BR102017002213A2 - Moléculas de ácido nucleico rpb7 para controlar pragas de insetos - Google Patents

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E. Worden Sarah
L. Frey Meghan
Rangasamy Murugesan
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Vilcinskas Andreas
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Abstract

a presente invenção refere-se a moléculas de ácido nucleico e métodos de utilização das mesmas para o controle de pragas de insetos através da inibição mediada por interferência de rna de sequências codificadoras alvo e não codificadoras transcritas em pragas de insetos, incluindo pragas de coleópteros e/ou hemípteros. a descrição também se refere a métodos para fazer plantas transgênicas que expressam moléculas de ácido nucleico úteis para o controle de pragas de insetos, e as células vegetais e plantas obtidas deste modo.

Description

(54) Título: MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO RPB7 PARA CONTROLAR PRAGAS DE INSETOS (51) Int. Cl.: C12N 15/12; C12N 15/113; C12N 15/31; C12N 15/11; C12N 15/63; (...) (30) Prioridade Unionista: 03/02/2016 US 62/290,847 (73) Titular(es): DOW AGROSCIENCES LLC, FRAUNHOFER-GESELLSCHAFT ZUR FÕRDERUNG DER ANGEWANDTEN FORSCHUNG E.V.
(72) Inventor(es): KENNETH E. NARVA; SARAH E. WORDEN; MEGHAN L. FREY; MURUGESAN RANGASAMY; PREMCHAND GANDRA; WENDY LO; ELANE FISHILEVICH; RAINER FISHER; ANDREAS VILCINSKAS; EILEEN KNORR (57) Resumo: A presente invenção refere-se a moléculas de ácido nucleico e métodos de utilização das mesmas para o controle de pragas de insetos através da inibição mediada por interferência de RNA de sequências codificadoras alvo e não codificadoras transcritas em pragas de insetos, incluindo pragas de coleópteros e/ou hemípteros. A descrição também se refere a métodos para fazer plantas transgênicas que expressam moléculas de ácido nucleico úteis para o controle de pragas de insetos, e as células vegetais e plantas obtidas deste modo.
Figure BR102017002213A2_D0001
(74) Procurador(es): DANNEMANN, SIEMSEN, BIGLER & IPANEMA MOREIRA
1/164
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para
MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO RPB7 PARA CONTROLAR
PRAGAS DE INSETOS.
REIVINDICAÇÃO PRIORITÁRIA [0001] Este pedido reivindica o benefício da data de depósito do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos com o Número de Série 62/290.847, depositado em 3 de Fevereiro de 2016, para RPB7 NUCLIEC ACID MOLECULES TO CONTROL PLUTOS INSECT.
CAMPO TÉCNICO [0002] A presente invenção refere-se, de um modo geral, ao controle genético de danos causados por plantas causadas por pragas de insetos (por exemplo, pragas de coleópteros e pragas de hemípteros). Em modalidades particulares, a presente invenção referese à identificação de polinucleotídeos codificadores alvo e não codificadores e à utilização de tecnologias de DNA recombinante para pós-transcripcionalmente reprimir ou inibir expressão de polinucleotídeos codificadores alvo e não codificadores nas células de uma praga de inseto para proporcionar um efeito protetor de planta.
ANTECEDENTES [0003] A lombriga do milho ocidental (WCR), Diabrotica virgifera virgifera LeConte, é uma das espécies de crisomelídeo do milho mais devastadoras crisomelídeo do milho na América do Norte e é uma preocupação especial nas áreas de milharal do Centro-Oeste dos Estados Unidos. O crisomelídeo do milho do norte (NCR), Diabrotica barberi Smith e Lawrence, é uma espécie estreitamente relacionada que co-habita grande parte da mesma faixa que WCR. Existem várias outras subespécies relacionadas de Diabrotica que são pragas significativas nas Américas: o crisomelídeo do milho mexicano (MCR), D. virgifera zeae Krysan e Smith; crisomelídeo do milho do sul (SCR), D. undecimpunctata howardi Barber; D. balteata LeConte; D.
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2/164 undecimpunctata tenella; D. speciosa Germar; e D. u.
Undecimpunctata Mannerheim. O Departamento de Agricultura dos
Estados Unidos estimou que os crisomelídeos do milho causam $ 1 bilhão em receita perdida a cada ano, incluindo $ 800 milhões em perda de rendimento e $ 200 milhões em custos de tratamento.
[0004] Os ovos de WCR e de NCR são depositados no solo durante o verão. Os insetos permanecem no estágio do ovo durante todo o inverno. Os ovos são oblongos, brancos, e menos de 0,1 mm (0,004 polegada) de comprimento. As larvas eclodem no final de maio ou no início de junho, com o tempo preciso de incubação de ovos variando de ano para ano devido a diferenças de temperatura e localização. As larvas recém-eclodidas são vermes brancos que têm menos de 3,2 mm (0,125 polegada) de comprimento. Uma vez incubadas, as larvas começam a se alimentar de raízes de milho. Os crisomelídeos do milho atravessam três estágios larvais. Após a alimentação por várias semanas, as larvas mudam para o estágio pupal. Elas passam a pupas no solo, e depois emergem do solo como adultos em julho e agosto. As larvas adultas têm cerca de 6,3 mm (0,25 polegada) de comprimento.
[0005] As larvas de crisomelídeo do milho completam o desenvolvimento no milho e em várias outras espécies de gramíneas. Larvas criadas em diásporoamarelo emergem mais tarde e têm um menor tamanho de cápsula de cabeça como adultos do que larvas criadas em milho. Ellsbury et al. (2005) Environ. Entomol. 34: 627-34. Os adultos de WCR alimentam-se da seda, do pólen, e dos núcleos do milho em pontas expostas da espiga. Se os adultos de WCR emergirem antes que os tecidos reprodutivos do milho estejam presentes, eles podem se alimentar do tecido foliar, retardando assim o crescimento da planta e ocasionalmente matando a planta hospedeira. No entanto, os adultos mudarão rapidamente para sedas
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3/164 e pólen preferidos quando estiverem disponíveis. NCR adultos também se alimentam de tecidos reprodutivos da planta de milho, mas em contraste raramente se alimentam de folhas de milho.
[0006] A maior parte do dano do crisomelídeo do milho é causada pela alimentação das larvas. As larvas recém-chocadas inicialmente se alimentam de pelos finos de raiz de milho e entram em pontas de raiz. À medida que as larvas crescem, elas se alimentam e afundam nas raízes primárias. Quando as larvas de crisomelídeo do milho são abundantes, a alimentação das larvas resulta frequentemente na poda das raízes até à base do talo do milho. Grave lesão radicular interfere com a capacidade das raízes para o transporte de água e nutrientes para a planta, reduz o crescimento da planta, e resulta em redução da produção de grãos, reduzindo, assim, drasticamente o rendimento geral. Grave lesão radicular também muitas vezes resulta em fixação de plantas de milho, o que torna a colheita mais difícil e diminui ainda mais o rendimento. Além disso, a alimentação de adultos nos tecidos reprodutivos do milho pode resultar na poda de sedas na ponta da espiga. Se este corte de seda é suficientemente grave durante a vertente de pólen, a polinização pode ser interrompida.
[0007] O controle dos crisomelídeos do milho pode ser tentado por, por exemplo, rotação de culturas; inseticidas químicos; biopesticidas (por exemplo, a bactéria gram-positiva formadora de esporos, Bacillus thuringiensis); plantas transgênicas que expressam toxinas Bt, polipeptídeos PIP (vide, por exemplo, Publicação de Patente Internacional PCT N° WO 2015/038734), e/ou polipeptídeos AflP (vide, por exemplo, Publicação de Patente U.S. N° US 2104/0033361 A1); ou uma combinação dos mesmos. A rotação das culturas sofre a desvantagem de impor restrições indesejáveis à utilização das terras agrícolas. Além disso, a oviposição de algumas espécies de crisomelídeos pode ocorrer em campos de soja,
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4/164 diminuindo assim a eficácia da rotação de culturas praticada com milho e soja.
[0008] Inseticidas químicos são os mais fortemente invocados após estratégia para alcançar o controle de crisomelídeo do milho. O uso de inseticidas químicos, no entanto, é uma estratégia imperfeita de controle da crisomelídeo do milho; Mais de US $ 1 bilhão podem ser perdidos nos Estados Unidos a cada ano devido ao crisomelídeo do milho quando os custos dos inseticidas químicos são adicionados aos custos do dano do crisomelídeo que pode ocorrer apesar do uso dos inseticidas. Altas populações de larvas, chuvas intensas e aplicação inadequada do (s) inseticida (s) podem resultar em controle inadequado do crisomelídeo do milho. Além disso, o uso contínuo de inseticidas pode selecionar cepas resistentes a inseticidas, bem como suscitar preocupações ambientais significativas devido à toxicidade para espécies não alvo.
[0009] Insetos fétidos e outros insetos hemípteros (heteroptera) são outro importante complexo de pragas agrícolas. Em todo o mundo mais de 50 espécies estreitamente relacionadas de insetos fétidos são conhecidas por causar danos às culturas. McPherson & McPherson (2000) Stink bugs of economic importance in America north of Mexico, cRC Press. Esses insetos estão presentes em um grande número de culturas importantes, incluindo milho, soja, frutas, legumes e cereais. [00010] Insetos fétidos passam por vários estágios de ninfa antes de atingir o estágio adulto. Estes insetos desenvolvem-se dos ovos aos adultos em aproximadamente 30-40 dias. Ambas as ninfas e adultos se alimentam de seiva de tecidos moles em que também injetam enzimas digestivas causando digestão de tecido extraoral e necrose. Material vegetal digerido e nutrientes são então ingeridos. A depleção de água e nutrientes do sistema vascular da planta resulta em danos ao tecido vegetal. Os danos ao desenvolvimento de grãos e
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5/164 sementes são os mais significativos, uma vez que o rendimento e a germinação são significativamente reduzidos. Múltiplas gerações ocorrem em climas quentes, resultando em uma pressão significativa de insetos. A manipulação atual dos insetos fétidos depende do tratamento com inseticidas em uma base de campo individual. Portanto, estratégias de manipulaão alternativas são urgentemente necessárias para minimizar perdas de cultura contínuas.
[00011] A interferência de RNA (RNAi) é um processo que utiliza vias celulares endógenas, pelo que uma molécula de RNA interferente (RNAi) (por exemplo, uma molécula de dsRNA) que é específica para todos ou qualquer outra porção de tamanho adequado de um genealvo resulta na degradação do mRNA codificado deste modo. iRNA tem sido utilizado para realizar o silenciamento de genes em várias espécies e sistemas experimentais; por exemplo, caenorhabditis elegans, plantas, embriões de insetos e células em cultura de tecidos. Vide, por exemplo, Fire et al. (1998) Nature 391:806-11; Martinez et al. (2002) Cell 110:563-74; McManus and Sharp (2002) Nature Rev. Genetics 3:737-47.
[00012] O iRNA realiza a degradação do mRNA através de uma via endógena incluindo o complexo de proteína DICER. DICER cliva longas moléculas de dsRNA em fragmentos curtos de aproximadamente 20 nucleotídeos, denominado RNA interferente pequeno (siRNA). O siRNA é desenrolado em dois RNAs de único filamento: o filamento passageiro e o filamento guia. O filamento passageiro é degradado e o filamento guia é incorporado no complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC). Os microácidos ribonucleicos (miRNAs) são moléculas estruturalmente muito semelhantes que são clivadas a partir de moléculas precursoras contendo uma alça de polinucleotídico que liga os filamentos guia e passageiro hibridizados e podem ser incorporados de forma
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6/164 semelhante no RISC. O silenciamento de genes pós-transcricional ocorre quando o filamento guia se liga especificamente a uma molécula complementar de mRNA e induz clivagem por Argonaute, o componente catalítico do complexo RISC. Este processo é conhecido por disseminar-se sistematicamente em todo o organismo apesar das concentrações inicialmente limitadas de siRNA e/ou miRNA em alguns eucariotos tais como plantas, nemátodos e alguns insetos.
[00013] A Patente U.S. 7 612 194 e as Publicações de Patente U.S. Nos. 2007/0050860, 2010/0192265 e 2011/0154545 descrevem uma biblioteca de 9112 sequências de marcador de sequência expressa (EST) de pupas D. v. Virgifera LeConte. É sugerido na Patente US 7 612 194 e na Publicação da Patente US N° 2007/0050860 a ligar operativamente a um promotor, uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma de várias sequências parciais particulares de H+ATPase do tipo D. v. virgifera (V-ATPase) aqui descrita para a expressão de RNA antissenso em células vegetais. A Publicação de Patente US N° 2010/0192265 sugere ligar operacionalmente um promotor a uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma sequência parcial particular de um gene D. v. Virgifera de função desconhecida e não descrita (a sequência parcial é declarada sendo 58% idêntica ao produto do gene C56C10.3 em C. elegans) para a expressão de RNA antissenso em células vegetais. A Publicação de Patente U.S. N° 2011/0154545 sugere ligar operacionalmente um promotor a uma molécula de ácido nucleico que é complementar a duas sequências parciais particulares de genes de subunidade beta de coatômero de D. v. Virgifera para a expressão de RNA antissenso em células vegetais. Além disso, a Patente US 7 943 819 divulga uma biblioteca de 906 sequências de marcador de sequência expressa (EST) isoladas de larvas de D. v. Virgifera LeConte, pupas e intestino médio dissecados, e sugere ligar operacionalmente um promotor a
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7/164 uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma determinada sequência parcial particular de um gene 4b de proteína de corpo multivesicular carregado com D. v. Virgifera para a expressão de RNA de duplo filamento em células vegetais.
[00014] Nenhuma outra sugestão é proporcionada na Patente US 7 612 194 e nas Publicações de Patente US Nos 2007/0050860, 2010/0192265 e 2011/0154545 para usar qualquer sequência particular das mais de nove mil sequências listadas nelas para interferência de RNA, diferentes dos várias sequências parciais particulares de V-ATPase e as sequências parciais particulares de genes de função desconhecida. Além disso, nenhuma das Patentes U.S. 7 612 194 e das Publicações de Patente U.S. Nos 2007/0050860, 2010/0192265 e 2011/0154545 proporciona qualquer orientação quanto a qual outra das mais de nove mil sequências proporcionadas seria letal, ou mesmo útil de outra forma, em espécies de crisomelídeo do milho quando usado como dsRNA ou siRNA. A Patente U.S. 7 943 819 não proporciona qualquer sugestão de utilização de qualquer sequência particular das mais de nove cem sequências nela listadas para interferência de RNA, com exceção da sequência parcial particular de um gene de proteína 4b de corpo multiesicular carregado. Além disso, a Patente U.S. 7 943 819 não proporciona qualquer orientação quanto a qual outra das mais de nove cem sequências proporcionadas seria letal, ou mesmo de outro modo útil, em espécies de crisomelídeo do milho quando utilizadas como dsRNA ou siRNA. A Publicação do Pedido de Patente U.S. N° U.S. 2013/040173 e a Publicação de Pedido PCT N° WO 2013/169923 descrevem a utilização de uma sequência derivada de um gene Diabrotica virgifera Snf7 para interferência de RNA em milho.
[00015] A esmagadora maioria das sequências complementares aos DNAs da crisomelídeo do milho (tais como as precedentes) não
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8/164 proporciona um efeito protetor das plantas de espécies de crisomelídeos do milho quando utilizadas como dsRNA ou siRNA. Por exemplo, Baum et al. (2007) Nature Biotechnology 25:1322-1326, descreve os efeitos da inibição de vários genes WCR alvos por iRNA. Estes autores relataram que 8 dos 26 genes-alvo que testaram não foram capazes de proporcionar mortalidade de praga de coleópteros experimentalmente significativas a uma concentração de iRNA (por exemplo, dsRNA) muito elevada de mais de 520 ng/cm2.
[00016] Os autores da Patente US 7 612 194 e A publicação de Patente U.S. N° 2007/0050860 fizeram o primeiro relatório de iRNA in planta em plantas de milho dirigidas ao crisomelídeo do milho ocidental. Baum et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25 (11): 1322-6. Estes autores descrevem um sistema de iRNA alimentar in vivo de alto rendimento para pesquisar genes-alvo potenciais para o desenvolvimento de milho iRNA transgênico. De um grupo genético inicial de 290 alvos, apenas 14 exibiram potencial de controle larval. Um dos RNAs de duplo filamento mais eficazes (dsRNA) alvejou um gene que codifica a subunidade A de ATPase vacuolar (V-ATPase), resultando em uma supressão rápida do mRNA endógeno correspondente e desencadeando uma resposta de iRNA específica com baixas concentrações de dsRNA. Dessa forma, esses autores documentaram pela primeira vez o potencial de iRNA in planta como uma possível ferramenta de manejo de pragas, ao mesmo tempo que demonstraram que alvos efetivos não podiam ser identificados com precisão a priori, mesmo a partir de um conjunto relativamente pequeno de genes candidatos.
DESCRIÇÃO [00017] A presente invenção refere-se a moléculas de ácido nucleico (por exemplo, genes-alvo, DNAs, dsRNAs, siRNAs, miRNAs, shRNAs e hpRNAs) e métodos de utilização dos mesmos, para o
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9/164 controle de pragas de insetos, incluindo, por exemplo, pragas coleópteras, tais como D. v. virgifera LeConte (crisomelídeo do milho do oeste, WCR); D. barberi Smith and Lawrence (crisomelídeo do milho do norte, NCR); D. u. howardi Barber (crisomelídeo do milho do sul, SCR); D. v. zeae Krysan e Smith (crisomelídeo do milho mexicano, MCR); D. balteata LeConte; D. u. tenella; D. u. undecimpunctata Mannerheim; e D. speciosa Germar, e pragas hemípteras, tais como Euschistus heros (Fabr.) (Neotropical Brown Stink Bug, BSB); e. servus (Say) (Brown Stink Bug); Nezara viridula (L.) (Percevejo Fétido verde do sul); piezodorus guildinii (Westwood) (Percevejo Fétido de listras vermelhas); Halyomorpha halys (Stál) (Percevejo Fétido de tonalidade marrom); Chinavia hilare (Say) (Percevejo Fétido verde); C. marginatum (Palisot de Beauvois); Dichelops melacanthus (Dallas); D. furcatus (F.); edessa meditabunda (F.); thyanta perditor (F.) (Percevejo Fétido de costas vermelhao neotrópico); Horcias nobilellus (Berg) (percevejo do algodão); taedia stigmosa (Berg); Dysdercus peruvianus (Guérin-Méneville); Neomegalotomus parvus (Westwood); Leptoglossus zonatus (Dallas); Niesthrea sidae (F.); Lygus hesperus (Knight) (percevejo de planta manchado do oeste); e L. lineolaris (Palisot de Beauvois). Em exemplos particulares, são descritadescritas moléculas de ácido nucleico exemplares que podem ser homólogas a pelo menos uma porção de um ou mais ácidos nucleicos nativos em uma praga de insetos.
[00018] Nestes e outros exemplos, a sequência de ácido nucleico nativa pode ser um gene-alvo, cujo produto pode ser, por exemplo, e sem limitação: envolvido em um processo metabólico ou envolvido no desenvolvimento de larvas / ninfas. Em alguns exemplos, a inibição pós-transcricional da expressão de um gene-alvo por uma molécula de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo homólogo à mesma
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10/164 pode ser letal para uma praga de inseto ou resultar em um crescimento e/ou viabilidade reduzidos de uma praga de inseto. Em exemplos específicos, o gene da subunidade rpb7 II do complexo de RNA polimerase (referido aqui como rpb7) ou um homólogo ou ortólogo de rpb7 pode ser selecionado como um gene-alvo para o silenciamento pós-transcricional. Em exemplos particulares, um genealvo útil para a inibição pós-transcricional é um gene rpb7 selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 78. Uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo o polinucleotídeo de SEQ ID NO: 1; o complemento e/ou complemento inverso de SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; o complemento e/ou complemento inverso de SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; o complemento e/ou complemento inverso de SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 78; o complemento e/ou complemento inverso de SEQ ID NO: 78; e/ou fragmentos compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer um dos precedentes (por exemplo, SEQ ID NO: 7-10 e SEQ ID NO: 80) é portanto aqui descrita.
[00019] Também são descritas moléculas de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que é pelo menos cerca de 85% idêntico a uma sequência de aminoácidos dentro de um produto de gene-alvo (por exemplo, o produto de um gene rpb7). Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico pode compreender um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que é pelo menos 85% idêntico à SEQ ID NO: 2 (D. virgifera rpb7-1), SEQ ID NO: 4 (D. virgifera rpb7-2), SEQ ID NO: 6 (D. virgifera rpb7-3), SEQ ID NO: 79 (E. heros rpb7-1); e/ou uma sequência de aminoácidos dentro de um produto de um gene rpb7. São ainda descritas moléculas de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo que é o complemento ou complemento inverso de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo pelo menos 85% idêntico a uma sequência de
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11/164 aminoácidos dentro de um produto de gene-alvo.
[00020] Estão também descritos os polinucleotídeos de cDNA que podem ser utilizados para a produção de moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA e hpRNA) que são complementares a todo ou parte de um gene-alvo de praga de inseto, por exemplo, um gene rpb7. Em modalidades particulares, podem ser produzidos in vitro ou in vivo dsRNAs, siRNAs, shRNAs, miRNAs e/ou hpRNAs por um organismo geneticamente modificado, tal como uma planta ou uma bactéria. Em exemplos particulares, são descritas moléculas de cDNA que podem ser utilizadas para produzir moléculas de iRNA que são complementares a todo ou parte de um gene rpb7 (por exemplo, SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; e SEQ ID NO: 78).
[00021] São ainda descritos meios de rpb7 para inibição da expressão de um gene essencial em uma praga de coleópteros, e meios de rpb7 para proporcionar proteção contra pragas de coleópteros a uma planta. Um meio de rpb7 para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga de coleópteros inclui uma molécula de RNA de único filamento consistindo em um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 89-92; e complementos e complementos inversos dos mesmos. Os equivalentes funcionais de rpb7 para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga de coleópteros incluem moléculas de RNA de único ou duplo filamento que são substancialmente homólogas a todo ou parte de um RNA transcrito a partir de um gene de rpb7 coleóptero compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO: 7 -10. Um meio de rpb7 para proporcionar proteção contra pragas de coleópteros a uma planta inclui uma molécula de DNA compreendendo um polinucleotídeo que codifica um rpb7 para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga de coleópteros operativamente ligada a
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12/164 um promotor, em que a molécula de DNA é capaz de ser integrada no genoma de uma planta.
[00022] Também são descritos meios de rpb7 para inibição da expressão de um gene essencial em uma praga de hemíptero e meios de rpb7 para proporcionar proteção de pragas de hemípteros a uma planta. Um meio de rpb7 para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga de hemíptero inclui uma molécula de RNA de único filamento consistindo em um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 80 e os complementos e complementos inversos dos mesmos. Os equivalentes funcionais de rpb7 para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga de hemíptero incluem moléculas de RNA de único ou duplo filamento que são substancialmente homólogos a todo ou parte de um RNA transcrito a partir de um gene rpb7 de hemíptero compreendendo a SEQ ID NO: 78. Um meio de rpb7 para proporcionar proteção contra pragas de hemípteros a uma planta inclui uma molécula de DNA que compreende um polinucleotídeo que codifica um meio de rpb7 para inibir a expressão de um gene essencial em uma praga de hemíptero ligada operativamente a um promotor, em que a molécula de DNA é capaz de ser integrada no genoma de uma planta.
[00023] Adicionalmente descritos aqui são métodos para controlar uma população de uma praga de inseto (por exemplo, um coleóptero ou uma praga de hemíptero), compreendendo proporcionar a uma praga de inseto (por exemplo, um coleóptero ou uma praga de hemíptero) um iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA e hpRNA) que funciona ao ser absorvido pela praga para inibir uma função biológica dentro da praga.
[00024] Em algumas modalidades, um método para controlar uma população de uma praga de coleópteros compreende proporcionar à praga de coleópteros uma molécula de iRNA que compreende todos
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13/164 ou um fragmento compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo consistindo em: SEQ ID NO: 86; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 86; SEQ ID NO: 87; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 87; SEQ ID NO: 88; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 89; SEQ ID NO: 90; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 90; SEQ ID NO: 91; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 91; SEQ ID NO: 92; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 92; um polinucleotídeo que hibrida com um polinucleotídeo rpb7 nativo de uma praga de coleópteros (por exemplo, WCR) compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO: 1, 3, 5 e 7-10; o complemento ou complemento inverso de um polinucleotídeo que hibrida com um polinucleotídeo rpb7 nativo de uma praga de coleópteros compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO: 1, 3, 5 e 7-10; um polinucleotídeo que hibrida com um fragmento compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO: 1, 3, 5 e 7-10; e o complemento ou complemento inverso de um polinucleotídeo que hibrida com um fragmento que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO: 1,3, 5 e 7-10.
[00025] Em algumas modalidades, um método para controlar uma população de uma praga de hemíptero compreende proporcionar à praga de hemíptero uma molécula de iRNA que compreende todo ou um fragmento compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em:
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SEQ ID NO: 93; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 93; SEQ ID NO: 94; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 94; um polinucleotídeo que hibrida com um polinucleotídeo rpb7 nativo de uma praga de hemíptero (por exemplo, BSB) compreendendo SEQ ID NO: 78 e/ou SEQ ID NO: 80; o complemento ou complemento inverso de um polinucleotídeo que hibrida com um polinucleotídeo rpb7 nativo de uma praga de hemíptero compreendendo SEQ ID NO: 78 e/ou SEQ ID NO: 80; um polinucleotídeo que hibrida com um fragmento compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo hemíptero (por exemplo, BSB) que compreende SEQ ID NO: 78 e/ou SEQ ID NO: 80; e o complemento ou complemento reverso de um polinucleotídeo que hibrida com um fragmento compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo hemíptero compreendendo SEQ ID NO: 78 e/ou SEQ ID NO: 80.
[00026] Em modalidades particulares, um iRNA que funciona quando é absorvida por uma praga de inseto para inibir uma função biológica dentro da praga é transcrita a partir de um DNA compreendendo a totalidade ou parte de um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 78; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 78; SEQ ID
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NO: 80; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 80; um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5 e 7-10; o complemento ou complemento inverso de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO: 1, 3, 5 e 7-10; um fragmento compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO: 1, 3, 5 e 7-10; o complemento ou complemento inverso de um fragmento compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO: 1, 3, 5 e 7-10; um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo hemíptero (por exemplo, BSB) compreendendo SEQ ID NO: 78 e/ou SEQ ID NO: 80; o complemento ou complemento inverso de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo de hemíptero compreendendo SEQ ID NO: 78 e/ou SEQ ID NO: 80; um fragmento compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo hemíptero (por exemplo, BSB) compreendendo SEQ ID NO: 78 e/ou SEQ ID NO: 80; e um fragmento que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos do complemento ou complemento inverso de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo hemíptero compreendendo SEQ ID NO: 78 e/ou SEQ ID NO: 80.
[00027] Também aqui descritos são métodos em que dsRNAs, siRNAs, shRNAs, miRNAs e/ou hpRNAs podem ser fornecidos a uma praga de inseto em um ensaio à base de dieta, ou em células de plantas geneticamente modificadas que expressam os dsRNA, siRNAs, shRNAs, miRNAs e/ou hpRNAs. Nestes e outros exemplos,
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16/164 os dsRNA, siRNAs, shRNAs, miRNAs e/ou hpRNAs podem ser ingeridos pela praga. A ingestão de dsRNAs, siRNA, shRNAs, miRNAs e/ou hpRNAs da invenção pode então resultar em iRNA na praga, que por sua vez pode resultar no silenciamento de um gene essencial para a viabilidade da praga e levando em última análise à mortalidade. Deste modo, são descritos métodos em que moléculas de ácido nucleico compreendendo polinucleotídeos exemplares úteis para o controle de pragas de insetos são fornecidas a uma praga de insetos. Em exemplos particulares, uma praga de coleópteros e/ou hemípteros controlada por utilização de moléculas de ácido nucleico da invenção pode ser WCR, NCR, SCR, MCR, BSB, D. balteata, D. u. tenella, D. speciosa, D. u. undecimpunctata, E. servus, Piezodorus guildinii, Halyomorpha halys, Nezara viridula, chinavia hilare, c. marginatum, Dichelops melacanthus, D. furcatus, Edessa meditabunda, Thyanta perditor, Horcias nobilellus, Taedia stigmosa, Dysdercus peruvianus, Neomegalotomus parvus, Leptoglossus zonatus, Niesthrea sidae, Lygus hesperus, e/ou Lygus lineolaris.
[00028] As anteriores e outras características tornar-se-ão mais evidentes a partir da descrição detalhada seguinte de várias modalidades, que prossegue com referência às figuras anexas 1-2. BREVE DESCRIÇÃO DO DESENHO.
[00029] FIGURA 1 inclui uma representação de uma estratégia utilizada para gerar dsRNA a partir de um modelo de transcrição única com um único par de iniciadores.
[00030] FIGURA 2 inclui uma descrição de uma estratégia utilizada para gerar dsRNA a partir de duas sequências de ácido nucleico de modelo de transcrição.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIA [00031] As sequências de ácido nucleico listadas na sequência de acompanhamento são mostradas usando abreviaturas em letras
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17/164 padrão para bases de nucleotídeo, tal como definido em 37 C.F.R. § 1.822. As sequências de ácido nucleico e de aminoácidos listadas definem moléculas (isto é, polinucleotídeos e polipeptídeos, respectivamente) possuindo os monômeros de nucleotídeos e aminoácidos dispostos da maneira descrita. As sequências de ácido nucleico e de aminoácidos listadas também definem um gênero de polinucleotídeos ou polipeptídeos que compreendem os monômeros de nucleotídeos e aminoácidos dispostos da maneira descrita. Em vista da redundância do código genético, deverá entender-se que uma sequência de nucleotídeos, incluindo uma sequência de codificação também descreve o gênero de polinucleotídeos que codificam o mesmo polipeptídeo como um polinucleotídeo que consiste na sequência de referência. Será ainda entendido que uma sequência de aminoácidos descreve o gênero de ORF polinucleotídicos que codificam esse polipeptídeo.
