e tetraciclina e similares. Os exemplos de taismarcadores que podem ser selecionados são ilustrados nas Patentes U.S.N22 5.550.318; 5.633.435; 5.780.708 e 6.118.047.

Um vetor ou uma construção recombinante da presenteinvenção também pode incluir um marcador que pode ser selecionado. Osmarcadores que podem ser selecionados podem ser utilizados paramonitorar a expressão. Os exemplos de marcadores que podem serselecionados incluem um gene da β-glucuronidase ou uidA (GUS) quecodifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos sãoconhecidos (Jefferson e outros, 1987); um gene do lócus R, que codifica umproduto que regula a produção de pigmentos de antocianina (coloraçãovermelha) em tecidos vegetais (Dellaporta e outros, 1988); um gene da β-Iactamase (Sutcliffe e outros, 1978), um gene que codifica uma enzima paraa qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo,PADAC, uma cefalosporina cromogênica); um gene da Iuciferase (Ow eoutros, 1986) um gene xylE (Zukowski e outros, 1983) que codifica umacatecol dioxigenase que pode converter os catecóis cromogênicos; um geneda α-amilase (lkatu e outros, 1990); um gene da tirosinase (Katz e outros,1983) que codifica uma enzima capaz de oxidar a tirosina em DOPA edopaquinona que por sua vez se condensa em melanina; uma a-galactosidase, que catalisa um substrato da α-galactose cromogêniço.

Os vetores de transformação vegetal preferidos incluem osderivados de um plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens (por exemplo,Patentes U.S. N- 4.536.475, 4.693.977, 4.886.937, 5.501.967 e EP 0 122791). Os plasmídeos de Agrobacterium rhizogenes (ou "Ri") também sãoúteis e conhecidos na arte. Outros vetores de transformação vegetalpreferidos incluem os divulgados, por exemplo, por Herrera-Estrella (1983);Bevan (1983), Klee (1985) e EP 0 120 516.

Em geral pode ser preferido introduzir um DNA recombinantefuncional em uma localização inespecífica de um genoma de planta. Emcasos especiais, pode ser útil inserir uma construção de DNA recombinanteatravés da integração específica ao sítio. Há vários sistemas derecombinação específicos ao sítio que são conhecidos por funcionarem emplantas e incluem cre-lox que é divulgado na Patente U.S. N9 4.959.317 eFLP-FRT que é divulgado na Patente U.S. N9 5.527.695.

Acredita-se que os métodos adequados para a transformação decélulas hospedeiras para uso com a presente invenção incluem virtualmentequalquer método através do qual o DNA pode ser introduzido dentro de umacélula (ver, por exemplo, Miki e outros, 1993), tal como através datransformação de protoplastos (Patente U.S. N5 5.508.184; Omirulleh eoutros, 1993), através da ingestão de DNA mediada por dessecação/inibição(Potrykus e outros, 1985), através de eletroporação (Patente U.S. N95.384.253), através da agitação com fibras de carbureto de silício (Kaepplere outros, 1990; Patente U.S. N9 5.302.523; e Patente U.S. N9 5.464.765),através da transfromação mediada por Agrobacterium (Patentes U.S. N-5.563.055; 5.591.616; 5.693.512; 5.824.877; 5.981.840; 6.384.301) e atravésda aceleração de partículas revestidas com DNA (Patentes U.S. N—5.015.580; 5.550.318; 5.538.880; 6.160.208; 6.399.861; 6.403.865; Padgettee outros 1995) etc. Através da aplicação de técnicas tais como estas, ascélulas de virtualmente qualquer espécie podem ser transformadas de formaestável. Nq caso de espécies multicelulares, as células transgênicas podemser regeneradas em organismos transgênicos.

O método mais amplamente utilizado para a introdução de umvetor de expressão em plantas se baseia no sistema de transformaçãonatural de Agrobacterium (por exemplo, Horsch e outros, 1985). A.tumefaciens e A. rhizogenes são bactérias do solo patogênicas para plantasque transformai geneticamente as células vegetais. Os plasmídeos Ti e Ride A. tumefaciens e de A. rhizogenes, respectivamente, carregam genesresponsáveis pela transformação genética da planta. As descrições desistemas de vetor e métodos de Agrobacterium para a transferência gênicamediada por Agrobacterium são fornecidas por várias referências, incluindoGruber e outros 1993; Miki e outros, 1993, Moloney e outros, 1989 ePatentes U.S. N-: 4.940.838 e 5.464.763. Outras bactérias tais comoSinorhizobium, Rhizobium e Mesorhizobium que interagem com plantasnaturalmente podem ser modificadas para mediar a transferência gênica emum número de plantas diversas. Estas bactérias simbióticas associadas àsplantas podem ser tornadas competentes para a transferência gênicaatravés da aquisição tanto de um plasmídeo Ti desarmado quanto de umvetor binário adequado (Broothaerts e outros 2005).

Os métodos para a criação de plantas transgênicas e para aexpressão de ácidos nucléicos heterólogos em plantas em particular sãoconhecidos e podem ser utilizados com os ácidos nucléicos fornecidos aquipara preparar plantas transgênicas que exibem menor susceptibilidade àalimentação por um nematóide alvo. Os vetores de transformação vegetalpodem ser preparados, por exemplo, através da inserção dos ácidosnucléicos que produzem dsRNA divulgados aqui dentro dos vetores detransformação vegetal e da introdução destes nas plantas. Um outro sistemade vetor conhecido foi derivado através da modificação do sistema detransferência gênica natural de Agrobacterium tumefaciens. O sistemanatural compreende grandes plasmídeos Ti (indutores de tumor) contendoum grande segmento, conhecido como T-DNA1 que é transferido para asplantas transformadas. Um outro segmento do plasmídeo Ti, a região vir, éresponsável pela transferência do T-DNA. A região T-DNA é delimitado porrepetições terminais. Nos vetores binários modificados os genes indutoresde tumor foram deletados e as funções da região vir são utilizadas paratransferir o DNA estranho delimitado pelas seqüências terminais do T-DNA.A região T também pode conter um marcador que pode ser selecionado paraa recuperação eficiente de plantas e células transgênicas e um sítio declonagem múltipla para a inserção de seqüências para a transferência talcomo um ácido nucléico que codifica dsRNA.

Uma planta transgênica formada utilizando métodos detransformação com Agrobacterium contém tipicamente uma única seqüênciasimples de DNA recombinante inserida dentro de um cromossomo e éreferida como um evento transgênico. Tais plantas transgênicas podem serreferidas como sendo heterozigotas para a seqüência exógena inserida.Uma planta transgênica homozigota em relação a um transgene pode serobtida através do cruzamento sexual (autocruzamento) de uma plantatransgênica segregante independente que contém uma única seqüênciagênica exógena com ela mesma, por exemplo, uma planta F0, para produzirsemente F1. Um quarto da semente F1 produzida será homozigoto emrelação ao transgene. A germinação da semente F1 resulta em plantas quepodem ser testadas em relação à heterozigosidade, utilizando tipicamenteum ensaio de SNP ou um ensaio de amplificação térmica que permite adistinção entre heterozigotos e homozigotos (isto é, um ensaio dezigosidade). O cruzamento de uma planta heterozigota com ela mesma ouuma outra planta heterozigota resulta apenas em progênie heterozigota.

C. Expressão de Ácidos Nucléicos e Supressão do Gene Alvo

A presente invenção fornece, como um exemplo, uma plantahospedeira transformada de um organismo alvo patogênico, células vegetaistransformadas e plantas transfromadas e sua progênia. As células vegetaistransformadas e as plantas transformadas podem ser engenhieradas paraexpressarem uma ou mais das seqüências de dsRNA ou de siRNA, sob ocontrole de um promotor heterólogo, descritas aqui para fornecer um efeitoprotetor ao agente patogênico. Estas seqüências podem ser utilizadas paraa supressão gênica em um agente patogênico, reduzindo assim o nível ou aincidência de doença causada pelo agente patogênico sobre um organismohospedeiro transformado protegido. Como utilizado aqui, é pretendido que aexpressão "supressão gênica" se refira a qualquer um dos métodos bemconhecidos para a redução dos níveis de proteína produzidos como umresultado da transcrição gênica em mRNA e da subseqüente tradução do mRNA.

É pretendido ainda que a supressão gênica signifique a reduçãoda expressão de proteína partindo de um gene ou de uma seqüênciacodificadora incluindo supressão gênica pós-transcrição e a supressão datranscrição. A supressão gênica pós-transcrição é mediada pela homologiaentre todo ou uma parte de um mRNA transcrito partindo de um gene ouuma seqüência codificadora direcionada para a supressão e o RNA defilamento duplo correspondente utilizado para a supressão e se refere àredução substancial e mensurável da quantidade de mRNA disponível nacélula para a ligação pelos ribossomos. O RNA transcrito pode estar naorientação senso para realizar o que é chamado de co-supressão, naorientação anti-senso para realizar o que é chamado de supressão anti-senso ou ém ambas as orientações produzindo um dsRNA para realizar oque é chamado de interferência por RNA (RNAi).

As supressão da transcrição é mediada pela presença na célulade um agente de supressão gênica de dsRNA que exibe identidade deseqüência substancial a uma seqüência de DNA promotora ou aocomplemento da mesma para realizar o que é referido como supressão transpelo promotor. A supressão gênica pode ser eficiente contra um genevegetal nativo associado com uma característica, por exemplo, para fornecerplantas com níveis reduzidos de uma proteína codificada pelo gene nativo oucom níveis maiores ou menores de um metabólito afetado. A supressãogênica também pode ser eficiente contra genes alvos em um nematóideparasita de plantas que pode ingerir ou entrar em contato com o materialvegetal que contém os agentes de supressão gênica, especificamenteplanejados para inibir ou suprimir a expressão de uma ou mais seqüênciashomólogas ou complementares nas células do nematóide. A supressãogênica pós-transcrição através do RNA com orientação anti-senso ou sensopara regular a expressão gênica nas células vegetais é divulgada nasPatentes U.S. N2s 5.107.065, 5.759.829, 5.283.184 e 5.231.020. O uso dodsRNA para suprimir os genes nas plantas é divulgado em WO 99/53050,WO 99/49029, Publicação U.S. N9 2003/0175965 e 2003/0061626, Pedidode Patente U.S. Nq 10/465.800 e Patentes U.S. N25 6.506.559 e 6.326.193.

Um método benéfico de supressão gênica pós-transcriçãoversus um nematóide parasita de plantas emprega RNA transcrito tanto naorientação senso quanto na orientação anti-senso que é estabilizado, porexemplo, na forma de um grampo e de uma estrutura em haste e laço. Umaconstrução de DNA preferida para realizar a supressão gênica pós-transcrição é uma em que um primeiro segmento codifica um RNA que exibeuma orientação anti-senso exibindo identidade substancial a um segmentode um gene direcionado para a supressão, que está ligado a um segundosegmento que codifica um RNA que exibe complementaridade substancialao primeiro segmento. Tal construção forma uma estrutura em haste e laçoatravés da hibridização do primeiro segmento com o segundo segmento euma estrutura em laço partindo das seqüências de nucleotídeos que ligamos dois segmentos (ver W094/01550, W098/05770, US 2002/0048814 e US2003/0018993). A co-expressão com um segmento gênico alvo adicionaltambém pode ser empregada, como citado anteriormente (por exemplo,W005/019408).

De acordo com uma modalidade da presente invenção, éfornecida uma seqüência de nucleotídeos, para a qual a expressão in vitroresulta na transcrição de uma seqüência de RNA estabilizada que ésubstancialmente homóloga a uma molécula de RNA de um gene alvo emum nematóide parasita de plantas que compreende uma seqüência de RNAcodificada por uma seqüência de nucleotídeos dentro do genoma donematóide. Assim, após o nematóide parasita de plantas ingerir a seqüênciade RNA estabilizada, é realizada uma regulação para menos da seqüênciade nucleotídeos que corresponde ao gene alvo nas células de um nematóidealvo.

Em certas modalidades da invenção, a expressão de umfragmento de pelo menos 21 nucleotídeos contíguos de uma seqüência deácido nucléico de qualquer uma das SEQ ID N8s: 301-1026, SEQ ID N8s:1269-1702 e SEQ ID N8®: 1920-1929 pode ser utilizada, incluindo aexpressão de um fragmento de até 21, 36, 60, 100, 550 ou 1000nucleotídeos contíguos ou seqüências que exibem 90-100% de identidadecom tais seqüências ou seus complementos. Em modalidades específicas,um nucleotídeo fornecido pela invenção pode compreender uma seqüênciaselecionada do grupo descrito na Tabela 4, incluindo uma localização em talseqüência que abrange os nucleotídeos que são descritos na Tabela 4.