[00032] Apenas uma vertente de cada sequência de ácido nucleico é mostrada, mas o filamento complementar é entendido como incluído por qualquer referência a filamento apresentada. Como o complemento e complemento inverso de uma sequência de ácido nucleico primária são necessariamente descritos pela sequência primária, a sequência complementar e sequência complementar de uma sequência de ácido nucleico reversa são incluídas por qualquer referência à sequência de ácido nucleico, a menos que seja explicitamente indicado como sendo contrário (ou é claro como sendo diferente do contexto em que a sequência aparece). Além disso, tal como é entendido na técnica que a sequência de nucleotídeos de um filamento de RNA é determinada pela sequência do DNA a partir do qual foi transcrito (mas para a substituição de nucleobases de uracila (U) para a timina (T)), um RNA é incluído por qualquer referência à sequência de DNA que a codifica. Na listagem de sequências em
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18/164 anexo:
[00033] SEQ ID NO: 1 mostra uma sequência contígua contendo um DNA rpb7 WCR exemplar, aqui referido em alguns lugares como WCR rpb7 ou WCR rpb7-1:
CTCGACCTGTAGATTCTTGTCTATTTTGCCACCGATTTTGCTGTGG
TGACGATGGCAATATGTCAAACACTAGCAAATACAAAAAAGAAGAC
GAAATATAATCCTAACCTTAACACCGGAAAATAACGTTTGTTTATAA
TTTATCAATAGACAAATTAAAATAATGTTTTACCACATATCTCTAGA
ACACGAAATCCTACTACATCCACAATATTTCGGACCACAACTGTTA
GAAAAAGTCAAAACTAAACTGTATACCGAAGTTGAAGGAACTTGCA
CAGGAAAGTATGGATTTGTGATTGCAGTAACCACTATAGATAGCAT
AGGTGCCGGTTTGATACTACCCGGACAAGGCTTTGTAGTCTACCC
GGTGAAATATAAAGCCATTGTGTTCCGTCCATTCAAAGGTGAAGTC
CTGGATGCGGTGGTTCGACAAGTCAACAAAGTTGGCATGTTCGCC
GAAATAGGTCCTTTATCTTGTTTCATTTCTCATCATTCCATACCCGC
AGAAATGGAGTTTTGTCCTAACGTTAATCCCCAATGCTATAAGACT
AAAGACGAAGATGTTGTGATACGAGCAGAAGGAGAAATCAGATTG
AAAATAGTGGGTACGAGAGTAGACGCCTCAGGGATATTTGCCATT
GGAACCTTAATGGATGATTATCTGGGATTAATAAGTAATTAAGTTG
AATATTTTTAAAATGTATTTATAAGTCTATAATTTTTAATATACAAAA
ATCAAACATTAACAAAAAAAAA [00034] SEQ ID NO: 2 mostra a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo rpb7 codificado por um DNA rpb7 WCR exemplar, aqui referido em alguns lugares como WCR rpb7 ou WCR rpb7-1:
MFYHISLEHEILLHPQYFGPQLLEKVKTKLYTEVEGTCTGKYGFVIAVT
TIDSIGAGLILPGQGFVVYPVKYKAIVFRPFKGEVLDAVVRQVNKVGM
FAEIGPLSCFISHHSIPAEMEFCPNVNPQCYKTKDEDVVIRAEGEIRLK
IVGTRVDASGIFAIGTLMDDYLGLISN [00035] SEQ ID NO: 3 mostra uma sequência contígua compreendendo um DNA rpb7 WCR exemplar, aqui referido em
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19/164 alguns lugares como WCR rpb7-2:
AAAACATAAATCCCTTAACCTATTTGTTCGCGAAGACAATAACTCC
TCTAAATTTCCAATCACAAAATGTTCTACCACATTTCCCTCGAACAT
GAAATATTGCTGCATCCCAAGTATTTCGGGCCCCAACTGATGGAA
ACAGTGAAACAGAAACTGTACACAGAAGTTGAAGGCACATGCACC
GGAAAGTATGGATTCGTCATAGCAGTAACAACAATCGATCAGATC
GGCTCTGGTATAATACAGCCGGGACAAGGATTCGTTGTGTATCCC
GTCAAATATAAGGCAATCGTTTTCCGACCATTCAAGGGCGAAGTG
TTGGACGCTGTCGTGACACAAGTGAATAAAGTGGGAATGTTCGCA
GAAATCGGTCCATTGTCGTGCTTCATATCGCATCATTCCATACCAG
CTGACATGCAGTTCTGTCCGAATGGAAATCCGCCCTGTTACAAAT
CGAAAGAAGAGGAAGTGGTCATCGCCCCAGAAGATAAAATCCGC
CTGAAGATTGTGGGTACAAGAGTTGATGCCACTGGAATCTTCGCT
ATCGGGACTCTTATGGACGATTATTTGGGCTTAG [00036] SEQ ID NO: 4 mostra a sequência de aminoácidos de um outro polipeptídeo WCR rpb7 codificado por um DNA WCR rpb7 exemplar (isto é, rpb7-2):
FYHISLEHEILLHPKYFGPQLMETVKQKLYTEVEGTCTGKYGFVIAVTT
IDQIGSGIIQPGQGFVVYPVKYKAIVFRPFKGEVLDAVVTQVNKVGMF
AEIGPLSCFISHHSIPADMQFCPNGNPPCYKSKEEEVVIAPEDKIRLKI
VGTRVDATGIFAIGTLMDDYLGL [00037] SEQ ID NO: 5 mostra uma sequência contígua compreendendo um DNA rpb7 WCR, aqui referido em alguns lugares como WCR rpb7-3:
GCTCGAGCGATCGTCGTCGCTGTAGCTACTGCTGTCGTCGCCAT
GTTCTTCCTCAAGCAGCTCTCGCGCGACCTGCTGCTCCATCCGAT
GCACTTTGGCCCGAAGCTCCACGACATCATCCGCTTGCGTTTGAT
CGAAGAGGTCGAGGGCACGTCCATGGGCAAGTACGGGTATGTTA
TCACCGTCACGGAAGTGCGCGACGAAGACATTGGCAAGGGCGTG
ATCCAGGACAACTCGGGCTTTGTGTGTTTCAACATCCGGTACCGC
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GCGATCCTCTTCCGTCCGTTCAAGAACCAGGTGCTCGACGCAGTC
GTGACAGTCGTGAACCAGCTCGGGTTCTTCGCCGACGTCGGACC
GCTCCAGGTCTTTGTCTCGCGCCACGCGATGCCGACGGACCTGA
ACAACGGCTACGACCACGAGAACAACGCGTGGATCTCTGATGAC
CGCGAAGTCGAGATCCGCAAAGGCTGCGGCGTGCGGCTCAAGAT
CATGGGCGTGAGCGTCGACGTCACGGAGATTAATGCGATTGGGA
CGATCAAGGACGACTACTTGGGGCTCATCTCGTCCGAGAACTTCT
AGTGCACGCGGCAAACAACAGCAGCGCCACTGGCAGCAAGAGCG
ACCGACATACGTTGCCCGAGTTGCGACTGTGCACTGACGCGCAA
CGTT [00038] SEQ ID NO: 6 mostra a sequência de aminoácidos de um outro polipeptídeo WCR rpb7 codificado por um DNA rpb7 WCR (isto é, rpb7-3):
FFLKQLSRDLLLHPMHFGPKLHDIIRLRLIEEVEGTSMGKYGYVITVTE
VRDEDIGKGVIQDNSGFVCFNIRYRAILFRPFKNQVLDAVVTVVNQLG
FFADVGPLQVFVSRHAMPTDLNNGYDHENNAWISDDREVEIRKGCG
VRLKIMGVSVDVTEINAIGTIKDDYLGLISSENF [00039] SEQ ID NO: 7 mostra um DNA rpb7 WCR exemplar, referido aqui em alguns lugares como WCR rpb7-1 Reg1 (região 1), que é utilizado em alguns exemplos para a produção de um dsRNA:
[00040] CCACAACTGTTAGAAAAAGTCAAAACTAAACTGTATACC
GAAGTTGAAGGAACTTGCACAGGAAAGTATGGATTTGTGATTGCA
GTAACCACTATAGATAGCATAGGTGCCGGTTTGATACTACCCGGA
CAAGGCTTTGTAGTCTACCCGGTGAAATATAAAGCCATTGTGTTCC
GTCCATTCAAAGGTGAAGTCCTGGATGCGGTGGTTCGACAAGTCA
ACAAAGTTGGCATGTTCGCCGAAATAGGTCCTTTATCTTGTTTCAT
TTCTCATCATTCCATACCCGCAGAAATGGAGTTTTGTCCTAACGTT
AATCCCCAATGCTATAAGACTAAAGACGAAGATGTTGTGATACGA
GCAGAAGGAGAAATCAGATTGAAAATAGTGGGT [00041] SEQ ID NO: 8 mostra um DNA rpb7 WCR exemplar, aqui
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21/164 referido em alguns lugares como WCR rpb7-2 Regí (região 1), que é utilizado em alguns exemplos para a produção de um dsRNA:
CCCTCGAACATGAAATATTGCTGCATCCCAAGTATTTCGGGCCCC
AACTGATGGAAACAGTGAAACAGAAACTGTACACAGAAGTTGAAG
GCACATGCACCGGAAAGTATGGATTCGTCATAGCAGTAACAACAA
TCGATCAGATCGGCTCTGGTATAATACAGCCGGGACAAGGATTCG
TTGTGTATCCCGTCAAATATAAGGCAATCGTTTTCCGACCATTCAA
GGGCGAAGTGTTGGACGCTGTCGTGACACAAGTGAATAAAGTGG
GAATGTTCGCAGAAATCGGTCCATTGTCGTGCTTCATATCGCATCA
TTCCATACCAGCTGACATGCAGTTCTGTCCGAATGGAAATCCGCC
CTGTTACAAATCGAAAGAAGAGGAAGTGGTCATCGCC [00042] SEQ ID NO: 9 mostra um DNA rpb7 WCR exemplar, aqui referido em alguns lugares como WCR rpb7-3 Regí (região 1), que é utilizado em alguns exemplos para a produção de um dsRNA:
ACGTCGACGCTCACGCCCATGATCTTGAGCCGCACGCCGCAGCC
TTTGCGGATCTCGACTTCGCGGTCATCAGAGATCCACGCGTTGTT
CTCGTGGTCGTAGCCGTTGTTCAGGTCCGTCGGCATCGCGTGGC
GCGAGACAAAGACCTGGAGCGGTCCGACGTCGGCGAAGAACCC
GAGCTGGTTCACGACTGTCACGACTGCGTCGAGCACCTGGTTCTT
GAACGGACGGAAGAGGATCGCGCGGTACCGGATGTTGAAACACA
CAAAGCCCGAGTTGTCCTGGATCACGCCCTTGCCAATGTCTTCGT
CGCGCACTTCCGTGACGGTGATAACATACCCGTACTTGCCCATGG
ACGTGCCCTCGACCTCTTCGATCAAACGCAAGCGGATGAT [00043] SEQ ID NO: 10 mostra um DNA rpb7 WCR exemplar, aqui referido em alguns lugares como WCR rpb7-1 V1 (versão 1), que é usado em alguns exemplos para a produção de um dsRNA:
AAAGCCATTGTGTTCCGTCCATTCAAAGGTGAAGTCCTGGATGCG
GTGGTTCGACAAGTCAACAAAGTTGGCATGTTCGCCGAAATAGGT
CCTTTATCTTGTTTCATTTCTCATCATTCCATACCCGCAGAAATGGA
GTTTTGTCCTAACGTTAATCCCCAATGCTATAAGACTAAAGACGAA
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GATGTTGTGATACGAGCAGAAGGAGAAATCAGATTGA [00044] SEQ ID NO: 11 mostra a sequência de nucleotídeos do promotor do fago T7.
[00045] SEQ ID NO: 12 mostra um fragmento de uma região de codificação YFP exemplar.
[00046] SEQ ID NOs: 13-20 mostram os iniciadores utilizados para amplificar porções de sequências rpb7 WCR exemplares compreendendo rpb7-1 reg1, rpb7-2 reg1, rpb7-3 reg1 e rpb7-1 v1, utilizadas em alguns exemplos para a produção de dsRNA.
[00047] SEQ ID NO: 21 mostra um gene YFP exemplar.
[00048] SEQ ID NO: 22 mostra uma sequência de DNA da região 1 de anexina.
[00049] SEQ ID NO: 23 mostra uma sequência de DNA da região 2 anexina.
[00050] SEQ ID NO: 24 mostra uma sequência de DNA da região 1 de beta espectrina 2.
[00051] SEQ ID NO: 25 mostra uma sequência de DNA da região 2 de beta espectrina 2 [00052] SEQ ID NO: 26 mostra uma sequência de DNA da região 1 de mtRP-L4.
[00053] SEQ ID NO: 27 mostra uma sequência de DNA da região 2 de mtRP-L4.
[00054] SEQ ID NOs: 28-55 mostram iniciadores utilizados para amplificar as regiões de gene de anexina, beta espectrina 2, mtRP-L4 e YFP para a síntese de dsRNA.
[00055] SEQ ID NO: 56 mostra uma sequência de DNA de milho que codifica uma proteína do tipo TIP41.
[00056] SEQ ID NO: 57 mostra a sequência nucleotídica de um oligonucleotídeo iniciador T20VN.
[00057] SEQ ID NOs: 58-62 mostram iniciadores e sondas
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23/164 utilizados para análises de expressão de transcrição de dsRNA em milho.
[00058] SEQ ID NO: 63 mostra uma sequência de nucleotídeos de uma porção de uma região de codificação SpecR utilizada para detecção de estrutura principal de vetor binário.
[00059] SEQ ID NO: 64 mostra uma sequência de nucleotídeos de uma região codificadora de AAD1 utilizada para a análise do número de cópias genômicas.
[00060] SEQ ID NO: 65 mostra uma sequência de DNA de um gene invertase de milho.
[00061] SEQ ID NO: 66-74 mostram sequências de nucleotídeo de oligonucleotídeo de DNA para determinações número de cópia de gene e detecção de estrutura principal de vetor binário.
[00062] SEQ ID NO: 75-77 mostram iniciadores e sondas utilizadas para análises de expressão de transcrições de milho.
[00063] A SEQ ID NO: 78 mostra um DNA rpb7 de Percevejo Fétido Marrom Neotropical exemplar (Euschistus heros), aqui referido em alguns lugares como BSB rpb7-1:
ACAAGATTTGAAAATGTTTTACCATATTTCTCTTGAACATGATATAT
TACTACATCCGAGATATTTTGGACCTCAATTACATGAAACAGTTAA
ACAAAAATTGTACACTGAAGTTGAAGGGACCTGTACTGGCAAGTA
TGGATTTGTTATTGCAGTCACTAATATTGATAACATTGGAGCTGGT
GTTATACAGCCAGGACAAGGATTTGTGGTTTATCCAGTGAAATATA
AAGCCATTGTTTTTAGACCTTTTAAGGGAGAAGTTGTTGATGCTAT
TGTTACTCAAGTTAATAAGGTTGGAATGTTTGCAGAAATTGGACCA
TTGTCTTGTTTTATATCCCATCACTCGATACCTGCTGATATGGAATT
CTGCCCCAATGAAACTCCACCTTGTTACCGTTCTAAAGATGAGGAT
GTTGTAATAACAGCAGAAGATGTAATAAGGTGTAAAATAGTTGGGA
CTAGAGTTGATGCATCCGGTATTTTTGCTATTGGTACTCTTATGGA
TGATTATTTAGGTTTGATTGGAAGTTAAAATTTTTTACTTGAAGACA
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GTCTACATGCAGGAGGAATTAGAAGAAAATAATAAACATTCTGTTT
AGACTGTATGATTTAGAAAATGTGAAAAATATGCTGGACTATTTATT
ATTACACTGTTGTAATTTTTGGAACCAATAAAAGTATTTTACAAAAA
AAA [00064] SEQ ID NO: 79 mostra a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo rpb7 BSB codificado por um DNA rpb7 BSB exemplar (isto é, BSB rpb7-1):
MFYHISLEHDILLHPRYFGPQLHETVKQKLYTEVEGTCTGKYGFVIAV
TNIDNIGAGVIQPGQGFVVYPVKYKAIVFRPFKGEVVDAIVTQVNKVG
MFAEIGPLSCFISHHSIPADMEFCPNETPPCYRSKDEDVVITAEDVIRC
KIVGTRVDASGIFAIGTLMDDYLGLIGS [00065] SEQ ID NO: 80 mostra um DNA rpb7 BSB exemplar, aqui referido em alguns lugares como BSB_rpb7-1 reg1 (região 1), que é utilizado em alguns exemplos para a produção de um dsRNA:
GTTAAACAAAAATTGTACACTGAAGTTGAAGGGACCTGTACTGGC
AAGTATGGATTTGTTATTGCAGTCACTAATATTGATAACATTGGAG
CTGGTGTTATACAGCCAGGACAAGGATTTGTGGTTTATCCAGTGA
AATATAAAGCCATTGTTTTTAGACCTTTTAAGGGAGAAGTTGTTGA
TGCTATTGTTACTCAAGTTAATAAGGTTGGAATGTTTGCAGAAATT
GGACCATTGTCTTGTTTTATATCCCATCACTCGATACCTGCTGATA
TGGAATTCTGCCCCAATGAAACTCCACCTTGTTACCGTTCTAAAGA
TGAGG [00066] SEQ ID NOs: 81-82 mostram os iniciadores utilizados para amplificar porções de sequências BSB rpb7 exemplares compreendendo BSB_rpb7-1 reg1 utilizadas em alguns exemplos para produção de dsRNA.
[00067] SEQ ID NO: 83 mostra um DNA YFP v2 exemplar, que é utilizado em alguns exemplos para a produção do filamento de senso de um dsRNA.
[00068] SEQ ID NOs: 84-85 mostram os iniciadores utilizados para
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25/164 a amplificação por PCR da sequência de YFP, YFP v2, utilizados em alguns exemplos para a produção de dsRNA.
[00069] SEQ ID NOs: 86-94 mostram RNAs exemplares transcritos a partir de ácidos nucleicos compreendendo polinucleotídeos rpb7 exemplares e fragmentos dos mesmos.
[00070] SEQ ID NO: 95 mostra uma sonda IDT Custom Oligo rpb7 PRB Set1, marcada com FAM e duplamente arrefecida com arrefecedores Zen e Iowa Black.
[00071] SEQ ID NO: 96 mostra um polinucleotídeo ligante exemplar, que forma uma alça quando transcrito em uma transcrição de RNA para formar uma estrutura de grampo.
DESCRIÇÃO DETALHADA
I. Visão geral de várias modalidades [00072] Desenvolveu-se a interferência de RNA (iRNA) como uma ferramenta para o manejo de pragas de insetos, usando uma das espécies de pragas-alvo mais prováveis para plantas transgênicas que expressam dsRNA; o crisomelídeo do milho ocidental. Até agora, a maioria dos genes propostos como alvos para iRNA em larvas de crisomelídeos não realmente alcançam seu propósito. Descrevemos a destruição mediada por iRNA de rpb7 nas pragas exemplares de insetos, o crisomelídeo do milho ocidental e o percevejo fétido marrom neotropical, que é mostrado ter um fenótipo letal quando, por exemplo, as moléculas de iRNA são administradas através de dsRNA rpb7 ingerido ou injetado. Em modalidades aqui, a capacidade de entregar dsRNA rpb7 por alimentação a insetos confere um efeito iRNA que é muito útil para o controle de pragas de insetos (por exemplo, coleópteros e hemípteros). Combinar iRNA mediado por rpb7 com outros alvos de iRNA úteis (por exemplo e sem limitação, alvos de ROP RNAi, como descrito em Pedido de Patente U.S. N° 14/577,811, alvos de RNA polimerase I1 RNAi, como descrito em Pedido de
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Patente U.S. N° 62/133,214, alvos de RNA polimerase II140 RNAi, como descrito em Pedido de Patente U.S. N° 14/577,854, alvos de RNA polimerase II215 RNAi, como descrito em Pedido de Patente U.S. N° 62/133,202, alvos de RNA polimerase II33 RNAi, como descrito em Pedido de Patente U.S. N° 62/133,210), alvos de ncm RNAi (Pedido de Patente U.S. N° 62/095487), alvos de snap25 RNAi (Pedido de Patente U.S. N° 62/193502), cOPI alfa (Pedido de Patente U.S. N° 62/063199), cOPI gama (Pedido de Patente U.S. N° 62/063192), cOPI delta (Pedido de Patente U.S. N° 62/063216), cOPI beta (Pedido de Patente U.S. N° 62/063203), dre4 (Pedido de Patente U.S. N° 61/989843), alvos de fator de alogamento de transcrição spt5 RNAi, como descrito em Pedido de Patente U.S. N° 62/168613), e alvos de fator de alogamento de transcrição spt6 RNAi, como descrito em Pedido de Patente U.S. N° 62/168606), o potencial para afetar múltiplas sequências alvo, por exemplo, com múltiplos modos de ação, pode aumentar as oportunidades para desenvolver abordagens sustentáveis para a manipulação de pragas de insetos envolvendo tecnologias iRNA.
[00073] São aqui descritos métodos e composições para o controle genético de infestações de pragas de insetos (por exemplo, coleópteros e/ou hemípteros). Métodos para identificar um ou mais genes essenciais para o ciclo de vida de uma praga de inseto para uso como um gene-alvo para o controle mediado por iRNA de uma população de pragas de insetos. Os vetores plasmídicos de DNA que codificam uma molécula de RNA podem ser concebidos para suprimir um ou mais genes-alvo essenciais para o crescimento, sobrevivência e/ou desenvolvimento. Em algumas modalidades, a molécula de RNA pode ser capaz de formar moléculas de dsRNA. Em algumas modalidades, são proporcionados métodos para a repressão póstranscrição da expressão ou inibição de um gene-alvo por meio de
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27/164 moléculas de ácido nucleico que são complementares a uma sequência codificadora ou não codificadora do gene-alvo em uma praga de inseto. Nestas e outras modalidades, uma praga pode ingerir uma ou mais moléculas de dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA e/ou hpRNA transcritas a partir de toda ou uma porção de uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma sequência codificadora ou não codificadora de um gene-alvo, proporcionando assim um efeito protetor das plantas.
[00074] Deste modo, algumas modalidades envolvem a inibição específica da sequência de expressão de produtos gênicos alvo, utilizando dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA e/ou hpRNA que é complementar a sequências codificadoras e/ou não codificadoras dos genes-alvo para alcançar pelo menos controle parcial de uma praga de insetos (por exemplo, coleópteros e/ou hemípteros). Descrito um conjunto de moléculas de ácido nucleico isoladas e purificadas compreendendo um polinucleotídeo, por exemplo, como apresentado em uma das SEQ ID NO: 1; 3; 5; e 78; e fragmentos de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos do mesmo. Em algumas modalidades, uma molécula de dsRNA estabilizada pode ser expressa a partir destes polinucleotídeos, fragmentos dos mesmos ou um gene compreendendo um destes polinucleotídeos, para o silenciamento pós-transcrição ou inibição de um gene-alvo. Em certas modalidades, as moléculas de ácido nucleico isoladas e purificadas compreendem todos ou pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, 3, 5 e 78 (por exemplo, SEQ ID NOs: 7-10 e 80) e/ou um complemento ou complemento inverso do mesmo.
[00075] Algumas modalidades envolvem uma célula hospedeira recombinante (por exemplo, uma célula vegetal) que tem no seu genoma pelo menos um DNA recombinante que codifica pelo menos uma ou mais moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA). Em
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28/164 modalidades particulares, uma molécula de dsRNA pode ser proporcionada quando ingerida por uma praga de inseto (por exemplo, coleópteros e/ou hemípteros) para silenciamento ou inibição póstranscrição da expressão de um gene-alvo na praga. O DNA recombinante pode compreender, por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7-10, 78 e 80; fragmentos de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 710, 78 e 80; e um polinucleotídeo consistindo em uma sequência parcial de um gene compreendendo uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 710, 78 e 80; e/ou complementos ou complementos inversos dos mesmos.
[00076] Algumas modalidades envolvem uma célula hospedeira recombinante possuindo no seu genoma um DNA recombinante que codifica pelo menos uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA) compreendendo todos ou pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 86-88 e 93 (por exemplo, pelo menos um polinucleotídeo selecionado a partir de um grupo compreendendo SEQ ID NOs: 89-92 e 94), ou o seu complemento ou complemento inverso. Quando ingeridas por uma praga de inseto (por exemplo, coleópteros e/ou hemípteros), as moléculas de iRNA podem silenciar ou inibir a expressão de um DNA rpb7 alvo (por exemplo, um DNA compreendendo todos ou pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7-10, 78 e 80) na praga e, deste modo, resulta na cessação do crescimento, desenvolvimento, viabilidade e/ou alimentação na praga.
[00077] Uma célula hospedeira recombinante possuindo no seu genoma pelo menos um DNA recombinante que codifica pelo menos uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA pode ser uma célula de planta transformada. Algumas modalidades
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29/164 envolvem plantas transgênicas compreendendo tal célula de planta transformada. Além destas plantas transgênicas, são fornecidas todas as plantas de progenitura de qualquer geração de plantas transgênicas, sementes transgênicas e produtos vegetais transgênicos, cada uma das quais compreende DNAs recombinantes. Em modalidades particulares, uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA pode ser expressa em uma célula vegetal transgênica. Deste modo, nestas e outras modalidades, uma molécula de dsRNA pode ser isolada a partir de uma célula de planta transgênica. Em modalidades particulares, a planta transgênica é uma planta selecionada a partir do grupo que compreende milho (Zea mays), soja (Glycine max), algodão e plantas da família Poaceae. [00078] Algumas modalidades envolvem um método para modular a expressão de um gene-alvo em uma célula de pragas de inseto (por exemplo, coleópteros ou hemípteros). Nestas e outras modalidades, pode ser proporcionada uma molécula de ácido nucleico, em que a molécula de ácido nucleico compreende um polinucleotídeo que codifica uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA. Em modalidades particulares, um polinucleotídeo que codifica uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA pode estar operacionalmente ligado a um promotor e também pode estar ligado operativamente a uma sequência de terminação de transcrição. Em modalidades particulares, um método para modular a expressão de um gene-alvo em uma célula de praga de inseto pode compreender: (a) transformar uma célula vegetal com um vetor compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA; (b) cultivar a célula vegetal transformada em condições suficientes para permitir o desenvolvimento de uma cultura de células vegetais compreendendo uma pluralidade de células vegetais transformadas; (c) selecionar uma
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30/164 célula vegetal transformada que tenha integrado o vetor no seu genoma; e (d) determinar que a célula de planta transformada selecionada compreende a molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA codificada pelo polinucleotídeo do vetor. Uma planta pode ser regenerada a partir de uma célula vegetal que tem o vetor integrado no seu genoma e compreende a molécula de dsRNA codificada pelo polinucleotídeo do vetor.
[00079] Assim, também é descrita uma planta transgênica compreendendo um vetor possuindo um polinucleotídeo que codifica uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA integrada no seu genoma, em que a planta transgênica compreende a molécula de dsRNA codificada pelo polinucleotídeo do vetor. Em modalidades particulares, a expressão de uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA na planta é suficiente para modular a expressão de um gene-alvo em uma célula de uma praga de inseto (por exemplo, coleóptero ou hemíptero) que contata a planta transformada ou a célula vegetal (por exemplo, alimentando a planta transformada, uma parte da planta (por exemplo, raiz) ou célula de planta), de tal modo que o crescimento e/ou sobrevivência da praga são inibidos. As plantas transgênicas aqui descritas podem apresentar proteção e/ou proteção reforçada contra infestações de pragas de insetos. Plantas transgênicas particulares podem exibir proteção e/ou proteção melhorada para uma ou mais pragas de coleópteros e/ou hemípteros selecionadas a partir do grupo que consiste em: WCR; BSB; NCR; SCR; MCR; D. balteata LeConte; D. u. tenella; D. u. undecimpunctata Mannerheim; D. speciosa Germar; E. servus (Say); Nezara viridula (L.); piezodorus guildinii (Westwood); Halyomorpha halys (Stál); Chinavia hilare (Say); C. marginatum (Palisot de Beauvois); Dichelops melacanthus (Dallas); D. furcatus (F.); Edessa meditabunda (F.); thyanta perditor (F.); Horcias nobilellus (Berg);
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31/164 taedia stigmosa (Berg); Dysdercus peruvianus (Guérin-Méneville);
Neomegalotomus parvus (Westwood); Leptoglossus zonatus (Dallas);
Niesthrea sidae (F.); Lygus hesperus (Knight); e L. lineolaris (Palisot de Beauvois).
[00080] Também aqui descritos são métodos para distribuição de agentes de controle, tais como uma molécula de iRNA, a uma praga de inseto (por exemplo, coleópteros ou hemípteros). Tais agentes de controle podem causar, direta ou indiretamente, prejuízo na capacidade de uma população de pragas de insetos para se alimentar, crescer ou causar outros danos em um hospedeiro. Em algumas modalidades, é proporcionado um método que compreende a administração de uma molécula estabilizada de dsRNA a uma praga de inseto para suprimir pelo menos um gene-alvo na praga, assim, causando iRNA e reduzindo ou eliminando o dano da planta em um hospedeiro de pragas. Em algumas modalidades, um método de inibição da expressão de um gene-alvo na praga de inseto pode resultar na cessação do crescimento, sobrevivência e/ou desenvolvimento na praga.
[00081] Em algumas modalidades, composições (por exemplo, uma composição tópica) são proporcionadas as quais compreendem uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA) para utilização em plantas, animais e/ou no ambiente de uma planta ou animal para conseguir a eliminação ou redução de uma infestação de pragas de inseto (por exemplo, coleópteros ou hemípteros). Em modalidades particulares, a composição pode ser uma composição nutricional ou fonte de alimento para ser alimentada à praga de inseto. Uma composição nutricional ou fonte de alimento a ser alimentada à praga de inseto pode ser, por exemplo, e sem limitação, uma isca de iRNA ou uma célula ou tecido vegetal compreendendo uma molécula de iRNA. Algumas modalidades compreendem fazer com que a composição nutricional
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32/164 ou fonte de alimento esteja disponível para a praga. A ingestão de uma composição compreendendo moléculas de iRNA pode resultar na captação das moléculas por uma ou mais células da praga, o que pode por sua vez resultar na inibição da expressão de pelo menos um gene-alvo nas células da praga. A ingestão de ou danos a uma planta ou célula de planta por uma infestação de praga de inseto pode ser limitada ou eliminada em ou em qualquer tecido ou ambiente hospedeiro no qual a praga está presente fornecendo uma ou mais composições compreendendo uma molécula de iRNA no hospedeiro da praga.
[00082] As iscas de iRNA são formadas quando o dsRNA é misturado com alimento ou um atrativo ou ambos. Quando as pragas comem a isca, elas também consomem o dsRNA. As iscas podem tomar a forma de grânulos, géis, pós fluidos, líquidos ou sólidos. Em outra modalidade, o rpb7 pode ser incorporado em uma formulação de isca tal como a descrita na Patente U.S. N° 8 530 440 que é aqui incorporada por referência. Geralmente, com iscas, as iscas são colocadas dentro ou em volta do ambiente da praga de inseto, por exemplo, WCR pode entrar em contato com, e/ou ser atraído para, a isca.
[00083] As composições e métodos aqui descritos podem ser utilizados em conjunto em combinações com outros métodos e composições para controlar danos por pragas de inseto (por exemplo, coleóptero ou hemíptero). Por exemplo, uma molécula de iRNA tal como aqui descrita para proteger plantas de pragas de insetos pode ser utilizada em um método compreendendo a utilização adicional de um ou mais agentes químicos eficazes contra uma praga de inseto, biopesticidas eficazes contra tal praga, rotação de cultura, expressão recombinante de outras moléculas iRNA, e ou técnicas recombinantes / genéticas que exibem características diferentes das características
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33/164 dos métodos de mediados por iRNA e composições de iRNA (por exemplo, produção recombinante de proteínas em plantas que são prejudiciais para uma praga de insetos (por exemplo, toxinas Bt, polipeptídeos PIP-1 (vide, por exemplo, Publicação de Patente US N° US 2014/0007292 A1), e/ou polipeptídeos AFLP (vide, por exemplo, Publicação de Patente US N° US 2104/0033361 A1)).
II. Abreviações
BSB percevejo fétido marrom neotropical (Euschistus heros) dsRNA ácido ribonucleico de duplo filamento GI inibição de crescimento
NCBI Centro Nacional para Informação de Biotecnologia gDNA ácido deoxirribonucleico genômico iRNA ácido ribonucleico inibidor
ORF quadro de leitura aberta
RNAi interferência de ácido ribonucleico miRNA microácido ribonucleico shRNA pequeno ácido ribonucleico de grampo siRNA pequeno ácido ribonucleico inibidor hpRNA ácido ribonucleico de grampo
UTR região não traduzida
WCR crisomelídeo do milho (Diabrotica virgifera virgifera LeConte)
NCR crisomelídeo do milho do norte (Diabrotica barberi Smith and Lawrence)
MCR crisomelídeo do milho mexicano (Diabrotica virgifera zeae Krysan and Smith)
PCR reação de cadeia de polimerase qPCR reação de cadeia de polimerase quantitativa
RISC Complexo de silenciamento induzido por RNA
SCR crisomelídeo do milho do sul (Diabrotica undecimpunctata
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34/164 howardi Barber)
SEM media de erro padrão
YFP proteína fluorescente amarela
III. Termos [00084] Na descrição e tabelas a seguir vários termos são usados. A fim de proporcionar uma compreensão clara e consistente do relatório descritivo e reivindicações, incluindo o âmbito a ser dado de tais termos, são fornecidas as seguintes definições:
[00085] Praga de coleópteros: Tal como aqui utilizado, o termo pragas de coleópteros refere-se a insetos de pragas da ordem Coleoptera, incluindo insetos de praga no gênero Diabrotica, que se alimentam de culturas agrícolas e produtos vegetais, incluindo milho e outras gramíneas verdadeiras. Em exemplos particulares, uma praga de coleópteros é selecionada a partir de uma lista compreendendo D. v. virgifera LeConte (WCR); D. barberi Smith and Lawrence (NCR); D. u. howardi (SCR); D. v. zeae (MCR); D. balteata LeConte; D. u. tenella; D. u. undecimpunctata Mannerheim; e D. speciosa Germar.
[00086] Contato (com um organismo): Tal como aqui utilizado, o termo contato com ou captação por um organismo (por exemplo, uma praga de coleópteros ou hemípteros), no que diz respeito a uma molécula de ácido nucleico, inclui internalização da molécula de ácido nucleico no organismo, por exemplo, e sem limitação: ingestão da molécula pelo organismo (por exemplo, por alimentação); contatando o organismo com uma composição compreendendo a molécula de ácido nucleico; e imersão de organismos com uma solução compreendendo a molécula de ácido nucleico.
[00087] Como aqui utilizado, o termo contíguo refere-se a uma sequência de DNA que é reconstruída a partir de um conjunto de segmentos de DNA sobrepostos derivados de uma única fonte genética.
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35/164 [00088] Planta de milho: Como aqui utilizado, o termo planta de milho refere-se a uma planta da espécie, Zea mays (milho).
[00089] Expressão: Tal como aqui utilizado, a expressão de um polinucleotídeo codificador (por exemplo, um gene ou um transgene) refere-se ao processo pelo qual a informação codificada de uma unidade de transcrição de ácido nucleico (incluindo, por exemplo, gDNA ou cDNA) é convertida em uma parte operacional, não operacional ou estrutural de uma célula, incluindo frequentemente a síntese de uma proteína. A expressão gênica pode ser influenciada por sinais externos; por exemplo, exposição de uma célula, tecido ou organismo a um agente que aumenta ou diminui a expressão do gene. A expressão de um gene pode também ser regulada em qualquer parte da via, desde o DNA até ao RNA para a proteína. Regulação da expressão do gene ocorre, por exemplo, através do controle atuando sobre a transcrição, a tradução, o transporte de RNA e o processamento, degradação de moléculas intermediárias, tais como mRNA, ou por meio de ativação, desativação, compartimentalização, ou degradação de moléculas de proteína específica, após terem sido feitas, ou por combinações dos mesmos. A expressão de genes pode ser medida ao nível de RNA ou ao nível de proteína por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, sem limitação, Northern blot, RT-PCR, western blot, ou ensaios de atividade de proteína in vitro, in situ ou in vivo).
[00090] Material genético: Como aqui utilizado, o termo material genético inclui todos os genes e moléculas de ácido nucleico, tais como DNA e RNA.
[00091] Pragas hemípteras: Como aqui utilizado, o termo praga hemíptera refere-se a pragas de insetos da ordem Hemiptera, incluindo, por exemplo, e sem limitação, insetos nas famílias Pentatomidae, Miridae, Pyrrhocoridae, coreidae, Alydidae e
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Rhopalidae, que se alimentam de uma vasta gama de plantas hospedeiras e têm partes de boca perfurantes e de sucção. Em exemplos particulares, uma praga hemíptera é selecionada a partir da lista compreendendo Euschistus heros (Fabr.) (Neotropical Brown Stink Bug), Nezara viridula (L.) (Southern Green Stink Bug), Piezodorus guildinii (Westwood) (Red-banded Stink Bug), Halyomorpha halys (Stál) (Brown Marmorated Stink Bug), chinavia hilare (Say) (Green Stink Bug), Euschistus servus (Say) (Brown Stink Bug), Dichelops melacanthus (Dallas), Dichelops furcatus (F.), Edessa meditabunda (F.), Thyanta perditor (F.) (Neotropical Red Shouldered Stink Bug), chinavia marginatum (Palisot de Beauvois), Horcias nobilellus (Berg) (Cotton Bug), Taedia stigmosa (Berg), Dysdercus peruvianus (Guérin-Méneville), Neomegalotomus parvus (Westwood), Leptoglossus zonatus (Dallas), Niesthrea sidae (F.), Lygus hesperus (Knight) (Western Tarnished Plant Bug), e Lygus lineolaris (Palisot de Beauvois) [00092] Inibição: Tal como aqui utilizado, o termo inibição, quando utilizado para descrever um efeito em um polinucleotídeo codificador (por exemplo, um gene), refere-se a uma diminuição mensurável no nível celular de mRNA transcritos a partir do polinucleotídeo codificador e/ou peptídeo, polipeptídeo ou produto proteico do polinucleotídeo codificador. Em alguns exemplos, a expressão de um polinucleotídeo codificador pode ser inibida tal que a expressão é quase eliminada. Inibição específica refere-se à inibição de um polinucleotídeo codificador alvo sem consequentemente afetar a expressão de outros polinucleotídeos codificadores (por exemplo, genes) na célula em que a inibição específica está sendo realizada. [00093] Inseto: Tal como aqui utilizado no que se refere a pragas, o termo praga de inseto especificamente inclui pragas de insetos de coleópteros. Em alguns exemplos, o termo praga de inseto refere-se
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37/164 especificamente a uma praga de coleópteros no gênero Diabrotica selecionada a partir de uma lista compreendendo D. v. virgifera LeConte (WCR); D. barberi Smith and Lawrence (NCR); D. u. howardi (SCR); D. v. zeae (MCR); D. balteata LeConte; D. u. tenella; D. u. undecimpunctata Mannerheim; e D. speciosa Germar. Em algumas modalidades, o termo inclui também algumas outras pragas de insetos; por exemplo, pragas de insetos hemípteros.
[00094] Isolado: Um componente biológico isolado (tal como um ácido nucleico ou uma proteína) foi substancialmente separado, produzido separadamente ou purificado de outros componentes biológicos na célula do organismo em que o componente naturalmente ocorre (ou seja, outro DNA e RNA cromossômico e extracromossômico e proteínas), enquanto efetua uma alteração química ou funcional no componente (por exemplo, um ácido nucleico pode ser isolado de um cromossoma por ruptura de ligações químicas que ligam o ácido nucleico ao DNA restante no cromossomo). Moléculas de ácido nucleico e proteínas que foram isoladas incluem moléculas de ácido nucleico e proteínas purificadas por métodos de purificação convencionais. O termo abrange também ácidos nucleicos e proteínas preparados por expressão recombinante em uma célula hospedeira, bem como moléculas de ácido nucleico, proteínas e peptídeos sintetizados quimicamente.
[00095] Molécula de ácido nucleico: Tal como aqui utilizado, o termo molécula de ácido nucleico pode referir-se a uma forma polimérica de nucleotídeos, que pode incluir abos os filamentos de senso e antissenso de RNA, cDNA, gDNA e formas sintéticas e polímeros misturados dos anteriores. Um nucleotídeo ou nucleobase pode referir-se a um ribonucleotídeo, desoxirribonucleotídeo ou a uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. Uma molécula de ácido nucleico como aqui utilizadao é sinônimo de ácido nucleico e
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38/164 polinucleotídeo. Uma molécula de ácido nucleico é normalmente de pelo menos 10 bases de comprimento, a menos que especificado de outro modo. Por convenção, a sequência nucleotídica de uma molécula de ácido nucleico é lida a partir da extremidade 5' para a 3' da molécula. O complemento de uma molécula de ácido nucleico refere-se a um polinucleotídeo possuindo nucleobases que podem formar pares de bases com as nucleobases da molécula de ácido nucleico (isto é, A-T/U e G-C).