Ainda em outras modalidades, um nucleotídeo fornecido pela invenção podeser descrito como compreendendo um ou mais dos nucleotídeos 1-21, 22-50, 51-100, 101-150, 151-200, 201-250, 251-300, 301-350, 351-400, 401-450, 451-500, 501-550, 551-600, 601-650, 651-700, 701-750, 751-800, 801-850, 851-900, 901-950, 951-1000, 1001-1050, 1051-1100, 1101-1150, 1151-1200, 1201-1250, 1251-1300, 1301-1350, 1351-1400, 1401-1450, 1451-'1500, 1501-1550, 1551-1600, 1601-1650, 1651-1700, 1701-1750, 1751-1800, 1801-1850, 1851-1900, 1901-1950, 1951-2000, 2001-2050, 2051-2100, 23-75, 76-125, 126-175, 176-225, 226-275, 276-325, 326-375, 376-425, 426-475, 476-525, 526-575, 576-625, 626-675, 676-725, 726-775, 776-825, 826-875, 876-925, 926-975, 976-1025, 1026-1075, 1076-1125, 1126-1175, 1176-1225, 1226-1275, 1276-1325, 1326-1375, 1376-1425, 1426-1475, 1476-1525, 1526-1575, 1576-1625, 1626-1675, 1676-1725, 1726-1775, 1776-1825, 1826-1875, 1876-1925, 1926-1975, 1976-2025, 2026-2075, 2076-2125, 1-550, 200-750, 300-850, 400-950, 500-1050, 600-1150,700-1250, 800-1350, 900-1450, 1000-1550, 1100-1650, 1200-1750, 1300-1850, 1400-1950, 1500-2050, até o comprimento completo da seqüência, deuma ou mais das SEQ ID N8s: 301-1026, SEQ ID N8s: 1269-1702 e SEQ IDNSs: 1920-1929. Entretanto, em certas modalidades, a invenção nãocompreende as SEQ ID NSs: 525, 569, 797, 1293 ou 1516 ou fragmentos dasmesmas. Os métodos para a seleção de subseqüências específicas comoalvos para a supressão gênica mediada pelo siRNA são conhecidos na arte(por exemplo, Reynolds e outros 2004).

A inibição de um gene alvo utilizando a tecnologia de dsRNAestabilizado da presente invenção é específica à seqüência no fato de queas seqüências de nucleotídeos que corresponde à região de duplex do RNAsão alvos para a inibição genética. O RNA que contém as seqüências denucleotídeos idênticas a uma parte do gene alvo é preferido para a inibição.

Também foi observado que as seqüências de RNA com inserções, deleçõese mutações pontuais isoladas em relação à seqüência alvo são eficientespara a inibição. Na realização da presente invenção, é preferido que odsRNA inibidor e a parte do gene alvo compartilhem pelo menosaproximadamente 80% de identidade de seqüência ou aproximadamente90% de identidade de seqüência ou aproximadamente 95% de identidade deseqüência ou aproximadamente 99% de identidade de seqüência ou aindaaproximadamente 100% de identidade de seqüência. Alternativamente, aregião de duplex do RNA pode ser definida funcionalmente como umaseqüência de nucleotídeos que é capaz de se hibridizar com uma parte doproduto da transcrição do gene alvo. Uma seqüência com menos que ocomprimento completo exibindo uma maior homologia compensa umaseqüência homóloga menos longa. O comprimento das seqüências denucleotídeos idênticas pode ser de pelo menos aproximadamente 25, 50,100, 200, 300, 400, 500 ou de pelo menos aproximadamente 1000 bases.

Normalmente, uma seqüência maior que 20-100 nucleotídeos deve serutilizada, embora uma seqüência maior que aproximadamente 200-300nucleotídeos seria preferida e uma seqüência maior que aproximadamente500-1000 nucleotídeos seria especialmente preferida dependendo dotamanho do gene alvo. A invenção possui a vantagem de ser capaz detolerar variações de seqüências que poderiam ser esperadas por causa damutação genética, do polimorfismo das cepas ou da divergência evolutiva. Amolécula de ácido nucléico introduzida pode não precisar ter homologiaabsoluta, pode não precisar ter comprimento completo, em relação aoproduto de transcrição primário ou ao mRNA completamente processado dogene alvo. Portanto, os peritos na arte precisam considerar que, comodivulgado aqui, 100% de identidade de seqüência entre o RNA e o gene alvonão é necessária para a prática da presente invenção.

A inibição da expressão do gene alvo pode ser quantificadaatravés da medida do RNA alvo endógeno ou da proteína produzida atravésda tradução do RNA alvo e as conseqüências da inibição podem serconfirmadas através da análise das propriedades externas da célula ou doorganismo. As técnicas para a quantificação do RNA e das proteínas sãobem conhecidas pelos peritos comuns na arte.

Em certas modalidades a expressão gênica é inibida em pelomenos 10%, preferencialmente em pelo menos 33%, mais preferencialmenteem pelo menos 50% e ainda mais preferencialmente em pelo menos 80%.Em modalidades particularmente preferidas da invenção, a expressão gênicaé inibida em pelo menos 80%, mais preferencialmente em pelo menos 90%,mais preferencialmente em pelo menos 95% ou em pelo menos 99% dentrodas células no agente patogênico de forma que uma inibição significativaocorra. É pretendido que uma inibição significativa se refira à inibiçãosuficiente que resulta em um fenótipo que pode ser detectado (por exemplo,interrupção do crescimento, da alimentação, do desenvolvimento damortalidade etc.) ou um decréscimo que pode ser detectado no RNA e/ou naproteína que corresponde ao gene alvo que está sendo inibido. Embora emcertas modalidades da invenção ocorra inibição em substancialmente todasas células do nematóide parasita de plantas, em outras modalidadespreferidas a inibição ocorre apenas em um subconjunto de células queexpressam o gene.

As moléculas de dsRNA podem ser sintetizadas in vivo ou invitro. O dsRNA pode ser formado por um único filamento de RNA autocomplementar ou de dois filamentos de RNA complementares. A RNApolimerase endógena da célula pode mediar a transcrição in vivo ou umaRNA polimerase clonada pode ser utilizada para a transcrição in vivo ou invitro. A inibição pode ser direcionada através da transcrição específica emum órgão, tecido ou tipo celular; do estímulo de uma condição ambiental (porexemplo, infecção, estresse, temperatura, indutores químicos); e/ou daengenharia da transcrição em um estágio do desenvolvimento ou idade. Osfilamentos de RNA podem ou não ser poliadenilados; os filamentos de RNApodem ou não ser capazes de serem traduzidos em um polipeptídeo atravésdo aparato de tradução de uma célula.

Um RNA, um dsRNA, um siRNA ou um miRNA da presenteinvenção pode ser produzido quimicamente ou enzimaticamente por umperito na arte através de reações manuais ou automatizadas ou in vivo emum outro organismo. O RNA também pode ser produzido através de sínteseorgânica parcial ou total; qualquer ribonucleotídeo modificado pode serintroduzido através da síntese eznimática ou orgânica in vitro. O RNA podeser sintetizado por uma RNA polimerase celular ou uma RNA polimerase debacteriófago (por exemplo, T3, T7, SP6). O uso e a produção de umaconstrução de expressão são conhecidos na arte (ver, por exemplo, WO97/32016; Patentes U.S. N2s 5.593.874, 5.698.425, 5.712.135, 5.789.214 e5.804.693). Se sintetizado quimicamente ou através da síntese enzimática invitro, o RNA pode ser purificado antes da introdução na célula. Por exemplo,o RNA pode ser purificado partindo de uma mistura através da extração comum solvente ou resina, precipitação, eletroforese, cromatografia e umacombinação das mesmas. Alternativamente, o RNA pode ser utilizado semou com um mínimo de purificação para evitar perdas causadas peloprocessamento da amostra. O RNA pode ser seco para armazenamento oudissolvido em uma solução aquosa. A solução pode conter tampões ou saispara promover o anelamento e/ou a estabilização dos filamentos do duplex.

Para a transcrição partindo de um transgene in vivo ou umaconstrução de expressão, uma região reguladora (por exemplo, promotor,intensificador, silenciador e poliadenilação) pode ser utilizada paratranscrever o filamento (ou filamentos) de RNA. Portanto, em umamodalidade, as seqüências de nucleotídeos para uso na produção demoléculas de RNA podem ser ligadas de forma operacional a uma ou maisseqüências promotoras funcionais em um microorganismo, um fungo ou umacélula vegetal hospedeira. De forma ideal, as seqüências de nucleotídeossão colocadas sob o controle de um promotor endógeno, normalmenteresidente no genoma do hospedeiro. A seqüência de nucleotídeos dapresente invenção, sob o controle de uma seqüência promotora ligada deforma operacional, pode também ser flanqueada por seqüências adicionaisque afetam vantajosamente a sua transcrição e/ou a estabilidade de umproduto da transcrição resultante. Tais seqüências ficam geralmentelocalizadas a montante do promotor ligado de forma operacional e/ou ajusante da extremidade a 3' da construção de expressão e pode ocorrertanto a montante quanto a jusante da extremidade a 3' da construção deexpressão, embora apenas tal seqüência a montante seja considerada.

Como utilizado aqui, o termo "agente de controle de doenças" ou"agente de supressão gênica" se refere a uma molécula de RNA particularque consiste em um primeiro segmento de RNA e um segundo segmento deRNA ligados por um terceiro segmento de RNA. O primeiro e o segundosegmentos de RNA ficam dentro do comprimento da molécula de RNA e sãorepetições substancialmente invertidas de cada outro e estão ligados peloterceiro segmento de RNA. A complementaridade entre o primeiro e osegundo segmentos de RNA resulta na capacidade dos dois segmentos dese hibridizarem in vivo e in vitro para formar uma molécula de filamentoduplo, isto é, uma haste, ligada junto em uma extremidade de cada um doprimeiro e do segundo segmentos pelo terceiro segmento que forma umlaço, de forma que a estrutura inteira se forma em uma estrutura em haste elaço ou estruturas que se hibridizam ainda mais fortemente podem se formarem uma estrutura aglomerada em haste-laço. O primeiro e o segundosegmentos correspondem invariavelmente a uma seqüência senso e anti-senso em relação ao RNA alvo transcrito partindo do gene alvo no agentepatogênico alvo que é suprimido pela ingestão da molécula de dsRNA. Oagente de controle pode também ser uma molécula de ácido nucléicosubstancialmente purificada (ou isolada) e mais especificamente moléculasde ácidos nucléicos ou moléculas de fragmentos de ácidos nucléicos dasmesmas provenientes de um DNA genômico (gDNA) ou uma biblioteca decDNA. Alternativamente, os fragmentos podem compreenderoligonucleotídeos menores que possuem de aproximadamente 15 atéaproximadamente 250 resíduos de nucleotídeos e mais preferencialmente,aproximadamente 15 até aproximadamente 30 resíduos de nucleotídeos.

Como utilizado aqui, o termo "genoma" como se aplica paracélulas de um nematóide parasita de plantas ou um hospedeiro abrange nãosomente o DNA cromossômico encontrado dentro do núcleo, mas o DNA deorganelas encontrado dentro de componentes subcelulares da célula. OsDNAs da presente invenção introduzidos dentro de células vegetais podem,portanto, estar integrados no cromossomo ou localizados em organelas. Otermo "genoma" como se aplica às bactérias abrange tanto o cromossomoquanto os plasmídeos dentro de uma célula hospedeira bacteriana. OsDNAs da presente invenção introduzidos dentro de células hospedeirasbacterianas podem, portanto, estar integrados no cromossomo oulocalizados em plasmídeos.