[00096] Algumas modalidades incluem ácidos nucleicos compreendendo um DNA modelo que é transcrito em uma molécula de RNA que é o complemento de uma molécula de mRNA. Nestas modalidades, o complemento do ácido nucleico transcrito na molécula de mRNA está presente na orientação 5' para 3', de modo que o RNA polimerase (que transcreve o DNA na orientação 5' para 3') irá transcrever um ácido nucleico a partir do complemento que pode hibridar com a molécula de mRNA. A menos que seja explicitamente indicado o contrário, ou é evidente que é diferente do contexto, o termo complemento refere-se, portanto, a um polinucleotídeo possuindo nucleobases, de 5' a 3', que podem formar pares de bases com as nucleobases de um ácido nucleico de referência. De modo semelhante, a menos que seja explicitamente afirmado que é de outro modo (ou é evidente que é diferente do contexto), o complemento inverso de um ácido nucleico refere-se ao complemento na orientação inversa. O acima é demonstrado na seguinte ilustração:
ATGATGATG polinucleotídeo
TACTACTAC complemento do polinucleotídeo
CATCATCAT complemento inverso do polinucleotídeo [00097] Algumas modalidades da invenção podem incluir moléculas iRNA formadoras de RNA em forma de grampo. Nestas moléculas de iRNA, tanto o complemento de um ácido nucleico a ser alvo por
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39/164 interferência de RNA como o complemento inverso podem ser encontrados na mesma molécula, tal como que a molécula de RNA de único filamento pode dobrar-se e hibridar com si mesma sobre a região compreendendo os polinucleotídeos complementares e reversos complementares.
[00098] Moléculas de ácido nucleico incluem todos os polinucleotídeos, por exemplo: formas de único filamento ou duplo de DNA; formas de único filamento ou duplo de RNA; e formas de duplo filamento de RNA (dsRNA). O termo sequência de nucleotídeos ou sequência de ácido nucleico refere-se tanto aos filamentos de senso como os de antissenso de um ácido nucleico, quer como filamentos simples individuais quer no duplex. O termo ácido ribonucleico (RNA) inclui iRNA (RNA inibitório), dsRNA (RNA de filamento duplo), siRNA (RNA de pequena interferência), shARN (RNA de pequeno grampo), mRNA (RNA mensageiro), miRNA (micro-RNA), hpRNA (RNA de grampo), tARN (RNAs de transferência, quer carregados ou descarregados com um aminoácido acilado correspondente), e cRNA (RNA complementar). O termo ácido desoxirribonucleico (DNA) é inclusive de cDNA, gDNA e híbridos de DNA-RNA. Os termos polinucleotídeo e ácido nucleico e fragmentos dos mesmos serão entendidos pelos versados na técnica como um termo que inclui tanto gDNAs, RNAs ribossômicos, RNAs de transferência, RNAs mensageiros, operons e polinucleotídeos de engenharia menores que codificam ou podem ser adaptados para codificar, peptídeos, polipeptídeos ou proteínas.
[00099] Oligonucleotídeo: Um oligonucleotídeo é um polímero de ácido nucleico curto. Os oligonucleotídeos podem ser formados por clivagem de segmentos de ácido nucleico mais longos, ou por polimerização de precursores de nucleotídeos individuais. Os sintetizadores automatizados permitem a síntese de oligonucleotídeos
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40/164 até várias centenas de bases de comprimento. Uma vez que os oligonucleotídeos podem ligar-se a um ácido nucleico complementar, eles podem ser utilizados como sondas para detectar DNA ou RNA.
Os oligonucleotídeos compostos de DNA (oligodesoxirribonucleotídeos) podem ser utilizados em PCR, uma técnica para a amplificação de DNAs. Em PCR, o oligonucleotídeo é tipicamente referido como um iniciador, o qual permite que um DNA polimerase estenda o oligonucleotídeo e replique o filamento complementar.
[000100] Molécula de ácido nucleico pode incluir qualquer um ou ambos os nucleotídeos que ocorrem naturalmente e modificados ligados entre si por agentes de ocorrência natural e as moléculas de ácido nucleico podem ser modificadas quimicamente ou bioquimicamente, ou podem conter bases nucleotídicas não naturais ou derivatizadas, como será facilmente apreciado pelos versados na técnica, tais como, por exemplo, marcadores, metilação, substituição de um ou mais dos nucleotídeos que ocorrem naturalmente com um análogo, modificações internucleotídicas (por exemplo, ligações não carregadas: por exemplo, metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.; ligações carregadas: por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc,; porções pendentes: por exemplo, peptídeos, intercaladores: por exemplo, acridina, psoraleno, etc.; quelantes; alquilantes; e ligações modificadas: por exemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.). O termo molécula de ácido nucleico também inclui qualquer conformação topológica, incluindo conformações de filamento simples, de filamento duplo, parcialmente duplexadas, triplexadas, com grampo, circulares e fechadas.
[000101] Como aqui utilizado em relação ao DNA, o termo polinucleotídeo codificador, polinucleotídeo estrutural ou molécula de ácido nucleico estrutural refere-se a um polinucleotídeo que é
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41/164 finalmente traduzido em um polipeptídeo, através de transcrição e mRNA, quando colocado sob o controle de elementos reguladores apropriados. Em relação ao RNA, o termo polinucleotídeo codificador refere-se a um polinucleotídeo que é traduzido em um peptídeo, polipeptídeo ou proteína. Os limites de um polinucleotídeo codificador são determinados por um códon de início de tradução no terminal 5' e um códon de terminação de tradução no terminal 3'. Os polinucleotídeos de codificação incluem, mas não estão limitados a: gDNA; cDNA; EST; e polinucleotídeos recombinantes.
[000102] Tal como aqui utilizado, polinucleotídeo não codificador transcrito refere-se a segmentos de moléculas de mRNA tais como 5'UTR, 3'UTR e segmentos de íntron que não são traduzidos em um peptídeo, polipeptídeo ou proteína. Além disso, polinucleotídeo não codificador transcrito refere-se a um ácido nucleico que é transcrito em um RNA que funciona na célula, por exemplo, RNAs estruturais (por exemplo, RNA ribossômico (rRNA) como exemplificado por rRNA 5S, rRNA 5,8S, rRNA, 18S rRNA, rRNA 23S, e rRNA 28S, e semelhantes); RNA de transferência (tRNA); e snRNAs tais como U4, U5, U6 e semelhantes. Os polinucleotídeos não codificados transcritos incluem também, por exemplo e sem limitação, RNAs pequenos (RNAs), cujo termo é frequentemente utilizado para descrever RNAs não codificadores pequenos e bacterianos; RNAs nucleolares pequenos (snoRNA); microRNAs; pequenos RNAs interferentes (siRNA); RNAs que interagem com Piwi (piRNA); e RNAs não codificadores longos. Ainda mais, polinucleotídeo não codificador transcrito refere-se a um polinucleotídeo que pode existir nativamente como um espaçador intragênico em um ácido nucleico e que é transcrito em uma molécula de RNA.
[000103] Interferência de RNA letal: Tal como aqui utilizado, o termo Interferência de RNA letal refere-se à interferência de RNA que
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42/164 resulta na morte ou em uma redução na viabilidade do indivíduo sujeito ao qual, por exemplo, é fornecido um dsRNA, miRNA, siRNA, shRNA e/ou hpRNA.
[000104] Genoma: Tal como aqui utilizado, o termo genoma referese ao DNA cromossômico encontrado dentro do núcleo de uma célula e também se refere ao DNA de organelas encontradas dentro de componentes subcelulares da célula. Em algumas modalidades da invenção, uma molécula de DNA pode ser introduzida em uma célula vegetal, de modo que a molécula de DNA é integrada no genoma da célula vegetal. Nestas e outras modalidades, a molécula de DNA pode ser integrada no DNA nuclear da célula vegetal ou integrada no DNA do cloroplasto ou mitocôndria da célula vegetal. O termo genoma, tal como se aplica a bactérias, refere-se tanto ao cromossoma como aos plasmídeos dentro da célula bacteriana. Em algumas modalidades da invenção, uma molécula de DNA pode ser introduzida em uma bactéria de modo que a molécula de DNA seja integrada no genoma da bactéria. Nessas e outras modalidades, a molécula de DNA pode ser integrada cromossomicamente ou localizada como ou em um plasmídeo estável.
[000105] Identidade de sequência: O termo identidade de sequência ou identidade, tal como aqui utilizado no contexto de dois polinucleotídeos ou polipeptídeos, refere-se aos resíduos nas sequências das duas moléculas que são as mesmas quando alinhadas para correspondência máxima sobre uma janela de comparação especificada.
[000106] Tal como aqui utilizado, o termo percentagem de identidade de sequência pode referir-se ao valor determinado comparando duas sequências idealmente alinhadas (por exemplo, sequências de ácidos nucleicos ou sequências polipeptídicas) de uma molécula sobre uma janela de comparação, em que a porção da
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43/164 sequência na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, intervalos) em comparação com a sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para o alinhamento ideal das duas sequências. A percentagem é calculada determinando o número de posições em que o nucleotídeo ou resíduo de aminoácido idêntico ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições correspondentes, dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicandoo resultado por 100 para produzir a percentagem de identidade de sequência. Uma sequência que é idêntica em cada posição em comparação com uma sequência de referência é dita ser 100% idêntica à sequência de referência e viceversa.
[000107] Os métodos para alinhar sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Vários programas e algoritmos de alinhamento estão descritos em, por exemplo: Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50. Uma consideração detalhada de métodos de alinhamento de sequência e calculus de homologia podem ser encontrados em, por exemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10.
[000108] O Centro National para Informação de Biotecnologia (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST™; Altschul et al. (1990)) está disponível a partir de várias fontes incluindo o Centro National para Informação de Biotecnologia (NCBI) e na internet, para uso em
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44/164 conexão com vários programas de análise de sequência. Uma descrição de como determinar a identidade de sequência utilizando este programa está disponível na Internet na seção ajuda para o BLAST™. Para comparações de sequências de ácidos nucleicos, a função sequências de Blast 2 do programa BLAST™ (Blastn) pode ser utilizada utilizando a matriz BLOSUM62 padrão para os parâmetros-padrão. Os ácidos nucleicos com ainda maior similaridade de sequência com as sequências dos polinucleotídeos de referência irão mostrar percentagem percentual crescente quando avaliados por este método.
[000109] Especificamente hibridável / especificamente complementar: Como aqui utilizado, os termos especificamente hibridável e especificamente complementar são termos que indicam Um grau de complementaridade suficiente tal que a ligação estável e específica ocorra entre a molécula de ácido nucleico e uma molécula de ácido nucleico alvo. A hibridação entre duas moléculas de ácido nucleico envolve a formação de um alinhamento antiparalelo entre as nucleobases das duas moléculas de ácido nucleico. As duas moléculas são então capazes de formar ligações de hidrogênio com as bases correspondentes no filamento oposta para formar uma molécula dupla que, se é suficientemente estável, é detectável utilizando métodos bem conhecidos na técnica. Um polinucleotídeo não necessita de ser 100% complementar ao seu ácido nucleico alvo para ser especificamente hibridável. No entanto, a quantidade de complementaridade que deve existir para que a hibridação seja específica é uma função das condições de hibridização utilizadas. [000110] As condições de hibridação resultando em graus específicos de rigor variam dependendo da na natureza do método de hibridação de escolha e na composição e comprimento dos ácidos nucleicos de hibridação. Geralmente, a temperatura de hibridação e a
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45/164 força iônica (especialmente a concentração de Na+ e/ou Mg++) do tampão de hibridação determinarão a rigidez da hibridação, embora os tempos de lavagem também influenciem a restrição. Os cálculos relativos às condições de hibridação requeridas para atingir graus específicos de rigor são conhecidos dos versados na técnica e são discutidos, por exemplo, em Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, cold Spring Harbor Laboratory Press, cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 e 11; e Hames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985. Instruções e orientações mas detalhadas no que diz respeito à hibridação de ácidos nucleicos podem ser encontradas, por exemplo, em in Tijssen, OverView of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays, in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Acid
Probes, Part I, chapter 2, Elsevier, NY, 1993; e Ausubel et al., Eds., current Protocols in Molecular Biology, chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995.
[000111] Tal como aqui utilizado, condições rigorosas englobam condições em que a hibridação só ocorrerá se houver menos de 20% de incompatibilidade entre a sequência da molécula de hibridação e um polinucleotídeo homólogo dentro da molécula de ácido nucleico alvo. Condições rigorosas incluem outros níveis particulares de rigor. Assim, tal como aqui utilizado, as condições de rigor moderado são aquelas em que moléculas com mais de 20% de correspondência de sequência não hibridam; as condições de alto rigor são aquelas em que as sequências com mais de 10% de incompatibilidade não hibridam; e as condições de rigor muito elevado são aquelas em que as sequências com mais de 5% de incompatibilidade não hibridam. [000112] A seguir são condições de hibridização não limitativas representativas.
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46/164 [000113] Condição de alta severidade (detecta polinucleotídeos que compartilham pelo menos 90% de identidade de sequência): A hibridação em tampão SSC 5x a 65 °C durante 16 horas; lavar duas vezes em tampão SSC 2x à temperatura ambiente durante 15 minutos cada; e lavar duas vezes em tampão SSC 0,5x a 65 °C durante 20 minutos cada.
[000114] Condição de severidade moderada (detecta polinucleotídeos que compartilham pelo menos 80% de identidade de sequência): Hibridação em tampão SSC 5x-6x a 65-70 °C durante 1620 horas; Lavar duas vezes em tampão SSC 2x à temperatura ambiente durante 5-20 minutos cada; e lavar duas vezes em tampão 1x SSC a 55-70 °C durante 30 minutos cada.
[000115] Condição de controle não rigorosa (polinucleotídeos que compartilham pelo menos 50% de identidade de sequência hibridam): Hibridação em tampão 6x SSC à temperatura ambiente a 55 °C por 16-20 horas; lavar pelo menos duas vezes em tampão SSC 2x-3x à temperatura ambiente até 55 °C durante 20-30 minutos cada.
[000116] Tal como aqui utilizado, o termo substancialmente homólogo ou homologia substancial, com referência a um ácido nucleico, refere-se a um polinucleotídeo que tem nucleobases contíguas que hibridizam sob condições rigorosas para o ácido nucleico de referência. Por exemplo, ácidos nucleicos que são substancialmente homólogos a um ácido nucleico de referência de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7-10, 78 e 80 são os ácidos nucleicos que hibridam sob condições rigorosas (por exemplo, condições de Moderação de Severidade estabelecidas acima) com os ácidos nucleicos de referência. Os polinucleotídeos substancialmente homólogos podem ter pelo menos 80% de identidade de sequência, por exemplo, os polinucleotídeos substancialmente homólogos podem ter de cerca de 80% a 100% de identidade de sequência, tal como
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79%, 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 82% 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, 92%, 93%, 94%, 95%; cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 98,5%, cerca de 99%, cerca de 99,5% e cerca de 100%. A propriedade de homologia substancial está intimamente relacionada com a hibridização específica. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico é especificamente hibridável quando existe um grau suficiente de complementaridade para evitar a ligação não específica do ácido nucleico a polinucleotídeos não alvo (por exemplo, outros polinucleotídeos genômicos em um alvo e/ou organismo hospedeiro) sob condições onde a ligação específica é desejada, por exemplo, sob condições de hibridação rigorosas.
[000117] Tal como aqui utilizado, o termo ortólogo refere-se a um gene em duas ou mais espécies que evoluiu a partir de um ácido nucleico ancestral comum e pode manter a mesma função nas duas ou mais espécies.
[000118] Tal como aqui utilizado, diz-se que duas moléculas de ácido nucleico exibem complementaridade completa quando cada nucleotídeo de um polinucleotídeo lido na direção 5' para 3' é complementar a cada nucleotídeo do outro polinucleotídeo quando lido na direção 3' para 5'. Um polinucleotídeo que é complementar a um polinucleotídeo de referência exibirá uma sequência idêntica ao complemento inverso do polinucleotídeo de referência. Esses termos e as descrições estão bem definidos na técnica e são facilmente compreendidos pelos versados na técnica.
[000119] Ligado operativamente: um primeiro polinucleotídeo está operacionalmente ligado a um segundo polinucleotídeo quando o primeiro polinucleotídeo está em uma relação funcional com o segundo polinucleotídeo. Quando produzidos de forma recombinante,
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48/164 os polinucleotídeos ligados operativamente são geralmente contíguos e, quando necessário juntar duas regiões codificadoras de proteínas, na mesma grelha de leitura (por exemplo, em um ORF fundido por tradução). No entanto, os ácidos nucleicos não necessitam de ser contíguos para serem operativamente ligados.
[000120] O termo ligado operativamente, quando utilizado em referência a um elemento genético regulador e a um polinucleotídeo codificador, significa que o elemento regulador afeta a expressão do polinucleotídeo codificador ligado. Elementos reguladores ou elementos de controle referem-se a polinucleotídeos que influenciam o tempo e o nível / quantidade de transcrição, processamento de RNA ou estabilidade ou tradução do polinucleotídeo codificador associado. Os elementos reguladores podem incluir promotores, líderes de tradução, íntrons, intensificadores, estruturas de haste-laço, polinucleotídeos de ligação do repressor, polinucleotídeos com uma sequência de terminação, polinucleotídeos com uma sequência de reconhecimento de poliadenilação, etc. Elementos reguladores particulares podem estar localizados a montante e/ou a jusante de um polinucleotídeo codificador operativamente ligado a eles. Também, elementos reguladores particulares operativamente ligados a um polinucleotídeo codificador podem estar localizados no filamento complementar associado de uma molécula de ácido nucleico de filamento duplo.
[000121] Promotor: Tal como aqui utilizado, o termo promotor refere-se a uma região de DNA que pode estar a montante do início da transcrição e que pode estar envolvida no reconhecimento e na ligação de RNA polimerase e de outras proteínas para iniciar a transcrição. Um promotor pode estar operacionalmente ligado a um polinucleotídeo codificador para expressão em uma célula, ou um promotor pode estar operacionalmente ligado a um polinucleotídeo
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49/164 que codifica um peptídeo de sinal que pode estar operacionalmente ligado a um polinucleotídeo codificador para expressão em uma célula. Um promotor da planta pode ser um promotor capaz de iniciar a transcrição em células vegetais. Exemplos de promotores sob controle de desenvolvimento incluem promotores que iniciam preferivelmente a transcrição em certos tecidos, tais como folhas, raízes, sementes, fibras, vasos de xilema, traqueídeos ou esclerênquima. Tais promotores são referidos como preferidos pelos tecidos. Os promotores que iniciam a transcrição apenas em certos tecidos são referidos como específicos de tecido. Um promotor específico de tipo celular dirige principalmente a expressão em certos tipos de células em um ou mais órgãos, por exemplo, células vasculares em raízes ou folhas. Um promotor induzível pode ser um promotor que pode estar sob controle ambiental. Exemplos de condições ambientais que podem iniciar a transcrição por promotores indutíveis incluem condições anaeróbias e a presença de luz. Os promotores específicos de tecidos, preferidos pelos tecidos, específicos de células e indutíveis constituem a classe de promotores não constitutivos. Um promotor constitutivo é um promotor que pode ser ativo sob a maioria das condições ambientais ou na maioria dos tipos de tecidos ou células. [000122] Qualquer promotor indutível pode ser utilizado em algumas modalidades da invenção. Vide Ward et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 361-366. Com um promotor indutível, a taxa de transcrição aumenta em resposta a um agente indutor. Exemplos de promotores indutíveis incluem, mas não estão limitados a: Promotores do sistema ACEI que respondem ao cobre; gene In2 do milho que responde aos fitoprotetores herbicidas de benzenossulfonamidas; repressor Tet de Tn10; e o promotor indutível de um gene de hormônio esteroide, cuja atividade de transcrição pode ser induzida por uma hormônio glucocorticosteroide (Schena et al. (1991) Proc. Nat. Acad. Sci. USA
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88: 0421).
[000123] Promotores constitutivos exemplares incluem, mas não estão limitados a: Promotores de vírus de plantas, tais como o promotor 35S de Vísus do mosaico da couve-flor (CaMV); promotores de genes de actina de arroz; promotores de ubiquitina; pEMU; MAS; promotor de histona H3 de milho; e o promotor de ALS, fragmento 5' de Xba1 /Ncol para o gene estrutural ALS3 de Brassica napus (ou um polinucleotídeo semelhante ao referido fragmento Xba1 / Ncol) (Publicação Internacional PCT N° WO96 / 30530).
[000124] Adicionalmente, qualquer promotor específico de tecido ou preferido de tecido pode ser utilizado em algumas modalidades da invenção. As plantas transformadas com uma molécula de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo codificador operacionalmente ligado a um promotor específico de tecido podem produzir o produto do polinucleotídeo codificador exclusivamente ou, preferivelmente, em um tecido específico. Exemplos de promotores específicos de tecidos ou preferidos de tecidos incluem, mas não se limitam a: um promotor preferido de semente, tal como o do gene de faseolina; um promotor específico da folha e induzido pela luz tal como o da cabina ou do rubisco; um promotor específico da antera tal como o de LAT52; um promotor específico do pólen tal como o de Zm13; e um promotor preferido de microspore tal como o de apg.
[000125] Planta de soja: Como usado aqui, o termo planta de soja refere-se a uma planta da espécie Glicina; por exemplo, Glicina Max. [000126] Transformação: Como aqui utilizado, o termo transformação ou transdução refere-se à transferência de uma ou mais moléculas de ácido nucleico para uma célula. Uma célula é transformada por uma molécula de ácido nucleico transduzida para dentro da célula quando a molécula de ácido nucleico torna-se estavelmente replicada pela célula, quer pela incorporação da
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51/164 molécula de ácido nucleico no genoma celular, quer por replicação epissomal. Tal como aqui utilizado, o termo transformação abrange todas as técnicas através das quais uma molécula de ácido nucleico pode ser introduzida em uma tal célula. Exemplos incluem, mas não estão limitados a: transfecção com vetores virais; transformação com vetores plasmídicos; eletroporação (Fromm et al. (1986) Nature 319:791-3); lipofection (Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7); microinjection (Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85); Agrobacterium-mediated transfer (Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7); direct DNA uptake; e microprojectile bombardment (Klein et al. (1987) Nature 327:70).
[000127] Transgene: Um ácido nucleico exógeno. Em alguns exemplos, um transgene pode ser um DNA que codifica um ou ambos os filamentos de um RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA que compreende um polinucleotídeo que é complementar a uma molécula de ácido nucleico encontrada em uma praga de coleópteros e/ou hemípteros. Em alguns exemplos, um transgene pode ser um polinucleotídeo antissenso, em que a expressão do polinucleotídeo antissenso inibe a expressão de um ácido nucleico alvo, produzindo desse modo um fenótipo de iRNA. Em alguns exemplos, um transgene pode ser um gene estrutural (por exemplo, um gene de tolerância a herbicida, um gene codificando um composto industrial ou farmaceuticamente útil, ou um gene codificando um traço agrícola desejável). Nestes e outros exemplos, um transgene pode conter elementos reguladores ligados operativamente a um polinucleotídeo codificador do transgene (por exemplo, um promotor).
[000128] Vetor: Uma molécula de ácido nucleico como introduzida em uma célula, por exemplo, para produzir uma célula transformada. Um vetor pode incluir elementos genéticos que lhe permitam replicar na célula hospedeira, tal como uma origem de replicação. Exemplos
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52/164 de vetores incluem, mas não estão limitados a: um plasmídeo; cosmídeo; bacteriófago; ou vírus que transporta DNA exógeno em uma célula. Um vetor pode também incluir um ou mais genes, incluindo aqueles que produzem moléculas antissenso e/ou genes marcadores selecionáveis e outros elementos genéticos conhecidos na técnica. Um vetor pode transduzir, transformar ou infectar uma célula, fazendo assim com que a célula expresse as moléculas de ácido nucleico e/ou as proteínas codificadas pelo vetor. Um vetor opcionalmente inclui materiais para ajudar a conseguir a entrada da molécula de ácido nucleico na célula (por exemplo, um lipossoma, revestimento de proteína, etc.) [000129] Rendimento: Um rendimento estabilizado de cerca de 100% ou mais em relação ao rendimento de variedades de controle no mesmo local de crescimento crescendo ao mesmo tempo e sob as mesmas condições. Em modalidades particulares, rendimento melhorado ou melhoramento de rendimento significa uma cultivar com um rendimento estabilizado de 105% ou mais em relação ao rendimento de variedades de controle na mesma localização de crescimento contendo densidades significativas das pragas de coleópteros e/ou hemípteros que são prejudiciais para essa cultura crescendo ao mesmo tempo e nas mesmas condições, que são alvo das composições e métodos aqui descritos.
[000130] A menos que especificamente indicado ou implícito, os termos a/o e uma/um significam pelo menos um, tal como aqui utilizado.
[000131] A menos que explicado de outro modo explicitamente, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que os entendidos vulgarmente na técnica a que pertence esta descrição. As definições de termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas em, por exemplo, Lewin's Genes X, Jones &
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Bartlett Publishers, 2009 (ISBN 10 0763766321); Krebs et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Bioloqy, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Meyers R.A. (ed.), Molecular Bioloqy and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8). Todas as percentagens são em peso e todas as proporções da mistura solvente são em volume, a menos que indicado de outra forma. Todas as temperaturas são em qraus Celsius.
IV. Moléculas de Ácido Nucleico Compreendendo uma Sequência de Praga de Inseto A. Visão Geral [000132] Descritas aqui são moléculas de ácido nucleico úteis para o controle de praqas de insetos. Em alquns exemplos, a praqa de inseto é um inseto de coleóptero (por exemplo, espécie do qênero Diabrotica) ou hemíptero (por exemplo, espécie do qênero Euschistus). As moléculas de ácido nucleico descritas incluem polinucleotídeos-alvo (por exemplo, qenes nativos e polinucleotídeos não codificadores), dsRNA, siRNAs, shRNAs, hpRNAs e miRNAs. Por exemplo, as moléculas de dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA e/ou hpRNA são descritas em alqumas modalidades que podem ser especificamente complementares a todo ou parte de um ou mais ácidos nucleicos nativos em uma praqa de coleóptero e/ou hemíptero. Nestas e outras modalidades, os ácidos nucleicosnativos podem ser um ou mais qenes-alvo, cujo produto pode ser, por exemplo, e sem limitação: envolvido em um processo metabólico ou envolvido no desenvolvimento de larvas / ninfas. As moléculas de ácido nucleico aqui descritas, quando introduzidas em uma célula compreendendo pelo menos um ácido nucleico nativo ao qual as moléculas de ácido nucleico são especificamente complementares, podem iniciar iRNA na célula e, consequentemente, reduzir ou eliminar a expressão dos
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54/164 ácidos nucleicos nativos. Em alguns exemplos, a redução ou eliminação da expressão de um gene-alvo por uma molécula de ácido nucleico especificamente complementar a ela pode resultar na redução ou cessação do crescimento, desenvolvimento e/ou alimentação na praga.
[000133] Em algumas modalidades, pelo menos um gene-alvo em uma praga de inseto pode ser selecionado, em que o gene-alvo compreende um polinucleotídeo rpb7. Em exemplos particulares, seleciona-se um gene-alvo em uma praga de coleópteros, em que o gene-alvo compreende um polinucleotídeo selecionado entre SEQ ID NOs: 1, 3, 5 e 7-10. Em exemplos particulares, seleciona-se um genealvo em uma praga hemíptera, em que o gene-alvo compreende o polinucleotídeo de SEQ ID NOs: 78 e/ou o polinucleotídeo de SEQ ID NO: 80.
[000134] Em algumas modalidades, um gene-alvo pode ser uma molécula de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo que pode ser traduzido de forma reversa em silício para um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos contígua que é pelo menos 85% idêntica (por exemplo, pelo menos 84%, 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 100% ou 100% idênticos) à sequência de aminoácidos de um produto proteico de um polinucleotídeo rpb7. Um gene-alvo pode ser qualquer polinucleotídeo rpb7 em uma praga de inseto, cuja inibição pós-transcricional tem um efeito deletério no crescimento, sobrevivência e/ou viabilidade da praga, por exemplo, para proporcionar um benefício protetor contra a praga para uma planta. Em exemplos particulares, um gene-alvo é uma molécula de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo que pode ser traduzido de forma reversa in silico para um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos contígua que é pelo
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55/164 menos cerca de 85% idêntica, cerca de 90% idêntica, cerca de 95% idêntica, cerca de 96% idêntica, cerca de 97% idêntica, cerca de 98% idêntica, cerca de 99% idêntica, cerca de 100% idêntica, ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4;
SEQ ID NO: 6; ou SEQ ID NO: 79.
[000135] São fornecidos de acordo com a invenção DNAs cuja expressão resulta em uma molécula de RNA compreendendo um polinucleotídeo que é especificamente complementar a todo ou parte de uma molécula de RNA nativa que é codificada por um polinucleotídeo codificador em um inseto (por exemplo, coleópteros e/ou hemípteros). Em algumas modalidades, após a ingestão da molécula de RNA expressa por uma praga de inseto, pode ser obtida uma regulação negativa do polinucleotídeo codificador em células da praga. Em modalidades particulares, a regulação para baixo do polinucleotídeo codificador em células da praga de inseto pode resultar em um efeito deletério no crescimento e/ou desenvolvimento da praga. [000136] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos-alvo incluem RNAs não codificadores transcritos, tais como 5'UTRs; 3'UTRs; líderes de junção; íntrons; outrons (por exemplo, 5'UTR RNA subsequentemente modificado em junção trans); donatrons (por exemplo, RNA não codificador necessário para proporcionar sequências doadoras para a junção trans); e outro RNA transcrito não codificador de genes-alvo de pragas de insetos. Tais polinucleotídeos podem ser derivados tanto de genes mono-cistrônicos como policistrônicos.
[000137] Assim, também aqui descritos em ligação com algumas modalidades são moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNAs, siRNAs, miRNAs, shRNAs e hpRNAs) que compreendem pelo menos um polinucleotídeo que é especificamente complementar a todo ou parte de um ácido nucleico alvo em uma praga de inseto (por exemplo,
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56/164 coleóptero e/ou hemíptero). Em algumas modalidades, uma molécula de iRNA pode compreender polinucleotídeo (s) que são complementares a todos ou parte de uma pluralidade de ácidos nucleicos alvo; por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais ácidos nucleicos alvo. Em modalidades particulares, uma molécula de iRNA pode ser produzida in vitro ou in vivo por um organismo geneticamente modificado, tal como uma planta ou uma bactéria. Também são descritos cDNAs que podem ser utilizados para a produção de moléculas de dsRNA, moléculas de siRNA, moléculas de miRNA, moléculas de shRNA e/ou moléculas de hpRNA que são especificamente complementares a todo ou parte de um ácido nucleico alvo em uma praga de inseto. São ainda descritas construtos de DNA recombinante para utilização na obtenção de uma transformação estável de alvos hospedeiros particulares. Os alvos hospedeiros transformados podem expressar níveis eficazes de moléculas de dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA e/ou hpRNA a partir dos construtos de DNA recombinante. Assim, também é descrito um vetor de transformação de plantas compreendendo pelo menos um polinucleotídeo ligado operacionalmente a um promotor heterólogo funcional em uma célula vegetal, em que a expressão do (s) polinucleotídeo (s) resulta em uma molécula de RNA compreendendo um filamento de nucleobases contíguas que é especificamente complementar a todo ou parte de um ácido nucleico alvo em uma praga de inseto.
[000138] Em exemplos particulares, as moléculas de ácido nucleico úteis para o controle de pragas de insetos (por exemplo, coleópteros e/ou hemípteros) podem incluir: todos ou pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um ácido nucleico nativo isolado de Diabrotica compreendendo um polinucleotídeo rpb7 (por exemplo, SEQ ID NO: 1, 3 e 5); DNAs que quando expressos resultam em uma molécula de
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RNA compreendendo um polinucleotídeo que é especificamente complementar a todos ou pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma molécula de RNA nativa que é codificada por Diabrotica rpb7; moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNAs, siRNAs, miRNAs, shRNAs e hpRNAs) que compreendem pelo menos um polinucleotídeo que seja especificamente complementar a todos ou pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de Diabrotica rpb7; CDNAs que podem ser utilizados para a produção de moléculas de dsRNA, moléculas de siRNA, moléculas de miRNA, moléculas de shRNA e/ou moléculas de hpRNA que são especificamente complementares a todos ou pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de Diabrotica rpb7; todos ou pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um ácido nucleico nativo isolado de Euschistus heros compreendendo um polinucleotídeo rpb7 (por exemplo, SEQ ID NO: 78); DNAs que quando expressos resultam em uma molécula de RNA compreendendo um polinucleotídeo que é especificamente complementar a todos ou pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma molécula de RNA nativa que está codificada por E. heros rpb7; moléculas de iRNA que compreendem pelo menos um polinucleotídeo que é especificamente complementar a todos ou pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de E. heros rpb7; CDNAs que podem ser utilizados para a produção de moléculas de dsRNA, moléculas de siRNA, moléculas de miRNA, moléculas de shRNA e/ou moléculas de hpRNA que são especificamente complementares a todos ou parte de E. heros rpb7; e construtos de DNA recombinante para utilização na obtenção de uma transformação estável de alvos hospedeiros particulares, em que um alvo hospedeiro transformado compreende uma ou mais das moléculas de ácido nucleico precedentes.
B. Moléculas de Ácido Nucleico [000139] Os compostos incluem, inter alia, moléculas de iRNA (por
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58/164 exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA e hpRNA) que inibem a expressão do gene-alvo em uma célula, tecido ou órgão de uma praga de inseto (por exemplo, coleópteros e/ou hemípteros); e moléculas de DNA capazes de serem expressas como uma molécula de iRNA em uma célula ou micro-organismo para inibir a expressão do gene-alvo em uma célula, tecido ou órgão de uma praga de inseto.
[000140] Algumas modalidades da invenção proporcionam uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo pelo menos um (por exemplo, um, dois, três ou mais) polinucleotídeo(s) selecionado(s) a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 1, 3 e 5; o complemento ou complemento inverso de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, 3 e 5; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3 e 5 (por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NO: 7-10); o complemento ou complemento inverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, 3 e 5; um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO: 7-10; o complemento ou complemento inverso de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO: 7-10; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO: 7-10; e o complemento ou complemento reverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO: 7-10.
[000141] Algumas modalidades da invenção proporcionam uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo pelo menos um (ou seja, um, dois, três, ou mais) polinucleotídeos selecionados a partir
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59/164 do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 78; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 78; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 78 (por exemplo, SEQ ID NO: 80); o complemento ou complemento inverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 78; um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo hemíptero (por exemplo, BSB) compreendendo SEQ ID NO: 80; o complemento ou complemento inverso de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo de hemíptero compreendendo SEQ ID NO: 80; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo de hemíptero compreendendo SEQ ID NO: 80; e o complemento ou complemento inverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo de hemíptero compreendendo SEQ ID NO: 80.