Como utilizado aqui, o termo "nematóide parasita de plantas" serefere aos nematóides que podem infectar, colonizar, parasitar ou causardoença no material vegetal hospedeiro transformado para expressar ourevestido com um agente de supressão gênica de filamento duplo. Comoutilizado aqui, uma característica de "resistência ao nematóide" é umacaracterística de uma planta transgênica, de um animal transgênico ou deoutro hospedeiro transgênico que faz com que o hospedeiro seja resistenteao ataque de um nematóide que é tipicamente capaz de causar danos ouperdas no hospedeiro. Tal resistência pode surgir de uma mutação naturalou, mais tipicamente, da incorporação de DNA recombinante que confereresistência ao nematóide parasita de plantas. Para conferir resistência aonematóide a uma planta transgênica, um DNA recombinante pode, porexemplo, ser transcrito dentro de uma molécula de RNA que forma umamolécula de dsRNA dentro dos tecidos ou dos fluidos da plantarecombinante. A molécula de dsRNA é compreendida em uma parte de umsegmento de RNA que é idêntico a um segmento de RNA correspondentecodificado partindo de uma seqüência de DNA dentro de um nematóideparasita de plantas que prefere causar doença na planta hospedeira. Aexpressão do gene dentro do nematóide parasita de plantas alvo é suprimidapelo dsRNA e a supressão da expressão do gene no nematóide parasita deplantas alvo resulta na planta se tornando resistente ao nematóide. Fire eoutros (Patente U.S. Ns 6.506.599) descrevem de forma genérica a inibiçãoda infestação de pragas, fornecendo especificamente apenasaproximadamente várias seqüências de nucleotídeos que eram eficientespara a inibição da função gênica nas espécies de nematóide Caenorhabditiselegans. Similarmente, a US 2003/0061626 descreve o uso de dsRNA paraa inibição da função gênica em uma variedade de pragas nematóides. A US2003/0150017 descreve o uso de seqüências de dsDNA para transformarcélulas hospedeiras para expressarem as seqüências dsRNAcorrespondentes que são substancialmente idênticas às seqüências alvo empragas específicas e descreve particularmente a construção de plantasrecombinantes que expressam tais seqüências de dsRNA para a ingestãopor vários nematóide parasita de plantas, facilitando a regulação para menosde um gene no genoma do organismo alvo e aumentando a resistência daplanta ao nematóide parasita de plantas.

O efeito modulador do dsRNA pode ser aplicado a umavariedade Of genes expressos no nematóide parasita de plantas incluindo,por exemplo, genes endógenos responsáveis pelo metabolismo celular outransformação celular, incluindo os genes de "manutenção da casa", fatoresde transcrição, genes relacionados à muda e outros genes que codificampolipeptídeos envolvidos no metabolismo celular ou no crescimento ou nodesenvolvimento normal.

Como utilizado aqui, a expressão "inibição da expressão gênica"ou "inibição da expressão de um gene alvo na célula de um nematóideparasita de plantas" se refere à ausência (ou decréscimo que pode serobservado) no nível de proteína e/ou produto de mRNA proveniente do genealvo. A especificidade se refere à capacidade de inibir o gene alvo semmanifestar efeitos sobre outros genes da célula e sem quaisquer efeitossobre qualquer gene dentro da célula que é produtor da molécula de dsRNA.A inibição da expressão gênica do gene alvo no nematóide parasita deplantas pode resultar em novas características fenotípicas no nematóide.

A presente invenção fornece em parte um sistema defornecimento para a distribuição dos agentes de controle de nematóidesatravés da ingestão de células hospedeiras ou do conteúdo das células. Deacordo com uma outra modalidade, a presente invenção envolve a produçãode uma célula vegetal transgênic ou uma planta que contém uma construçãode DNA recombinante que transcreve as moléculas de dsRNA estabilizadasda presente invenção. Como utilizado aqui, "captar" se refere ao processode um agente entrar em contato com as células de um organismo alvo, talcomo um nematóide. Isto pode ocorrer, por exemplo, através da alimentaçãodo nematóide, através de imersão ou através de injeção. Como utilizadoaqui, a expressão "produção de uma célula vegetal transgênica ou umaplanta" se refere aos métodos de emprego das tecnologias do DNArecombinante facilmente disponíveis na arte (por exemplo, por Sambrook eoutros, 1989) para a construção de um vetor de transformação vegetal quetranscreve as moléculas de dsRNA estabilizadas da presente invenção, paratransformar a célula vegetal ou a planta e para produzir a célula vegetaltransgênica ou a planta transgênica que contém as moléculas de dsRNAestabilizadas transcritas.

É imaginado que as composições da presente invenção podemser incorporadas dentro das sementes de uma espécie vegetal na forma deum produto de expressão partindo de um gene recombinante incorporadodentro do genomas das células vegetais ou incorporado dentro de umrevestimento ou tratamento de sementes que é aplicado na semente antesdo plantio. A célula vegetal que contém um gene recombinante éconsiderada aqui como sendo um evento transgênico.

A presente invenção fornece em parte um sistema defornecimento para a distribuição de agentes de controle de doenças anematóides parasitas de plantas. As moléculas de dsRNA ou de siRNAestabilizadas da presente invenção podem ser diretamente introduzidasdentro das células de um nematóide parasita de plantas. Os métodos paraintrodução podem incluir a mistura direta de RNA com o tecido hospedeiropara o nematóide parasita de plantas, assim como abordagensengenheiradas em que uma espécie que é um hospedeiro é engenheiradapara expressar o dsRNA ou o siRNA. Em uma modalidade, o RNA pode serborrifado sobre a superfície de uma planta. Ainda em uma outra modalidade,o dsRNA ou o siRNA pode ser expresso por microorganismos e osmicroorganismos podem ser aplicados sobre a superfície de uma planta ouintroduzidos dentro de uma raiz, caule através de um meio físico tal comouma injeção. Ainda em uma outra modalidade, uma planta pode serengenheirada geneticamente para expressar o dsRNA ou o siRNA em umaquantidade suficiente para matar os nematóides parasitas de plantasconhecidos por infestarem a planta.

É também esperado que os dsRNAs produzidos através dasíntese química ou enzimática possam ser formulados de uma maneiracoerente com as práticas agrícolas comuns e utilizados na forma deprodutos "spray-on" (aspersão sobre) para o controle de doença de planta.

As formulações podem incluir os adesivos e os agentes umectantesapropriados necessários para a cobertura foliar eficiente assim comoagentes protetores de UV para proteger os dsRNAs de danos causados peloUV. Tais aditivos são comumente utilizados na indústria de bioinseticidas esão bem conhecidos pelos peritos na arte. Tais aplicações poderiam sercombinadas com outras aplicações de inseticida "spray-on", com basebiológica ou não, para aumentar a proteção da planta dos nematóidesparasitas de plantas.

A presente invenção refere-se ainda a construções de DNArecombinantes para a expressão em um microorganismo. Os ácidosnucléicos exógenos partindo dos quais um RNA de interesse é transcritopodem ser introduzidos em uma célula microbiana hospedeira, tal como umacélula bacteriana ou uma célula de fungo, utilizando métodos conhecidos naarte.As seqüências de nucleotídeos da presente invenção podem serintroduzidas em uma variedade de hospedeiros microbianos procarióticos eeucarióticos pára a produção das moléculas de dsRNA ou de siRNAestabilizadas. O termo "microorganismo" inclui espécies procarióticas eeucarióticas tais como bactérias e fungos, assim como nematóides. Osfungos incluem leveduras e fungos filamentosos, entre outros. Osprocariotos ilustrativos, tanto Gram-negativos quanto Gram-positivos,incluem Enterobacteriaceae, tais como Escherichia, Erwinia e Serratia;Bacillaceae; Rhizobiaceae, tal como Rhizobium; Spirillaceae, tal comofotobactéria, Zymomonas\ Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, tais comoPseudomonas e Acetobacter, Azotobacteraceae, Actinomycetales eNitrobacteraceae. Entre os eucariotos estão os fungos, tais comoPhycomycetes e Ascomycetes, incluindo Saccharomyces eSchizosaccharomyces; e Basidiomycetes, tais como Rhodotorula,Aureobasidium e similares.

D. Plantas Transgênicas

A presente invenção fornece sementes e plantas que possuemum ou mais eventos transgênicos. As combinações de eventos são referidascomo eventos transgênicos "empilhados". Estes eventos transgênicosempilhados podem ser eventos que são direcionados para o mesmoorganismo alvo ou podem ser direcionados para agentes patogênicos oupragas alvos diferentes. Em uma modalidade, uma semente que possui acapacidade de expressar um ácido nucléico fornecido aqui também possui acapacidade de expressar pelo menos um outro agente, que inclui, mas nãoestá limitado a uma molécula de RNA cuja seqüência é derivada daseqüência de um RNA expresso em um agente patogênico alvo tal como umnematóide e que forma uma estrutura de RNA de filamento duplo após aexpressão na semente ou nas células de uma planta cultivada partindo dasemente, em que a ingestão de uma ou mais células da planta pelo alvoresulta na supressão da expressão do RNA nas células do alvo.

Em certas modalidades, uma semente que possui a capacidadede expressar um dsRNA cuja seqüência é derivada de um nematóideparasita de plantas alvo também possui um evento transgênico que fornecetolerância a herbicida. Um exemplo benéfico de um gene de tolerância aherbicida fornece resistência ao glifosato, N-(fosfonometil) glicina, incluindo aforma de sal dé isopropilamina de tal herbicida.

Os benefícios fornecidos pela presente invenção podem incluir,mas não estão limitados a: facilidade de introduzir dsRNA nas células denematóides parasita de plantas, a baixa concentração de dsRNA que podeser utilizada, a estabilidade do dsRNA e a eficiência da inibição. Acapacidade de utilizar uma baixa concentração de um dsRNA estabilizadoevita várias desvantagens de interferência anti-senso. A presente invençãonão está limitada ao uso in vitro ou a composições de seqüênciasespecíficas, a um conjunto particular de genes alvos, uma parte particular daseqüência de nucleotídeos do gene alvo ou um transgene particular ou a ummétodo de fornecimento particular, o que é oposto a algumas técnicasdisponíveis conhecidas na arte, tais como anti-senso e co-supressão. Alémdisso, a manipulação genética se torna possível em organismos que não sãomodelos genéticos clássicos.

Com a finalidade de atingir a inibição de um gene alvo de formaseletiva dentro de uma espécie de nematóide parasita de plantas que édesejada para controle, o gene alvo deve preferencialmente exibir um baixograu de identidade de seqüência com os genes correspondentes em umaplanta ou um animal vertebrado. Preferencialmente o grau da identidade deseqüência é menor que aproximadamente 80%. Mais preferencialmente ograu da identidade de seqüência é menor que aproximadamente 70%. Maispreferencialmente o grau da identidade de seqüência é menor queaproximadamente 60%.

Em adição à transformação direta de uma planta com umaconstrução de DNA recombinante, as plantas transgênicas podem serpreparadas através do cruzamento de uma primeira planta que possui umaconstrução de DNA recombinante com uma segunda planta que não possuia construção. Por exemplo, o DNA recombinante para supressão gênicapode ser introduzido dentro da primeira linhagem de planta que é sensível àtransformação para produzir uma planta transgênica que pode ser cruzadacom uma segunda linhagem de planta para introduzir o DNA recombinantepara supressão gênica na segunda linhagem de planta.

A presente invenção pode ser, na prática, combinada com outrascaracterísticas de controle de doenças em uma planta para atingircaracterísticas desejadas para maior controle de doença de plantas. Acombinação de características de controle de doenças que empregammodos de ação distintos pode fornecer plantas transgênicas protegidas comdurabilidade superior em relação a plantas que carregam uma únicacaracterística dé controle por causa da probabilidade reduzida de que aresistência será desenvolvida no campo.

A invenção refere-se ainda a produtos de consumo que contêmuma ou mais das seqüências da presente invenção e produzidos partindo deuma planta ou uma semente recombinante que contém uma ou mais dasseqüências de nucleotídeos da presente invenção que são especificamenteconsiderados como modalidades da presente invenção. É pretendido queum produto de consumo que contém uma ou mais das seqüências dapresente invenção inclua, mas que não esteja limitado a farinhas grossas,óleos, grãos ou sementes trituradas ou inteiras de uma planta ou qualquerproduto alimentício que compreenda qualquer farinha grossa, óleo ou grãotriturado ou inteiro de uma planta ou semente recombinante que contém umaou mais das seqüências da presente invenção. A detecção de uma ou maisdas seqüências da presente invenção em um ou mais bens consumíveis ouprodutos de consumo considerados aqui é uma evidência de fato de que obem consumível ou o produto de consumo é composto de uma plantatransgênica planejada para expressar uma ou mais das seqüências denucleotídeos da presente invenção com a finalidade de controlar doença deplantas utilizando métodos de supressão gênica mediados por dsRNA.

E. Obtenção de Ácidos Nucléicos

A presente invenção fornece métodos para a obtenção de umácido nucléico que compreende uma seqüência de nucleotídeos para aprodução de um dsRNA ou um siRNA. Em uma modalidade, tal métodocompreende: (a) a análise de um ou mais genes alvos em relação a suaexpressão, função e fenótipo após a supressão gênica mediada por dsRNAem um nematóide: (b) a análise de uma biblioteca de cDNA ou gDNA comuma sonda dé hibridização que compreende toda ou uma parte de umaseqüência de nucleotídeos ou um homóloga proveniente de um nematóidealvo que exibe um fenótipo de crescimento ou de desenvolvimento donematóide alterado, por exemplo, reduzido em uma análise de supressãomediada por dsRNA; (c) a identificação de um clone de DNA que se hibridizacom a sonda de hibridização; (d) o isolamento do clone de DNA identificadona etapa (b) ; e (e) o seqüenciamento do fragmento de cDNA ou de gDNAque compreende o clone isolado na etapa (d) em que a molécula de ácidonucléico seqüenciada transcreve toda ou uma parte da seqüência de ácidonucléico de RNA ou um homóloga da mesma.

Em uma outra modalidade, um método da presente invençãopara a obtenção de um fragmento de ácido nucléico que compreende umaseqüência de nucleotídeos para a produção de uma parte substancial de umdsRNA ou de um siRNA compreende: (a) a síntese de um primeiro e umsegundo iniciadores de oligonucleotídeo que correspondem a uma parte deuma das seqüências de nucleotídeos de um agente patogênico alvo; e (b) aamplificação de um inserto de cDNA ou de gDNA presente em um vetor declonagem utilizando o primeiro e o segundo iniciadores de oligonucleotídeoda etapa (a) em que a molécula de ácido nucléico amplificada transcreveuma parte substancial da parte substancial de um dsRNA ou de um siRNAda presente invenção.

Na prática da presente invenção, um gene alvo pode serderivado de H. glycines ou um outro nematóide. É considerado que várioscritérios podem ser empregados na seleção dos genes alvos preferidos. Ogene de H. glycines pode ser um que possui um ortólogo de C. elegans comuma probabilidade de um fenótipo fornte após o nocaute por RNAi daexpressão, incluindo um fenótipo P0. Tais alvos são freqüentemente aquelescom produtos de proteínas envolvidos em processos celulares centrais taiscomo a replicação do DNA, o ciclo celular, a transcrição, o processamentodo RNA, a tradução, o tráfego de proteínas, a secreção, a modificação deproteínas, a estabilidade e a degradação de proteínas, a produção deenergia, o metabolismo intermediário, a estrutura celular, a transdução desinalm canais e transportadores e a endocitose. Em certas modalidades évantajoso selecionar um gene para o qual uma pequena queda no nível deexpressão resulta em efeitos deletérios para o agente patogênico.

Como utilizado aqui, o termo "derivada de" se refere a umaseqüência de nucleotídeos especificada que pode ser obtida partindo deuma fonte ou uma espécie especificada particular, embora nãonecessariamente diretamente de tal fonte ou espécie especificada.

Em uma modalidade, é selecionado um gene que estáessencialmente envolvido no crescimento e no desenvolvimento de umnematóide parasita de plantas. Outros genes alvos para uso na presenteinvenção podem incluir, por exemplo, aqueles que desempenham funçõesimportantes na viabilidade, no crescimento, no desenvolvimento, nacapacidade de infecção e no estabelecimento de sítios de alimentação donematóide. Estes genes alvos podem ser um dos genes de "manutenção dacasa", fatores de transcrição e similares. Adicionalmente, as seqüências denucleotídeos para uso na presente invenção também podem ser derivadasde homólogos, incluindo ortólogos, de genes de plantas, virais, bacterianosou de insetos cujas funções foram estabelecidas na literatura e cujasseqüências de nucleotídeos compartilham similaridade substancial com osgenes alvos no genoma de um nematóide alvo. De acordo com um aspectoda presente invenção para o controle de nematóides, as seqüências alvospodem essencialmente ser derivadas do nematóide parasita de plantas alvo.Alguns dos exemplos de seqüências alvos clonadas de um nematóide quecodificam proteínas ou fragmentos das mesmas que são homólogas deproteínas conhecidas podem ser encontrados na listagem de seqüências,por exemplo, SEQ ID N8s: 301-1026, SEQ ID N?s: 1269-1702 e SEQ ID N5s:1920-1929.

Para a finalidade da presente invenção, as moléculas de dsRNAou de siRNA podem ser obtidas através da amplificação em cadeia pelapolimerase (PCR™) das seqüências de um gene alvo derivadas de umabiblioteca de gDNA ou de cDNA ou partes das mesmas. A biblioteca de DNApode ser preparada utilizando métodos conhecidos por peritos comuns naarte e o DNA/RNA pode ser extraído. As bibliotecas de DNA genômico ou decDNA geradas partindo de um organismo alvo podem ser utilizadas para aamplificação pela PCR™ para a produção do dsRNA ou do siRNA.

Os genes alvos podem então ser amplificados pela PCR™ eseqüenciados utilizando os métodos facilmente disponíveis na arte. Umperito na arte pode ser capaz de modificar as condições da PCR™ paragarantir a formação ótima de produtos da PCR™. O produto da PCR™confirmado pode ser utilizado como um molde para a transcrição in vitro paragerar RNA senso e anti-senso com promotores mínimos incluídos. Em umamodalidade, a presente invenção compreende seqüências de nucleotídeosisoladas e purificadas que podem ser utilizadas como agentes de controle denematóides parasitas de plantas. As seqüências de nucleotídeos isoladas epurificadas podem compreender aquelas que são apresentadas na listagemde seqüências.

Como utilizado aqui, a expressão "seqüência codificadora","seqüência de nucleotídeos estrutural" ou "molécula de ácido nucléicoestrutural" se refere a uma seqüência de nucleotídeos que é traduzida emum polipeptídeo, geralmente através do mRNA, quando colocada sob ocontrole dé seqüências reguladoras apropriadas. Os limites da seqüênciacodificadora são determinados por um códon de início da tradução noterminal a 5' e um códon de término da tradução no terminal a 3'. Umaseqüência codificadora pode incluir, mas não está limitada a DNA genômico,cDNA, EST e seqüências de nucleotídeos recombinantes.

O termo "DNA recombinante" ou "seqüência de nucleotídeosrecombinante" se refere ao DNA que contém uma modificação engenheiradageneticamente através da manipulação via mutagênese, enzimas derestrição e similares.

Para muitos dos nematóides parasitas de plantas que são alvospotenciais para o controle pela presente invenção, pode haver informaçãolimitada em relação às seqüências da maior parte dos genes ou ao fenótiporesultante da mutação de genes particulares. Portanto, é considerado que aseleção de genes apropriados para uso na presente invenção pode serrealizada através do uso da informação disponível proveniente do estudo dosgenes correspondentes em um organismo modelo tal como em C. elegans,em que os genes foram caracterizados, de acordo com a análise descrita nosExemplos 1 -8. Em alguns casos será possível a obtenção da seqüência deum gene correspondente de um nematóide alvo através da busca em bancosde dados tal como o GenBank utilizando o nome do gene ou a seqüência, porexemplo, de um nematóide do qual o gene foi clonado. Uma vez que aseqüência é obtida, a PCR™ pode ser utilizada para amplificar um segmentoselecionado apropriadamente do gene no nematóide alvo para uso napresente invenção. Os iniciadores da PCR™ podem ser planejados com basena seqüência que é encontrada em um outro organismo do qual o gene foiclonado. Os iniciadores são planejados para a amplificação de um segmentode DNA de comprimento suficiente para uso na presente invenção. O DNA(seja DNA genômico ou cDNA) é preparado partindo de um nematóideparasita de plantas alvo e os iniciadores da PCR™ são utilizados paraamplificar o segmento de DNA. As condições de amplificação sãoselecionadas de forma que a amplificação ocorrerá mesmo se os iniciadoresnão se combinarem exatamente com a seqüência alvo. Alternativamente, ogene (ou uma parte do mesmo) pode ser clonado partindo de uma bibliotecade gDNA ou de cDNA preparada partindo de uma espécie de nematóideparasita de plantas, utilizando o gene conhecido como uma sonda. Astécnicas para a realização da PCR™ e da clonagem partindo de bibliotecassão conhecidas. Os detalhes adicionais do processo através do qual ossegmentos de DNA das espécies alvos de nematóides parasitas de plantaspodem ser isolados com base na seqüência de genes previamente clonadosde outras espécies são fornecidos nos Exemplos. Um perito comum na artereconhecerá que uma variedade de técnicas pode ser utilizada para isolarsegementos de genes de nematóides parasitas de plantas quecorrespondem aos genes previamente isolados de outras espécies.EXEMPLOS

Os inventores desta identificaram um meio para o controle denematóides parasitas de plantas através do fornecimento de moléculas deácido ribonucléico de filamento duplo a nematóides parasitas de plantas eum meio para selecionar seqüências que codificam estas moléculas de ácidoribonucléico de filamento duplo. As moléculas de ácido ribonucléico defilamento duplo que funcionam após a ingestão para inibir uma funçãobiológica em um nematóide podem resultar, por exemplo, em um ou maisdos atributos a seguir: redução no crescimento de um nematóide, inibição dodesenvolvimento de um nematóide ou redução da viabilidade. Qualquer umou qualquer combinação destes atributos pode resultar em uma inibiçãoeficiente da infecção ou da colonização da planta e no caso de umnematóide patogênico de planta, a inibição de doença de planta e/ou aredução na gravidade dos sintomas de doença.

EXEMPL0 1

Critérios para a Seleção do Gene Alvo

Para classificar os genes através da essencialidade provável defunção no ciclo de vida do nematóide, a informação proveniente deexperimentos de interferência por RNA (RNAi) de C. elegans disponível nowormbase.org foi combinada com informação experimental adicional.Utilizando os pontos de dados de fenótipos >40.000 no wormbase, todos os-20.000 genes de C. elegans foram classificados em relação a sua potênciade fenótipo, ao nível de confiança no fenótipo e à probabilidade dos efeitosem vários estágios do ciclo de vida. 715 genes de C. elegans com homologiade aminoácidos de BLAST com H. glycines de pelo menos e-10 (ver adeterminação de ortologia abaixo) tinham escores neste sistema declassificação de fenótipos de 44 ou melhores, em que 1 é melhor. Abaixo, asestatísticas dos fenótipos são fornecidas apenas para os alvos constituindoeventualmente a lista dos 300 principais (utilizando todos os critérios). Comoa classificação dos fenótipos é dependente da informação disponívelatualmente, não significa que todos incluam a captura de cada gene quepoderia ser um bom alvo, mas ao invés disso fornecem uma lista de alvos dealta qualidade que serão bem sucedidos no RNAi de H. glycines com basena informação em mãos.

A análise a seguir de fenótipos evidentes após o tratamento deRNAi foi realizada antes da publicação recente de Sonnichsen e outros C.elegans genome RNAi survey (Sonnichsen e outros, 2005). Este grupotestou 19.075 genes através da injeção de dsRNA dentro das gônadas dehermafroditas N2 da linhagem do tipo selvagem de C. elegans e buscaramefeitos sobre tal animal e sua progênie. Observaram efeitos para apenas1.668 genes (8,7%). Fornecendo suporte adicional à robustez da lista dos300 principais (FIG 3), 293 estavam entre os genes testados por Sonnichsene outros e 257 tinham fenótipos (87,7%) incluindo 176 Emb (letal paraembrião), 34 Lva (impedimento de larva), 34 Ste (estéril), 8 Lvl (letal para alarva), 2 Stp (progênie estéril), 1 Bmd (defeito morfológico do corpo), 1 Dpy(atarracado), 1 Egl (postura anormal dos ovos). 36 tinham descrições do tiposelvagem (WT). As descrições do tipo selvagem aumentaram em direção áofinal da lista: 7 descrições WT em 1-100, 13 WT em 101-200, 16 WT em201-300.

As descrições de fenótipo de RNAi foram categorizadas emquatro grupos. Primeiro, as descrições de Ietalidade nos estágios Iarvais(letal = Ietl letal para a larva = Ivl, impedimento de larva = Iva) foramcolocadas juntas e forneceram o maior peso. Tais fenótipos, se imitados emH. glycines, seriam vantajosos uma vez que o fornecimento de dsRNA daplanta para o nematóide começaria na forma da larva de segundo estágiojuvenil, um estágio análogo ao de larva permanente, que entra na planta. Ofornecimento continuaria ao longo do desenvolvimento dos estágios juvenisou Iarvais J2, J3 e J4 no sítio de alimentação. A interrupção da fisiologia donematóide durante estes estágios Iarvais poderia prevenir a formação dossítios de alimentação nas raízes da planta na geração PO (primária).

Segundo, descrições de defeitos na muda (mlt), formação debolhas (bli) e ruptura (rup) foram colocadas juntas e forenceram um segundomaior peso. Tais fenótipos são raros em relação a outros efeitos maiscomumente observados tal como Ietalidade ou esterilidade. Os nematóides,incluindo tanto C. elegans quanto H. glycines são cobertos por uma cutículade colágeno. Os defeitos na muda poderiam bloquear o descascamento e areformação da cutícula entre os estágios Iarvais (J2 -> J3, J3 -> J4, J4 ->A)e, portanto, á progressão do desenvolvimento. Os fenótipos de bolhafreqüentemente envolvem também defeitos na cutícula. Os fenótipos deruptura em C. elegans não são bem entendidos, mas podem envolver aperda da integridade do corpo ou alterações osmóticas. Os fenótipos deruptura são particularmente atraentes para o controle de SCN uma vez queprovavelmente são irreversíveis sem oportunidade da larva se recuperarcomo pode ser o caso para bloqueios temporários no metabolismo ou nodesenvolvimento.