[000142] Em modalidades particulares, o contato com ou a absorção por uma praga de inseto (por exemplo, coleópteros e/ou hemíptero) de um iRNA transcrito a partir do polinucleotídeo isolado inibe o crescimento, desenvolvimento e/ou alimentação da praga. Em algumas modalidades, o contato com ou a absorção pelo inseto ocorre por meio da alimentação em material vegetal ou isca que compreende o iRNA (isca de iRNA). Em algumas modalidades, o contato com ou a absorção pelo inseto ocorre por meio de pulverização de uma planta compreendendo o inseto com uma composição compreendendo o iRNA.
[000143] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico isolada de A invenção pode compreender pelo menos um (ou seja, um, dois, três, ou mais) polinucleotídeo (s) selecionado (s) do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 86; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 86; SEQ ID NO: 87; o complemento ou
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60/164 complemento inverso de SEQ ID NO: 87; SEQ ID NO: 88; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 89; SEQ ID NO: 90; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 90; SEQ ID NO: 91; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 91; SEQ ID NO: 92; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 92; SEQ ID NO: 93; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 93; SEQ ID NO: 94; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 94; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NO: 86-94; o complemento ou complemento inverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NO: 86-94; um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO: 89-92; o complemento ou complemento inverso de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO: 89-92; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO: 89-92; o complemento ou complemento inverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO: 89-92; um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo de Euschistus compreendendo SEQ ID NO: 94; o complemento ou complemento inverso de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo de Euschistus compreendendo SEQ ID NO: 94; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo de Euschistus compreendendo SEQ ID NO: 94; e o complemento ou complemento inverso de um fragmento de
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61/164 pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo de Euschistus compreendendo
SEQ ID NO: 94.
[000144] Em certas modalidades, as moléculas de dsRNA proporcionadas pela invenção compreendem polinucleotídeos complementares a uma transcrição de um gene-alvo compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO: 1, 3, 5 e 78 e fragmentos de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos dos mesmos, cuja inibição-alvo em uma praga de inseto resulta na redução ou remoção de um agente de polipeptídeo ou polinucleotídeo que é essencial para o crescimento, desenvolvimento ou outra função biológica da praga. Um polinucleotídeo selecionado pode exibir entre cerca de 80% e cerca de 100% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NO: 1, 3, 5 e 78; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5 e 78; e o complemento ou complemento inverso de qualquer dos anteriores. Por exemplo, um polinucleotídeo selecionado pode apresentar 79%; 80%; cerca de 81%; cerca de 82%; cerca de 83%; cerca de 84%; cerca de 85%; cerca de 86%; cerca de 87%; cerca de 88%; cerca de 89%; cerca de 90%; cerca de 91%; cerca de 92%; cerca de 93%; cerca de 94% cerca de 95%; cerca de 96%; cerca de 97%; cerca de 98%; cerca de 98,5%; cerca de 99%; cerca de 99,5%; ou cerca de 100% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5 e 78; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5 e 78 (por exemplo, SEQ ID NOs: 7-10 e 80); e o complemento ou complemento inverso de qualquer dos anteriores. [000145] Em algumas modalidades, uma molécula de DNA capaz de ser expressa como uma molécula de iRNA em uma célula ou microorganismo para inibir a expressão do gene-alvo pode compreender um único polinucleotídeo que é especificamente complementar a todo ou
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62/164 parte de um polinucleotídeo nativo encontrado em uma ou mais pragas de insetos alvo (por exemplo, uma espécie de parasita coleópteros ou hemípteros), ou a molécula de DNA pode ser construída como uma quimera a partir de uma pluralidade desses polinucleotídeos especificamente complementares.
[000146] Em outras modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode compreender um primeiro e um segundo polinucleotídeos separados por um espaçador. Um espaçador pode ser uma região compreendendo qualquer sequência de nucleotídeos que facilita a formação de estrutura secundária entre o primeiro e o segundo polinucleotídeos, quando isto é desejado. Em uma modalidade, o espaçador é parte de um polinucleotídeo codificador de senso ou antissenso para mRNA. O espaçador pode compreender alternativamente qualquer combinação de nucleotídeos ou seus homólogos que sejam capazes de serem ligados covalentemente a uma molécula de ácido nucleico. Em alguns exemplos, o espaçador pode ser um íntron (por exemplo, como íntron ST-LS1).
[000147] Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de DNA pode compreender um polinucleotídeo que codifica para uma ou mais moléculas de iRNA diferentes, em que cada uma das diferentes moléculas de iRNA compreende um primeiro polinucleotídeo e um segundo polinucleotídeo, em que o primeiro e o segundo polinucleotídeos são complementares entre si. O primeiro e o segundo polinucleotídeos podem estar ligados dentro de uma molécula de RNA por um espaçador. O espaçador pode constituir parte do primeiro polinucleotídeo ou do segundo polinucleotídeo. A expressão de uma molécula de RNA compreendendo o primeiro e o segundo nucleotídeos e polinucleotídeos pode conduzir à formação de uma molécula de dsRNA, por emparelhamento de base intramolecular específico dos primeiro e segundo nucleotídeo e polinucleotídeos. O
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63/164 primeiro polinucleotídeo ou o segundo polinucleotídeo podem ser substancialmente idênticos a um polinucleotídeo (por exemplo, um gene-alvo ou polinucleotídeo não codificador transcrito) nativo para uma praga de inseto (por exemplo, uma praga de coleóptero ou hemíptero), um derivado do mesmo ou um seu polinucleotídeo complementar.
[000148] As moléculas de ácido nucleico de dsRNA compreendem dois filamentos de ribonucleotídeos polimerizados e podem incluir modificações querano estrutura principal de açúcar de fosfato ou no nucleotídeo. As modificações na estrutura de RNA podem ser adaptadas para permitir a inibição específica. Em uma modalidade, as moléculas de dsRNA podem ser modificadas através de um processo enzimático ubíquo para que possam ser geradas moléculas de siRNA. Este processo enzimático pode utilizar uma enzima RNase III, tal como DICER em eucariotas, quer in vitro quer in vivo. Vide Elbashir et al. (2001) Nature 411: 494-8; e Hamilton and Baulcombe (1999) Science 286 (5441): 950-2. DICER ou enzimas RNase III funcionalmente equivalentes clivam filamentos maiores de dsRNA e/ou moléculas de hpRNA em oligonucleotídeos menores (por exemplo, siRNAs), cada um dos quais tem cerca de 19-25 nucleotídeos de comprimento. As moléculas de siRNA produzidas por estas enzimas têm 2 a 3 nucleotídeos 3' salientes, e 5' terminais fosfato e 3' hidroxila. As moléculas de siRNA geradas por enzimas RNase III são desenroladas e separadas em RNA de único filamento na célula. As moléculas de siRNA então hibridam especificamente com RNAs transcritos a partir de um gene-alvo, e ambas as moléculas de RNA são subsequentemente degradadas por um mecanismo inerente de degradação de RNA celular. Este processo pode resultar na degradação ou remoção eficaz do RNA codificado pelo gene-alvo no organismo-alvo. O resultado é o silenciamento pós-transcricional do
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64/164 gene-alvo. Em algumas modalidades, as moléculas de siRNA produzidas por enzimas RNase III endógenas a partir de moléculas de ácido nucleico heterólogas podem mediar eficientemente a regulação negativa de genes-alvo em pragas de insetos.
[000149] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode incluir pelo menos um polinucleotídeo que não ocorre naturalmente que pode ser transcrito em uma molécula de RNA de único filamento capaz de formar uma molécula de dsRNA in vivo através de hibridação intermolecular. Tais dsRNAs tipicamente se autoagrupam, e podem ser proporcionados na fonte de nutrição de uma praga de inseto (por exemplo, coleópteros ou hemípteros) para conseguir a inibição pós-transcricional de um gene-alvo. Nestas e outras modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode compreender dois polinucleotídeos diferentes que não ocorrem naturalmente, cada um dos quais é especificamente complementar a um gene-alvo diferente em uma praga de inseto. Quando uma tal molécula de ácido nucleico é proporcionada como uma molécula de dsRNA para, por exemplo, uma praga de coleóptero e/ou hemíptero, a molécula de dsRNA inibe a expressão de pelo menos dois genes-alvo diferentes na praga.
C. Obtenção de Moléculas de Ácido Nucleico [000150] Uma variedade de polinucleotídeos em pragas de insetos (por exemplo, coleópteros e hemípteros) pode ser utilizada como alvos para a concepção de moléculas de ácido nucleico, tais como iRNAs e moléculas de DNA que codificam iRNAs. A seleção de polinucleotídeos nativos não é, no entanto, um processo direto. Por exemplo, apenas um pequeno número de polinucleotídeos nativos em uma coletividade de coleópteros ou hemípteros serão alvos eficazes. Não se pode prever com certeza se um polinucleotídeo nativo particular pode ser efetivamente regulado para baixo pelas moléculas
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65/164 de ácido nucleico da invenção, ou se a regulação negativa de um polinucleotídeo nativo particular terá um efeito prejudicial no crescimento, viabilidade, alimentação e/ou sobrevivência de uma praga de inseto. A grande maioria dos polinucleotídeos nativos de coleópteros e de hemípteros, tais como ESTs isolados a partir daí (por exemplo, os polinucleotídeos de peptídeos coleópteros listados na Patente U.S. 7,612,194), não têm um efeito prejudicial no crescimento e/ou na viabilidade da praga. Nem é previsível quais dos polinucleotídeos nativos que podem ter um efeito prejudicial sobre uma praga de inseto são capazes de ser utilizados em técnicas recombinantes para expressar moléculas de ácido nucleico complementares a tais polinucleotídeos nativos em uma planta hospedeira e proporcionando o efeito prejudicial sobre a praga ao alimentar sem causar dano na planta hospedeira.
[000151] Em algumas modalidades, moléculas de ácido nucleico (por exemplo, moléculas de dsRNA a serem fornecidas na planta hospedeira de uma praga de inseto (por exemplo, coleóptero ou hemíptero) são selecionadas para cDNAs alvo que codificam proteínas ou partes de proteínas essenciais para o desenvolvimento de pragas, tais como polipeptídeos envolvidos em vias bioquímicas metabólicas ou catabólicas, divisão celular, metabolismo energético, digestão, reconhecimento de plantas hospedeiras e semelhantes. Tal como aqui descrito, a ingestão de composições por um organismo de praga alvo contendo um ou mais dsRNA, pelo menos um segmento do qual é especificamente complementar a pelo menos um segmento substancialmente idêntico de RNA produzido nas células do organismo de praga alvo, pode resultar na morte ou outra inibição do alvo. Pode utilizar-se um polinucleotídeo, quer DNA quer RNA, derivado de uma praga de insetos, para construir células vegetais protegidas contra a infestação pelas pragas. A planta hospedeira do coleóptero e/ou da
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66/164 praga hemíptera (por exemplo, Z. mays ou G. max), por exemplo, pode ser transformada para conter um ou mais polinucleotídeos derivados do coleóptero e/ou da praga hemíptera como aqui proporcionado. O polinucleotídeo transformado no hospedeiro pode codificar um ou mais RNAs que se formam em uma estrutura de dsRNA nas células ou fluidos biológicos dentro do hospedeiro transformado, tornando assim o dsRNA disponível se / quando a praga forma uma relação nutricional com o hospedeiro transgênico. Isto pode resultar na supressão da expressão de um ou mais genes nas células da praga e, finalmente, na morte ou inibição do seu crescimento ou desenvolvimento.
[000152] Em modalidades particulares, um gene é alvejado que está essencialmente envolvido no crescimento e desenvolvimento de uma praga de inseto (por exemplo, coleópteros ou hemípteros). Outros genes-alvo para utilização na presente invenção podem incluir, por exemplo, aqueles que desempenham papéis importantes na viabilidade, no movimento, na migração, no crescimento, no desenvolvimento, na infectividade e no estabelecimento dos locais de alimentação da praga. Um gene-alvo pode, portanto, ser um gene de manutenção ou um fator de transcrição. Adicionalmente, um polinucleotídeo de praga de inseto nativo para utilização na presente invenção também pode ser derivado de um homólogo (por exemplo, um ortólogo), de um gene de planta, viral, bacteriano ou de inseto, cuja função é conhecida dos versados na técnica, e o polinucleotídeo do qual é especificamente hibridável com um gene-alvo no genoma da praga alvo. Os métodos para identificar um homólogo de um gene com uma sequência de nucleotídeos conhecida por hibridação são conhecidos dos versados na técnica.
[000153] Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos para a obtenção de uma molécula de ácido nucleico compreendendo
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67/164 um polinucleotídeo para produzir uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA e hpRNA). Uma tal modalidade compreende: (a) analisar um ou mais genes-alvo para a sua expressão, função e fenótipo sobre a supressão génica mediada por dsRNA em um inseto (por exemplo, coleóptero ou hemíptero); (b) sondagem de uma biblioteca de cDNA ou gDNA com uma sonda que compreende a totalidade ou uma porção de um polinucleotídeo ou um seu homólogo a partir de uma praga alvo que exibe um fenótipo de crescimento ou desenvolvimento alterado (por exemplo, reduzido) em uma análise de supressão mediada por dsRNA; (c) identificar um clone de DNA que hibrida especificamente com a sonda; (d) isolar o clone de DNA identificado na etapa (b); (e) sequenciar o fragmento de cDNA ou gDNA que compreende o clone isolado na etapa (d), em que a molécula de ácido nucleico sequenciada compreende a totalidade ou uma porção substancial do RNA ou um seu homólogo; e f) sintetizar quimicamente a totalidade ou uma parte substancial de um gene, ou um siRNA, miRNA, hpRNA, mRNA, shRNA ou dsRNA.
[000154] Em outras modalidades, um método para obter um fragmento de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo para produzir uma porção substancial de uma molécula iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA e hpRNA) inclui: (a) sintetizar primeiro e segundo iniciadores oligonucleotídicos especificamente complementares a uma porção de um polinucleotídeo nativo de uma praga de inseto alvo (por exemplo, coleóptero ou hemíptero); e (b) a amplificação de um inserto de cDNA ou gDNA presente em um vetor de clonagem utilizando o primeiro e segundo iniciadores oligonucleotídicos da etapa (a), em que a molécula de ácido nucleico amplificada compreende uma porção substancial de um siRNA, miRNA, hpRNA, mRNA, shRNA, ou molécula de dsRNA.
[000155] Os ácidos nucleicos podem ser isolados, amplificados ou
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68/164 produzidos por várias abordagens. Por exemplo, pode ser obtida uma molécula de iRNA (por exemplo, ARNbc, siRNA, miRNA, shARN e hpRNA) por amplificação por PCR de um polinucleotídeo-alvo (por exemplo, um gene-alvo ou um polinucleotídeo não codificador transcrito alvo) derivado de um gDNA ou biblioteca de cDNA, ou porções dos mesmos. O DNA ou o RNA podem ser extraídos de um organismo-alvo, e as bibliotecas de ácido nucleico podem ser preparadas a partir daí utilizando métodos conhecidos dos versados habituais na técnica. gDNA ou bibliotecas de cDNA geradas a partir de um organismo-alvo podem ser utilizadas para amplificação por PCR e sequenciamento de genes-alvo. Um produto de PCR confirmado pode ser utilizado como um modelo para transcrição in vitro para gerar RNA senso e antissenso com promotores mínimos. Alternativamente, as moléculas de ácido nucleico podem ser sintetizadas por qualquer uma de várias técnicas (vide, por exemplo, Ozaki et al. (1992) Nucleic Acids Research, 20: 5205-5214; and Agrawal et al. (1990) Nucleic Acids Research, 18: 5419-5423), incluindo o uso de um sintetizador de DNA automatizado (por exemplo, um sintetizador de DNA / RNA modelo 392 ou 394 de P.E. Biosystems, Inc. (Foster City, Calif.)), utilizando química padrão, tal como a química de fosforamidita. Vide, por exemplo, Beaucage et al. (1992) Tetrahedron, 48: 2223-2311; U.S. Patents 4,980,460, 4,725,677, 4,415,732, 4,458,066, and 4,973,679. Químicas alternativas resultando em grupos de estrutura principal não naturais, tais como fosforotioato, fosforamidato e semelhantes também podem ser empregadas.
[000156] Uma molécula RNA, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA ou hpRNA da presente invenção pode ser produzida quimicamente ou enzimaticamente por um versado na matéria através de reações manuais ou automatizadas, ou in vivo em uma célula compreendendo uma molécula de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo
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69/164 que codifica a molécula de RNA, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA ou hpRNA. O RNA pode também ser produzido por síntese orgânica parcial ou total - qualquer ribonucleotídeo modificado pode ser introduzido por síntese enzimática ou orgânica in vitro. Uma molécula de RNA pode ser sintetizada por uma RNA polimerase celular ou uma RNA polimerase de bacteriófago (por exemplo, RNA polimerase T3, RNA polimerase T7 e RNA polimerase SP6). Os construtos de expressão úteis para a clonagem e expressão de polinucleotídeos são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Publicação Internacional PCT N° WO97/32016; e Patentes U.S. 5 593 874, 5 698 425, 5 712 135, 5 789 214 e 5 804 693. As moléculas de RNA que são sintetizadas quimicamente ou por síntese enzimática in vitro podem ser purificadas antes da introdução em uma célula. Por exemplo, as moléculas de RNA podem ser purificadas a partir de uma mistura por extração com um solvente ou resina, precipitação, eletroforese, cromatografia ou uma combinação dos mesmos. Alternativamente, as moléculas de RNA que são sintetizadas quimicamente ou por síntese enzimática in vitro podem ser utilizadas sem ou com um mínimo de purificação, por exemplo, para evitar perdas devido ao processamento da amostra. As moléculas de RNA podem ser secas para armazenamento ou dissolvidas em uma solução aquosa. A solução pode conter tampões ou sais para promover o recozimento e/ou estabilização de moléculas de dsRNA de filamentos duplos.
[000157] Em modalidades, uma molécula de dsRNA pode ser formada por uma único filamento de RNA autocomplementar ou a partir de duas filamentos de RNA complementares. As moléculas de dsRNA podem ser sintetizadas in vivo ou in vitro. Uma RNA polimerase endógena da célula pode mediar a transcrição de um ou duas filamentos de RNA in vivo, ou a RNA polimerase clonada pode ser utilizada para mediar a transcrição in vivo ou in vitro. A inibição
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70/164 pós-transcricional de um gene-alvo em uma praga de inseto pode ser alvo do hospedeiro por transcrição específica em um tipo de órgão, tecido ou célula do hospedeiro (por exemplo, utilizando um promotor específico de tecido); estimulação de uma condição ambiental no hospedeiro (por exemplo, utilizando um promotor indutível que responde a infecção, estresse, temperatura e/ou indutores químicos); e/ou engenharia de transcrição em um estágio de desenvolvimento ou idade do hospedeiro (por exemplo, utilizando um promotor específico do estágio de desenvolvimento). Os filamentos de RNA que formam uma molécula de dsRNA, quer transcritos in vitro quer in vivo, podem ou não ser poliadenilados e podem ou não ser capazes de serem traduzidos em um polipeptídeo pelo aparelho de tradução de uma célula.
D. Vetores Recombinantes e Transformação de Células Hospedeiras [000158] Em algumas modalidades, a invenção também proporciona uma molécula de DNA para introdução em uma célula (por exemplo, uma célula bacteriana, uma célula de levedura ou uma célula vegetal), em que a molécula de DNA compreende um polinucleotídeo que, quando da expressão a RNA e ingestão por uma praga de inseto (por exemplo, coleópteros e/ou hemípteros), consegue a supressão de um gene-alvo em uma célula, tecido ou órgão da praga. Assim, algumas modalidades proporcionam uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo um polinucleotídeo capaz de ser expresso como uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA e hpRNA) em uma célula de planta para inibir a expressão do gene-alvo em uma praga de inseto. A fim de iniciar ou aumentar a expressão, tais moléculas de ácido nucleico recombinantes podem compreender um ou mais elementos reguladores, cujos elementos reguladores podem estar
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71/164 operacionalmente ligados ao polinucleotídeo capaz de ser expresso como um iRNA. São conhecidos métodos para expressar uma molécula de supressão génica em plantas e podem ser utilizados para expressar um polinucleotídeo da presente invenção. Vide, por exemplo, Publicação Internacional PCT N° WO06/073727; e Publicação de Patente U.S. N° 2006/0200878 A1).
[000159] Em modalidades específicas, uma molécula de DNA recombinante da invenção pode compreender um polinucleotídeo que codifica um RNA que pode formar uma molécula de dsRNA. Tais moléculas de DNA recombinante podem codificar RNAs que podem formar moléculas de dsRNA capazes de inibir a expressão de gene (s) alvo endógeno em uma célula de pragas de inseto (por exemplo, coleópteros e/ou hemíptero) após ingestão. Em muitas modalidades, um RNA transcrito pode formar uma molécula de dsRNA que pode ser proporcionada em uma forma estabilizada; por exemplo, como uma estrutura de grampo e de haste e de alça.
[000160] Em algumas modalidades, um filamento de uma molécula de dsRNA pode ser formado por transcrição a partir de um polinucleotídeo que é substancialmente homólogo a um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NO: 1, 3, 5 e 78; o complemento ou complemento inverso de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, 3, 5 e 78; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5 e 78 (por exemplo, SEQ ID NOs: 7-10 e 80); o complemento ou complemento inverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer SEQ ID NOs: 1, 3, 5, e 78; um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO: 7-10; o complemento ou complemento inverso de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID
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NO: 7-10; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO: 7-10; o complemento ou complemento inverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO: 7-10; um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo hemíptero (por exemplo, BSB) compreendendo SEQ ID NO: 80; o complemento ou complemento inverso de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo de hemíptero compreendendo SEQ ID NO: 80; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo de hemíptero compreendendo SEQ ID NO: 80; e o complemento ou complemento inverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo de hemíptero compreendendo SEQ ID NO: 80.
[000161] Em algumas modalidades, um filamento de uma molécula de dsRNA pode ser formado por transcrição a partir de um polinucleotídeo que é substancialmente homólogo a um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7-10 e 80; o complemento ou complemento inverso de qualquer uma das SEQ ID NOs: 7-10 e 81; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5 e 78; e o complemento ou complemento reverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NO: 1,3, 5 e 78.
[000162] Em modalidades particulares, uma molécula de DNA recombinante que codifica um RNA que pode formar uma molécula de dsRNA pode compreender uma região de codificação em que pelo menos dois polinucleotídeos estão dispostos de modo que um
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73/164 polinucleotídeo está em uma orientação de senso e o outro polinucleotídeo está em uma orientação antissenso, em relação a pelo menos um promotor, em que o polinucleotídeo senso e o polinucleotídeo antissenso estão ligados ou ligados por um espaçador, por exemplo, de cerca de cinco (~ 5) a cerca de mil (~ 1000) nucleotídeos. O espaçador pode formar um ciclo entre os polinucleotídeos senso e antissenso. O polinucleotídeo senso ou o polinucleotídeo antissenso pode ser substancialmente homólogo a um gene-alvo (por exemplo, um gene rpb7 compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO: 1, 3, 5 e 78) ou um fragmento compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos contíguos do mesmo. Em algumas modalidades, no entanto, uma molécula de DNA recombinante pode codificar um RNA que pode formar uma molécula de dsRNA sem um espaçador. Em modalidades, um polinucleotídeo codificador de senso e um polinucleotídeo codificador antissenso podem ter diferentes comprimentos.
[000163] Os polinucleotídeos identificados como tendo um efeito prejudicial sobre uma praga de inseto ou um efeito protetor da planta em relação à praga podem ser facilmente incorporados em moléculas de dsRNA expressas através da criação de cassetes de expressão adequados em uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção. Por exemplo, tais polinucleotídeos podem ser expressos como um grampo com estrutura de haste e alça tomando um primeiro segmento correspondendo a um polinucleotídeo de um gene-alvo (por exemplo, um gene rpb7 compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO: 1, 3, 5 e 78 e um fragmento compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer um dos anteriores); ligando este polinucleotídeo a uma segunda região espaçadora de segmento que não é homóloga ou complementar ao primeiro segmento; e ligando este a um terceiro segmento, em que pelo menos uma porção do
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74/164 terceiro segmento é substancialmente complementar ao primeiro segmento. Um tal construto forma uma estrutura de haste e alça por emparelhamento de base intramolecular do primeiro segmento com o terceiro segmento, em que a estrutura de alça se forma compreendendo o segundo segmento. Vide, por exemplo, Publicações de Patente U.S. Nos. 2002/0048814 e 2003/0018993; e Publicações Internacionais PCT Nos. WO94/01550 e WO98/05770. Uma molécula de dsRNA pode ser gerada, por exemplo, na forma de uma estrutura de filamento duplo, tal como uma estrutura de haste-alça (por exemplo, grampo), pelo que a produção de siRNA direcionada para um polinucleotídeo de praga de inseto nativo (por exemplo, coleópteros e/ou hemípteros) é reforçada pela coexpressão de um fragmento do gene-alvo, por exemplo em uma cassete expressível de uma planta adicional, que leva a uma produção aumentada de siRNA, ou reduz a metilação para impedir o silenciamento de genes de transcrição do promotor de grampo de dsRNA.
[000164] Algumas modalidades da invenção incluem a introdução de uma molécula de ácido nucleico recombinante da presente invenção em uma planta (isto é, transformação) para alcançar níveis inibidores de praga de inseto (por exemplo, coleópteros e/ou hemíptero) de expressão de uma ou mais moléculas de iRNA. Uma molécula de DNA recombinante pode, por exemplo, ser um vetor, tal como um plasmídeo circular linear ou fechado. O sistema de vetor pode ser um único vetor ou plasmídeo, ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que contêm em conjunto o DNA total a ser introduzido no genoma de um hospedeiro. Além disso, um vetor pode ser uma expressão vetor. Os ácidos nucleicos da invenção podem, por exemplo, ser adequadamente inseridos em um vetor sob o controle de um promotor adequado que funcione em um ou mais hospedeiros para conduzir a expressão de um polinucleotídeo codificador ligado ou outro elemento
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75/164 de DNA. Muitos vetores estão disponíveis para esta finalidade e a seleção do vetor apropriado dependerá principalmente do tamanho do ácido nucleico a ser inserido no vetor e da célula hospedeira particular a ser transformada com o vetor. Cada vetor contém vários componentes dependendo da sua função (por exemplo, amplificação de DNA ou expressão de DNA) e da célula hospedeira particular com a qual é compatível.
[000165] Para transmitir proteção de uma praga de inseto (por exemplo, coleópteros e/ou hemípteros) a uma planta transgênica, um DNA recombinante pode, por exemplo, ser transcrito em uma molécula de iRNA (por exemplo, uma molécula de RNA que forma uma molécula de dsRNA) dentro dos tecidos ou fluidos da planta recombinante. Uma molécula de iRNA pode compreender um polinucleotídeo que é substancialmente homólogo e especificamente hibridável com um polinucleotídeo transcrito correspondente dentro de uma praga de inseto que pode causar danos à espécie da planta hospedeira. A praga pode contatar a molécula de iRNA que é transcrita em células da planta hospedeira transgênica, por exemplo, ingerindo células ou fluidos da planta hospedeira transgênica que compreendem a molécula de iRNA. Assim, em exemplos particulares, a expressão de um gene-alvo é suprimida pela molécula de iRNA dentro de coleópteros e/ou de pragas de hemípteros que infestam a planta hospedeira transgênica. Em algumas modalidades, a supressão da expressão do gene-alvo em uma praga do hemíptero e/ou coleóptero alvo pode resultar na proteção da planta contra o ataque da praga.
[000166] A fim de permitir a liberação de moléculas de iRNA para uma praga de inseto em uma relação nutricional com uma célula vegetal que tenha sido transformada com uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção, é necessária a expressão (isto é,
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76/164 transcrição) de moléculas de iRNA na célula vegetal. Assim, uma molécula de ácido nucleico recombinante pode compreender um polinucleotídeo da invenção operacionalmente ligado a um ou mais elementos reguladores, tais como um elemento promotor heterólogo que funciona em uma célula hospedeira, tal como uma célula bacteriana em que a molécula de ácido nucleico deve ser amplificada, e uma célula vegetal em que a molécula de ácido nucleico deve ser expressa.
[000167] Promotores adequados para utilização em moléculas de ácido nucleico da invenção incluem aqueles que são indutíveis, virais, sintéticos ou constitutivos, todos os quais são bem conhecidos na técnica. Exemplos não limitativos descrevendo tais promotores incluem as Patentes U.S. 6 437 217 (promotor RS81 de milho); 5 641 876 (promotor de actina de arroz); 6 426 446 (promotor RS324 de milho); 6 429 362 (promotor PR-1 de milho); 6.232.526 (promotor A3 de milho); 6 177 611 (promotores constitutivos de milho); 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142 e 5.530.196 (promotor CaMV 35S); 6 433 252 (promotor de oleosina L3 de milho); 6 429 357 (promotor de actina de arroz 2, e íntron de actina de arroz 2); 6,294,714 (promotores indutíveis por luz); 6 140 078 (promotores indutíveis em sal); 6,252,138 (promotores indutíveis por patógenos); 6.175.060 (promotores indutíveis por deficiência de fósforo); 6 388 170 (promotores bidirecionais); 6 635 806 (promotor de gama-coixina); e Publicação de Patente U.S. N° 2009/757,089 (promotor de aldolase de cloroplasto de milho). Promotores adicionais incluem o promotor da nopalina sintase (NOS) (Ebert et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84 (16): 5745-9) e os promotores da octopina sintase (OCS) (que são transportados nos plasmídeos indutores de tumor de Agrobacterium tumefaciens); os promotores de caulimovírus tais como o promotor 19S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) (Lawton et al., (1987) Plant Mol. Biol. 9:
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315-24); o promotor 35S de CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313: 810-2, o promotor 35S do vírus do mosaico da escrofulária (Walker et al. (1987) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84 (19): 6624- 8), o promotor do complexo de sacarose sintase (Yang e Russell (1990) Proc. Nat. Ac., USA 87: 4144-8), o promotor do complexo do gene R (Chandler et al. (1989) Plant Cell 1: 1175-83), o promotor do gene da proteína de ligação da clorofila a/b, CaMV 35S (Patentes US 5 322 938, 5 352 605, 5 359 142 e 5 530 19 6), FMV 35S (Patentes US 6 051 753 e 5 378 619), um promotor PC1SV (Patente US 5 850 019), o promotor SCP1 (Patente US 6 677 503) e promotores AGRtu.nos (GenBank™ N° de Adesão V00087, Depicker et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet 1:561-73, Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7).
[000168] Em modalidades particulares, as moléculas de ácido nucleico da invenção compreendem um promotor específico de tecido, tal como um promotor específico de raiz. Os promotores específicos de raiz dirigem a expressão de polinucleotídeos de codificação operativamente ligados, exclusiva ou preferivelmente, no tecido de raiz. Exemplos de promotores específicos de raiz são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Patentes U.S. 5,110,732; 5.459.252 e 5.837.848; e Opperman et al. (1994) Science 263: 221-3; e Hirel et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20: 207-18. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo ou fragmento para controle de pragas de coleópteros de acordo com a invenção podem ser clonados entre dois promotores específicos da raiz orientados em direções transcricionais opostas relativamente ao polinucleotídeo ou fragmento e que são operáveis em uma célula vegetal transgênica e expressos na mesma para produzir moléculas de RNA na célula vegetal transgênica que subsequentemente podem formar moléculas de dsRNA, como descrito acima. As moléculas de iRNA expressas nos tecidos das plantas podem ser ingeridas por uma praga de insetos de modo que a
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78/164 supressão da expressão do gene-alvo seja conseguida.
[000169] Os elementos reguladores adicionais que podem opcionalmente estar ligados operativamente a um ácido nucleico incluem 5'UTRs localizados entre um elemento promotor e um polinucleotídeo codificador que funciona como um elemento líder de tradução. O elemento líder de tradução está presente no mRNA totalmente processado e pode afetar o processamento da transcrição primária e/ou estabilidade do RNA. Exemplos de elementos líder de tradução incluem líderes de proteína de choque térmico de milho e petúnia (Patente U.S. 5 362 865), líderes de proteína de revestimento de vírus de plantas, líderes de rubisco de plantas e outros. Vide, por exemplo, Turner and Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36. Exemplos não limitantes de 5'UTRs incluem GmHsp (Patente U.S. 5,659,122); PhDnaK (Patent U.S. 5,362,865); AtAnt1; TEV (Carrington and Freed (1990) J. Virol. 64:1590-7); e AGRtunos (GenBank™ N° de Adesão V00087; e Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7).
[000170] Elementos reguladores adicionais que podem opcionalmente ser ligados operativamente a um ácido nucleico incluem também elementos não traduzidos 3', regiões de terminação de transcrição 3', ou regiões de poliadenilação. Estes são elementos genéticos localizados a jusante de um polinucleotídeo e incluem polinucleotídeos que proporcionam sinal de poliadenilação e/ou outros sinais reguladores capazes de afetar a transcrição ou processamento de mRNA. O sinal de poliadenilação funciona em plantas para provocar a adição de nucleotídeos de poliadenilato à extremidade 3' do precursor de mRNA. O elemento de poliadenilação pode ser derivado de uma variedade de genes de plantas, ou de genes de TDNA. Um exemplo não limitativo de uma região de terminação da transcrição 3' é a região 3' da nopalina sintase (nos 3', Fraley et al. (1983) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80: 4803-7). Um exemplo da
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79/164 utilização de diferentes regiões 3' não traduzidas é fornecido em
Ingelbrecht et al., (1989) Plant Cell 1: 671-80. Exemplos não limitativos de sinais de poliadenilação incluem um de um gene RbcS2 de Pisum sativum (Ps.RbcS2-E9, Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3: 1671-9) e
AGRtu.nos (GenBank™ N° de Adesão E01312).
[000171] Algumas modalidades podem incluir um vetor de transformação de plantas que compreende uma molécula de DNA isolada e purificada compreendendo pelo menos um dos elementos reguladores acima descritos operacionalmente ligados a um ou mais polinucleotídeos da presente invenção. Quando expressos, um ou mais polinucleotídeos resultam em uma ou mais moléculas de iRNA compreendendo um polinucleotídeo que é especificamente complementar a todo ou parte de uma molécula de RNA nativa em uma praga de inseto (por exemplo, coleópteros e/ou hemípteros). Deste modo, o (s) polinucleotídeo (s) pode (m) compreender um segmento codificando todo ou parte de um polirribonucleotídeo presente dentro de uma transcrição de RNA de coleóptero e/ou hemípteros alvo e pode compreender repetições invertidas de todo ou parte de uma transcrição de praga alvo. Um vetor de transformação de plantas pode conter polinucleotídeos especificamente complementares a mais de um polinucleotídeo-alvo, permitindo assim a produção de mais de um dsRNA para inibição da expressão de dois ou mais genes em células de uma ou mais populações ou espécies de pragas de insetos alvo. Os segmentos de polinucleotídeos especificamente complementares aos polinucleotídeos presentes em diferentes genes podem ser combinados em uma única molécula de ácido nucleico composta para expressão em uma planta transgênica. Tais segmentos podem ser contíguos ou separados por um espaçador.