Terceiro, os fenótipos estéril (ste) e de Ietalidade ao embrião(emb) foram colocados juntos e forneceram o terceiro maior peso. Em C.elegans, o tecido de linhagem germinativa, onde muitos genes envolvidos nafertilidade e no desenvolvimento embrionário estão ativos (fatores maternos),é particularmente sensível a RNAi. Ns contexto de uma infecção SCN1 umbloqueio estéril ou letal para embrião no ciclo de vida isoladamente poderiaprevenir a formação de uma segunda geração, mas permitiria a formação desítios de alimentação iniciais e danos no sistema radicular da planta. Quarto,outros defeitos principais na fisiologia incluindo fenótipos de crescimentodefeituoso (gro), doente (sck), descoordenado (une), paralisado (prl, prz)foram colocados juntos e forneceram o quarto maior peso. Nas fêmeas de H.glycines, uma vez que um sítio de alimentação é formado, a larva para de semover e a musculatura da parede do corpo desempenha uma funçãolimitada na sobrevivência. Entretanto, as larvas do sexo masculino se tornammóveis como adultos de forma que podem procurar, encontrar e fertilizar asfêmeas. Portanto, o bloqueio das estruturas dos sistemas muscular enorvoso importantes para o movimento normal poderia interferir nafertilização e na formação de uma segunda geração. Para as finalidadesdesta classificação, outros fenótipos de RNAi não letais (atarracado, curto,longo, defeito da morfologia do corpo etc.) não foram incluídos. Os fenótiposobservados por mutação genética também não foram utilizados nestesistema de classificação.

Para classificar os genes com base na informação de RNAi dowormbase, os genes com várias descrições fenotípicas e vários fenótiposdiferentes foram favorecidos em relação aos genes com descriçõesfenotípicas isoladas e fenótipos isolados. Várias descrições de fenótipos sãoúteis uma vez que adicionam confiança à atribuição do fenótipo a um gene.

Com base em experimentos para vários grupos, os experimentos de RNAiem C. elegans possuem uma taxa de falsos negativos e falsos positivos de-10-15%. A evidência de fenótipos proveniente de mais de uma descriçãodiminui a probabilidade de inclusão de falsos positivos na lista. Devido aofato de que o RNAi em C. elegans não resulta na eliminação completa doproduto da transcrição (o nocaute é estimado em 90%) é freqüentementenão é uniforme ao longo da população, experimentos de RNAi em genesisolados freqüentemente resultam na observação de vários fenótipos aolongo do curso do ciclo de vida. Portanto, a descrição do fenótipo de umcerto gene como "ste, emb, Ivl" pode significar que este é requerido ao longode todo o ciclo de vida enquanto que um fenótipo de "emb" isoladamentepode significar que o gene é apenas necessário para uma etapa nodesenvolvimento embrionário. Para as finalidades do controle de parasitas,os genes necessários para várias etapas e vários processos no ciclo de vidasão alvos mais atraentes que os necessários apenas em um estágio umavez que isto fornece mais oportunidades para que um dsRNA interfira nociclo de vida e bloqueie a infecção.

Em cada uma destas quatro categorias, as descrições de RNAiem C. elegans foram toleradas e pesadas. A primeira descrição de umfenótipo em um "fundo" de N2 (do tipo selvagem) para um gene de um certolaboratório recebeu um peso de 1. A segunda, terceira etc. descrições de umfenótipo do mesmo laboratório receberam um peso descontado de 0,7.

Portanto, descrições independentes provenientes de dois laboratórios(escore = 2) seriam favorecidas em relação às duas descrições provenientesdo mesmo laboratório (escore = 1,7) que poderiam ser vulneráveis a um errosistemático (por exemplo, clone errado selecionado e utilizado duas vezes).As descrições de fenótipos no "fundo" genético rrf-3(-/-) que é mais sensívelao RNAi que o dé N2 receberam um escore descontado de 0,6.

Com estas categorias e pesos, os alvos foram classificados emuma escala partindo de um escore de 1 até 44 ou maior com base em seucálculo na matriz mostrado na FIG 1. Por exemplo, para receber um escorede 3, os alvos tinham que ter um escore de Iet Ivl Iva > 2, um escore de mltbli rup X> 1, um escore de a ste emb > 2 e um escore de outro fenótipo > 1.

A maior parte dos genes em C. elegans possui um escore pior que 44. 715genes tinham um escore de 44 ou melhor e um homólogo potencial em H.glycines. Para os 300 alvos principais, seguindo a classificação em todos oscritérios, o escore médio de fenótipo era 22±9. O escore principal era 3 (6alvos) e apenas 10 alvos tinham um escore menor que 10. As categoriasmais comuns eram escores de 10 (61 alvos com um escore de Iet Ivl Iva > 2,um escore de mlt bli rup de 0, um escore de ste emb > 2 e um escore deoutro fenótipo > 1), 15 (23 alvos), 24 (26 alvos), 26 (93 alvos) e 33 (19alvos). As médias e os desvios padrões para os cálculos em cada categoriaeram escore de Iet Ivl Iva = 1,9±1, escore de mlt bli rup = 0,3±0,7, escore deste emb = 2,8±1,7 e um escore de outro fenótipo = 1,6±1,3. mlt bli rup eramos fenótipos mais raros com apenas 56 alvos possuindo um escore > 0. Ostotais dos alvos com escores > 0 nas outras categorias eram 284 para Iet IvlIva, 281 para o escore de ste emb > 2 e 258 para outro fenótipo.

Em adição às descrições de fenótipos visíveis partindo dowormbase, as descrições do tipo selvagem (isto é, sem fenótipo) para cadaalvo também foram registradas. As descobertas do tipo selvagem foramvistas como um negativo para a classificação dos alvos e a maior parte dosalvos com altos números de descrições do tipo selvagem não foi levada emconsideração para a lista dos 300 principais. Todas as descrições do tiposelvagem receberam um escore de 1 exceto aquelas de Vidal e outros quereceberam um escore de 0,3 uma vez que a metodologia deste grupo pareceter resultado em uma porcentagem maior de descrições do tipo selvagemque todos os outros grupos de descrição. Em adição ao cálculo do tiposelvagem total, também foi calculada a % do tipo selvagem em relação atodas as outras descrições. Para os 300 alvos principais, as médias e osdesvios padrões para o cálculo do tipo selvagem e a porcentagem do tiposelvagem eram de 0,14±0,41 e 1,9+5,1%. 250 dos 300 alvos não tinhamdescrições do tipo selvagem. Para os 50 alvos com descrições do tiposelvagem, o cálculo e as porcentagens do tipo selvagem eram de 0,85±0,65e 11,3±7,3%. Apenas em 24 casos as descrições do tipo selvagem eram>10% de todas as descrições com o maior sendo de 33%.

Depois, os dados de RNAi foram comparados com osdisponíveis no wormbase. Os experimentos de RNAi foram realizados emmais de 1.500 genes de interesse de C. elegans nos ensaios de alimentaçãocom N2, rrf-3 e outras linhagens. Dos 715 genes de C. elegans emconsideração com homologia de aminoácidos de BLAST com os escores defenótipos de H. glycines e do wormbase de 44 ou melhores (FIG 1), estavadisponível informação para aproximadamente 75. Adicionalmente, 3 genescom efeitos de PO (primeira geração) nos ensaios não presentes na lista de715 foram adicionados à lista. 10 genes alvos dos 715 originais não exibiamfenótipo em um ensaio (várias réplicas com confirmação da seqüência dasconstruções) e foram, portanto, excluídos dos 300 principais. Os fenótiposforam observados para 39 genes alvos nos 300 principais incluindo Ivl1 Iva,rup, ste, emb, une, sck e fenótipos adicionais não incluídos no sistema declassificação tal como defeituoso em relação ao crescimento (gro), progênieestéril (stp), atarracado (dpy) e defeito na morfologia do corpo (bmd).

EXEMPLO 2

Seleções de RNAi em C. elegans P-zero (PO)

Em adição ao ensaio de RNAi padronizado, foram realizadasseleções adicionais de RNAi em C. elegans. Uma destas era uma seleçãoletal de P0.

Efeitos de P-zero (PO) ou de RNAi de Início Rápido em C. elegans

Para controlar Heterodera glycines através do fornecimento dedsRNA partindo de uma planta de soja transgênica, os genes dealimentação que são sensíveis aos efeitos de RNAi de início rápidopoderiam ser úteis. Tais genes poderiam bloquear a formação de sítios dealimentação maduros pelo J2 enquanto que os genes de início lento nãopoderiam exibir um efeito até a geração seguinte. Os genes de C. elegansnos quais os efeitos são observados no animal exposto, os assim chamadosefeitos da geração PO (P-zero), poderiam prever ortólogos de H. glyçinescom sensibilidade alta e rápida ao RNAi.

Todas as seleções em grande escala em relação aos efeitos doRNAi em C. elegans expunham as larvas iniciais como L4s ou adultos (ageração genética PO (P-zero)) ao dsRNA e buscavam os fenótipos em suaprogênie, a geração F1 e F2. A esterilidade do animal PO inicial também foiobservada em muitos casos. Nenhuma das seleções por microinjeção(Gonczy e outros, 2000; Piano e outros 2000; Piano e outros, 2002) ouseleções de alimentação (Fraser e outros, 2000; Kamath e outros, 2003)mostrou efeitos sobre os animais PO sem ser a esterilidade. Similarmente,em uma seleção de mais de 1.200 genes de C. elegans através daalimentação partindo do início de L4, fenótipos PO sem ser a esterilidade nãoforam observados. Os registros do wormbase (www.wormbase.org) defenótipos de RNAi nem mesmo mostraram a geração na qual um efeito éobservado (P0, F1, F2 etc.) de forma que a descoberta de candidatos PO dealimentação partindo destes registros não é possível. Maeda e outros 2000realizaram RNAi em 2.500 genes de C. elegans através da imersão de L4s.1 De forma interessante, no material online suplementar que acompanha apublicação, Maeda e outros citam 26 casos em que os efeitos de PO sem sera esterilidade foram observados variando do crescimento não saudável atélento até a letalidade. Estes alvos foram investigados experimentalmentepara observar se qualquer um dos genes constituía efeitos realmentelegítimos de PO (FIG 2).

Dos 26 registros de Maeda e outros 21 correspondiam aosregistros do wormbase.org enquanto que 5 eram clones de origem incerta.19 genes foram clonados de forma bem sucedida dentro de construções dealimentação de RNAi de E. coli e a seqüência foi verificada enquanto 2tiveram dificuldades na clonagem. 17 dos 19 clones completos foram atéagora testados em relação aos fenótipos de P0. Estão em progressoexperimentos para terminar o teste de mais dois clones e repetir o teste deseis outros que foram testados apenas uma vez para confirmar osresultados. Adicionalmente, 7 alvos de interesse foram testados no mesmoensaio para um total de 24. Foram coletados dados provenientes de doispontos de partida do ciclo de vida. Em primeiro lugar, um início com L4 dePO foi realizado para imitar tanto o ensaio de Maeda quanto o ensaio dealimentação com E. coli padronizado. Em segundo lugar, um início com ovode PO foi realizado para expor o animal PO ao dsRNA ao longo de todo odesenvolvimento, uma situação similar àquela que pode ser encontrada porum nematóide Heterodera glycines após a infecção de uma planta queproduz um dsRNA. Para o início com ovo, a hipótese é que a primeiraexposição ao dsRNA ocorre à medida que a larva L1 eclode e começa a sealimentar.

Partindo dos 17 candidatos testados por Maeda e outros (2001)e de 7 alvos adicionais, foi observado que 6 tinham fenótipos PO sem ser aesterilidade partindo de um início com ovo no ensaio de alimentação (3 deMaeda e 3 da lista adicional). Estes eram Y57G11C.15 (sec61 alpha),C47E12.5 (uba-1) e R07E4.6 (kin-2) de Maeda e C34G6.6 (pan-1),F52B11.3 (pan-2) e T25C8.2 (act-5) da lista adicional. Para o início com L4,apenas três genes exibiam fenótipos PO sem ser a esterilidade. Os genescom fenótipos com início com L4 constituíam um subconjunto dos 6 queexibiam um fenótipo de início com ovo: Y57G11C.15 (sec61 alpha) eR07E4.6 (kin-2) de Maeda e T25C8.2 (act-5) da lista adicional. Dos genesrestantes testados até agora dos candidatos de Maeda, 4 tinham fenótiposmenos graves tais como esterilidade e impedimento de larva F.1 enquantoque 9 eram completamente do tipo selvagem e provavelmente eram falsospositivos na seleção de Maeda. Continua possível, entretanto, que os genesque não possuem um fenótipo em um ensaio de alimentação bacterianoteriam um fenótipo em um ensaio de imersão.

Em adição aos estudos com larvas de C. elegans N2 (linhagempadronizada de laboratório), foram também realizados estudos para 22 dosgenes em um "fundo" mutante fog-2(q71). fog-2(q71) é um mutante quefeminiza a linhagem germinativa do hermafrodita e é mantido na forma deuma linhagem sexo masculino/sexo feminino. As fêmeas das larvas foramseparadas dos machos na forma de larvas antes da fertilização. Tais larvasdo sexo feminino virgens são fáceis de manter durante muitos dias uma vezque envelhecem assim que não há geração F1 presente para crescer naplaca e podem, portanto, auxiliar na observação de efeitos com início tardiona larva adulta de P0. Os resultados de PO observados em fog-2(q71) eramidênticos aos observados em N2 e nenhum fenótipo adicional foi detectado.Os testes de fog-2 nos genes subseqüentes foram, portanto,descontinuados.

Os estudos mostraram que em C. elegans a obtenção de umfenótipo de PO sem ser a esterilidade partindo de um início com L4 é umevento muito raro, mas que há exemplos tais como Y57G11C.15 (sec61alpha), R07E4.6 (kin-2) e T25C8.2 (act-5) (FIG 2). Uma evidência sugereque a maior parte dos fenótipos de PO sem ser a esterilidade registrados porMaeda e outros em seus materiais suplementares era constituída de falsospositivos. Isto é sustentado por outra evidência: em adição aos presentesdados pelo menos seis genes foram testados por outros laboratórios e foiobservado que possuíam apenas fenótipos do tipo selvagem em todas asgerações (PO, F1 etc.). Os fenótipos de PO sem ser a esterilidade partindo1 de um início com L4 são presumivelmente raros uma vez que o adulto jápossui muitas das proteínas necessárias para a sobrevivência e a cinéticalenta do RNAi leva tempo para degradar todos os produtos da transcrição.

Os genes que exibem um efeito sob tais condições pode ser aqueles em quea larva é especialmente sensível a sua interrupção e, portanto, altamenteclassificados entre os alvos para consideração. Os fenótipos de PO sem sera esterilidade partindo de um início com ovo são menos raros e sãoobservados em vários dos alvos de interesse conhecidos por possuíremfenótipos graves (por exemplo, pan-1, pan-2). Presumivelmente, umainspeção maior de alvos com fenótipos fortes encontraria mais.

Dos seis alvos em que um fenótipo letal de PO foi confirmado,todos possuem ortólogos razoavelmente fortes entre as seqüências de H.glycines. kin-2 já foi confirmado como possuindo um fenótipo de PO e foi,portanto, classificado nos 10 principais, pan-1 e pan-2 já estão ambos entreos 100 principais utilizando o presente sistema de classificação de fenótiposde RNAi do wormbase (FIG 1) e informação adicional de seqüências de H.glycines e também serão considerados, Pan-1, que estava faltando partindodas ESTs, é recém-identificado em H. glycines com base noseqüenciamento de Genome Survey. act-5, uba-1 e sec61 alpha ainda nãoestavam entre as várias centenas de alvos principais utilizando o sistema declassificação de fenótipos de RNAi do wormbase porque não possuíamdescrições de fenótipos let, Ivl1 Iva1 mlt, bli e rup no wormbase. As posiçõesde classificação finais destes seis alvos entre os 300 principais sãoY57G11C.15 (sec61 alpha) = #2, C47E12.5 (uba-1) = #3 e R07E4.6 (kin-2) =#4, C34G6.6 (pan-1) = #7, F52B11.3 (pan-2) = #30 e T25C8.2 (act-5) = #21.

EXEMPLO 3

Seleção de RNAi específico ao intestino de C. elegans

Uma segunda seleção adicional também foi realizada paraauxiliar na seleção de genes alvos (Tabela 1). Uma linhagem de C. elegansque é sensível ao RNAi apenas no intestino foi gerada anteriormente. Estalinhagem pode ser utilizada para selecionar rapidamente o conjunto degenes que mostraram anteriormente ser essenciais para a viabilidade e odesenvolvimento pelo RNAi para a identificação daqueles que sãoespecificamente essenciais no intestino. Tais genes podem ser alvosvantajosos com RNAi de H. glycines fornecido por plantas uma vez queacredita-se que o intestino seja o primeiro tecido a entrar em contato com odsRNA que está entrando. Ainda, os genes que codificam proteínassecretadas e transmembrana podem ser vulneráveis à interrupção pelaexpressão na planta de proteínas nematocidas que interrompem a funçãodestes produtos gênicos.

A linhagem de RNAi específica ao intestino de C. elegans foigerada através da introdução de um transgene que controla a expressão dogene sid-1 do tipo selvagem sob o controle de um promotor específico aointestino em um "fundo" de outra maneira sem sid-1 (Linhagem HC75). sid-1é essencial para o RNAi sistêmico em C. elegans e codifica uma proteínatransmembrana que é um suposto transportador de dsRNA (Winston eoutros, 2002). Três linhagens, cada uma com expressão controlada partindode um promotor intestinal diferente, foram testadas em relação àsensibilidade ao RNAi. Os promotores utilizados são regiões a 5' de elt-2,ges-1 e ile-1. O dsRNA de alimentação proveniente de unc-54 (músculo daparede do corpo), dpy-7 (hipoderme) e act-1 (vários tecidos) não exibiufenótipo nestas linhagens embora todos os três dsRNAs produzissem ofenótipo esperado nos controles de larvas do tipo selvagem (N2). Por outrolado, o dsRNA de alimentação proveniente de act-5, uma actina específicaao intestino e ile-1, um gene com localização intestinal, nestas linhagensresultou em esterilidade. Estas observações apoiam a conclusão de queestas linhagens são sensíveis ao RNAi no intestino, mas não em um númerode outros tecidos. A linhagem ges-1 ::sid-1 foi selecionada para triagem. Osfenótipos nesta linhagem são mais fracos que em N2 mesmo para genesque não somente possuem funções no intestino, provavelmente porque aexpressão de ges-1 não é uniforme ou mais fraca que a expressão intestinalde SID-1 endógeno de forma que SID-1 nem sempre está presente nosníveis que estaria em N2. Entretanto, fenótipos, tal como 50% deesterilidade, são facilmente classificados em relação aos controles e podem1 ser reproduzidos. Até hoje, foram verificados 130 genes na linhagem deRNAi intestinal, com um foco nos alvos secretados e transmembrana e foiobservado que 57 possuem fenótipos (Tabela 1). Dos 715 gene alvos emconsideração para a lista dos 300 principais, 24 tinham fenótipos nalinhagem de RNAi intestinal enquanto 3 eram do tipo selvagem. Naclassificação de alvos pesados igualmente de outra maneira foi dadapreferência aos genes exibindo fenótipos de linhagem de RNAi intestinal e14 tais genes constituíam a lista dos 300 principais. Os 10 que nãoconstituíam tinham fenótipos de RNAi intestinal fracos (por exemplo, 25%estéril) ou outros inconvenientes (homologia fraca, não ortologia etc.).Tabela 1.

<table>table see original document page 74</column></row><table>EXEMPLO 4

Informação sobre Ortólogos de Genes de C. elegans - Suposta FunçãoMolecular

Além do fenótipo, a informação adicional extraída do wormbaseincluía o nome do gene, a ID da proteína wormpep, o padrão de expressão, alocalização subcelular, os motivos proeminentes, a identificação sucinta, adescrição concisa e os termos da ontologia gênica. Para a classificação, foidada preferência aos genes alvos com função molecular conhecida em relaçãoaqueles com função completamente desconhecida. Foi observado que os genes com fenótipos fortes eram, em geral, aqueles com produtos protéicosenvolvidos em processos celulares centrais tais como a replicação do DNA1 ociclo celular, a transcrição, o processamento de RNA, a tradução incluindoribossomo e tRNÀ, o tráfeto de proteínas, a secreção, a modificação deproteínas, a estabilidade e a degradação de proteínas, a produção de energiaincluindo a função mitocondrial, o metabolismo intermediário, a estruturacelular, a transdução de sinal, canais e transportadores e a endocitose. Dos300 alvos selecionados, 275 pertencem a uma destas categorias (Tabela 2).Dos 100 principais, 98 pertenciam a uma destas categorias. As categorias maisfreqüentemente observadas entre os alvos com fenótipos fortes eramtradução/ribossomo/tRNAs, transcrição/processamento de RNA eestabilidade/degradação de proteínas/proteossomo.Tabela 2. Categorização de 300 Alvos Principais de C. elegans Através daSuposta Função Celular

<table>table see original document page 76</column></row><table>

Rastrear a suposta função celular garante que a diversidadeadequada seja mantida na lista dos alvos principais e que a lista dos alvos nãofique muito dependente de um ou de alguns poucos processos que poderiamfuncionar diferentemente em H. glycines do que em C. elegans. N- conceito, éfornecida baixa prioridade aos processos do desenvolvimento que acredita-seque evoluam rapidamente em nematóides tal como a determinação do sexouma vez que tais processos são menos provavelmente conservados entre H.glycines e C. elegans. Na prática, poucos dos tais genes possuem escoresbons o suficiente no fenótipo de RNAi para serem levados em consideraçãopara a lista dos 300 principais. De forma interessante, considerando aintensidade do fenótipo de C. elegans isoladamente (escore de 1-44 edescrições do tipo selvagem) mesmo antes da inclusão da informação sobre aconservação da seqüência, alvos com classificação alta super representamenormemente processos celulares centrais que envolvem grandes complexosde várias unidades tais como ribossomos e proteossomos. Isto pode resultarsimplesmente da importância da tradução e da degradação de proteínas para asobrevivência celular. Uma interpretação adicional desta descoberta é quesubunidades de complexos grandes tendem a possuir fenótipo forte após onocaute com RNAi uma vez que são mais sensíveis à dosagem que asproteínas que não atuam em complexos. Por exemplo, embora uma enzimamonomérica possa manter o fluxo adequado ao longo de uma via metabólicacom apenas 10% de sua dose de proteína normal, o desequilíbrio entre asdoses das subunidades em um complexo grande pode resultar na montagemerrada do complexo ou outra falha funcional. Descobertas recentes em S.cerevisiae apoiam esta interpretação (Papp e outros, 2003).

EXEMPLO 5

Indicação de Homologia, Identidade e Ortologia de Seqüência

Para a identificação de ortólogos de Heterodera glycines de genesde C. elegans caracterizados, foram realizadas buscas de homologia utilizandoo conjunto de programas BLAST (Altschul e outros, 1990). Utilizando asseqüências de proteínas previstas para os genes de C. elegans (Wormpep) foiutilizado o TBLASTN para buscar tanto ESTs aglomeradas de H. glycinesquanto outras seqüências disponíveis no Genbank assim como seqüências depropriedade do Genome Survey geradas recentemente. Bitscore, valor de e e% de identidade foram rastreados. Para consideração como um alvo, um genede C. elegans tinha que ter uma combinação em TBLASTN com um ortólogoou um homólogo em H. glycines com um valor de e de pelo menos e-10 oumelhor. 715 genes de C. elegans com fenótipos de RNAi com classificação de1-44 (FIG 1) satisfaziam este critério mínimo. Para estes 715 genes, ascombinações de H. glycines eram:

<table>table see original document page 78</column></row><table>

Para construir a lista dos 300 principais (FIG 3), a seqüência emnível de aminoácidos favorável similar entre C. elegans e H. glycines era osegundo fator mais importante na classificação depois do fenótipo de RNAi. Ascaracterísticas dos alvos de % de ID1 bitscore e valor de e foram divididas emquartis. Os alvos de classificação principal em adição ao fato de possuíremfenótipos de RNAi fortes também tinham características de homologiafavoráveis indicativas de ortologia: bitscore (>100), valor de e (<e-20) eporcentagem de identidade (>40%). Para garantir a atribuição de ortologia, osalvos também foram testados em relação a combinações de BLAST recíprocasde forma que quando a seqüência selecionada de H. glycines era verificada porBLAST de volta para a lista de wormpep de C. elegans (BLASTX), a seqüênciade partida original era identificada. 25 genes que de outra maneira constituiriamos 300 principais falharam neste teste de BLAST recíproco indicando que osgenes em C. elegans e H. glycines provavelmente não eram ortólogos. Dos300 finais, 296 pareciam ser ortólogos evidentes com combinações principaispor BLAST recíproco em ambas as direções, 1 estava limitado à combinaçãoprincipal (2 homólogos próximos em C. elegans) e 3 estavam dentro dos 5% dobitscore principal (estes foram mantidos por causa dos fenótipos fortes entretodos os homólogos principais de C. elegans). Para os 300 genes principais, ascombinações de H. glycines eram:

<table>table see original document page 78</column></row><table>Dos 300 alvos principais, 63 pareciam ter sido identificadosespecificamente devido ao seqüenciamento pelo Genoma Survey. Ascombinações nas ESTs ou outras seqüências disponíveis publicamente estãofaltando ou têm escores substancialmente mais fracos (a maioria parálogos), Aclassificação destes genes entre os 300 principais é como a seguir:

23 nos 100 principais: 1, 5, 7, 9, 15, 33, 35, 37, 38, 40, 44, 51, 53,58, 60, 67, 68, 75, 80, 82, 83, 88, 96

15 na segunda centena: 102, 115, 134, 142, 148, 151, 152, 156,163, 164, 191, 193, 199, 200

26 na terceira centena: 206, 208, 211, 219, 226, 231, 237, 241,242, 247, 251, 254, 256, 258, 260, 261, 263, 267, 271, 272, 280, 281, 289, 292,298, 300.