[000172] Em outras modalidades, um plasmídeo da presente invenção que já contém pelo menos polinucleotídeo (s) da invenção
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80/164 pode ser modificado pela inserção sequencial de polinucleotídeos adicionais no mesmo plasmídeo, em que o (s) polinucleotídeo (s) adicional (is) são operativamente ligados aos mesmos elementos reguladores que o pelo menos polinucleotídeo (s) original (is). Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode ser concebida para a inibição de múltiplos genes-alvo. Em algumas modalidades, os múltiplos genes a serem inibidos podem ser obtidos a partir da mesma espécie de praga de inseto (por exemplo, coleópteros ou hemípteros), o que pode aumentar a eficácia da molécula de ácido nucleico. Em outras modalidades, os genes podem ser derivados de diferentes pragas de insetos, o que pode alargar a gama de pragas contra as quais o (s) agente (s) é (são) eficaz (es). Quando múltiplos genes são alvo de supressão ou uma combinação de expressão e supressão, um elemento de DNA policistrônico pode ser manipulado. [000173] Uma molécula ou vetor de ácido nucleico recombinante da presente invenção pode compreender um marcador selecionável que confere um fenótipo selecionável em uma célula transformada, tal como uma célula vegetal. Marcadores selecionáveis também podem ser usados para selecionar plantas ou células vegetais que compreendem uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção. O marcador pode codificar a resistência a biocidas, resistência a antibióticos (por exemplo, canamicina, geneticina (G418), bleomicina, higromicina, etc.) ou tolerância a herbicidas (por exemplo, glifosato, etc.). Exemplos de marcadores selecionáveis incluem, mas não estão limitados a: um gene neo que codifica para a resistência à canamicina e pode ser selecionado para utilizar canamicina, G418, etc.; um gene bar que codifica a resistência ao bialafos; um gene EPSP sintase mutante que codifica a tolerância ao glifosato; um gene de nitrilase que confere resistência à bromoxinila; um gene de acetolactato sintase (ALS) mutante que confere tolerância à
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81/164 imidazolinona ou sulfonilureia; e um gene de DHFR resistente ao metotrexato. Vários marcadores selecionáveis encontram-se disponíveis os quais conferem resistência à ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, canamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina, espectinomicina, rifampicina, estreptomicina e tetraciclina e semelhantes. Exemplos de tais marcadores selecionáveis estão ilustrados, por exemplo, nas Patentes U.S. 5 550 318; 5,633,435; 5,780,708 e 6,118,047.
[000174] Uma molécula ou vetor de ácido nucleico recombinante da presente invenção também pode incluir um marcador que pode ser pesquisado. Podem ser utilizados marcadores selecionáveis para monitorizar a expressão. Os exemplos de marcadores selecionáveis incluem um gene de p-glucuronidase ou uidA (GUS) que codifica uma enzima para a qual são conhecidos vários substratos cromogênicos (Jefferson et al. (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387-405); um gene Rlocus, que codifica um produto que regula a produção de pigmentos antocianina (cor vermelha) nos tecidos vegetais (Dellaporta et al. (1988) Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac. In 18th Stadler Genetics Symposium, P. Gustafson and R. Appels, eds. (New York: Plenum), pp. 263-82); um gene de βlactamase (Sutcliffe et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:373741); um gene que codifica uma enzima para a qual são conhecidos vários substratos cromogênicos (por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogênica); um gene de luciferase (Ow et al. (1986) Science 234: 856-9); um gene xylE que codifica uma catecol dioxigenase que pode converter catecois cromogênicos (Gene Zukowski et al., Gene 46 (2-3): 247-55); um gene de amilase (Ikatu et al., (1990) Bio / Technol., 8: 241-2); um gene de tirosinase que codifica uma enzima capaz de oxidar tirosina a DOPA e dopaquinona que por sua vez condensa a melanina (Katz et al. (1983) J. Gen. Microbiol.,
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129: 2703-14); e uma α-galactosidase.
[000175] Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico recombinantes, como descrito acima, podem ser utilizadas em métodos para a criação de plantas transgênicas e expressão de ácidos nucleicos heterólogos em plantas para preparar plantas transgênicas que exibem susceptibilidade reduzida a insetos (por exemplo, coleópteros e/ou hemípteros). Os vetores de transformação de plantas podem ser preparados, por exemplo, inserindo moléculas de ácido nucleico que codificam moléculas de iRNA em vetores de transformação de plantas e introduzindo estas em plantas.
[000176] Métodos adequados para transformação de células hospedeiras incluem qualquer método pelo qual o DNA pode ser introduzido em uma célula, por transformação de protoplastos (vide, por exemplo, Patente US 5 508 184), por absorção de DNA mediada por dessecação / inibição (vide, por exemplo, Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. 199: 183-8), para eletroporação vide, por exemplo, a Patente US 5 384 253), para agitação com fibras de carboneto de silício (vide, por exemplo, Patentes US 5 302 523 e 5 464 765), para transformação mediada por Agrobacterium (vide, por exemplo, Patentes US 5 563 055 5 591 616 5 693 512 5 824 877 5 981 840; 6.384.301) e para aceleração de partículas revestidas com DNA (vide, por exemplo, Patentes U.S. 5.015.580, 5.550.318, 5.538.880, 6.160.208, 6.399.861 e 6.403.865), etc. As técnicas que são particularmente úteis para transformar milho são descritas, por exemplo, nas Patentes US 7 060 876 e 5 591 616; e Publicação Internacional PCT WO95/06722. Através da aplicação de técnicas como estas, as células de virtualmente qualquer espécie podem ser transformadas de forma estável. Em algumas modalidades, o DNA de transformação é integrado no genoma da célula hospedeira. No caso de espécies multicelulares, as células transgênicas podem ser
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83/164 regeneradas em um organismo transgênico. Qualquer uma destas técnicas pode ser utilizada para produzir uma planta transgênica, por exemplo, compreendendo um ou mais ácidos nucleicos que codificam uma ou mais moléculas de iRNA no genoma da planta transgênica. [000177] O método mais utilizado para introduzir um vetor de expressão em plantas é baseado no sistema de transformação natural de Agrobacterium. A. tumefaciens e A. rhizogenes são bactérias patogênicas de plantas patogênicas que transformam geneticamente células vegetais. Os plasmídeos Ti e Ri de A. tumefaciens e A. rhizogenes, respectivamente, carregam genes responsáveis pela transformação genética da planta. Os plasmídeos Ti (indutores de tumores) contêm um grande segmento, conhecido como T-DNA, que é transferido para plantas transformadas. Outro segmento do plasmídeo Ti, a região Vir, é responsável pela transferência de T-DNA. A região de T-DNA é delimitada por repetições de terminais. Em vetores binários modificados, os genes indutores de tumor foram suprimidos, e as funções da região Vir são utilizadas para transferir DNA estranho limitado pelos elementos de fronteira de T-DNA. A região T também pode conter um marcador selecionável para a recuperação eficiente de células e plantas transgênicas e um sítio de clonagem múltiplo para inserir polinucleotídeos para transferência tal como um dsRNA que codifica ácido nucleico.
[000178] Em modalidades particulares, um vetor de transformação de plantas é derivado de um plasmídeo Ti de A. tumefaciens (vide, por exemplo, as Patentes US 4.536.475, 4.693.977, 4.886.937 e 5.501.967 e a Patente Europeia EP 0 122 791) ou um plasmídeo Ri de A Rizogenes. Outros vetores de transformação de plantas incluem, por exemplo e sem limitação, os descritos por Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303: 209-13; Bevan et al. (1983) Nature 304: 184-7; Klee et al. (1985) Bio / Technol. 3: 637-42; e na Patente Europeia EP 0 120 516,
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84/164 e os derivados de qualquer dos anteriores. Outras bactérias como Sinorhizobium, Rhizobium e Mesorhizobium que interagem com plantas naturalmente podem ser modificadas para mediar a transferência de genes para um número de plantas diversas. Estas bactérias simbióticas associadas a plantas podem ser tornadas competentes para a transferência de genes pela aquisição de um plasmídeo Ti desarmado e de um vetor binário adequado.
[000179] Depois de proporcionar DNA exógeno às células receptoras, as células transformadas são geralmente identificadas para cultura adicional e regeneração da planta. De modo a melhorar a capacidade de identificar células transformadas, pode-se desejar utilizar um gene marcador selecionável ou pesquisável, como previamente estabelecido, com o vetor de transformação utilizado para gerar o transformante. No caso em que se utiliza um marcador selecionável, as células transformadas são identificadas dentro da população celular potencialmente transformada expondo as células a um agente ou agentes seletivos. No caso em que é utilizado um marcador selecionável, as células podem ser rastreadas quanto ao traço do gene marcador desejado.
[000180] As células que sobrevivem à exposição ao agente seletivo, ou células que foram marcadas positivas em um ensaio de rastreio, podem ser cultivadas em meios que suportam regeneração de plantas. Em algumas modalidades, qualquer meio de cultura de tecido vegetal adequado (por exemplo, meio MS e N6) pode ser modificado incluindo outras substâncias, tais como reguladores de crescimento. O tecido pode ser mantido em um meio básico com reguladores de crescimento até que haja tecido suficiente para iniciar os esforços de regeneração da planta, ou após repetidas rondas de seleção manual, até que a morfologia do tecido seja adequada para regeneração (por exemplo, pelo menos 2 semanas), então transferidos para meios propícios à
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85/164 formação de brotos. As culturas são transferidas periodicamente até que haja formação suficiente de brotos. Uma vez formados os brotos, eles são transferidos para meios que conduzem à formação de raízes. Uma vez que são formadas raízes suficientes, as plantas podem ser transferidas para o solo para crescimento e maturação adicionais. [000181] Para confirmar a presença de uma molécula de ácido nucleico de interesse (por exemplo, um DNA que codifica uma ou mais moléculas de iRNA que inibem a expressão do gene-alvo em um coleóptero e/ou praga hemíptera) nas plantas de regeneração, podem ser realizados vários ensaios. Tais ensaios incluem, por exemplo: ensaios de biologia molecular, tais como Southern and northern blotting, PCR e sequenciamento de ácidos nucleicos; ensaios bioquímicos, tais como detecção da presença de um produto proteico, por exemplo, por meios imunológicos (ELISA e/ou Western blots) ou por função enzimática; ensaios de partes de plantas, tais como ensaios de folhas ou de raiz; e análise do fenótipo de toda a planta regenerada.
[000182] Os eventos de integração podem ser analisados, por exemplo, por amplificação por PCR usando, por exemplo, iniciadores oligonucleotídicos específicos para uma molécula de ácido nucleico de interesse. A genotipagem por PCR é entendida como incluindo, mas não se limitando a, amplificação por reação em filamento de polimerase (PCR) de gDNA derivado de tecido de calo de planta hospedeira isolado previsto para conter uma molécula de ácido nucleico de interesse integrada no genoma, seguida por clonagempadrão e análise de sequência de produtos de amplificação de PCR. Os métodos de genotipagem por PCR foram bem descritos (por exemplo, Rios, G. et al., Plant J. 32: 243-53) e podem ser aplicados a gDNA derivado de qualquer espécie vegetal (por exemplo, Z. mays) ou tipo de tecido, incluindo culturas de células.
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86/164 [000183] Uma planta transgênica formada utilizando métodos de transformação dependentes de Agrobacterium tipicamente contém um único DNA recombinante inserido em um cromossoma. O polinucleotídeo do único DNA recombinante é referido como um evento transgênico ou evento de integração. Tais plantas transgênicas são heterozigóticas para o polinucleotídeo exógeno inserido. Em algumas modalidades, uma planta transgênica homozigótica em relação a um transgene pode ser obtida por acasalamento sexual (autofecundação) de uma planta transgênica segregante independente que contém um único gene exógeno para si próprio, por exemplo, uma planta T0, para produzir semente T1. Um quarto da semente T1 produzida será homozigótica em relação ao transgene. Germinação de sementes T1 resulta em plantas que podem ser testadas quanto à heterozigosidade, tipicamente utilizando um ensaio de SNP ou um ensaio de amplificação térmica que permite a distinção entre heterozigotos e homozigotos (isto é, um ensaio de zigoto).
[000184] Em modalidades particulares, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais moléculas de iRNA diferentes são produzidas em uma célula de planta que tem um efeito inibidor de pragas de inseto (por exemplo, coleópteros e/ou hemíptero). As moléculas de iRNA (por exemplo, moléculas de dsRNA) podem ser expressas a partir de múltiplos ácidos nucleicos introduzidos em diferentes eventos de transformação, ou a partir de um único ácido nucleico introduzido em um único evento de transformação. Em algumas modalidades, uma pluralidade de moléculas de iRNA são expressas sob o controle de um único promotor. Em outras modalidades, uma pluralidade de moléculas de iRNA são expressas sob o controle de múltiplos promotores. Podem expressar-se moléculas de iRNA simples que compreendem múltiplos polinucleotídeos que são cada um homólogos a diferentes
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87/164 loci dentro de uma ou mais pragas de insetos (por exemplo, os loci definidos pelas SEQ ID NO: 1, 3, 5 e 78), ambos em diferentes populações da mesma espécie de praga de inseto, ou em diferentes espécies de pragas de insetos.
[000185] Além da transformação direta de uma planta com uma molécula de ácido nucleico recombinante, as plantas transgênicas podem ser preparadas atravessando uma primeira planta tendo pelo menos um evento transgênico com uma segunda planta sem tal evento. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma molécula de iRNA pode ser introduzida em uma primeira linhagem de planta que é passível de transformação para produzir uma planta transgênica, a qual planta transgênica pode ser cruzada com uma segunda linhagem de planta para introduzir o polinucleotídeo que codifica a molécula de iRNA para a segunda linhagem de planta.
[000186] Em alguns aspectos, são incluídos sementes e produtos de base produzidos por plantas transgênicas derivadas de células vegetais transformadas, em que as sementes ou produtos de base compreendem uma quantidade detectável de um ácido nucleico da invenção. Em algumas modalidades, tais produtos de base podem ser produzidos, por exemplo, obtendo plantas transgênicas e preparando alimentos ou ração a partir delas. Os produtos de base que compreendem um ou mais dos polinucleotídeos da invenção incluem, por exemplo e sem limitação: refeições, óleos, grãos ou sementes esmagadas ou inteiras de uma planta, e qualquer produto alimentar compreendendo qualquer farinha, óleo ou grãos inteiros ou esmagados de uma planta ou semente recombinante compreendendo um ou mais dos ácidos nucleicos da invenção. A detecção de um ou mais dos polinucleotídeos da invenção em um ou mais produtos de base ou produtos de base é evidência de fato de que a mercadoria ou
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88/164 produto de base é produzido a partir de uma planta transgênica concebida para expressar uma ou mais das moléculas de iRNA da invenção com o objetivo de controlar pragas de insetos (por exemplo, coleópteros e/ou hemípteros).
[000187] Em algumas modalidades, uma planta ou semente transgênica compreendendo uma molécula de ácido nucleico da invenção também pode compreender pelo menos um outro evento transgênico no seu genoma, incluindo, sem limitação: um evento transgênico a partir do qual é transcrita uma molécula de iRNA direcionada para um locus em um coleóptero ou uma praga de hemíptero diferente da definida pela SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 78, tal como, por exemplo, um ou mais loci selecionados a partir do grupo que consiste em Caf1-180 (Publicação de Pedido de Patente U.S. N° 2012/0174258), VatpaseC (Publicação de Pedido de Patente U.S. N° 2012/0174259), Rho1 (Publicação de Pedido de Patente U.S. N° 2012/0174260), VatpaseH (Publicação de Pedido de Patente U.S. N° 2012/0198586), PPI-87B (Publicação de Pedido de Patente U.S. N° 2013/0091600), RPA70 (Publicação de Pedido de Patente U.S. N° 2013/0091601), RPS6 (Publicação de Pedido de Patente U.S. N° 2013/0097730), alvos ROP RNAi, como descrito no Pedido de Patente U.S. N° 14/577,811, alvos RNA polimerase I1 RNAi, como descrito no Pedido de Patente U.S. N° 62/133,214, alvos RNA polimerase II140 RNAi, como descrito no Pedido de Patente U.S. N° 14/577,854, alvos RNA polimerase II215 RNAi, como descrito no Pedido de Patente U.S. N° 62/133,202, alvos RNA polimerase II33 RNAi, como descrito no Pedido de Patente U.S. N° 62/133,210), alvos ncm RNAi, como descrito no Pedido de Patente U.S. N° 62/095487, alvos Dre4 RNAi, como descrito no Pedido de Patente U.S. N° 14/705,807, alvos COPI alpha RNAi, como descrito no Pedido de Patente U.S. N° 62/063,199, alvos COPI beta RNAi, como
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89/164 descrito no Pedido de Patente U.S. N° 62/063,203, alvos COPI gama RNAi, como descrito no Pedido de Patente U.S. N° 62/063,192, alvos COPI delta RNAi, como descrito no Pedido de Patente U.S. N° 62/063,216, alvos de fator de alongamento de transcrição spt5 RNAi, como descrito no Pedido de Patente U.S. N° 62/168613, e alvos histona chaperona spt6 RNAi, como descrito no Pedido de Patente
U. S. N° 62/168606; um evento transgênico a partir do qual é transcrita uma molécula de iRNA direcionada para um gene em um organismo diferente de um coleóptero e/ou de uma praga hemíptera (por exemplo, um nemátodo parasítico de plantas); um gene que codifica uma proteína inseticida (por exemplo, uma proteína inseticida Bacillus thuringiensis, um polipeptídeo PIP-1 e um polipeptídeo AflP); um gene de tolerância a herbicidas (por exemplo, um gene que proporciona tolerância ao glifosato); e um gene que contribui para um fenótipo desejável na planta transgênica, tal como aumento do rendimento, metabolismo alterado dos ácidos graxos ou restauração da esterilidade masculina citoplasmática. Em modalidades particulares, os polinucleotídeos que codificam moléculas de iRNA da invenção podem ser combinados com outras características desejadas de controle e doença de inseto em uma planta para alcançar os traços desejados para controle melhorado da doença da planta e danos causados por insetos. A combinação de traços de controle de insetos que empregam modos de ação distintos pode proporcionar plantas transgênicas protegidas com durabilidade superior sobre plantas que possuem um único traço de controle, por exemplo, devido à menor probabilidade de que a resistência ao traço se desenvolva no campo.
V. Supressão de Gene-alvo em uma Praga de Insetos [000188] Em algumas modalidades da invenção, pelo menos uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de pragas de insetos (por exemplo, coleópteros e/ou hemípteros) pode ser proporcionada a
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90/164 uma praga de inseto, em que a molécula de ácido nucleico conduz a silenciamento de genes mediado por iRNA Na praga. Em modalidades particulares, uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA e hpRNA) pode ser proporcionada a um coleóptero e/ou a uma praga de hemíptero. Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de pragas de insetos pode ser proporcionada a uma praga por contato da molécula de ácido nucleico com a praga. Nestas e outras modalidades, uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de pragas de insetos pode ser proporcionada em um substrato de alimentação da praga, por exemplo, uma composição nutricional. Nestas e outras modalidades, uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de uma praga de inseto pode ser proporcionada através da ingestão de material vegetal compreendendo a molécula de ácido nucleico que é ingerida pela praga. Em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico está presente no material vegetal através da expressão de um ácido nucleico recombinante introduzido no material vegetal, por exemplo, por transformação de uma célula vegetal com um vetor compreendendo o ácido nucleico recombinante e regeneração de um material vegetal ou planta inteira a partir da célula vegetal transformada.
B. Supressão de Gene-alvo Mediada por iRNA [000189] Em algumas modalidades, a invenção proporciona moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA e hpRNA) que podem ser concebidas para direcionar polinucleotídeos nativos essenciais (por exemplo, genes essenciais) no transcriptoma de uma praga de inseto (por exemplo, uma praga de coleóptero (por exemplo, WCR, NCR e SCR) ou hemíptero (por exemplo, BSB)), por exemplo projetando uma molécula de iRNA que compreende pelo menos um filamento compreendendo um polinucleotídeo que seja
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91/164 especificamente complementar ao polinucleotídeo-alvo. A sequência de uma molécula de iRNA assim concebida pode ser idêntica à do polinucleotídeo-alvo ou pode incorporar desajustes que não impeçam a hibridação específica entre a molécula de iRNA e o seu polinucleotídeo-alvo.
[000190] As moléculas de iRNA da invenção podem ser utilizadas em métodos para a supressão genética em uma praga de inseto (por exemplo, coleóptero e/ou hemíptero), reduzindo assim o nível ou incidência de danos causados pela praga em uma planta (por exemplo, uma planta transformada protegida compreendendo uma molécula de iRNA). Tal como aqui utilizado, o termo supressão gênica refere-se a qualquer dos métodos bem conhecidos para reduzir os níveis de proteína produzida como resultado da transcrição de genes para mRNA e subsequente tradução do mRNA, incluindo a redução da expressão de proteína a partir de um gene ou um polinucleotídeo codificador incluindo a inibição pós-transcricional da expressão e supressão transcricional. A inibição pós-transcricional é mediada por homologia específica entre todo ou uma parte de um mRNA transcrito a partir de um gene direcionado para a supressão e a molécula de iRNA correspondente utilizada para a supressão. Adicionalmente, a inibição pós-transcricional refere-se à redução substancial e mensurável da quantidade de mRNA disponível na célula para ligação a ribossomas.
[000191] Em modalidades em que uma molécula de iRNA é uma molécula de dsRNA, a molécula de dsRNA pode ser clivada pela enzima DICER em moléculas curtas de siRNA (aproximadamente 20 nucleotídeos de comprimento). A molécula de siRNA de filamento duplo gerada pela atividade de DICER sobre a molécula de dsRNA pode ser separada em dois siRNA de filamento simples; o filamento passageiro e o filamento guia. O filamento passageiro pode ser
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92/164 degradado, e a filamento guia pode ser incorporado no RISC. A inibição pós-transcricional ocorre por hibridação específica do filamento guia com um polinucleotídeo especificamente complementar de uma molécula de mRNA e subsequente clivagem pela enzima
Argonaute (componente catalítico do complexo RISC).
[000192] Em modalidades da invenção, qualquer forma de molécula de iRNA pode ser usada. Aqueles versados na técnica compreenderão que as moléculas de dsRNA são tipicamente mais estáveis durante a preparação e durante a etapa de proporcionar a molécula de iRNA a uma célula do que as moléculas de RNA de único filamento e são tipicamente também mais estáveis em uma célula. Deste modo, embora as moléculas de siRNA e de miRNA, por exemplo, possam ser igualmente eficazes em algumas modalidades, uma molécula de dsRNA pode ser escolhida devido à sua estabilidade.
[000193] Em modalidades particulares, é proporcionada uma molécula de ácido nucleico que compreende um polinucleotídeo in vitro para produzir uma molécula de iRNA que é substancialmente homóloga a uma molécula de ácido nucleico codificada por um polinucleotídeo dentro do genoma de uma praga de inseto (por exemplo, coleóptero e/ou hemíptero). Em certas modalidades, a molécula de iRNA transcrita in vitro pode ser uma molécula de dsRNA estabilizada que compreende uma estrutura de haste-laço. Depois de uma praga de inseto contatar a molécula de iRNA transcrita in vitro, pode ocorrer inibição pós-transcricional de um gene-alvo na praga (por exemplo, um gene essencial).
[000194] Em algumas modalidades da invenção, a expressão de uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos contíguos (por exemplo, pelo menos 19 nucleotídeos contíguos) de um polinucleotídeo é utilizada em um método para a inibição pós-transcricional de um gene-alvo em uma praga de inseto
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93/164 (por exemplo, coleópteros e/ou hemípteros), em que o polinucleotídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 86; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 86; SEQ ID NO: 87; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 87; SEQ ID NO: 88; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 93; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 93; um RNA expresso a partir de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO: 1; o complemento ou complemento inverso de um RNA expresso a partir de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO: 1; um RNA expresso a partir de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO: 3; o complemento ou complemento inverso de um RNA expresso a partir de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO: 3; um RNA expresso a partir de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO: 5; o complemento ou complemento inverso de um RNA expresso a partir de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO: 5; um RNA expresso a partir de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo de Euschistus heros compreendendo SEQ ID NO: 78; e o complemento ou complemento inverso de um RNA expresso a partir de um polinucleotídeo codificador nativo de um organismo de E. heros compreendendo SEQ ID NO: 78. As moléculas de ácido nucleico compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos contíguos dos polinucleotídeos anteriores incluem, por exemplo e sem limitação, fragmentos compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 89-92 e 94. Em certas modalidades, expressão de uma
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94/164 molécula de ácido nucleico que é pelo menos cerca de 80% idêntica (por exemplo, 79%, cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86% Cerca de 89%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% , cerca de 100%, e 100%) com qualquer dos anteriores pode ser utilizada. Nestas e outras modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode ser expressa que hibrida especificamente com uma molécula de RNA presente em pelo menos uma célula de uma praga de inseto (por exemplo, coleópteros e/ou hemíptero).
[000195] Em algumas modalidades, é proporcionada uma molécula de iRNA em uma composição nutricional aqui referida como uma isca de iRNA. Uma isca de iRNA pode ser formada em modalidades particulares quando uma molécula de iRNA (por exemplo, um dsRNA) é misturada com um alimento do inseto-alvo, um atrativo do inseto, ou ambos. Quando o inseto come uma isca de iRNA, o inseto pode consumir a molécula de iRNA. Uma isca de iRNA pode ser, por exemplo e sem limitação, um grânulo, gel, pó fluido, líquido ou sólido. Em modalidades particulares, uma molécula de iRNA pode ser incorporada em uma formulação de isca tal como a descrita na Patente U.S. N° 8 530 440, cujo conteúdo é aqui incorporado na sua totalidade por esta referência. Em alguns exemplos, uma isca de iRNA é colocada dentro ou em volta do ambiente de uma praga de inseto, de modo que, por exemplo, a praga pode entrar em contato com e/ou ser atraída para a isca de iRNA.
[000196] É uma característica importante de algumas modalidades aqui que o sistema de inibição pós-transcrição de iRNA é capaz de tolerar variações de sequência entre os genes-alvo que poderiam ser esperadas devido à mutação genética, polimorfismo de tensão ou
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95/164 divergência evolutiva. A molécula de ácido nucleico introduzida pode não necessitar de ser absolutamente homóloga quer a um produto de transcrição primário ou a um mRNA totalmente processado de um gene-alvo, desde que a molécula de ácido nucleico introduzida seja especificamente hibridável a um produto de transcrição primária ou um mRNA totalmente processado do gene-alvo. Além disso, a molécula de ácido nucleico introduzida pode não necessitar de ser de comprimento total, relativamente a um produto de transcrição primário ou a um mRNA totalmente processado do gene-alvo.
[000197] A inibição de um gene-alvo utilizando a tecnologia iRNA da presente invenção é específica da sequência; isto é, os polinucleotídeos substancialmente homólogos à (s) molécula (s) de iRNA são alvo de inibição genética. Em algumas modalidades, uma molécula de RNA compreendendo um polinucleotídeo com uma sequência de nucleotídeos que é idêntica à de uma porção de um gene-alvo pode ser utilizada para inibição. Nestas e outras modalidades, pode ser utilizada uma molécula de RNA compreendendo um polinucleotídeo com uma ou mais mutações de inserção, de deleção e/ou de ponto relativamente a um polinucleotídeo-alvo. Em modalidades particulares, uma molécula de iRNA e uma porção de um gene-alvo podem compartilhar, por exemplo, pelo menos entre cerca de 80%, pelo menos entre cerca de 81%, pelo menos entre cerca de 82%, pelo menos entre cerca de 83%, pelo menos de pelo menos cerca de 84%, pelo menos de cerca de 85%, pelo menos de cerca de 86%, pelo menos de cerca de 87%, pelo menos de cerca de 88%, pelo menos de cerca de 89%, pelo menos de cerca de 90%, pelo menos de cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos desde cerca de 93%, pelo menos desde cerca de 94%, pelo menos desde cerca de 95%, pelo menos desde cerca de 96%, pelo menos desde cerca de 97%, pelo menos cerca de
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98%, pelo menos de cerca de 99%, pelo menos de cerca de 100% e 100% de identidade de sequência. Alternativamente, a região duplex de uma molécula de dsRNA pode ser especificamente hibridável com uma porção de uma transcrição de gene-alvo. Em moléculas especificamente hibridizáveis, um polinucleotídeo inferior ao comprimento total que exibe uma homologia maior compensa um polinucleotídeo mais longo, menos homólogo. O comprimento do polinucleotídeo de uma região duplex de uma molécula de dsRNA que é idêntica a uma porção de uma transcrição de gene-alvo pode ser pelo menos cerca de 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500 ou pelo menos cerca de 1000 bases. Em algumas modalidades, pode ser utilizado um polinucleotídeo com mais de 20-100 nucleotídeos. Em modalidades particulares, pode ser utilizado um polinucleotídeo superior a cerca de 200-300 nucleotídeos. Em modalidades particulares, pode ser utilizado um polinucleotídeo superior a cerca de 500-1000 nucleotídeos, dependendo do tamanho do gene-alvo.
[000198] Em certas modalidades, a expressão de um gene-alvo em uma praga (por exemplo, coleóptero ou hemíptero) pode ser inibida pelo menos 10%; pelo menos 33%; pelo menos 50%; ou pelo menos 80% dentro de uma célula da praga, de modo que ocorre uma inibição significativa. Inibição significativa refere-se à inibição acima de um limite que resulta em um fenótipo detectável (por exemplo, cessação do crescimento, cessação da alimentação, cessação do desenvolvimento, mortalidade induzida, etc.) ou uma diminuição detectável no RNA e/ou produto de gene correspondente ao gene-alvo sendo inibido. Embora, em certas modalidades da invenção a inibição ocorra substancialmente em todas as células da praga, em outras modalidades a inibição ocorre apenas em um subconjunto de células que expressam o gene-alvo.
[000199] Em algumas modalidades, a supressão transcricional é
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97/164 mediada pela presença em uma célula de uma molécula de dsRNA que exibe uma identidade de sequência substancial com um DNA promotor ou o complemento do mesmo para efetuar o que é referido como supressão trans de promotor. A supressão de genes pode ser eficaz contra genes-alvo em uma praga de insetos que pode ingerir ou contatar tais moléculas de dsRNA, por exemplo, por ingestão ou contato com material vegetal contendo as moléculas de dsRNA. As moléculas de dsRNA para utilização na supressão trans de promotor podem ser especificamente concebidas para inibir ou suprimir a expressão de um ou mais polinucleotídeos homólogos ou complementares nas células da praga de inseto. A supressão do gene pós-transcricional por RNA antissenso ou orientado para o senso para regular a expressão génica em células vegetais é descrita nas Patentes U.S. 5.107.065; 5,759,829; 5,283,184; e 5.231.020.
C. Expressão de Moléculas de iRNA Fornecidas a uma Praga de Insetos [000200] A expressão de moléculas de iRNA para a inibição de genes mediada por iRNA em uma praga de insetos (por exemplo, coleópteros e/ou hemípteros) pode ser realizada em qualquer um de muitos dos formatos in vitro ou in vivo. As moléculas de iRNA podem então ser fornecidas a uma praga de inseto, por exemplo, por contato das moléculas de iRNA com a praga, ou fazendo com que a praga iniba ou de outro modo internalize as moléculas de iRNA. Algumas modalidades incluem plantas hospedeiras transformadas de um coleóptero e/ou de uma praga de hemíptero, células de plantas transformadas e progénie de plantas transformadas. As células vegetais transformadas e as plantas transformadas podem ser manipuladas para expressar uma ou mais das moléculas de iRNA, por exemplo, sob o controle de um promotor heterólogo, para proporcionar um efeito protetor de pragas. Assim, quando uma planta ou célula
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98/164 vegetal transgênica é consumida por uma praga de inseto durante a alimentação, a praga pode ingerir moléculas de iRNA expressas nas plantas ou células transgênicas. Os polinucleotídeos da presente invenção também podem ser introduzidos em uma grande variedade de micro-organismo procarióticos e eucarióticos hospedeiros para produzir moléculas de iRNA. O termo micro-organismo inclui espécies procarióticas e eucarióticas, tais como bactérias e fungos. [000201] A modulação da expressão gênica pode incluir a supressão parcial ou completa dessa expressão. Em uma outra modalidade, um método para a supressão da expressão de um gene em uma praga de inseto (por exemplo, coleópteros e/ou hemíptero) consiste em proporcionar no tecido do hospedeiro da praga uma quantidade supressora de genes de pelo menos uma molécula de dsRNA formada após a transcrição de um polinucleotídeo como aqui descrito, pelo menos um segmento do qual é complementar a um mRNA dentro das células da praga de inseto. Uma molécula de dsRNA, incluindo a sua forma modificada tal como uma molécula de siRNA, miRNA, shARN ou hpRNA, ingerida por uma praga de inseto pode ser pelo menos de cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85% 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou cerca de 100% idêntica a uma molécula de RNA transcrita a partir de uma molécula de DNA rpb7, por exemplo, compreendendo um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7-10, 78 e 80. Moléculas de ácido nucleico isoladas e substancialmente purificadas incluindo, mas não limitadas a, polinucleotídeos que não ocorrem naturalmente e construtos de DNA recombinantes para proporcionar moléculas de dsRNA são portanto proporcionadas, as quais suprimem ou inibem a expressão de um polinucleotídeo codificador endógeno ou um polinucleotídeo codificador alvo em uma praga de inseto quando introduzidas na
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99/164 mesma.
[000202] Modalidades particulares proporcionam um sistema de distribuição para a administração de moléculas de iRNA para a inibição pós-transcricional de um ou mais genes-alvo em um inseto (por exemplo, coleóptero e/ou hemíptero) e controle de uma população da praga de plantas. Em algumas modalidades, o sistema de administração compreende a ingestão de uma célula de planta transgênica hospedeira ou conteúdos da célula hospedeira compreendendo moléculas de RNA transcritas na célula hospedeira. Nestas e outras modalidades, é criada uma célula de planta transgênica ou uma planta transgênica que contém um construto de DNA recombinante que proporciona uma molécula de dsRNA estabilizada da invenção. As células de plantas transgênicas e plantas transgênicas compreendendo ácidos nucleicos que codificam uma molécula de iRNA particular podem ser produzidas empregando tecnologias de DNA recombinante (tais tecnologias básicas são bem conhecidas na técnica) para construir um vetor de transformação de plantas compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma molécula de iRNA da invenção (por exemplo, uma molécula estabilizada de dsRNA); para transformar uma célula ou planta vegetal; e para gerar a célula vegetal transgênica ou a planta transgênica que contém a molécula de iRNA transcrita.
[000203] Para transmitir uma proteção contra pragas de insetos (por exemplo, coleópteros e/ou hemípteros) a uma planta transgênica, uma molécula de DNA recombinante pode, por exemplo, ser transcrita em uma molécula de iRNA, tal como uma molécula de dsRNA, uma molécula de siRNA, uma molécula de miRNA, ShRNA, ou uma molécula de hpRNA. Em algumas modalidades, uma molécula de RNA transcrita a partir de uma molécula de DNA recombinante pode formar uma molécula de dsRNA dentro dos tecidos ou fluidos da planta
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100/164 recombinante. Uma tal molécula de dsRNA pode estar compreendida em parte de um polinucleotídeo que é idêntico a um polinucleotídeo correspondente transcrito de um DNA dentro de uma praga de inseto de um tipo que pode infestar a planta hospedeira. A expressão de um gene-alvo dentro da praga é suprimida pela molécula de dsRNA, e a supressão da expressão do gene-alvo na praga resulta na proteção da planta transgênica contra a praga. Verificou-se que os efeitos moduladores das moléculas de dsRNA são aplicáveis a uma variedade de genes expressos em pragas, incluindo, por exemplo, genes endógenos responsáveis pelo metabolismo celular ou transformação celular, incluindo genes de manutenção doméstica; fatores de transcrição; genes relacionados com muda; e outros genes que codificam polipeptídeos envolvidos no metabolismo celular ou no crescimento e desenvolvimento normais.