EXEMPLO 6

Expressão Gênica em H. glycines e Outros Tylenchids

A expressão de genes alvos em H. glycines e outros nematóidesparasitas de plantas Tylenchid também foi monitorada. Mesmo dentro de H.glycines, este processo era impreciso uma vez que o produto da transcriçãoidentificado da lista dos 300 principais pode ser o gene de interesse real noscasos em que a coincidência principal era uma EST (237 dos 300) ou umhomólogo relacionado em que a combinação principal era com a seqüênciagenômica (63 dos 300). Similarmente, as combinações em Tylenchidsrelacionados podem ser ortólogos ou homólogos. Entretanto, esta informaçãofornece um ponto de partida para verificar o estágio da expressão. A expressãoem J2, J3 e J4 é particularmente atraente uma vez que o fornecimento de RNAde filamento duplo seria possível partindo da planta nestes estágios através dosítio de alimentação enquanto o cisto está sendo formado. Dos genes comrepresentação de EST em H. glycines, 47% eram representados por uma únicaEST. 53% dos genes eram representados por duas ou mais ESTs. 64% tinhamrepresentação nos estágios J2, J3 ou J4. 165 dos 300 alvos tinham ortólogosou homólogos entre as ESTs e outro seqüenciamento disponível partindo deoutros nematóides parasitas de plantas Tylenchid incluindo Heteroderaschachtii, Globodera rostochiensis, Globodera pallida, Meloidogyne incógnita,Meloidogyne javanica, Meloidogyne arenaria, Meloidogyne hapla, Meloidogynechitwoodi, Meloidogyne paranaensis, Pratylenchus vulnus, Pratylenchuspenetrans, Radopholus slmilis (Tabela 3).

Tabela 3: Evidência de Expressão dos 300 Alvos Principais em H. glycines

<table>table see original document page 80</column></row><table>

EXEMPLO 7

Lista de alvos para RNAi de H. glycines

A interrupção da função do gene alvo dentro do nematóide de cistoda soja patogênico para a planta, Heterodera glycines, pode ser realizadaatravés da interferência com RNA e pode resultar na interrupção do ciclo devida do agente patogênico. Os genes alvos ótimos para a interrupção incluemgenes essenciais para o ciclo de vida em que a interrupção resulta na morte dealta penetrância das populações de parasitas ou "morte genética" através dobloqueio da reprodução com danos mínimos à planta e número mínimo delarvas viáveis que escapam que atingem a geração seguinte. Os inventoresforneceram um processo para a seleção de RNAi alvos e uma lista de 300genes alvos previstos como sendo essenciais para a reprodução de H.glycines. As características principais utilizadas para prever os alvos incluem aortologia aos genes conhecidos de C. elegans com fenótipos de interferênciacom RNA fortes e que podem ser reproduzidos. A lista completa dos 300 alvosprincipais é fornecida na FIG 3. A Tabela 4 lista os genes alvos selecionadospara análise em tecidos vegetais.Tabela 4: Gene Alvos Selecionados para Raiz Peluda da Soja e Ensaios in planta

<table>table see original document page 81</column></row><table><table>table see original document page 82</column></row><table><table>table see original document page 83</column></row><table>

EXEMPLO 8

Genes selecionados de H. glycines que exibem eficiência no bloqueio dainfecção da soja pelo nematóide de cisto da soja

Os resultados dos ensaios de imersão mostram que os ortólogos (efragmentos de tais ortólogos) de pas-4 (por exemplo, encontrados nosnucleotídeos 1-544 da SEQ ID Ns: 1292), de pas-5 (por exemplo, encontradosnas SEQ ID NSs: 525, 569, 797, nos nucleotídeos 1-672 da SEQ ID Ns: 1293 ouna SEQ ID Ns: 1516), de pas-6 (por exemplo, encontrados nos nucleotídeos314-859 da SEQ ID Ns: 1290) e de cgh-1 (por exemplo, encontrados nosnucleotídeos 931-1567 da SEQ ID N9: 1289), entre outros, demonstrameficiência no bloqueio da reprodução do nematóide de cisto da soja (SCN).Cada um destes genes é encontrado nos 16 registros principais na FIG 3.

Os genes ou os fragmentos gênicos selecionados também foramtestados em um ensaio de raiz peluda da soja (por exemplo, Narayanan eoutros, 1999) e os tecidos vegetais demonstraram resistência ao SCN comomostrado na Tabela 5:Tabela 5. Resultados do ensaio de raiz peluda que demonstram atividadede resistência ao SCN.

<table>table see original document page 84</column></row><table>

Classificação de Eficiência para a Tabela 5

Classe IV: maior ou igual a 50% de redução no número médiode cistos em relação ao número médio de cistos para o controle do tiposelvagem com vetor transgênico vazio;

Classe III: 35 - 49% de redução no número médio de cistos emrelação ao número médio de cistos para o controle do tipo selvagem com vetortransgênico vazio;

Classe II: 20 - 34% de redução no número médio de cistos emrelação ao número médio de cistos para o controle do tipo selvagem com vetortransgênico vazio

Classe I: possuindo eventos de transformação individuaiscom maior eficiência que o evento com maior eficiência observado com ocontrole do tipo selvagem com vetor transgênic vazio

As plantas transgênicas de soja foram preparadas expressandofragmentos de genes que codificam, por exemplo, Pas-4, Pas-5, Cgh-1 ou Pas-6 e estas plantas foram testadas em relação à resistência ao SCN. Osresultados são mostrados na Tabela 6, demonstrando a eficiência na reduçãoda infecção e/ou da reprodução do SCN.

Tabela 6. Análise das plantas transgênicas em relação à resistência ao SCN

<table>table see original document page 85</column></row><table>Classificação da Eficiência para a Tabela 6:

Classe 1: 10-20% de redução no número médio decistos em relação ao número médio de cistos para Lee 74 ou A3244;

Classe II: 20 - 35% de redução no número médio de cistos emrelação ao número médio de cistos para Lee 74 ou A3244;

Classe III: 36 - 50% de redução no número médio de cistos emrelação ao número médio de cistos para Lee 74 ou A3244;

Classe IV: >50% de redução no número médio de cistos em

relação ao número médio de cistos para Lee 74 ou A3244**************

Todas as composições e os métodos divulgados e reivindicadosaqui podem ser feitos e executados sem experimentos desnecessários à luz dapresente divulgação. Embora as composições e os métodos desta invençãotenham sido descritos em termos das modalidades ilustrativas anteriores, seráevidente para os peritos na arte que variações, mudanças, modificações ealterações podem ser aplicadas à composição, aos métodos e às etapas ou àseqüência de etapas dos métodos descritos aqui, sem sair do conceito, doespírito e do âmbito reais da invenção. Mais especificamente, será evidenteque certos agentes que são tanto quimicamente quanto fisiologicamenterelacionados podem ser substituídos pelos agentes descritos aqui enquanto osmesmos resultados ou similares podem ser atingidos. Todos os tais substitutossimilares e as modificações evidentes para os peritos na arte são consideradoscomo estando dentro do espírito, do âmbito e do conceito da invenção que sãodefinidos pelas reivindicações em anexo.

Referências

As referências a seguir são incorporadas aqui como referência:Patente U.S. N9 4.536.475; Patente U.S. N9 4.693.977; PatenteU.S. N9 4.886.937; Patente U.S. N9 4.940.838; Patente U.S. N9 4.959.317;Patente U.S. N9 5.015.580; Patente U.S. N9 5.107.065; Patente U.S. N95.110.732; Patente U.S. N9 5.231.020; Patente U.S. N9 5.283.184; Patente U.S.N9 5.302.523; Patente U.S. N9 5.384.253; Patente U.S. N9 5.464.763; PatenteU.S. N9 5.464.765; Patente U.S. N9 5.501.967; Patente U.S. N9 5.508.184;Patente U.S. N9 5.527.695; Patente U.S. N9 5.538.880; Patente U.S. N95.459.252; Patente U.S. N9 5.550.318; Patente U.S. N9 5.563.055; Patente U.S.N9 5.591.616; Patente U.S. N9 5.593. 874; Patente U.S. N9 5.633.435; PatenteU.S. Ng 5.693.512; Patente U.S. N9 5.698.425; Patente U.S. N9 5.712.135;Patente U.S. N9 5.759.829; Patente U.S. N9 5.780.708; Patente U.S. N95.789.214; Patente U.S. N9 5.804.693; Patente U.S. N9 5.824.877; Patente U.S.N9 5.837.848; Patente U.S. N9 5.981.840; Patente U.S. N9 6.118.047; PatenteU.S. N9 6.160.208; Patente U.S. N9 6.326.193; Patente U.S. N9 6.384.301;Patente U.S. N9 6.399.861; Patente U.S. N9 6.403.865; Patente U.S. N96.506.559

Pedido de Patente U.S. N9 de Série 10/465.800; Pedido de Patente U.S. N9 deSérie 11/360.355

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Claims

1. Polinucleotídeo isolado selecionado do grupo que consiste em:(a) um fragmento de pelo menos 21 nucleotídeos contíguosde uma seqüência de ácido nucléico de qualquer uma das SEQ ID N9: 301-SEQ ID Ne: 1026, SEQ ID N9: 1269- SEQ ID Ne: 1702 e SEQ ID N5: 1920- SEQID N9: 1929, em que a captação por um nematóide parasita de plantas de umaseqüência de ribonucleotídeo de filamento duplo que compreende pelo menosum filamento que é complementar ao dito fragmento inibe o crescimento do ditonematóide; e(b) um complemento da seqüência de (a).

2. Polinucleotídeo isolado da reivindicação 1, definido como ligadode forma operacional a um promotor heterólogo.

3. Polinucleotídeo isolado da reivindicação 1, definido comocompreendido em um vetor de transformação vegetal.

4. Seqüência de ribonucleotídeo de filamento duplo produzidapartindo da expressão de um polinucleotide de acordo com a reivindicação 1,em que a captação da dita seqüência de ribonucleotídeo por um nematóideparasita dé plantas inibe o crescimento do dito nematóide.

5. Seqüência de ribonucleotídeo de filamento duplo dareivindicação 4, definida como produzida através da preparação de umaseqüência de polinucleotídeo recombinante que compreende uma primeira,uma segunda e uma terceira seqüências de polinucleotídeos, em que aprimeira seqüência de polinucleotídeo compreende o polinucleotídeo isolado dareivindicação 1, em que a terceira seqüência de polinucleotídeo está ligada àprimeira seqüência de polinucleotídeo pela segunda seqüência depolinucleotídeo e em que a terceira seqüência de polinucleotídeo ésubstancialmente o complemento inverso da primeira seqüência depolinucleotídeo de forma que a primeira e a terceira seqüências depolinucleotídeos se hibridizam quando transcritas em um ácido ribonucléicopara formar a molécula de ribonucleotídeo de filamento duplo estabilizada pelasegunda riboseqüência de nucleotídeos ligada.

6. Seqüência de ribonucleotídeo de filamento duplo dareivindicação 4, em que a captação da seqüência de polinucleotídeo pelonematóide parasita de plantas inibe a expressão de uma seqüência denucleotídeos substancialmente complementar à dita seqüência depolinucleotídeo.

7. Vetor de transformação vegetal que compreende a seqüênciade nucleotídeos da reivindicação 1, em que a seqüência de DNA está ligadade forma operacional a um promotor heterólogo funcional em uma célulavegetal.

8. Célula transformada com o polinucleotídeo da reivindicação 1.

9. Célula da reivindicação 8, definida como célula procariótica.

10. Célula da reivindicação 8, definida como uma célulaeucariótica.

11. Célula da reivindicação 8, definida como uma célula vegetal.

12. Planta transformada com o polinucleotídeo da reivindicação 1.

13. Semente da planta da reivindicação 12, em que a sementecompreende o polinucleotídeo.

14. Planta da reivindicação 12, em que o dito polinucleotídeo éexpresso na célula vegetal na forma de uma seqüência de ribonucleotídeode filamento duplo.

15. Planta da reivindicação 14, em que o nematóide parasita deplantas é Heterodera glycines.

16. Planta da reivindicação 14, em que a captação daquantidade inibidora da seqüência de ribonucleotídeo de filamento duplopelo nematóide parasita de plantas inibe o crescimento do nematóide.

17. Produto de consumo obtido partindo de uma planta deacordo com a reivindicação 12, em que o dito produto de consumocompreende uma quantidade detectável do polinucleotídeo da reivindicação-1 ou de um ribonucleotídeo expresso partindo do mesmo.

18. Processo para o controle de uma população de nematóidesparasitas de plantas que compreende o fornecimento de um agente quecompreende uma seqüência de ribonucleotídeo de filamento duplo quefunciona após ser captada pelo nematóide para inibir uma função biológicadentro do dito nematóide, em que o agente compreende uma seqüência denucleotídeos selecionada do grupo que consiste das SEQ ID N9: 301 - SEQID Ns: 1026, SEQ ID N9: 1269 - SEQ ID N9: 1702 e SEQ ID N9: 1920 - SEQID N9: 1929 e complementos das mesmas.

19. Processo para o controle de uma população de nematóidesparasitas de plantas que compreende o fornecimento de um agente quecompreende uma primeira seqüência de polinucleotídeo que funciona apósser captada pelo agente patogênico para inibir uma função biológica dentrodo dito nematóide, em que a dita seqüência de polinucleotídeo exibeaproximadamente 95 até aproximadamente 100% de identidade deseqüência de nucleotídeos ao longo de pelo menos aproximadamente 19 atéaproximadamente 25 nucleotídeos contíguos com uma seqüênciacodificadora derivada do dito nematóide e é hibridizada com uma segundaseqüência de polinucleotídeo que é complementar à dita primeira seqüênciade polinucleotídeo e em que a dita seqüência codificadora derivada do ditonematóide é selecionada do grupo que consiste das SEQ ID N9:301 - SEQID N9: 1026, SEQ ID N9:1269 - SEQ ID N9: 1702 e SEQ ID N9: 1920 - SEQID N9: 1929 e os complementos das mesmas.

20. Processo da reivindicação 19, em que o dito nematóide éHeterodera glycines.

21. Processo para o controle de uma população de nematóidesparasitas de plantas que compreende o fornecimento na planta hospedeirade um nematóide parasita de plantas de uma célula vegetal transformadaque expressa uma seqüência de polinucleotídeo de acordo com areivindicação 1, em que o polinucleotídeo é expresso para produzir um ácidoribonucléico de filamento duplo que funciona após ser captado pelonematóide parasita de plantas para inibir a expressão de uma seqüênciaalvo dentro do dito nematóide e resulta no crescimento reduzido donematóide ou da população de nematóides, em relação ao crescimentosobre um hospedeiro que não possui a célula vegetal transformada.

22. Processo da reivindicação 21, em que o nematóide exibecrescimento reduzido após a infecção da planta hospedeira.

23. Processo da reivindicação 21, em que a seqüência alvocodifica uma proteína, cuja função prevista é selecionada do grupo queconsiste em: replicação do DNA, controle do ciclo celular, transcrição,processamento do RNA, tradução, função de ribossomo, síntese de tRNA,função de tRNA, tráfego de proteínas, secreção, modificação de proteínas,estabilidade de proteínas, degradação de proteínas, produção de energia,função mitocondrial, metabolismo intermediário, estrutura celular, transduçãode sinal, endocitose, regulação de íons e transporte.

24. Processo da reivindicação 21, em que o dito nematóide éselecionado do grupo que consiste em Heterodera sp., Meloidogyne sp.,Globodera sp., Helicotylenchus sp., DityIenchus sp., Pratylenchus sp.,Paratylenehus sp., Rotylenehus sp., Tylenchulus sp., Tylenehorhynehus sp.,Hoplolaimus sp., Belonolaimus sp., Anguina sp., Subanguina sp. e Naeobbussp.

25. Processo da reivindicação 24, em que o nematóide éHeterodera glyeines.

26. Processo da reivindicação 21, em que o polinucleotídeofunciona após ser captado pelo nematóide parasita de plantas para suprimirum gene que realiza uma função essencial para a sobrevivência ou para ocrescimento do nematóide, a dita função sendo selecionada do grupo queconsiste em replicação do DNA, controle do ciclo celular, transcrição,processamento do RNA, tradução, função de ribossomo, síntese de tRNA,função de tRNA, tráfego de proteínas, secreção, modificação de proteínas,estabilidade de proteínas, degradação de proteínas, produção de energia,função mitocondrial, metabolismo intermediário, estrutura celular, transduçãode sinal, endocitose, regulação de íons e transporte.

27. Processo para reduzir o número de sítios de alimentação deHeterodera estabelecidos no tecido radicular de uma planta hospedeira, quecompreende o fornecimento na planta hospedeira de um Heterodera sp. deuma célula vegetal transformada que expressa uma seqüência depolinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, em que o polinucleotídeo éexpresso para produzir um ácido ribonucléico de filamento duplo quefunciona após ser captado pelo Heterodera sp. para inibir a expressão deuma seqüência alvo dentro do dito nematóide e resulta em um decréscimono número de sítios de alimentação estabelecidos, em relação aocrescimento sobre um hospedeiro que não possui a célula vegetaltransformada.

28. Processo de controle da infestação por pragas nematóidesde plantas em uma planta que compreende o fornecimento na dieta de umapraga nematóide de plantas de um dsRNA que compreende:a) uma seqüência de nucleotídeos senso; eb) uma seqüência de nucleotídeos anti-sensocomplementar à dita seqüência de nucleotídeos senso,em que a dita seqüência de nucleotídeos senso compreende oué complementar a uma seqüência de nucleotídeos de acordo com areivindicação 1.

29. Processo da reivindicação 28, em que a dita dietacompreende uma célula vegetal transformada para expressar a ditaseqüência de nucleotídeos senso e a dita anti-senso.

30. Processo para aumentar o rendimento de uma produçãoobtida partindo de uma planta de cultivo subetida à infecção por nematóidesparasitas de plantas, o dito processo compreendendo as etapas de:a) introdução de um polinucleotídeo de acordo com areivindicação 1 dentro da dita planta de cultivo;b) cultivo da planta de cultivo para permitir a expressão dodito polinucleotídeo;em que a expressão do polinucleotídeo inibe a infecção ou ocrescimento do nematóide parasita de plantas e a perda do rendimentocausada pela infecção por nematóides parasitas de plantas.

31. Processo da reivindicação 30, em que a planta de cultivo é asoja {GIycine max).

32. Processo da reivindicação 30, em que a expressão dopolinucleotídeo produz uma molécula de RNA que suprime pelo menos umprimeiro gene alvo em um nematóide parasita de plantas que entrou emcontato com uma parte da dita planta de cultivo, em que o gene alvo realizapelo menos uma função essencial selecionada do grupo que consiste emreplicação do DNA, controle do ciclo celular, transcrição, processamento doRNA, tradução, função de ribossomo, síntese de tRNA, função de tRNA,tráfego de proteínas, secreção, modificação de proteínas, estabilidade deproteínas, degradação de proteínas, produção de energia, funçãomitocondrial, metabolismo intermediário, estrutura celular, transdução desinal, endocitose, regulação de íons e transporte.

33. Processo da reivindicação 32, em que o nematóide parasitade plantas é um nematóide Tylenchid.

34. Processo da reivindicação 33, em que o nematóide parasitade plantas é um Heterodera sp..

35. Processo da reivindicação 34, em que o nematóide parasitade plantas é Heterodera glycines.

36. Processo para aumentar a tolerância ao estresse osmóticode uma planta de cultivo submetida à infecção por nematóides parasitas deplantas, o dito processo compreendendo as etapas de:a) introdução de um polinucleotídeo de acordo com areivindicação 1 dentro da dita planta de cultivo;b) cultivo da planta de cultivo para permitir a expressão do ditopolinucleotídeo;em que expressão do polinucleotídeo aumenta a tolerância aoestresse osmótico de uma planta de cultivo.

37. Processo da reivindicação 36, em que a tolerância aoestresse osmótico é definida como tolerância à seca.

38. Processo de obtenção de um produto de consumo quecompreende a obtenção de uma planta de acordo com a reivindicação 12 ouuma parte da mesma e a preparação de um produto de consumo partindo daplanta ou de parte da mesma.

39. Processo de produção de alimento ou produto alimentício,que compreende a obtenção de uma planta de acordo com a reivindicação 12 ou uma parte da mesma e a preparação do alimento ou do produtoalimentício partindo da dita planta ou parte da mesma.

40. Processo da reivindicação 39, em que o alimento ou oproduto alimentício é definido como óleo, farinha grossa, proteína, amido,farinha ou ensilagem.

41. Processo para a modulação da expressão de um gene alvoem uma célula de nematóide parasita de plantas, o processocompreendendo:(a) a transformação de uma célula vegetal com um vetor quecompreende uma seqüência de ácido nucléico que codifica um dsRNAselecionado do grupo que consiste das SEQ ID NQ: 301 - SEQ ID NQ: 1026,SEQ ID Ne: 1269 - SEQ ID NQ: 1702 e e SEQ ID N9: 1920 - SEQ ID NQ: 1929,ligada de forma operacional a um promotor e uma seqüência de término datranscrição;(b) o cultivo da célula vegetal transformada sob condiçõessuficientes para permitir o desenvolvimento de uma cultura de célulasvegetais compreendendo um grande número de células vegetaistransformadas;(c) a seleção de células vegetais transformadas que possuemintegrada a seqüência de ácido nucléico dentro de seus genomas;(d) a seleção das células vegetais transformadas para aexpressão do dsRNA codificado pela seqüência de ácido nucléico; e(e) a seleção de uma célula vegetal que expressa o dsRNA.

42. Processo da reivindicação 41, que compreende ainda aregeneração de uma planta partindo da célula vegetal que expressa odsRNA; em que a expressão do gene na planta é suficiente para modular aexpressão de um gene alvo em uma célula de nematóide parasita de plantasque entra em contato com a planta ou a célula vegetal transformada.

43. Processo de identificação de genes prováveis de seremessenciais no ciclo de vida de um nematóide alvo, que compreende:(a) a classificação de um gene de Caenorhabditis elegans deacordo com um ou mais critérios selecionados do grupo que consiste em:potência do fenótipo de RNAi descrito; nível de confiança no fenótipodescrito; e probabilidade do efeito de RNAi em vários estágios no ciclo devida de um nematóide, de forma que um escore de fenótipo é obtido, em queuma alta classificação indica um gene de C. elegans com uma maiorprobabilidade de demonstrar um fenótipo de RNAi detectável comparadacom a probabilidade de tal fenótipo em um gene com classificação inferior;(b) a identificação de ortólogos possíveis de um gene de C.elegans no genoma do nematóide alvo realizando uma busca desimilaridade de seqüência em um banco de dados de proteínas ou de ácidosnucléicos de forma que uma proteína ou uma seqüência de ácido nucléicode um nematóide sem ser C. elegans que possui um valor de e no BLASTlimite de e"10 quando comparada com uma seqüência de C. elegans éconsiderada um ortólogo possível da seqüência de C. elegans-,(c) a identificação, entre os ortólogos possíveis da etapa (b), dosgenes de um nematóide sem ser C. elegans que demonstram um escore defenótipo na etapa (a) entre os 3,5% principais de todos os genes de C.elegans.

44. Processo da reivindicação 43, em que o nematóide alvo éum nematóide parasita de plantas.

45. Processo da reivindicação 44, em que o nematóide alvo éum nematóide Tylenchid.

46. Processo da reivindicação 45, em que o nematóide alvo éselecionado do grupo que consiste em Heterodera sp.; Globodera sp.;Meloidogyne sp.; Pratylenchus sp.; e Ditylenchus sp.

47. Processo da reivindicação 46, em que o nematóide alvo éum Heterodera sp.

48. Processo da reivindicação 47, em que o nematóide alvo éHeterodera glycines.