[000204] Para a transcrição a partir de um transgene in vivo ou de um construto de expressão, uma região reguladora (por exemplo, promotor, intensificador, silenciador e sinal de poliadenilação) pode ser utilizada em algumas modalidades para transcrever o filamento de RNA (ou filamentos). Por conseguinte, em algumas modalidades, tal como descrito acima, um polinucleotídeo para utilização na produção de moléculas de iRNA pode estar operacionalmente ligado a um ou mais elementos promotores funcionais em uma célula hospedeira vegetal. O promotor pode ser um promotor endógeno, normalmente residente no genoma do hospedeiro. O polinucleotídeo da presente invenção, sob o controle de um elemento promotor ligado operativamente, pode ainda ser flanqueado por elementos adicionais que afetam vantajosamente a sua transcrição e/ou a estabilidade de uma transcrição resultante. Tais elementos podem estar localizados a montante do promotor operacionalmente ligado, a jusante da extremidade 3' do construto de expressão, e podem ocorrer tanto a
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101/164 montante do promotor como a jusante da extremidade 3' do construto de expressão.
[000205] Algumas modalidades proporcionam métodos para reduzir o dano a uma planta hospedeira (por exemplo, uma planta de milho) causada por uma praga de inseto (por exemplo, coleópteros e/ou hemípteros) que se alimenta na planta, em que o método compreende proporcionar na planta hospedeira uma célula vegetal transformada que expressa pelo menos uma molécula de ácido nucleico da invenção, em que a(s) molécula(s) de ácido nucleico atua(m) quando é(são) absorvida(s) pela(s) praga(s) para inibir a expressão de um polinucleotídeo-alvo dentro da(s) praga(s), cuja inibição da expressão resulta em mortalidade e/ou crescimento reduzido da(s) praga(s), reduzindo assim o dano à planta hospedeira causado pela(s) praga(s). Em algumas modalidades, a(s) molécula(s) de ácido nucleico compreende(m) moléculas de dsRNA. Nestas e outras modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende moléculas de dsRNA que compreendem cada uma mais de um polinucleotídeo que é especificamente hibridável com uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de coleóptero e/ou de hemíptero. Em algumas modalidades, a (s) molécula (s) de ácido nucleico consiste(m) em um polinucleotídeo que é especificamente hibridável com uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de pragas de insetos.
[000206] Em algumas modalidades, é proporcionado um método para aumentar o rendimento de uma cultura de milho, em que o método compreende a introdução em uma planta de milho de pelo menos uma molécula de ácido nucleico da invenção; cultivar a planta de milho para permitir a expressão de uma molécula de iRNA compreendendo o ácido nucleico, em que a expressão de uma molécula de iRNA compreendendo o ácido nucleico inibe danos e/ou
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102/164 crescimento de pragas de insetos (por exemplo, coleópteros e/ou hemípteros), reduzindo ou eliminando uma perda de rendimento devido à infestação por pragas. Em algumas modalidades, a molécula de iRNA é uma molécula de dsRNA. Nestas e outras modalidades, a(s) molécula(s) de ácido nucleico compreende(m) moléculas de dsRNA que compreendem, cada uma, mais de um polinucleotídeo que é especificamente hibridável com uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de praga de inseto. Em alguns exemplos, a(s) molécula(s) de ácido nucleico compreende(m) um polinucleotídeo que é especificamente hibridável com uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de coleóptero e/ou de hemíptero.
[000207] Em algumas modalidades, é proporcionado um método para modular a expressão de um gene-alvo em uma praga de inseto (por exemplo, coleóptero e/ou hemíptero), o método compreendendo: transformar uma célula de planta com um vetor compreendendo um polinucleotídeo que codifica pelo menos uma molécula de iRNA da invenção, em que o polinucleotídeo está operativamente ligado a um promotor e a um elemento de terminação de transcrição; cultivar a célula vegetal transformada em condições suficientes para permitir o desenvolvimento de uma cultura de células vegetais incluindo uma pluralidade de células vegetais transformadas; selecionar células de plantas transformadas que integraram o polinucleotídeo nos seus genomas; triar as células vegetais transformadas para expressão de uma molécula de iRNA codificada pelo polinucleotídeo integrado; selecionar uma célula de planta transgênica que expresse a molécula de iRNA; e alimentar a célula de planta transgênica selecionada para a praga de inseto. As plantas podem também ser regeneradas a partir de células de plantas transformadas que expressam uma molécula de iRNA codificada pela molécula de ácido nucleico integrada. Em algumas modalidades, a molécula de iRNA é uma molécula de dsRNA.
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Nestas e outras modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende moléculas de dsRNA que compreendem cada uma mais de um polinucleotídeo que é especificamente hibridável com uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de praga de inseto. Em alguns exemplos, a(s) molécula(s) de ácido nucleico compreende(m) um polinucleotídeo que é especificamente hibridável com uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de coleóptero e/ou de praga de hemíptero.
[000208] As moléculas de iRNA da invenção podem ser incorporadas nas sementes de uma espécie de planta (por exemplo, milho) quer como um produto de expressão a partir de um gene recombinante incorporado em um genoma das células vegetais, quer como incorporado em um revestimento ou tratamento de sementes que é aplicado à semente antes da plantação. Considera-se que uma célula vegetal compreendendo um gene recombinante é um evento transgênico. Também estão incluídas nas modalidades do invento sistemas de distribuição para o fornecimento de moléculas de iRNA a pragas de insetos (por exemplo, coleópteros e/ou hemípteros). Por exemplo, as moléculas de iRNA da invenção podem ser diretamente introduzidas nas células de praga (s). Os métodos para introdução podem incluir a mistura direta de iRNA com tecido vegetal de um hospedeiro para a(s) praga(s) de inseto, bem como a aplicação de composições compreendendo moléculas de iRNA da invenção para o tecido vegetal hospedeiro. Por exemplo, as moléculas de iRNA podem ser pulverizadas sobre uma superfície vegetal. Alternativamente, uma molécula de iRNA pode ser expressa por um micro-organismo, e o micro-organismo pode ser aplicado sobre a superfície da planta, ou introduzido em uma raiz ou haste por um meio físico tal como uma injeção. Como discutido acima, uma planta transgênica pode também ser geneticamente modificada para expressar pelo menos uma
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104/164 molécula de iRNA em uma quantidade suficiente para matar as pragas de insetos conhecidas por infestarem a planta. As moléculas de iRNA produzidas por síntese química ou enzimática também podem ser formuladas de forma consistente com as práticas agrícolas comuns e utilizadas como spray-on ou produtos de isca para controlar o dano da planta por uma praga de inseto. As formulações podem incluir os adesivos apropriados e as manchas necessárias para uma cobertura foliar eficiente, bem como protetores de UV para proteger moléculas de iRNA (por exemplo, moléculas de dsRNA) de danos por UV. Tais aditivos são comumente utilizados na indústria bioinseticida e são bem conhecidos dos versados na técnica. Tais aplicações podem ser combinadas com outras aplicações inseticidas de spray-on (com base biológica ou de outro modo) para aumentar a proteção das plantas contra as pragas.
[000209] Todas as referências, incluindo publicações, patentes e pedidos de patente aqui citados, são aqui incorporadas por referência na medida em que não são inconsistentes com os detalhes explícitos desta descrição e são assim incorporadas na mesma extensão que se cada referência fosse individual e especificamente Indicada para ser incorporada por referência e fosse estabelecida na sua totalidade aqui. As referências aqui discutidas são fornecidas apenas para a sua divulgação antes da data de apresentação do presente pedido. Nada aqui deve ser interpretado como uma admissão de que os inventores não têm direito a antecipar tal divulgação em virtude da invenção anterior.
[000210] Os seguintes EXEMPLOS são fornecidos para ilustrar certas características e/ou aspectos particulares. Estes Exemplos não devem ser interpretados como limitando a divulgação às características ou aspectos específicos descritos.
EXEMPLOS
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EXEMPLO 1: Materiais e Métodos
Preparação de amostras e bioensaios [000211] Um número de moléculas de dsRNA (incluindo as correspondentes a rpb7-1 reg1 (SEQ ID NO: 7), rpb7- 2 reg1 (SEQ ID NO: 8), rpb7-3 reg1 (SEQ ID NO: 9) e rpb7-1 v1 (SEQ ID NO: 10) foi sintetizado e purificado utilizando um kit iRNA T7 de MEGASCRIPT® (LIFE TECHNOLOGIES, Carlsbad , CA) ou Kit T7 Quick High Yield RNA Synthesis (NOVA INGLATERRA BIOLABS, Whitby, Ont.) As moléculas de dsRNA purificadas foram preparadas em tampão TE, e todos os bioensaios continham um tratamento de controle constituído por este tampão, que serviu como Verificação de Fundo para A mortalidade ou inibição do crescimento de WCR (Diabrotica virgifera virgifera LeConte). As concentrações de moléculas de dsRNA no tampão de bioensaio foram medidas usando um espectrofotômetro NANODROP ™ 8000 (THERMO SCIENTIFIC, Wilmington, DE). [000212] As amostras foram testadas quanto à atividade de inseto em bioensaios conduzidos com larvas de neonatos de insetos na dieta de insetos artificial. Os ovos de WCR foram obtidos de CROP CHARACTERISTICS, INC. (Farmington, MN).
[000213] Os bioensaios foram conduzidos em bandejas de plástico de 128 poços especificamente concebidas para bioensaio de insetos (C-D INTERNATIONAL, Pitman, NJ). Cada poço continha aproximadamente 1,0 mL de uma dieta artificial projetada para o crescimento de insetos coleópteros. Uma alíquota de 60 pL de amostra de dsRNA foi administrada por meio de uma pipeta na superfície da dieta de cada poço (40 pL / cm2). As concentrações da amostra de dsRNA foram calculadas como a quantidade de dsRNA por centímetro quadrado (ng/cm2) de área de superfície (1,5 cm2) no poço. As bandejas tratadas foram mantidas em uma chaminé até que o líquido na superfície da dieta evaporou ou foram absorvidos na dieta.
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106/164 [000214] Dentro de algumas horas de eclosão, as larvas individuais foram recolhidas com uma escova de cabelo de camelo umedecida e depositadas na dieta tratada (uma ou duas larvas por poço). Os poços infestados das bandejas de plástico de 128 poços foram então selados com folhas adesivas de plástico transparente e ventilados para permitir a troca de gás. As bandejas de bioensaio foram mantidas sob condições ambientais controladas (28 °C, ~ 40% de Umidade Relativa, 16: 8 (Luz: Escuro)) durante 9 dias, após o que o número total de insetos expostos a cada amostra, o número de insetos mortos, e registou-se o peso dos insetos sobreviventes. Calculou-se a percentagem média de mortalidade e a inibição média de crescimento para cada tratamento. A inibição de crescimento (GI) foi calculada como se segue:
GI = [1 - (TWIT / TNIT) / (TWIBC / TNIBC)], em que TWIT é o Peso Total de Insetos vivos no
Tratamento,
TNIT é o Número Total de Insetos no Tratamento:
TWIBC é o Peso Total de Insetos Vivos na Verificação de
Fundo (Controle de Tampão); e
TNIBC é o Número Total de Insetos na Verificação de
Fundo (Controle de Tampão).
A análise estatística foi feita utilizando o software JMP™ (SAS, cary, NC).
[000215] A LC50 (Concentração Letal) é definida como a dosagem na qual 50% da quantidade de Insetos Insetos de teste são mortos. O GI50 (Inibição de Crescimento) é definido como a dosagem em que o crescimento médio (por exemplo, peso vivo) dos insetos de teste é 50% do valor médio observado em amostras de Verificação de Fundo. [000216] Os bioensaios replicados demonstraram que a ingestão de amostras particulares resultou em uma mortalidade surpreendente e
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107/164 inesperada e inibição de crescimento de larvas de crisomelídeos de milho.
EXEMPLO 2: Identificação de Genes-alvo Candidatos [000217] Os Insetos de múltiplos estágios do desenvolvimento de WCR (Diabrotica virgifera virgifera LeConte) foram selecionados para análise de transcriptoma agrupada para fornecer sequências de genes-alvo candidatas para controle por tecnologia de proteção de inseto de planta transgênica com iRNA.
[000218] Em um exemplo, o RNA total foi isolado a partir de larvas de WCR de primeiro instar de cerca de 0,9 gm; (4 a 5 dias (PÁG. 81) após a eclosão; mantidas a 16 °C) e purificadas utilizando o seguinte método baseado em fenol / TRI REAGENT® (MOLECULAR RESEARCH CENTER, cincinnati, OH):
[000219] As larvas foram homogeneizadas à temperatura ambiente em um homogeneizador de 15 mL com 10 mL de TRI REAGENT® até uma suspensão homogénea ser obtida. Após 5 min. de incubação à temperatura ambiente, o homogeneizado foi distribuído em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL (1 mL por tubo), adicionaram-se 200 pL de clorofórmio e agitou-se vigorosamente a mistura durante 15 segundos. Depois de deixar a extração em repouso à temperatura ambiente durante 10 min, as fases foram separadas por centrifugação a 12 000 x g a 4 °C. A fase superior (compreendendo cerca de 0,6 mL) foi cuidadosamente transferida para outro tubo estéril de 1,5 mL, e foi adicionado um volume igual de isopropanol à temperatura ambiente. Após incubação à temperatura ambiente durante 5 a 10 minutos, a mistura foi centrifugada durante 8 minutos a 12 000 x g (4 °C ou 25°C). [000220] O sobrenadante foi cuidadosamente removido e rejeitado, e o pélete de RNA foi lavado duas vezes por agitação em vortex com etanol a 75%, com recuperação por centrifugação durante 5 min a 7 500 x g (4 °C ou 25 °C) após cada lavagem. O etanol foi
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108/164 cuidadosamente removido, o pélete foi deixado secar ao ar durante 3 a 5 min, e depois foi dissolvido em água estéril livre de nuclease. A concentração de RNA foi determinada medindo a absorvância (A) a 260 nm e 280 nm. Uma extração típica de cerca de 0,9 g de larvas produziu mais de 1 mg de RNA total, com uma razão A260 / A280 de 1,9. O RNA assim extraído foi armazenado a -80 °C até processamento posterior.
[000221] A qualidade do RNA foi determinada correndo uma alíquota através de um gel de agarose a 1%. A solução de gel de ágarose foi preparada utilizando tampão TAE 10x autoclavado (Tris-acetato EDTA, concentração 1x é Tris-acetato a 0,04 M, EDTA a 1 mM (sal de sódio do ácido etilenodiaminotetraacético), pH 8,0) diluído com água tratada com DEPC (pirocarbonato de dietila) em um recipiente autoclavado. Utilizou-se TAE 1x como tampão de execução. Antes da utilização, o tanque de eletroforese e o pente de formação de poço foram limpos com RNaseAway™ (INVITROGEN INC., carlsbad, CA). Misturaram-se 2 pL de amostra de RNA com 8 pL de tampão TE (Tris HCl a 10 mM pH 7,0, EDTA a 1 mM) e 10 pL de tampão de amostra de RNA (NOVAGEN® Catalog N° 70606; eMD4 Bioscience, Gibbstown, NJ). A amostra foi aquecida a 70 °C durante 3 min, arrefecida até à temperatura ambiente e foram carregados 5 pL (contendo 1 pg a 2 pg de ARN) por poço. Marcadores de peso molecular de RNA comercialmente disponíveis foram executados simultaneamente em poços separados para comparação de tamanho molecular. O gel foi executado a 60 volts durante 2 horas.
[000222] Uma biblioteca de cDNA normalizada foi preparada a partir do RNA total de larvas por um fornecedor de serviços comerciais (EUROFINS MWG Operon, Huntsville, AL), utilizando iniciador aleatório. A biblioteca de cDNA de larva normalizada foi sequenciada a uma escala de 1/2 placa por química da série GS FLX 454 Titanium™
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109/164 no EUROFINS MWG Operon, que resultou em mais de 600 000 leituras com um comprimento médio de leitura de 348 pb. 350.000 leituras foram montadas em mais de 50.000 contigs. As leituras não montadas e os contigs foram convertidos em bancos de dados BLASTable utilizando o programa disponível publicamente, FORMATDB (disponível a partir de NCBI).
[000223] RNA total e bibliotecas de cDNA normalizadas foram preparados de forma semelhante a partir de materiais colhidos em outros estágios de desenvolvimento de WCR. Uma biblioteca de transcriptoma agrupada para a pesquisa de genes-alvo foi construída combinando membros de biblioteca de cDNA que representam os vários estágios de desenvolvimento.
[000224] Os genes candidatos para direcionamento de iRNA foram hipotetizados como sendo essenciais para a sobrevivência e crescimento em insetos de pragas. Os homólogos de genes-alvo selecionados foram identificados no banco de dados de sequências de transcriptoma, como descrito abaixo. As sequências completas ou parciais dos genes-alvo foram amplificadas por PCR para preparar modelos para produção de RNA de duplo filamento (dsRNA).
[000225] As pesquisas TBLASTN utilizando sequências de codificação de proteínas candidatas foram executadas contra bancos de dados BLASTable contendo as leituras de sequência de Diabrotica não montadas ou os contigs montados. Resultados significativos a uma sequência de Diabrotica (definida como melhor do que e-20 para homologias de contigs e melhor que e-10 para sequência não montada lê homologias) foram confirmados utilizando BLASTX contra o banco de dados NCBI não redundante. Os resultados desta pesquisa BLASTX confirmaram que as sequências de genes candidatas homólogas de Diabrotica identificadas na pesquisa TBLASTN compreendiam de fato os genes Diabrotica ou eram as melhores
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110/164 batidas para a sequência genética candidata não Diabrotica presente nas sequências Diabrotica. Em alguns casos, ficou claro que alguns dos contigs de Diabrotica ou leituras de sequência não montadas selecionadas por homologia a um gene candidato não-Diabrotica se sobrepuseram, e que a montagem dos contigs não tinha conseguido juntar estas sobreposições. Nesses casos, utilizou-se Sequencher ™ v4.9 (GENE CODES CORPORATION, Ann Arbor, MI) para reunir as sequências em contigs mais longos.
[000226] Vários genes-alvo candidatos foram identificados incluindo Diabrotica rpb7 (SEQ ID NOs: 1, 3 e 5) como genes que podem levar à mortalidade de pragas de coleópteros, inibição de crescimento, inibição de desenvolvimento e/ou inibição de alimentação em WCR. [000227] O gene rpb7 da subunidade do complexo RNA da polimerase II codifica uma proteína de ligação à cromatina que está envolvida na ativação de genes homeóticos.
[000228] As sequências SEQ ID NO: 1, 3 e 5 são novas. As sequências não são fornecidas em bancos de dados públicos e não são descritas na Publicação de Patente Internacional PCT N° WO/2011/025860; pedido de Patente U.S. N° 20070124836; pedido de Patente U.S. N° 20090306189; pedido de Patente U.S. N° US20070050860; pedido de Patente U.S. N° 20100192265; patente U.S. 7,612,194; ou Pedido de Patente U.S. N° 2013192256. Não havia nenhuma sequência de nucleotídeos WCR rpb7-1 (SEQ ID NO: 1) homóloga significativa encontrada dentro de uma pesquisa GENBANK. WCR rpb7-2 (SEQ ID NO: 3) está ligada de algum modo a um fragmento de uma sequência de Orussus abietinus (N° de Acesso GENBANK XM_012420068.1). WCR rpb7-3 (SEQ ID NO: 5) está ligada de algum modo a um fragmento de uma sequência de Phytophthora sojae (N° de Acesso GENBANK XM_009533254.1). O homólogo mais próximo da sequência de aminoácidos rpb7-1 de WCR
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111/164 (SEQ ID NO: 2) é uma proteína Tribolium castaneum possuindo o número de acesso GENBANK XP_970313.1 (99% semelhante; 98% idêntico sobre a região de homologia). O homólogo mais próximo da sequência de aminoácidos rpb7-2 de WCR (SEQ ID NO: 4) é uma proteína Culex quinquefasciatus possuindo o número de acesso GENBANK XP_001842888.1 (98% semelhante, 96% idêntico sobre a região de homologia). O homólogo mais próximo da sequência de aminoácidos rpb7-3 de WCR (SEQ ID NO: 6) é uma proteína Phytophthora infestans possuindo o número de acesso GENBANK XP_002899067.1 (100% semelhante, 99% idêntico sobre a região de homologia).
[000229] Os transgenes de dsRNA de rpb7 podem ser combinados com outras moléculas de dsRNA, por exemplo, para proporcionar uma direcionamento redundante de iRNA e efeitos combinados de iRNA. Os eventos de milho transgênicos que expressam dsRNA que alveja rpb7 são úteis para prevenir danos causados pela raiz pelo crisomelídeo do milho. Os transgenes rpb7 dsRNA representam novos modos de ação para combinar com Bacillus thuringiensis, PIP e/ou tecnologia de proteína inseticida AflP em pirâmides de genes de Manipulação de Resistência a Insetos para mitigar o desenvolvimento de populações de crisomelídeos resistentes a qualquer uma dessas tecnologias de controle de larvas.
EXEMPLO 3: Amplificação de Genes-alvo para Produzir dsRNA [000230] Clones parciais ou de comprimento de sequências de genes candidatos rpb7 Diabrotica foram utilizados para gerar amplicons de PCR para a síntese de dsRNA. Os iniciadores foram concebidos para amplificar porções de regiões de codificação de cada gene-alvo por PCR. Vide Tabela 1. Quando apropriado, foi incorporada uma sequência de promotor de fago T7 (TTAATACGACTCACTATAGGGAGA; SEQ ID NO: 11) nas
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112/164 extremidades 5' dos filamentos de senso ou antissenso. Vide Tabela 1. RNA total foi extraído de WCR utilizando TRIzol® (Life Technologies, Grand Island, NY) e utilizou-se então para fazer cDNA de primeiro filamento com o Sistema de Síntese First Strand SuperScriptIII® e os fabricantes de instruções iniciadas com Oligo dT (Life Technologies, Grand Island, NY). O cDNA de primeiro filamento foi utilizado como modelo para reações de PCR utilizando iniciadores opostos posicionados para amplificar toda ou parte da sequência do gene-alvo nativo. O dsRNA foi também amplificado a partir de um clone de DNA compreendendo a região de codificação para uma proteína fluorescente amarela (YFP) (SEQ ID NO:12; Shagin et al. (2004) Mol. Biol. Evol. 21 (5): 841-50).
Tabela 1. Iniciadores e Pares de Iniciador usados para amplificar porções de regiões de codificação de gene-alvo rpb7 exemplar e do gene de controle negativo YFP.
ID de Gene ID de Iniciador Sequência
Par 1 rpb7-1 Dvv-rpb7- 1_For TTAATACGACTCACTATAGGGAG ACCACAACTGTTAGAAAAAGTCAA AAC (SEQ ID NO:13)
Dvv-rpb7- 1_Rev TTAATACGACTCACTATAGGGAG AACCCACTATTTTCAATCTGATTT CTC (SEQ ID NO:14)
Par 2 rpb7-2 Dvv-rpb7- 2_For TTAATACGACTCACTATAGGGAG ACCCTCGAACATGAAATATTGCT GC (SEQ ID NO:15)
Dvv-rpb7- 2_Rev TTAATACGACTCACTATAGGGAG AGGCGATGACCACTTCCTCTTC (SEQ ID NO:16)
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ID de Gene ID de Iniciador Sequência
Par 3 rpb7-3 Dvv-rpb7- 3_For TTAATACGACTCACTATAGGGAG AACGTCGACGCTCACGCCCATGA TCTTG (SEQ ID NO:17)
Dvv-rpb7- 3_Rev TTAATACGACTCACTATAGGGAG AATCATCCGCTTGCGTTTGATC (SEQ ID NO:18)
Par 4 rpb7-2 v1 Dvv-rpb7- 1_v1_For TTAATACGACTCACTATAGGGAG AAAAGCCATTGTGTTCCGTCC (SEQ ID NO:19)
Dvv-rpb7- 1_v1_Rev TTAATACGACTCACTATAGGGAG ATCAATCTGATTTCTCCTTCTGCT C (SEQ ID NO:20)
Par 5 YFP YFP-F_T7 TTAATACGACTCACTATAGGGAG ACACCATGGGCTCCAGCGGCGC CC (SEQ ID NO:28)
YFP-R_T7 TTAATACGACTCACTATAGGGAG AAGATCTTGAAGGCGCTCTTCAG G (SEQ ID NO:31)
EXEMPLO 4: Construtos de iRNA
Preparação modelo por PCR e síntese de dsRNA [000231] As estratégias utilizadas para fornecer modelos específicos para a produção de dsRNA de rpb7 e produção de dsRNA de YFP são mostradas na FIGURA 1 e FIGURA 2. DNAs modelo destinados para uso na síntese de dsRNA rpb7 foram preparados por PCR utilizando os pares de iniciadores na Tabela 1 e cDNA de primeiro filamento preparado como modelo de PCR a partir de RNA total isolado de ovos de WCR, larvas de primeiro instar ou adultos. Para cada região de gene-alvo selecionada de rpb7 e YFP, as amplificações de PCR
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114/164 introduziram uma sequência promotora de T7 nas extremidades 5' dos filamentos de senso e antissenso amplificado (o segmento YFP foi amplificado a partir de um clone de DNA da região codificadora de YFP). Os dois fragmentos amplificados por PCR para cada região dos genes-alvo foram então misturados em quantidades aproximadamente iguais e a mistura foi utilizada como transcrição para a produção de dsRNA. Vide FIGURA 1. As sequências dos modelos de dsRNA amplificados com os pares de iniciadores particulares foram: SEQ ID NO: 7 (rpb7-1 reg1), SEQ ID NO: 8 (rpb7-2 reg1), SEQ ID NO: 9 (rpb73 reg1 ), SEQ ID NO: 10 (rpb7-1 v1) e SEQ ID NO: 12 (YFP). O RNA de duplo filamento para bioensaio de insetos foi sintetizado e purificado utilizando um kit AMBION® MEGASCRIPT® iRNA seguindo as instruções do fabricante (INVITROGEN) ou Kit de Transcrição HiScribe® T7 in vitro seguindo as instruções do fabricante (New England Biolabs, Ipswich, MA). As concentrações de dsRNAs foram medidas utilizando um espectrofotômetro NANODROP™ 8000 (THERMO SCIENTIFIC, Wilmington, DE).
Construção de vetores de transformação de plantas [000232] Vetores de entrada que abrigam um construto de gene-alvo para formação de grampo compreendendo segmentos de rpb7 (SEQ ID NOs: 1, 3, and 5) foram montados utilizando uma combinação de fragmentos sintetizados quimicamente (DNA2.0, Menlo Park, cA) e métodos de clonagem molecular convencionais. A formação de grampo intramolecular por transcritos primários de RNA foi facilitada arranjando (dentro de uma única unidade de transcrição) duas cópias do segmento de gene-alvo de rpb7 em orientação oposta uma à outra, sendo os dois segmentos separados por um polinucleotídeo ligante (por exemplo, uma alça SEQ ID NO: 96) ou um íntron ST-LS1, Vancanneyt et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 220 (2): 245-50). Assim, a transcrição de mRNA primário contém as duas sequências de
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115/164 segmento de gene rpb7 como grandes repetições invertidas uma da outra, separadas pela sequência ligante. Uma cópia de um promotor (por exemplo, ubiquitina 1 de milho, Patente US N° 5 510 474; 35S de CaMV), promotor de badnavírus baciliforme de cana-de-açúcar (ScBV), promotores de genes de actina de arroz, promotores de ubiquitina, pEMU, MAS, promotor de histona H3 do milho, promotor de ALS, promotor do gene de faseolina, cab, rubisco, LAT52, Zm13 e/ou apg) para conduzir a produção da transcrição grampo de mRNA primário, e um fragmento compreendendo uma região 3' não traduzida (por exemplo, um gene 5 de peroxidase de milho (ZmPer5 3'UTR v2, Patente US 6 699 984), AtUbi10, AtEf1 ou StPinlI) para terminar a transcrição do gene que expressa o RNA de grampo.
[000233] O vetor de destino binário compreende um gene de tolerância a herbicidas (ariloxialcnoato dioxigenase, AAD-1 v3) (Patente US 7 838 733 (B2) e Wright et al. (2010) Proc. Nat. Ac., USA 107: 20240-5) sob regulação de um promotor operável na planta (por exemplo, promotor de badnavírus baciliforme da cana-de-açúcar (ScBV) (Schenk et al. (1999) Plant Mol. Biol. 39: 1221-30) ou ZmUbi1 (Patente US 5 510 474)). Um 5'UTR e um ligante são posicionados entre a extremidade 3' do segmento promotor e o códon de iniciação da região codificadora de AAD-1. Utiliza-se um fragmento compreendendo uma região 3' não traduzida de um gene de lipase de milho (ZmLip 3'UTR, Patente US 7 179 902) para terminar a transcrição do mRNA de AAD-1.
[000234] Um vetor binário de controle negativo, que compreende um gene que expressa uma proteína YFP, é construído por meio de reações de recombinação GATEWAY® padrão com um vetor de destino binário típico e vetor de entrada. O vetor de destino binário compreende um gene de tolerância a herbicidas (ariloxialcnoato dioxigenase: AAD-1 v3) (como acima) sob a regulação de expressão
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116/164 de um promotor de ubiquitina 1 de milho (como acima) e um fragmento compreendendo uma região 3' não traduzida de um gene de lipase de milho (ZmLip 3'UTR, como acima). O vetor de entrada compreende uma região de codificação YFP (SEQ ID NO: 21) sob o controle de expressão de um promotor de ubiquitina 1 de milho (como acima) e um fragmento compreendendo uma região 3' não traduzida de um gene de peroxidase 5 de milho (como acima).
EXEMPLO 5: Triagem de Genes-alvo Candidatos [000235] O dsRNA sintético concebido para inibir as sequências de genes-alvo identificadas no EXEMPLO 2 causou mortalidade e inibição de crescimento quando administrado a WCR em ensaios baseados em dieta.
[000236] Os bioensaios replicados demonstraram que a ingestão de preparações de dsRNA derivadas de rpb7-1 reg1 e rpb7- 1 v1 resultou em mortalidade e inibição do crescimento de larvas de crisomelídeos do milho ocidental. A Tabela 2 mostra os resultados dos bioensaios de alimentação de larvas de WCR a seguir à dieta após 9 dias de exposição ao dsRNA rpb7-1 reg1 e rpb7-1 v1, bem como os resultados obtidos com uma amostra de controle negativo de dsRNA preparado a partir de uma proteína fluorescente amarela (YFP) (SEQ ID NO: 12). A Tabela 3 mostra os resultados de LC50 e GI50 da exposição ao dsRNA de rpb7-1 v1.
[000237] Tabela 2. Resulta dos ensaios de alimentação de dsRNA de rpb7 obtidos com larvas de crisomelídeos do milho ocidentais após 9 dias de alimentação. A análise de ANOVA encontrou diferenças de significativas em % de Mortalidade Média e % de Crescimento de Crescimento Média (GI). Os meios foram separados usando o teste de Tukey-Kramer.
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NOME DO GENE Dose (ng/cm2) N Média (%de Mortalidade) ± SEM* Média (GI) ± SEM
rpb7-1 v1 500 20 76,72 ± 3,07 (A) 0,91 ± 0,01 (A)
rpb7-1 Regí 500 2 64,71 ± 17,64 (A) 0,94 ± 0,02 (A)
TE** 0 28 15,47 ± 2,58 (B) 0,07 ± 0,04 (B)
ÁGUA 0 23 13,39 ± 2,09 (B) -0,03 ± 0,05 (B)
YFP*** 500 24 11,05 ± 1,80 (B) 0,03 ± 0,03 (B)
*SEM =Erro Padrão da Média. Letras em parênteses designam níveis
estatísticos. Níveis não conectados pela mesma letra são siginificativamente diferentes (P<0,05).
**TE = Tris HCl (1 mM) plus EDTA (0,1 mM) tampão, pH7,2.
***YFP = Proteína fluorescente amarela
Tabela 3. Resumo de Potência Oral de rpb7 dsRNA sobre larvas de WCR (ng/cm2).
Nome do Gene LC50 Faixa GI50 Faiaa
rpb7-1 v1 12,50 8,89-17,19 1,58 1,21-2,06
[000238] Foi previamente sugerido que certos genes de Diabrotica spp. podem ser explorados para controle de insetos mediado por iRNA. Vide a Publicação da Patente U.S. N° 2007/0124836, que descreve 906 sequências, e a Patente U.S. N° 7 612 194, que descreve 9,112 sequências. No entanto, foi determinado que muitos genes sugeridos para terem utilidade para o controle de insetos mediado por iRNA não são eficazes no controle de Diabrotica. Foi também determinado que as sequências rpb7-1 reg1 e rpb7-1 v1 dsRNA proporcionam um controle superior surpreendente e inesperado de Diabrotica, em comparação com outros genes sugeridos a ter utilidade para controle de insetos mediado por iRNA. [000239] Por exemplo, anexina, beta spectrina 2 e MtRP-L4 foram sugeridas na Patente US 7 612 194 para serem eficazes no controle
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118/164 de insetos mediado por iRNA. SEQ ID NO: 22 é a sequência de DNA da região 1 de anexina (Reg 1) e SEQ ID NO: 23 é a sequência de DNA da região 2 de anexina (Reg 2). A SEQ ID NO: 24 é a sequência de DNA da região 2 da spectrina 2 beta (Reg1) e a SEQ ID NO: 25 é a sequência de DNA da região 2 da spectrina 2 (Reg2). A SEQ ID NO: 26 é a sequência de DNA da região 1 de mtRP-L4 (Reg1) e a SEQ ID NO: 27 é a sequência de DNA da região 2 de mtRP-L4 (Reg2). Uma sequência YFP (SEQ ID NO: 12) foi também utilizada para produzir dsRNA como controle negativo.
[000240] Cada uma das sequências acima mencionadas foi utilizada para produzir dsRNA pelos métodos do EXEMPLO 3. A estratégia utilizada para fornecer modelos específicos para a produção de dsRNA é apresentada Na FIGURA 2. Os DNAs de modelo pretendidos para utilização na síntese de dsRNA foram preparados por PCR utilizando os pares de iniciadores na Tabela 4 e cDNA de primeiro filamento (como modelo de PCR) preparado a partir de RNA total isolado a partir de larvas de primeiro instar de WCR. (YFP foi amplificado a partir de um clone de DNA). Para cada região de genealvo selecionada, foram realizadas duas amplificações de PCR separadas. A primeira amplificação por PCR introduziu uma sequência promotora de T7 na extremidade 5' dos filamentos de senso amplificadas. A segunda reação incorporou a sequência promotora de T7 nas extremidades 5' dos filamentos antissenso. Os dois fragmentos amplificados por PCR para cada região dos genes-alvo foram então misturados em quantidades aproximadamente iguais, e a mistura foi utilizada como um modelo de transcrição para a produção de dsRNA. Vide FIGURA 2. RNA de duplo filamento foi sintetizado e purificado utilizando um kit AMBION® MEGAscript® iRNA seguindo as instruções do fabricante (INVITROGEN). As concentrações de dsRNA foram medidas utilizando um espectrofotômetro NANODROP™ 8000
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119/164 (THERMO SCIENTIFIC, Wilmington, DE) e os dsRNA foram testados pelos mesmos métodos de bioensaio baseados na dieta descritos acima. A Tabela 4 lista as sequências dos iniciadores utilizados para produzir as moléculas de dsRNA de anexina Reg1, anexina Reg2, espectrina beta 2 Reg1, espectrina beta 2 Reg2, mtRP-L4 Reg1, mtRP-L4 Reg2 e YFP dsRNA. A Tabela 5 apresenta os resultados dos bioensaios alimentares baseados em dieta de larvas de WCR após exposição de 9 dias a estas moléculas de dsRNA. Os bioensaios replicados demonstraram que a ingestão destes dsRNA não resultou em mortalidade ou inibição do crescimento de larvas de crisomelídeos do milho ocidentais acima da observada com amostras de controle de tampão TE, água ou proteína YFP.
Tabela 4. Iniciadores e Pares de Iniciadores utilizados para amplificar porções de regiões de codificação de genes.
Gene (Região) ID de Iniciador Sequência
Par 6 YFP YFP- F_T7 TTAATACGACTCACTATAGGGAGA CACCATGGGCTCCAGCGGCGCCC (SEQ ID NO:28)
YFP YFP-R AGATCTTGAAGGCGCTCTTCAGG (SEQ ID NO:29)
Par 7 YFP YFP-F CACCATGGGCTCCAGCGGCGCCC (SEQ ID NO:30)
YFP YFP- R_T7 TTAATACGACTCACTATAGGGAGA AGATCTTGAAGGCGCTCTTCAGG (SEQ ID NO:31)
Par 8 anexina (Reg 1) Ann- F1_T7 TTAATACGACTCACTATAGGGAGA GCTCCAACAGTGGTTCCTTATC (SEQ ID NO:32)
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Gene (Região) ID de Iniciador Sequência
anexina (Reg 1) Ann-R1 CTAATAATTCTTTTTTAATGTTCCTG AGG (SEQ ID NO:33)
Par 9 anexina (Reg 1) Ann-F1 GCTCCAACAGTGGTTCCTTATC (SEQ ID NO:34)
anexina (Reg 1) Ann- R1_T7 TTAATACGACTCACTATAGGGAGA CTAATAATTCTTTTTTAATGTTCCTG AGG (SEQ ID NO:35)
Par 10 anexina (Reg 2) Ann- F2_T7 TTAATACGACTCACTATAGGGAGA TTGTTACAAGCTGGAGAACTTCTC (SEQ ID NO:36)
anexina (Reg 2) Ann-R2 CTTAACCAACAACGGCTAATAAGG (SEQ ID NO:37)
Par 11 anexina (Reg 2) Ann-F2 TTGTTACAAGCTGGAGAACTTCTC (SEQ ID NO:38)
anexina (Reg 2) Ann- R2T7 TTAATACGACTCACTATAGGGAGA CTTAACCAACAACGGCTAATAAGG (SEQ ID NO:39)
Par 12 beta- spect2 (Reg 1) Betasp2- F1_T7 TTAATACGACTCACTATAGGGAGA AGATGTTGGCTGCATCTAGAGAA (SEQ ID NO:40)
beta- spect2 (Reg 1) Betasp2- R1 GTCCATTCGTCCATCCACTGCA (SEQ ID NO:41)
Par 13 beta- spect2 (Reg 1) Betasp2- F1 AGATGTTGGCTGCATCTAGAGAA (SEQ ID NO:42)
beta- Betasp2- TTAATACGACTCACTATAGGGAGA
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Gene (Região) ID de Iniciador Sequência
spect2 (Reg 1) R1_T7 GTCCATTCGTCCATCCACTGCA (SEQ ID NO:43)
Par 14 beta- spect2 (Reg 2) Betasp2- F2_T7 TTAATACGACTCACTATAGGGAGA GCAGATGAACACCAGCGAGAAA (SEQ ID NO:44)
beta- spect2 (Reg 2) Betasp2- R2 CTGGGCAGCTTCTTGTTTCCTC (SEQ ID NO:45)
Par 15 beta- spect2 (Reg 2) Betasp2- F2 GCAGATGAACACCAGCGAGAAA (SEQ ID NO:46)
beta- spect2 (Reg 2) Betasp2- R2_T7 TTAATACGACTCACTATAGGGAGA CTGGGCAGCTTCTTGTTTCCTC (SEQ ID NO:47)
Par 16 mtRP-L4 (Reg 1) L4- F1_T7 TTAATACGACTCACTATAGGGAGA AGTGAAATGTTAGCAAATATAACAT CC (SEQ ID NO:48)
mtRP-L4 (Reg 1) L4-R1 ACCTCTCACTTCAAATCTTGACTTT G (SEQ ID NO:49)
Par 17 mtRP-L4 (Reg 1) L4-F1 AGTGAAATGTTAGCAAATATAACAT CC (SEQ ID NO:50)
mtRP-L4 (Reg 1) L4- R1_T7 TTAATACGACTCACTATAGGGAGA ACCTCTCACTTCAAATCTTGACTTT G (SEQ ID NO:51)
Par 18 mtRP-L4 (Reg 2) L4- F2_T7 TTAATACGACTCACTATAGGGAGA CAAAGTCAAGATTTGAAGTGAGAG GT (SEQ ID NO:52)
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Gene (Região) ID de Iniciador Sequência
mtRP-L4 (Reg 2) L4-R2 CTACAAATAAAACAAGAAGGACCC C (SEQ ID NO:53)
Par mtRP-L4 (Reg 2) L4-F2 CAAAGTCAAGATTTGAAGTGAGAG GT (SEQ ID NO:54)
19 mtRP-L4 (Reg 2) L4- R2_T7 TTAATACGACTCACTATAGGGAGA CTACAAATAAAACAAGAAGGACCC C (SEQ ID NO:55)
Tabela 5. Resultados de ensaios de alimentação de dieta obtidos com larvas de crisomelídeo do milho ocidental após 9 dias.
Nome do gene Dose (ng/cm2) Peso Médio de Larva Viva (mg) % Média de Mortalidade Inibição Média de Crescimento
anexina-Reg 1 1000 0,545 0 -0,262
anexina-Reg 2 1000 0,565 0 -0,301
beta espectrina2 Reg 1 1000 0,340 12 -0,014
beta espectrina2 Reg 2 1000 0,465 18 -0,367
mtRP-L4 Reg 1 1000 0,305 4 -0,168
mtRP-L4 Reg 2 1000 0,305 7 -0,180
Tampã TE * 0 0,430 13 0,000
Água 0 0,535 12 0,000
YFP** 1000 0,480 9 -0,386
* TE = Tris HCl (10 mM) mais tampão EDTA (1 mM), pH 8 ** YFP = Proteína Fluorescente Amarela
EXEMPLO 6: Produção de Tecidos de Milho Transgênico Compreendendo dsRNAs Inseticidas
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123/164 [000241] Transformação Mediada por Agrobacterium. Células, tecidos e plantas de milho transgênicos que produzem uma ou mais moléculas de dsRNA inseticidas (por exemplo, pelo menos uma molécula de dsRNA incluindo uma molécula de dsRNA direcionada para um gene compreendendo rpb7 (por exemplo, SEQ ID NOs: 1, 3 e
5)) através da expressão de um gene quimérico estavelmente integrado no genoma da planta foi produzida após a transformação mediada por Agrobacterium. Métodos de transformação de milho que empregam vetores de transformação soberanos ou binários são conhecidos na técnica, como descrito, por exemplo, na Patente U.S. 8 304 604, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Os tecidos transformados foram selecionados pela sua capacidade de crescer em meio contendo Haloxifop e foram pesquisados quanto à produção de dsRNA, conforme apropriado. Porções de tais culturas de tecidos transformadas podem ser apresentadas a larvas de neonatos de crisomelídeo do milho para bioensaio, essencialmente como descrito no EXEMPLO 1.
[000242] Iniciação de Cultura de Agrobacterium. Os estoques de glicerol de células DAt13192 da cepa de Agrobacterium (Publicação Internacional PCT N° WO 2012/016222A2) contendo um vetor de transformação binário descrito acima (EXEMPLO 4) foram lisados em placas de meio mínimo AB (Watson et al., 1975) J. Bacteriol 123:255264) contendo antibióticos apropriados, e foram cultivados a 20 °C durante 3 dias. As culturas foram então colocadas em placas YEP (g/L: extrato de levedura, 10, Peptona, 10, NaCl, 5) contendo os mesmos antibióticos e foram incubadas a 20 °C durante 1 dia.
[000243] Cultura de Agrobacterium. No dia de uma experiência, uma solução estoque de meio de inoculação e acetosiringona foi preparada em um volume apropriado para o número de construtos na experiência e pipetadas em um frasco estéril descartável de 250 mL. Meio de
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Inoculação (Frame et al. (2011) Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos. IN Plant Embryo Culture Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. T. A. Thorpe and E. C. Yeung, (Eds), Springer Science and Business Media, LLC. pp 327341) continha: 2,2 g/L de sais MS; 1X ISU Vitaminas modificadas MS (Frame et al., Ibid.) 68,4 g/L de sacarose; 36 g/L de glucose; 115 mg/L de L-prolina; e 100 mg/L de mio-inositol; a pH 5,4.) Adicionou-se acetosiringona ao frasco contendo meio de inoculação até uma concentração final de 200 pM a partir de uma solução de estoque a 1 M em dimetilsulfóxido a 100% e a solução foi cuidadosamente misturada.
[000244] Para cada construto, 1 ou 2 alças cheias de inoculação de Agrobacterium da placa YEP foram suspensos em 15 mL de solução estoque de meio de inoculação / acetosinringona em um tubo de centrífuga descartável estéril de 50 mL e a densidade óptica da solução a 550 nm (OD550) foi medida em um espectrofotômetro. A suspensão foi então diluída para OD550 de 0,3 a 0,4 utilizando misturas adicionais de meio de inoculação / acetosiringona. O tubo de suspensão de Agrobacterium foi então colocado horizontalmente em um agitador de plataforma ajustado a cerca de 75 rpm à temperatura ambiente e agitado durante 1 a 4 horas enquanto se realizava a disseção do embrião.
[000245] Esterilização de espiga e isolamento do embrião. Os embriões imaturos de milho foram obtidos a partir de plantas da linhagem endogâmica B104 de Zea mays (Hallauer et al. (1997) Crop Science 37: 1405-1406), cultivadas em estufa e auto- ou sibpolinizadas para produzir espigas. As espigas foram colhidas aproximadamente 10 a 12 dias após a polinização. No dia experimental, as espigas descascadas foram esterilizadas à superfície por imersão em solução a 20% de branqueador comercial (ULTRA
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CLOROX® Germicidal Bleach, hipoclorito de sódio a 6,15%, duas gotas de TWEEN 20) e agitadas durante 20 a 30 min, seguido por três enxaguamentos em água desionizada estéril em uma capa de fluxo laminar. Os embriões zigóticos imaturos (1,8 a 2,2 mm de comprimento) foram dissecados assepticamente de cada espiga e aleatoriamente distribuídos em tubos de microcentrífuga contendo 2,0 mL de uma suspensão de células de Agrobacterium apropriadas em meio de inoculação líquido com 200 pM de acetosiringona, na qual foram adicionados 2 pL de surfactante BREAK-THRU® S233 a 10% (EVONIK INDUSTRIES, Essen, Alemanha). Para um dado conjunto de experimentos, embriões de espigas agrupadas foram utilizados para cada transformação.
[000246] Cocultivo de Agrobacterium. Após o isolamento, os embriões foram colocados em uma plataforma de balanço durante 5 minutos. O conteúdo do tubo foi então vertido sobre uma placa de meio de cocultura, que continha 4,33 g/L de sais de MS; Vitaminas de MS Modificado 1X ISU; 30 g/L de sacarose; 700 mg/L de L-prolina; Dicamba em 3,3 mg/L de KOH (ácido 3,6-dicloro-o-anisico ou ácido 3,6-dicloro-2-metoxibenzoico); 100 mg/L de mio-inositol; 100 mg/L de Hidrolisado Enzimático de Caseína; 15 mg/L de AgNO3; 200 uM de acetosiringona em DMSO; e 3 g/L de GELZAN™, a pH 5,8. A suspensão líquida de Agrobacterium foi removida com uma pipeta de transferência estéril, descartável. Os embriões foram então orientados com o scutellum virado para cima usando fórceps estéril com a ajuda de um microscópio. A placa foi fechada, selada com fita médica MICROPORE™ 3M™ e colocada em uma incubadora a 25 °C com luz contínua a aproximadamente 60 pmol m-2s-1 de Radiação Fotossintéticamente Ativa (PAR).
[000247] Seleção de Calo e Regeneração de Eventos Transgênicos. Após o período de Cocultivo, os embriões foram transferidos para Meio
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126/164 de Repouso, que foi composto de 4,33 g/L de sais MS; Vitaminas de MS Modificado 1X ISU; 30 g/L de sacarose; 700 mg/L de L-prolina; 3,3 mg/L Dicamba em KOH; 100 mg/L de mio-inositol; 100 mg/L de Hidrolisado Enzimático de Caseína; 15 mg/L de AgNO3; 0,5 g/L de MES (ácido 2-(N-morfolino) etanossulfônico mono-hidratado, PHYTOTECHNOLOGIES LABR, Lenexa, KS); 250 mg/L Carbenicilina; e 2,3 g/L de GELZAN™; a pH 5,8. Não mais de 36 embriões foram movidos para cada placa. As placas foram colocadas em uma caixa de plástico transparente e incubadas a 27 °C com luz contínua a aproximadamente 50 pmol m-2s-1 PAR durante 7 a 10 dias. Os embriões calosos foram então transferidos para o Meio de Seleção I, que era composto de Meio de Repouso (acima) com ácido R-Haloxifop 100 nM (0,0362 mg/L, para seleção de calos que abrigavam o gene AAD-1). As placas foram retornadas para caixas transparentes e incubadas a 27 °C com luz contínua a aproximadamente 50 pmol m-2s-1 PAR durante 7 dias. Os embriões calosos foram então transferidos (<12 / placa) para o Meio de Seleção II, que era constituído por Meio de Repouso (acima) com ácido R-Haloxifop a 500 nM (0,181 mg/L). As placas foram devolvidas a caixas transparentes e incubadas a 27 °C com luz contínua a aproximadamente 50 pmol m-2s-1 PAR durante 14 dias. Esta etapa de seleção permitiu que o calo transgênico proliferasse e diferenciasse ainda mais.
[000248] Calos proliferativos embriogênicos foram transferidos (<9/placa) para meio de pré-regeneração. O Meio de Pré-Regeneração continha 4,33 g/L de sais MS; Vitaminas de MS Modificado 1X ISU; 45 g/L de sacarose; 350 mg/L de L-prolina; 100 mg/L de mio-inositol; 50 mg/L de Hidrolisado Enzimático de Caseína; 1,0 mg/L de AgNO3; 0,25 g/L de MES; 0,5 mg/L de ácido naftalenoacético em NaOH; 2,5 mg/L de ácido abscísico em etanol; 1 mg/L de 6-benzilaminopurina; 250 mg/L Carbenicilina; 2,5 g/L de GELZAN™; e 0,181 mg/L de ácido
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Haloxifop; a pH 5,8. As placas foram armazenadas em caixas transparentes e incubadas a 27 °C com luz contínua a aproximadamente 50 pmol m-2s-1 PAR durante 7 dias. Os calos regeneradores foram então transferidos para o Meio de Regeneração em PHYTATRAYS™ (SIGMA-ALDRICH) e incubados a 28 °C com 16 horas de luz / 8 horas de escuro por dia (a aproximadamente 160 pmol m-2s-1 PAR) por 14 dias ou até brotos e raízes se desenvolverem. O Meio de Regeneração continha 4,33 g/L de sais MS; Vitaminas de MS Modificado 1X ISU; 60 g/L de sacarose; 100 mg/L de mio-inositol; 125 mg/L Carbenicilina; 3 g/L de goma GELLAN™; e 0,181 mg/L de ácido R-haloxifop; a pH 5,8. Os pequenos brotos com raízes primárias foram então isolados e transferidos para o meio de alongamento sem seleção. O Meio de Elongação continha 4,33 g/L de sais MS; Vitaminas de MS Modificado 1X ISU; 30 g/L de sacarose; e 3,5 g/L de GELRITE™: a pH 5,8.
[000249] As mudas de plantas transformadas selecionadas pela sua capacidade de crescimento em meio contendo Haloxifop foram transplantadas de PHYTATRAYS™ para pequenos vasos cheios com meio de cultura (PROMIX BX, PREMIER TECH HORTICULTURE), cobertos com xícaras ou HUMI-DOMES (ARCO PLASTICS), e em seguida colhidas em uma câmara de crescimento CONVIRON (27 °C dia / 24 °C noite, fotoperíodo de 16 horas, 50-70% RH, 200 pmol m-2s-1 PAR). Em alguns casos, as plântulas transgênicas putativas foram analisadas quanto ao número de cópias relativo ao transgene por ensaios quantitativos de PCR em tempo real utilizando iniciadores concebidos para detectar o gene de tolerância a herbicidas AAD1 integrado no genoma do milho. Além disso, os ensaios de qPCR foram utilizados para detectar a presença do ligante e/ou sequência alvo em transformantes putativos. As plântulas transformadas selecionadas foram então transferidas para uma estufa para crescimento e ensaios
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128/164 adicionais.
[000250] Transferência e estabelecimento de plantas T0 na estufa para bioensaio e produção de sementes. Quando as plantas atingiram a fase V3-V4, elas foram transplantadas para a mistura de solo IE CUSTOM BLEND (PERFIL / METRO MIX 160) e crescidas até a floração na estufa (Tipo de Exposição à Luz: Foto ou Assimilação, Limite de Alta Luz: 1200 PAR, comprimento de 16 horas dia 27 °C dia / 24 °C noite).
[000251] As plantas a serem usadas para bioensaios de insetos foram transplantadas de pequenos potes para TINUS™ 350-4 ROOTRAINERS® (SPENCER-LEMAIRE INDUSTRIES, Acheson, Alberta, Canadá) (uma planta por evento por ROOTRAINER®). Aproximadamente quatro dias após o transplante para ROOTRAINERS®, as plantas foram infestadas para bioensaio. [000252] As plantas da geração T1 foram obtidas por polinização das sedas de plantas transgênicas T0 com pólen recolhido a partir de plantas de linhagem B104 de elite não transgênica ou de outros doadores de pólen apropriados e plantando as sementes resultantes. Cruzamentos recíprocos foram realizados sempre que possível. EXEMPLO 7: Análises Moleculares de Tecidos de Milho Transgênicos [000253] Foram efetuadas análises moleculares (por exemplo, RTqPCR) de tecidos de milho a partir de folhas recolhidas de plantas cultivadas em estufa nos mesmos dias em que foi avaliado o dano à raiz.
[000254] Resultados dos ensaios de RT-qPCR para o alvo foram utilizados para validar a expressão dos transgenes. Os resultados dos ensaios RT-qPCR para a sequência ligante (que é integral para a formação de moléculas de dsRNA de grampo) em RNA expressos foram utilizados para validar a presença das transcrições. Os níveis de
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129/164 expressão de RNA de transgene foram medidos em relação aos níveis de RNA de um gene de milho endógeno.
[000255] Análises de DNA qPCR para detectar uma porção da região codificadora de AAD1 em gDNA foram usadas para estimar o número de cópia de inserção de transgene. As amostras para estas análises foram recolhidas a partir de plantas cultivadas em câmaras ambientais. Os resultados foram comparados com os resultados de DNA qPCR de ensaios concebidos para detectar uma porção de um gene nativo de uma única cópia, e eventos simples (tendo uma ou duas cópias de transgenes rpb7) foram avançados para estudos adicionais na estufa. [000256] Adicionalmente, foram utilizados ensaios qPCR concebidos para detectar uma porção do gene de resistência à espectinomicina (SpecR, alojado nos plasmídeos de vetor binários fora do T-DNA) para determinar se as plantas transgênicas contêm sequências de estrutura principal plasmídicas integradas estranhas.
[000257] Nível de expressão de transcrição de RNA: qPCR alvo. Eventos de células de calo ou plantas transgênicas foram analisados por PCR quantitativa em tempo real (qPCR) da sequência alvo para determinar o nível de expressão relativo da transcrição em grampo de comprimento completo, em comparação com o nível de transcrição de um gene de milho interno (por exemplo, GENBANK N° de Acesso BT069734), que codifica uma proteína do tipo TIP41 (isto é, um homólogo de milho do N° Acesso GENBANK AT4G34270, possuindo uma pontuação BLASTX de 74% de identidade; SEQ ID NO: 56). O RNA foi isolado utilizando um Kit de Isolamento de RNA Total Norgen BioTek (Norgen, Thorold, ON). O RNA total foi submetido a um tratamento On Column DNase1 de acordo com o protocolo sugerido pelo kit. O RNA foi então quantificado em um espectrofotômetro NANODROP 8000 (THERMO SCIENTIFIC) e a concentração foi normalizada para 50 ng/pL. O cDNA de primeiro filamento foi
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130/164 preparado utilizando um KIT DE SÍNTESE DE cDNA DE ALTA CAPACIDADE (INVITROGÊNIO) em um volume de reação de 10 pL com 5 pL de RNA desnaturado, substancialmente de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. O protocolo foi modificado ligeiramente para incluir a adição de 10 pL de 100 pM de oligonucleotídeo T20VN (IDT) (TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN, em que V é A, C ou G e N é A, C, G ou T; SEQ ID NO: 57) no tubo de 1 mL de mistura estoque de iniciador aleatório, de modo a preparar uma solução estoque de trabalho de iniciadores aleatórios combinados e oligo dT.
[000258] Após síntese de cDNA, as amostras foram diluídas 1:3 com água isenta de nuclease e armazenadas a -20 °C até serem ensaiadas.
[000259] Realizaram-se ensaios de PCR em tempo real separados para o gene-alvo e a transcrição semelhante a TIP41 em um LIGHTCYCLER™ 480 (ROCHE DIAGNOSTICS, Indianapolis, IN) em volumes de reação de 10 pL. Para o ensaio do gene-alvo, as reações foram realizadas com Primersrpb7 (F) (SEQ ID NO: 58) e rpb7 (R) (SEQ ID NO: 59) e uma sonda IDT Custom Oligo rpb7 PRB Set1, marcada com FAM e duplamente arrefecida com neutralizadores de Zen e Iowa Black (SEQ ID NO: 95). Para o ensaio do gene de referência de tipo TIP41, os iniciadores TIPmxF (SEQ ID NO: 60) e TIPmxR (SEQ ID NO: 61) e Probe HXTIP (SEQ ID NO: 62) marcados com HEX (hexaclorofluoresceína) foram utilizados.
[000260] Todos os ensaios incluíram controles negativos de não modelo (mistura apenas). Para as curvas-padrão, um espaço em branco (água no poço de origem) também foi incluído na placa de origem para verificar a contaminação cruzada da amostra. As sequências de iniciador e de sonda são apresentadas na Tabela 6. As receitas de componentes de reação para a detecção dos vários
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131/164 transcritos são descritas na Tabela 7 e as condições das reações de
PCR são resumidas na Tabela 8. A porção fluorescente FAM (6Carbóxi Fluoresceína Amidita) foi excitada a 465 nm e a fluorescência foi medida a 510 nm; os valores correspondentes para a porção fluorescente HEX (hexaclorofluoresceína) foram 533 nm e 580 nm.
Tabela 6. Sequências oligonucleotídicas utilizadas para análises moleculares de níveis de transcrição em milho transgênico.
Alvo Oligonucleotídeo Sequência
rpb7 rpb7 (F) AGCCATTGTGTTCCGTCCAT (SEQ ID NO:58)
rpb7 rpb7 (R) AGGACCTATTTCGGCGAACA (SEQ ID NO:59)
rpb7 rpb7 (FAM-Probe) /56- FAM/CCTGGATGC/ZEN/GGTGGTTC GACA/3IABkFQ/ (SEQ ID NO:95)
TIP41 TIPmxF TGAGGGTAATGCCAACTGGTT (SEQ ID NO:60)
TIP41 TIPmxR GCAATGTAACCGAGTGTCTCTCAA (SEQ ID NO:61)
TIP41 P -Probe) TTTTTGGCTTAGAGTTGATGGTGTAC TGATGA (SEQ ID NO:62)
*Proteína tipo TIP41.
Tabela 7. Receitas de reação de PCR para detecção de transcrição.
Gene-alvo Gene tipo TIP
Componente Concentração Final
Tampão Roche 1 X 1X
rpb7 (F) 0,4 μΜ 0
rpb7 (R) 0,4 μΜ 0
rpb7 (FAM) 0,2 μΜ 0
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Gene-alvo Gene tipo TIP
Componente Concentração Final
HEXtipZM F 0 0,4 μΜ
HEXtipZM R 0 0,4 μΜ
HEXtipZMP (HEX) 0 0,2 μΜ
cDNA (2,0 pL) NA NA
Água A 10 pL A 10 μL
Tabela 8. Condições de Termociclador para RNA qPCR.
Gene-alvo e detecção de gene tipo TIP41
Processo Temp. Tempo N° Ciclos
Ativação Alvo 95 °C 10 min 1
Desnaturação 95 °C 10 sec 40
Extensão 60 °C 40 sec
Adquirir FAM ou HEX 72 °C 1 sec
Frio 40 °C 10 sec 1
[000261] Dados foram analisados utilizando o software LIGHTCYCLER ™ v1.5 por quantificação relativa Utilizando um algoritmo de derivada de segunda derivada para o cálculo dos valores de Cq de acordo com as recomendações do fornecedor. Para as análises de expressão, os valores de expressão foram calculados utilizando o método AACt (isto é, 2-(Cq TARGET - Cq REF)), que se baseia na comparação de diferenças de valores de Cq entre dois alvos, com o valor base de 2 sendo selecionado sob o pressuposto de que, para reações de PCR otimizadas, o produto dobra a cada ciclo. [000262] Tamanho de transcrição e integridade: Ensaio de Northern Blot. Em alguns casos, a caracterização molecular adicional das plantas transgênicas é obtida pelo uso da análise de Northern blot (RNA blot) para determinar o tamanho molecular do dsRNA de rpb7 de grampo em plantas transgênicas que expressam um dsRNA de rpb7. [000263] Todos os materiais e equipamento são tratados com
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RNaseZAP (AMBION / INVITROGEN) antes da utilização. Amostras de tecidos (100 mg a 500 mg) são coletadas em tubos SAFELOCK EPPENDORF de 2 mL, interrompidos com um pulverizador de tecidos KLECKO ™ (GARCIA MANUFACTURING, Visalia, CA) com três esferas de tungstênio em 1 mL de TRIZOL (INVITROGENO) à temperatura ambiente (RT) durante 10 min. Opcionalmente, as amostras são centrifugadas durante 10 min a 4 °C a 11 000 rpm e o sobrenadante é transferido para um novo tubo SAFELOCK EPPENDORF de 2 mL. Depois de se adicionarem 200 pL de clorofórmio ao homogeneizado, o tubo é misturado por inversão durante 2 a 5 min, incubado à TA durante 10 minutos e centrifugado a 12 000 x g durante 15 min a 4 °C. A fase superior é transferida para um tubo EPPENDORF estéril de 1,5 mL, são adicionados 600 pL de isopropanol a 100%, seguido de incubação à TA durante 10 minutos a 2 horas e depois centrifugado a 12 000 xg durante 10 min a 4 °C a 25°C. O sobrenadante é descartado e o pélete de RNA é lavado duas vezes com 1 mL de etanol a 70%, com centrifugação a 7.500 x g durante 10 min entre 4 °C e 25 °C entre lavagens. O etanol é descartado e o pélete é brevemente seco ao ar durante 3 a 5 minutos antes de ressuspender em 50 pL de água livre de nucleases.
[000264] O RNA total é quantificado utilizando o NANODROP 8000® (THERMO-FISHER) e as amostras são normalizadas para 5 pg / 10 pL. 10 pL de glioxal (AMBION / INVITROGEN) são então adicionados a cada amostra. Cinco a 14 ng mistura de marcador DIG RNA padrão (ROCHE APPLIED SCIENCE, Indianapolis, IN) é dispensado e adicionado a um volume igual de glioxal. As amostras e os RNAs marcadores são desnaturados a 50 °C durante 45 min e armazenados em gelo até serem carregados em um gel de ágarose a 1,25% de SEAKEM GOLD (LONZA, Allendale, NJ) em tampão de execução glioxal NORTHERNMAX 10X (AMBION / INVITROGEN). Os RNAs são
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134/164 separados por eletroforese a 65 volts / 30 mA durante 2 horas e 15 minutos.
[000265] Após eletroforese, o gel é enxaguado em 2X SSC durante 5 min e fotografado em uma estação GEL DOC (BIORAD, Hercules, cA), depois o RNA é transferido passivamente para uma membrana de náilon (MILLIPORE) durante a noite à TA, utilizando 10X SSC como (20X SSC consiste em cloreto de sódio a 3 M e 300 mM de citrato trissódico, pH 7,0). Após a transferência, a membrana é enxaguada em 2X SSC durante 5 minutos, o RNA é reticulado por UV com a membrana (AGILENT / STRATAGENE), e a membrana é deixada secar à temperatura ambiente durante até 2 dias.
[000266] A membrana é pré-hibridada em tampão ULTRAHYB ™ (AMBION / INVITROGEN) durante 1 a 2 horas. A sonda consiste em um produto amplificado por PCR contendo a sequência de interesse (por exemplo, a porção de sequência antissenso de uma das SEQ ID NO: 7-10, conforme apropriado) marcada com digoxigenina por meio de um procedimento ROCHE APPLIED SCIENCE DIG. A hibridação no tampão recomendado é durante a noite a uma temperatura de 60°C em tubos de hibridação. Após a hibridização, a mancha é submetida a lavagens DIG, envolvida, exposta ao filme durante 1 a 30 minutos, em seguida, o filme é desenvolvido, todos pelos métodos recomendados pelo fornecedor do kit DIG.
[000267] Determinação de número de cópia de transgene. Pedaços de folhas de milho aproximadamente equivalentes a 2 perfurações de folha foram coletados em placas de coleta de 96 poços (QIAGEN). A ruptura tecidular foi realizada com um pulverizador de tecidos KLECKO ™ (GARCIA MANUFACTURING, Visalia, cA) em tampão de lise BIOSPRINT96 AP1 (fornecido com um KIT DE PLANTAS BIOSPRINT96, QIAGEN) com uma esfera de aço inoxidável. Após a maceração dos tecidos, o gDNA foi isolado em formato de alto
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135/164 rendimento utilizando um KIT de PLANTAS BIOSPRINT96 e um robô de extração BIOSPRINT96. GDNA foi diluído 1:3 DNA:água antes de se estabelecer a reação qPCR.
[000268] Análise qPCR. A detecção de transgene por ensaio de sonda de hidrólise foi realizada por PCR em tempo real utilizando um sistema LIGHTCYCLER®480. Os oligonucleotídeos utilizados nos ensaios de sonda de hidrólise para detectar o gene-alvo, a sequência de ligação (por exemplo, a alça) ou para detectar uma porção do gene SpecR (isto é, o gene de resistência à espectinomicina suportado nos plasmídeos de vetor binários; oligonucleotídeos SPC1 na Tabela 9), foram concebidos utilizando o LIGHTCYCLER® PROBE DESIGN SOFTWARE 2.0. Além disso, os oligonucleotídeos utilizados nos ensaios de sonda de hidrólise para detectar um segmento do gene de tolerância a herbicida AAD-1 (SEQ ID NO: 64; oligonucleotídeos GAAD1 na Tabela 9) foram projetados usando software PRIMER EXPRESS (Applied Biosystems). A Tabela 9 mostra as sequências dos iniciadores e sondas. Os ensaios foram multiplexados com reagentes para um gene do milho cromossômico endógeno (invertase (SEQ ID NO: 65; GenBank Acesso No: U16123; aqui referido como IVR1), que serviu como uma sequência de referência interna para garantir que gDNA estivesse presente em cada ensaio. Para amplificação, mistura de LIGHTCYCLER®480 PROBES MASTER (Roche Applied CIÊNCIA) foi preparada em uma concentração final de 1x em um volume de reação de 10 pL contendo multiplex 0,4 μΜ de cada iniciador e 0,2 μΜ de cada sonda (Tabela 10). Uma reação de amplificação em duas etapas foi efetuada como delineado na Tabela
11. A ativação e emissão de fluoroforo para as sondas marcadas com FAM e HEX foram como descritas acima, os conjugados CY5 foram excitados maximamente a 650 nm e fuorescência máxima a 670 nm. [000269] Pontuações Cp (o ponto em que o sinal de fluorescência
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136/164 atravessa o limite de fundo) foram determinadas a partir dos dados de
PCR em tempo real utilizando o algoritmo de pontos de ajuste (LIGHTCYCLER® SOFTWARE versão 1.5) e o módulo Relative Quant (baseado no método AACt). Os dados foram manipulados como descrito anteriormente (acima; qPCR).
Tabela 9. Sequências de iniciadores e sondas (com conjugado fluorescente) utilizadas nas determinações do número de cópia do gene e detecção de estrutura principal de plasmídeo de vetor binário.
Nome Sequência
GAAD1-F TGTTCGGTTCCCTCTACCAA (SEQ ID NO:66)
GAAD1-R CAACATCCATCACCTTGACTGA (SEQ ID NO:67)
GAAD1-P (FAM) CACAGAACCGTCGCTTCAGCAACA (SEQ ID NO:68)
IVR1-F TGGCGGACGACGACTTGT (SEQ ID NO:69)
IVR1-R AAAGTTTGGAGGCTGCCGT (SEQ ID NO:70)
IVR1-P CGAGCAGACCGCCGTGTACTTCTACC (SEQ ID
(HEX) NO:71)
SPC1A CTTAGCTGGATAACGCCAC (SEQ ID NO:72)
SPC1S GACCGTAAGGCTTGATGAA (SEQ ID NO:73)
TQSPEC (CY5*) CGAGATTCTCCGCGCTGTAGA (SEQ ID NO:74)
Alça F GGAACGAGCTGCTTGCGTAT (SEQ ID NO:75)
Alça R CACGGTGCAGCTGATTGATG (SEQ ID NO:76)
Alça P (FAM) TCCCTTCCGTAGTCAGAG (SEQ ID NO:77)
CY5 = Cianina-5
Tabela 10. Componentes de reação para análises de número de cópias de genes e detecção de estrutura principal de plasmídeo.
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Componente Amt. (pL) Estoque Concentração Final
2x Buffer 5,0 2x 1x
Iniciador direto apropriado 0,4 10 μΜ 0,4
Iniciador reverso apropriado 0,4 10 μΜ 0,4
Sonda apropriada 0,4 5 μΜ 0,2
IVR1- Iniciador direto 0,4 10 μΜ 0,4
IVR1- Iniciador reverso 0,4 10 μΜ 0,4
IVR1-Sonda 0,4 5 μΜ 0,2
H2O 0,6 NA* NA
gDNA 2,0 ND** ND
Total 10,0
*NA = Não Aplicável **ND = Não Determinado
Tabela 11. Condições do termociclador para DNA qPCR.
Análises de número de cópia genômica
Processo Temp. Tempo N° de ciclos
Ativação alvo 95 °C 10 min 1
Desnaturação 95 °C 10 s 40
Estender & Adquirir FAM, HEX, ou CY5 60 °C 40 s
Frio 40 °C 10 s 1
EXEMPLO 8: Bioensaio de Milho Transgênico [000270] Bioensaios de inseto. A bioatividade do dsRNA da presente invenção produzida em células vegetais é demonstrada por métodos de bioensaio. Vide, por exemplo, Baum et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25 (11): 1322-1326. Um é capaz de demonstrar eficácia, por exemplo, alimentando vários tecidos vegetais ou pedaços de tecido derivados de uma planta produzindo um dsRNA inseticida para alvejar insetos em um ambiente de alimentação controlada. Alternativamente, os
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138/164 extratos são preparados a partir de vários tecidos vegetais derivados de uma planta produzindo o dsRNA inseticida, e os ácidos nucleicos extraídos são distribuídos por cima de dietas artificiais para bioensaios como anteriormente descrito aqui. Os resultados de tais ensaios de alimentação são comparados com bioensaios conduzidos de forma semelhante que empregam tecidos de controle apropriados a partir de plantas hospedeiras que não produzem um dsRNA inseticida ou a outras amostras de controle. Crescimento e sobrevivência de insetos alvo na dieta de teste são reduzidos em comparação com o do grupo de controle.
[000271] Bioensaios de Insetos com Eventos de Milho Transgênico. Duas larvas de crisomelídeos do milho ocidental (1 a 3 dias de idade) incubadas a partir de ovos lavados são selecionadas e colocadas em cada poço do tabuleiro de bioensaio. Os poços são então cobertos com uma tampa de aba PULL N'PEEL (BIO-CV-16, BIO-SERV) e colocados em uma incubadora a 28 °C com um ciclo claro / escuro de 18/6 horas. Nove dias após a infestação inicial, as larvas são avaliadas quanto à mortalidade, que é calculada como a percentagem de insetos mortos do número total de insetos em cada tratamento. As amostras de insetos são congeladas a -20 °C durante dois dias e depois as larvas de insetos de cada tratamento são agrupadas e pesadas. A percentagem de inibição de crescimento é calculada como o peso médio dos tratamentos experimentais dividido pela média do peso médio de dois tratamentos de controle de poços. Os dados são expressos como uma Percentagem de Inibição de Crescimento (dos controles negativos). Os pesos médios que excedem o peso médio de controle são normalizados para zero.
[000272] Bioensaios de insetos na estufa. Os ovos de larva crisomelídeo do milho (WCR, Diabrotica virgifera virgifera LeConte) foram recebidos em solo de CARACTERÍSTICAS DE CULTIVO
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139/164 (Farmington, MN). Os ovos de WCR foram incubados a 28 °C durante 10 a 11 dias. Os ovos foram lavados do solo, colocados em uma solução de ágar 0,15%, e a concentração foi ajustada para aproximadamente 75 a 100 ovos por alíquota de 0,25 mL. Uma placa de incubação foi montada em uma placa de Petri com uma alíquota de suspensão de ovo para monitorizar as taxas de incubação.
[000273] O solo em torno das plantas de milho que crescem em ROOTRANERS® foi infestado com 150 a 200 ovos WCR. Os insetos foram autorizados a alimentar durante 2 semanas, após o que um tempo de Root Rating foi dado a cada planta. Utilizou-se uma escala Nó-lesão para classificação, essencialmente de acordo com Oleson et al. (2005), J. Econ. Entomol. 98: 1-8. As plantas que passaram este bioensaio, mostrando lesões reduzidas, foram transplantadas para vasos de 5 galões para produção de sementes. Os transplantes foram tratados com inseticida para evitar mais dano da raiz e liberação de insetos nas estufas. As plantas foram polinizadas manualmente para a produção de sementes. As sementes produzidas por estas plantas foram guardadas para avaliação nas gerações de plantas T1 e subsequentes.
[000274] As plantas de controle negativo transgênico foram geradas por transformação com vetores que continham genes concebidos para produzir uma proteína fluorescente amarela (YFP). Os bioensaios foram conduzidos com controles negativos incluídos em cada conjunto de materiais vegetais.
Tabela 12. Classificação de Danos da Raiz com base no bioensaio em estufa e resultados relativos de nível de expressão de transcrição de plantas de milho que expressam rpb7 e plantas de controle YFP.
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ID de Amostra Gene de Interesse ssRNA dsRNA Classificação de raiz
Eventos Rpb7-1
130746[1]-005.001 Rpb7-1 v1 0,382 3,364 0,2
130746[1]-006.001 Rpb7-1 v1 0,467 8,282 2
130746[1]-007.001 Rpb7-1 v1 0,476 0,187 2
130746[1]-010.001 Rpb7-1 v1 0,669 4,891 2
130746[1]-011.001 Rpb7-1 v1 1,474 7,621 2
130746[1]-014.001 Rpb7-1 v1 0,337 1,206 1
130746[1]-015.001 Rpb7-1 v1 4,857 7,160 2
130746[1]-018.001 Rpb7-1 v1 0,369 4,959 2
130746[1]-019.001 Rpb7-1 v1 0,432 2,412 1
130746[1]-021.001 Rpb7-1 v1 0,281 3,681 2
130746[1]-022.001 Rpb7-1 v1 0,184 3,340 1
130746[1]-024.001 Rpb7-1 v1 0,785 9,714 1
130746[1]-025.001 Rpb7-1 v1 0,532 5,897 1
130746[1]-026.001 Rpb7-1 v1 1,986 16,336 0,1
130746[1]-027.001 Rpb7-1 v1 0,877 8,456 1
Eventos YFP
126944[16]-186.001 YPF 2
126944[16]-187.001 YPF 2
126944[16]-188.001 YPF 2
126944[16]-190.001 YPF 2
126944[16]-191.001 YPF 1,5
126944[16]-192.001 YPF 2
126944[16]-193.001 YPF 2
126944[16]-196.001 YPF 2
126944[17]-197.001 YPF 2
126944[17]-198.001 YPF 2
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126944[17]-200.001 YPF 2
126944[17]-201.001 YPF 2
126944[17]-202.001 YPF 2
126944[17]-203.001 YPF 2
126944[17]-204.001 YPF 2
126944[17]-205.001 YPF 2
126944[17]-206.001 YPF 2
126944[17]-207.001 YPF 2
126944[17]-209.001 YPF 2
126944[17]-211.001 YPF 2
[000275] A medição de dsRNA relativamente ao gene de referência endógeno (proteína semelhante a TIP-41) varia de 0,187 a 16,336. As classificações de raiz para os eventos 130746 [1] -005,001 e 130746 [1] -026,001 foram 0,2 e 0,1, respectivamente. Seis eventos rpb7 adicionais tiveram avaliações de raiz de 1. Todos os controles YFP tinham uma classificação de raiz igual ou superior a 1,5.
EXEMPLO 9: Zea mays Transgênico Compreendendo Sequências de Praga de Coleópteros [000276] 10-20 plantas T0 de Zea mays transgênico são geradas como descrito no EXEMPLO 6. 10-20 linhagens independentes de Zea mays T1 expressando dsRNA de grampo para um construto iRNA são obtidas para o desafio de crisomelídeo do milho. O dsRNA de grampo compreende uma porção de SEQ ID NOs: 1, 3 e/ou 5. Os dsRNAs adicionais de grampo derivam, por exemplo, de sequências de pragas de coleópteros tais como, por exemplo, Caf1-180 (Publicação de Pedido de Patente U.S. N° 2012/0174258), VatpaseC (Publicação de Pedido de Patente U.S. N° 2012/0174259), Rho1 (Publicação de Pedido de Patente U.S. N° 2012/0174260), VatpaseH (Publicação de Pedido de Patente U.S. N° 2012/0198586), PPI-87B (Publicação de Pedido de Patente U.S. N° 2013/0091600), RPA70 (Publicação de
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Pedido de Patente U.S. N° 2013/0091601), RPS6 (Publicação de Pedido de Patente U.S. N° 2013/0097730), ROP (Pedido de Patente U.S. N° 14/577,811), RNA polymerase II140 (Pedido de Patente U.S. N° 14/577,854), RNA polymerase I1 (Pedido de Patente U.S. N° 62/133,214), RNA polymerase II-215 (Pedido de Patente U.S. N° 62/133,202), RNA polymerase 33 (Pedido de Patente U.S. N° 62/133,210), ncm (Pedido de Patente U.S. N° 62/095487), Dre4 (Pedido de Patente U.S. N° 14/705,807), COPI alpha (Pedido de Patente U.S. N° 62/063,199), COPI beta (Pedido de Patente U.S. N° 62/063,203), COPI gama (Pedido de Patente U.S. N° 62/063,192), ou COPI delta (Pedido de Patente U.S. N° 62/063,216), fator de alongamento de transcrição spt5 (Pedido de Patente U.S. N° 62/168613), e spt6 (Pedido de Patente U.S. N° 62/168606). Estes são confirmados através de RT-PCR ou outros métodos de análise molecular.
[000277] As preparações de RNA total a partir de linhagens T1 independentes selecionadas são opcionalmente utilizadas para RTPCR com iniciadores concebidos para se ligar no ligante do cassete de expressão de grampo em cada um dos construtos de iRNA. Adicionalmente, iniciadores específicos para cada gene-alvo em um construto iRNA são opcionalmente utilizados para amplificar e confirmar a produção do mRNA pré-processado necessário para a produção de siRNA in planta. A amplificação das bandas desejadas para cada gene-alvo confirma a expressão do RNA de grampo em cada planta de Zea mays transgênica. O processamento do dsRNA de grampo dos genes-alvo em siRNA é subsequentemente confirmado opcionalmente em linhagens transgênicas independentes utilizando hibridações por transferência de RNA.
[000278] Além disso, as moléculas de iRNA que têm sequências de incompatibilidade com mais de 80% de identidade de sequência com
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143/164 os genes-alvo afetam as larvas de crisomelídeo do milho de uma forma semelhante à vista com moléculas de iRNA possuindo 100% de identidade de sequência com os genes-alvo. O emparelhamento da sequência de incompatibilidade com sequências nativas para formar um dsRNA de grampo no mesmo construto de iRNA proporciona siRNAs processados em plantas capazes de afetar o crescimento, desenvolvimento e viabilidade da alimentação de pragas de coleópteros.
[000279] Na entrega in planta de dsRNA, siRNA ou miRNA correspondendo a genes-alvo e a subsequente absorção por pragas de coleópteros através da alimentação resulta na regulação para baixo dos genes-alvo na praga coleópteros através de silenciamento de genes mediado por RNA. Quando a função de um gene-alvo é importante em um ou mais estágios de desenvolvimento, o crescimento e/ou o desenvolvimento das pragas de coleópteros são afetados, e no caso de pelo menos um de WCR, NCR, SCR, MCR, D. balteata LeConte, D. speciosa Germar, D. u. Tenella, e D. u. Undecimpunctata Mannerheim, leva à falha de infestar, alimentar, e/ou desenvolver com sucesso, ou leva à morte da praga de coleópteros. A escolha de genes-alvo e a aplicação bem-sucedida de iRNA são então utilizadas para controlar as pragas de coleópteros.
[000280] Comparação fenotípica de linhagens de iRNA transgênico e Zea mays não transformado. Os genes ou sequências de pragas de coleópteros alvo selecionados para a criação de dsRNA de grampo não têm semelhança com qualquer sequência de gene de planta conhecida. Por conseguinte, não se espera que a produção ou a ativação de iRNA (sistêmico) por construtos direcionadas para estes genes ou sequências de pragas de coleópteros tenha qualquer efeito nocivo sobre plantas transgênicas. No entanto, o desenvolvimento e as características morfológicas das linhagens transgênicas são
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144/164 comparados com plantas não transformadas, bem como as de linhagens transgênicas transformadas com um vetor vazio sem gene que expressa em grampo. As características da raiz, da planta, da folha e da reprodução da planta são comparadas. As características das plantas, tais como altura, número de folhas e tamanhos, tempo de floração, tamanho floral e aparência são registradas. Em geral, não há diferenças morfológicas observáveis entre linhagens transgênicas e aquelas sem expressão de moléculas de iRNA alvo quando cultivadas in vitro e em solo na estufa.
EXEMPLO 10: Zea mays Transgênicos Compreendendo uma Sequência de Pest de Coleópteros e Construtos Adicionais de iRNA [000281] Uma planta de Zea mays transgênica compreendendo uma sequência de codificação heteróloga no seu genoma que é transcrito em uma molécula de iRNA que mira um organismo diferente de uma praga de coleópteros é secundariamente transformada através de metodologias de Agrobacterium ou WHISKERSão (vide Petolino e Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526: 59-67) para produzir uma ou mais moléculas de dsRNA inseticidas (por exemplo, pelo menos uma molécula de dsRNA incluindo uma molécula de dsRNA direcionada para um gene compreendendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5). Os vetores de plasmídeo de transformação de plantas preparados essencialmente como descrito no EXEMPLO 4 são administrados através de métodos de transformação mediados por Agrobacterium ou WHISKERS™ em células em suspensão de milho ou embriões de milho imaturos obtidos a partir de uma planta Hi II ou B104 Zea mays transgênica compreendendo uma sequência codificadora heteróloga no seu genoma que é transcrito em uma molécula de iRNA que alveja um organismo diferente de uma pest colperótica.
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EXEMPLO 11: Zea mays transgênicos compreendendo um construto iRNA e sequências adicionais de controle de pragas de coleópteros [000282] Uma planta de Zea mays transgênica compreendendo uma sequência de codificação heteróloga no seu genoma que é transcrita em um iRNA (por exemplo, pelo menos uma molécula de dsRNA que inclui uma molécula de dsRNA direcionada para um gene compreendendo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5) é secundariamente transformada através de metodologias de Agrobacterium ou WHISKERS™ (vide Petolino e Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526: 59-67) para produzir uma ou mais moléculas de proteína inseticida, por exemplo, proteínas inseticidas Cry3, cry34 e Cry35. Os vetores plasmídicos de transformação de plantas preparados essencialmente como descritos no EXEMPLO 4 são administrados via métodos de transformação mediados por Agrobacterium ou WHISKERS™ em células de suspensão de milho ou embriões de milho imaturos obtidos a partir de uma planta B104 Zea mays transgênica compreendendo uma sequência de codificação heteróloga no seu genoma que é transcrita em uma molécula de iRNA que alveja um organismo de praga de coleópteros. As plantas duplamente transformadas são obtidas as quais produzem moléculas de iRNA e proteínas inseticidas para o controle de pragas de coleópteros.
EXEMPLO 12: Triagem de Genes-alvo Candidatos em Percevejo Fétido Marrom Neotropical (Euschistus heros) [000283] Colônia de Percevejo Fétido Marrom Neotropical (BSB; Euschistus heros). BSB foram criados em uma incubadora a 27 °C, a 65% de umidade relativa, com um ciclo luz: escuro de 16: 8 horas. Um grama de ovos recolhidos ao longo de 2-3 dias foi semeado em recipientes de 5L com discas de papel de filtro no fundo, e os
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146/164 recipientes foram cobertos com malha # 18 para ventilação. Cada recipiente de criação produziu aproximadamente 300-400 BSB adultos. Em todas as fases, os insetos foram alimentados com feijão verde fresco três vezes por semana, uma saqueta de mistura de sementes que continha sementes de girassol, soja e amendoim (proporção 3: 1: 1 em peso) foi substituída uma vez por semana. A água foi suplementada em frascos com tampões de algodão como mechas. Após as duas semanas iniciais, os insetos foram transferidos para um novo recipiente uma vez por semana.
[000284] Dieta artifial de BSB. Preparou-se uma dieta artificial de BSB como se segue. Os feijões verdes liofilizados foram misturados em um pó fino em um misturador MAGIC BULLET®, enquanto os amendoins crus (orgânicos) foram misturados em um misturador MAGIC BULLET® separado. Combinaram-se os ingredientes secos misturados (percentagens em peso: feijão verde, 35%; amendoim, 35%; sacarose, 5%; complexo vitamínico (por exemplo, mistura de vitamina Vanderzant para insetos, SIGMA-ALDRICH, N° de catálogo V1007); em um grande misturador MAGIC BULLET®, que foi tapado e agitado bem para misturar os ingredientes. Os ingredientes secos misturados foram então adicionados a uma bacia de mistura. Em um recipiente separado, misturou-se bem a água e o agente antifúngico de benomila (50 ppm, 25 pL de uma solução de 20.000 ppm / solução de dieta de 50 ml) e depois adicionou-se à mistura de ingredientes secos. Todos os ingredientes foram misturados à mão até a solução estar completamente misturada. A dieta foi moldada em tamanhos desejados, envolvida frouxamente em folha de alumínio, aquecida durante 4 horas a 60 °C, e depois arrefecida e armazenada a 4 °C. A dieta artificial foi utilizada dentro de duas semanas de preparação. [000285] Montagem de transcriptoma de BSB. Foram selecionados seis estágios de desenvolvimento de BSB para preparação de
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147/164 biblioteca de mRNA. O RNA total foi extraído de insetos congelados a -70 °C e homogeneizado em 10 volumes de tampão de lise / ligação em tubos de lise MATRIX A (MP BIOMEDICALS, Santa Ana, cA) em um instrumento FastPrep®-24 (MP BIOMEDICALS). O mRNA total foi extraído utilizando um kit de isolamento miRNA mirVana™ (AMBION, INVITROGEN) de acordo com o protocolo do fabricante. O sequenciamento de RNA utilizando um sistema Illumina® HiSeq ™ (San Diego, cA) proporcionou sequências de genes-alvo candidatas para utilização na tecnologia de controle de insetos iRNA. HiSeq™ gerou um total de cerca de 378 milhões de leituras para as seis amostras. As leituras foram montadas individualmente para cada amostra utilizando o software de montagem TRINITY ™ (Grabherr et al. (2011) Nature Biotech, 29: 644-652). As transcrições agrupadas foram combinadas para gerar um transcriptoma agrupado. Este transcriptoma agrupado de BSB continha 378,457 sequências.
[000286] Identificação ortóloga de BSB rpb7. Uma pesquisa tBLASTn do transcriptoma agrupado BSB foi realizada utilizando como consulta, isoforma A da proteína Drosophila rpb7 (N° de Acesso GENBANK NP_731983). BSB rpb7-1 (SEQ ID NO: 78) foi identificado como um gene-alvo rpb7 candidato de Euschistus heros, cujo produto tem a sequência de aminoácidos prevista de SEQ ID NO: 79.
[000287] Preparação de placa e síntese de dsRNA. O cDNA foi preparado a partir de RNA de BSB total extraído de um único inseto jovem adulto (cerca de 90 mg) utilizando o Reagente TRIzol® (LIFE TECHNOLOGIES). O inseto foi homogeneizado à temperatura ambiente em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL com 200 pL de TRIzol® utilizando um pilão de pélete (FISHERBRAND, N° de catálogo 12-141-363) e Pestle Motor Mixer (COLE-PARMER, Vernon Hills, IL). Após homogeneização, adicionou-se mais 800 pL de TRIzol®, homogeneizou-se em vórtice e depois incubou-se à temperatura
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148/164 ambiente durante cinco minutos. Os detritos celulares foram removidos por centrifugação, e o sobrenadante foi transferido para um novo tubo. Seguindo o protocolo de extração TRIzol® recomendado pelo fabricante para 1 mL de TRIzol®, o pélete de RNA foi seco à temperatura ambiente e ressuspenso em 200 pL de tampão Tris a partir de um GFX PCR DNA e GEL EXTRATION KIT (Illustra™, GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES) utilizando tampão de eluição Tipo 4 (isto é, 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0). A concentração de RNA foi determinada utilizando uma amplificação de cDNA de espectrofotômetro NANODROP™ 8000 (THERMO SCIENTIFIC, Wilmington, DE).
[000288] Amplificação de cDNA. O cDNA foi transcrito inversamente a partir de 5 pg de modelo de RNA total BSB e iniciador oligo dT, utilizando um SUPERSCRIPT III FIRST-STRAND SYNTHESIS SYSTEM™ para RT-PCR (INVITROGEN), seguindo o protocolo recomendado pelo fornecedor. O volume final da reação de transcrição foi levado para 100 pL com água livre de nuclease.
[000289] Iniciadores como mostrado na Tabela 13 foram usados para amplificar BSB_rpb7-1 reg1. O modelo de DNA foi amplificado por PCR de toque (temperatura de recozimento reduzida de 60 °C para 50 °C, em uma diminuição de 1 °C / ciclo) com 1 pL de cDNA (acima) como modelo. Um fragmento compreendendo um segmento de 325 pb de BSB_rpb7-1 reg1 (SEQ ID NO: 80), foi gerado durante 35 ciclos de PCR. O procedimento acima foi também utilizado para amplificar um modelo de controle negativo de 301 pb YFPv2 (SEQ ID NO: 83), utilizando os iniciadores YFPv2-F (SEQ ID NO: 84) e YFPv2R (SEQ ID NO: 85). Os iniciadores BSB_ rpb7-1 reg1 e YFPv2 continham uma sequência de promotor de fago T7 (SEQ ID NO: 11) nas suas extremidades 5', e assim permitiu a utilização de fragmentos de DNA de YFPv2 e BSB_rpb7 para a transcrição de dsRNA.
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Tabela 13. Iniciadores e Pares de Iniciadores utilizados para amplificar porções de regiões codificadoras de genes-alvo rpb7 exemplares e um gene de controle negativo YFP.
ID de Gene ID de Iniciador Sequência
Par 20 rpb7- 1 reg1 BSB_rpb 7-1_For TTAATACGACTCACTATAGGGAGAGTT AAACAAAAATTGTACACTGAAG (SEQ ID NO:81)
BSB_rpb 7-1_Rev TTAATACGACTCACTATAGGGAGACCT CATCTTTAGAACGGTAAC (SEQ ID NO:82)
Par 21 YFP YFPv2-F TTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCA TCTGGAGCACTTCTCTTTCA (SEQ ID NO:84)
YFPv2-R TTAATACGACTCACTATAGGGAGACCA TCTCCTTCAAAGGTGATTG (SEQ ID NO:85)
[000290] Sínl tese de dsDNA. dsRNA foi sintetizado utilizando 2 pL de
produto de PCR (acima) como modelo com um kit MEGAscript™ T7 iRNA (AMBION) utilizado de acordo com as instruções do fabricante. Vide FIGURA 1. O dsRNA foi quantificado em um espectrofotômetro NANODROP™ 8000 e diluído para 500 ng/pL em tampão TE 0,1X nuclease (1 mM de Tris HCL, 0,1 mM de EDTA, pH 7,4).
[000291] Injeção de dsRNA em hemocoel de BSB. BSB foi criado em uma dieta de feijão verde e semente, como colônia, em uma incubadora a 27 °C a 65% de umidade relativa e fotoperíodo 16:8 horas luz:escuro. As ninfas do segundo estágio (cada uma pesando 1 a 1,5 mg) foram suavemente manuseadas com uma pequena escova para evitar lesões, e foram colocadas em uma placa de Petri em gelo para esfriar e imobilizar os insetos. Cada inseto foi injetado com 55,2
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150/164 nL de solução de dsRNA a 500 ng / mL (isto é, 27,6 ng de dsRNA, dose de 18,4 a 27,6 pg / g de peso corporal). As injeções foram realizadas utilizando um injector NANOJECT™ II (DRUMMOND SCIENTIFIC, Broomhall, PA), equipado com uma agulha de injeção retirada de um capilar de vidro Drummond de 3,5 polegadas # 3-000203-G/X. A ponta da agulha foi quebrada, e o capilar foi reenchido com óleo mineral leve e depois cheio com 2 a 3 pL de dsRNA. O dsRNA foi injetado no abdómen das ninfas (10 insetos injetados por dsRNA por ensaio) e os ensaios foram repetidos em três dias diferentes. Os insetos injetados (5 por poço) foram transferidos para bandejas de 32 poços (Bandeja de Elevação Bio-RT-32, BIO-SERV, Frenchtown, NJ) contendo uma pastilha de dieta BSB artificial e coberta com abas PullN- Peel™ BIO-CV-4, BIO-SERV). A umidade foi fornecida por meio de 1,25 mL de água em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL com uma mecha de algodão. As bandejas foram incubadas a 26,5 °C, 60% de umidade e fotoperíodo 16:8 horas luz:escuro. As contagens de viabilidade e os pesos foram tomados no dia 7 após as injeções. [000292] BSB rpb7 é um alvo de dsRNA letal. Como resumido na Tabela 14, em cada repetição, pelo menos dez ninfas BSB de 2° instar (1 - 1,5 mg cada) foram injetadas no hemocoel com 55,2 nL de dsRNA BSB_rpb7-1 reg1 (500 ng / mL), para uma concentração final aproximada de 18,4 - 27,6 pg de dsRNA / g de inseto. A mortalidade determinada para BSB_rpb7-1 reg1 dsRNA foi maior do que a observada com a mesma quantidade de dsRNA YFPv2 injetado (controle negativo).
Tabela 14. Resultados da injeção de dsRNA BSB rpb7 no hemocoel de ninfas de Percevejo fétido marrom neotropical de segundo instar sete dias após a injeção.
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Tratamento * N Triagens % de Mortalidade Média ± SEM** Valor p í-test
BSB rpb7-1 regí 3 62 ± 18,5 0,047t
Não injetado 1 0
YFPv2 3 7 ± 6,7
* Dez insetos injetados por ensaio para cada dsRNA ** Erro-padrão da média t indica diferença significativa do controle de dsRNA YFPv2 utilizando um teste t de Student p < 0,05.
EXEMPLO 13: Zea mays Transgênico Compreendendo Sequências de Praga de Hemíptero [000293] Dez a 20 plantas de Zea mays T0 transgênico circundando vetores de expressão para ácidos nucleicos compreendendo qualquer porção de SEQ ID NO: 78 (por exemplo, SEQ ID NO: 80) são geradas como descrito no EXEMPLO 4. Mais 10-20 linhagens independentes de Zea mays T1 que expressam dsRNA de grampo para um construto de iRNA são obtidas para desafio BSB. dsRNA de grampo é derivado compreendendo uma porção de SEQ ID NO: 78 ou segmentos do mesmo (por exemplo, SEQ ID NO: 80). Estes são confirmados através de RT-PCR ou outros métodos de análise molecular. As preparações de RNA total a partir de linhagens T1 independentes selecionadas são opcionalmente utilizadas para RT-PCR com iniciadores concebidos para se ligar no íntron ligante do cassete de expressão de grampo em cada um dos construtos de iRNA. Adicionalmente, iniciadores específicos para cada gene-alvo em um construto iRNA são opcionalmente utilizados para amplificar e confirmar a produção do mRNA pré-processado necessário para a produção de siRNA in planta. A amplificação das bandas desejadas para cada gene-alvo confirma a expressão do RNA de grampo em cada planta de Zea mays transgênica. O processamento do dsRNA de grampo dos genes-alvo
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152/164 em siRNA é subsequentemente opcionalmente confirmado em linhagens transgênicas independentes utilizando hibridações blot de
RNA.
[000294] Além disso, as moléculas de iRNA tendo sequências de incompatibilidade com mais de 80% de identidade de sequência com os genes-alvo afetam os hemípteros de uma forma semelhante à vista com moléculas de iRNA possuindo 100% de identidade de sequência com os genes-alvo. O emparelhamento da sequência de incompatibilidade com sequências nativas para formar um dsRNA de grampo no mesmo construto de iRNA proporciona siRNAs processados em plantas capazes de afetar o crescimento, o desenvolvimento e a viabilidade da alimentação de pragas de hemíptero.
[000295] Entrega in planta de dsRNA, siRNA, shRNA, hpRNA, ou miRNA correspondentes aos genes-alvo e a subsequente absorção por pragas de hemíptero através da alimentação resulta na regulação para baixo dos genes-alvo na praga hemíptera através de silenciamento de genes mediado por RNA. Quando a função de um gene-alvo é importante em um ou mais estágios de desenvolvimento, crescimento, desenvolvimento e/ou sobrevivência da praga hemíptera é afetada, e no caso de pelo menos um de Euschistus heros, E. servus, Nezara Viridula, Piezodorus guildinii, Halyomorpha halys, chinavia hilare, c. marginatum, Dichelops melacanthus, D. furcatus; edessa meditabunda, Thyanta perditor, Horcias nobilellus, Taedia stigmosa, Dysdercus peruvianus, Neomegalotomus parvus, Leptoglossus zonatus, Niesthrea sidae, Lygus hesperus e L. lineolaris conduzir à falha ao infestar, alimentar, desenvolver e/ou levar à morte da praga hemíptera. A escolha de genes-alvo e a aplicação bemsucedida de iRNA são então utilizadas para controlar pragas hemípteras.
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153/164 [000296] Comparação fenotípica de linhagens de iRNA transgênico e Zea mays não transformadas. Os genes ou sequências de pragas de hemípteros alvo selecionados para a criação de dsRNA de grampo não têm semelhança com qualquer sequência de gene de planta conhecida. Por conseguinte, não se espera que a produção ou a ativação de iRNA (sistêmico) por construtos que tenham como alvo estes genes ou sequências de pragas hemípteras terá qualquer efeito nocivo sobre plantas transgênicas. No entanto, o desenvolvimento e as características morfológicas das linhagens transgênicas são comparados com plantas não transformadas, bem como as de linhagens transgênicas transformadas com um vetor vazio sem gene que expressa em grampo. As características da raiz, da planta, da folha e da reprodução da planta são comparadas. Não há diferença observável no comprimento da raiz e nos padrões de crescimento de plantas transgênicas e não transformadas. As características das plantas, tais como altura, número de folhas e tamanhos, tempo de floração, tamanho floral e aparência são semelhantes. Em geral, não há diferenças morfológicas observáveis entre linhagens transgênicas e aquelas sem expressão de moléculas de iRNA alvo quando cultivadas in vitro e em solo na estufa.
EXEMPLO 14: Glicina max transgênica Compreendendo Sequências de Pragas Hemípteras [000297] Dez a 20 plantas transgênicas T0 Glycine max que abrigam vetores de expressão são geradas para ácidos nucleicos compreendendo uma porção de SEQ ID NO: 78 ou segmentos dos mesmos (por exemplo, SEQ ID NO: 80) como é conhecido na técnica, incluindo por exemplo por transformação mediada por Agrobacterium, como se segue. Sementes de soja madura (Glycine max) são esterilizadas durante a noite com gás cloro durante dezesseis horas. Após a esterilização com gás cloro, as sementes são colocadas em
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154/164 um recipiente aberto em uma capa de fluxo LAMINAR ™ para dissipar o gás cloro. Em seguida, as sementes esterilizadas são imbibidas com
H2O estéril durante dezesseis horas no escuro, utilizando uma caixa preta a 24 °C.
[000298] Preparação de soja semente dividida. A semente de soja separada compreendendo uma porção de um protocolo de eixo embrionário requer a preparação de material de semente de soja que é cortado longitudinalmente, utilizando uma lâmina # 10 afixada em um bisturi, ao longo do hilo da semente para separar e remover o revestimento de semente e para dividir a semente em duas seções de cotilédones. Uma atenção cuidadosa é feita para remover parcialmente o eixo embrionário, em que cerca de 1/2 - 1/3 do eixo do embrião permanece ligado à extremidade nodal do cotilédone.
[000299] Inoculação. As sementes de soja separadas compreendendo uma porção parcial do eixo embrionário são então imersas durante cerca de 30 minutos em uma solução de Agrobacterium tumefaciens (por exemplo, cepa EHA 101 ou EHA 105) contendo um plasmídeo binário compreendendo SEQ ID NO: 78 e/ou segmentos (por exemplo, SEQ ID NO: 80). A solução de A. tumefaciens é diluída até uma concentração final de λ = 0,6 OD650 antes de imergir os cotilédones compreendendo o eixo do embrião. [000300] Cocultivo. Após inoculação, a semente de soja separada é deixada cocultivar com a cepa Agrobacterium tumefaciens durante 5 dias em meio de cocultivo (Agrobacterium Protocols, vol. 2, 2a Ed., Wang, K. (Ed.) Humana Press, New Jersey, 2006) em uma placa de Petri coberta com um pedaço de papel de filtro.
[000301] Indução de broto. Após 5 dias de cocultivo, as sementes de soja separadas são lavadas em meio líquido de Indução de Disparo (SI) consistindo em sais de B5, vitaminas B5, ferroso, Na2EDTA a 38 mg/L, 30 g/L de sacarose, 0,6 g/L de MES, 1,11 mg/L de BAP, 100
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155/164 mg/L de TIMENTIN ™, 200 mg/L de cefotaxima e 50 mg/L de vancomicina (pH 5,7). As sementes de soja divididas são então cultivadas em meio de Indução I Shoo (SI I), consistindo em sais de B5, vitaminas B5, 7 g/L de ágar Noble, 28 mg/L de ferroso, 38 mg/L de Na2EDTA, 30 g/L de sacarose, 0,6 g/L de MES, 1,11 mg/L BAP, 50 mg/L de TIMENTIN ™, 200 mg/L de cefotaxima e 50 mg/L de vancomicina (pH 5,7), com o lado plano do cotilédone virado para cima e a extremidade nodal do cotilédone encaixada no meio. Após 2 semanas de cultura, os explantes a partir da semente de soja dividida transformada são transferidos para o meio de Indução de broto II (SI II) contendo meio SI I suplementado com 6 mg/L de glufosinato (LIBERTY®).
[000302] Alongamento de broto. Após 2 semanas de cultura em meio SI II, os cotilédones são removidos dos explantes e uma almofada de broto de alinhada contendo o eixo embrionário é excisada fazendo um corte na base do cotilédone. A almofada de broto isolada do cotilédone é transferida para o meio de alongamento de broto (SE). O meio SE consiste em sais de MS, 28 mg/L de ferroso, 38 mg/L de Na2EDTA, 30 g/L de sacarose e 0,6 g/L de MES, 50 mg/L de asparagina, 100 mg/L de ácido L-piroglutâmico, 0,1 mg/L IAA, 0,5 mg/L de GA3, 1 mg/L de ribossido de zeatina, 50 mg/L de TIMENTIN™, 200 mg/L de cefotaxima, 50 mg/L de vancomicina, 6 mg/L de glufosinato e 7 g / PH 5,7). As culturas são transferidas para meio SE fresco a cada 2 semanas. As culturas são cultivadas em uma câmara de crescimento CONVIRON ™ a 24 °C com um fotoperíodo de 18 h a uma intensidade de luz de 80-90 pmol / m2s.
[000303] Enraizamento. Os brotos alongados que se desenvolvem a partir da almofada de broto são isolados cortando o broto alongado na base da almofada de cotilédones e mergulhando o broto alongado em 1 mg/L de IBA (ácido indol 3-butírico) durante 1-3 minutos para
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156/164 promover enraizamento. Em seguida, os brotos alongados são transferidos para meio de enraizamento (sais de MS, vitaminas B5, ferroso 28 mg/L, Na2EDTA a 38 mg/L, sacarose 20 g/L e 0,59 g/L de
MES, asparagina a 50 mg/L, 100 mg/L de ácido L-piroglutâmico e 7 g/L de ágar Noble, pH 5,6) em bandejas de fíta.
[000304] Cultivo. Após cultura em câmara de crescimento CONVIRON™ a 24 °C, fotoperíodo de 18 h, durante 1-2 semanas, os brotos que têm raízes desenvolvidas são transferidos para uma mistura de solo em um copo de sundae coberto e colocados em uma câmara de crescimento CONVIRON™ (modelos CMP4030 e CMP3244, Controlled Environments Limited, Winnippor exemplo, Manitoba, Canadá) em condições de dia longo (16 horas de luz / 8 horas de escuro) a uma intensidade de luz de 120-150 pmol / m2s à temperatura constante (22 °C) e umidade -50%) para aclimatação de plântulas. As plântulas enraizadas são aclimatadas em copos de sundae por várias semanas antes de serem transferidas para a estufa para uma posterior aclimatização e estabelecimento de plantas transgênicas robustas de soja.
[000305] Mais 10-20 linhagens T1 Glycine max independentes expressando dsRNA de grampo para um construto de iRNA são obtidas para desafio BSB. O dsRNA de grampo pode ser derivado compreendendo a SEQ ID NO: 78 ou seus segmentos (por exemplo, SEQ ID NO: 80). Estes são confirmados através de RT-PCR ou outros métodos de análise molecular como são conhecidos na técnica. As preparações de RNA total a partir de linhagens T1 independentes selecionadas são opcionalmente utilizadas para RT-PCR com iniciadores concebidos para se ligar no íntron ligante do cassete de expressão de grampo em cada um dos construtos de iRNA. Adicionalmente, iniciadores específicos para cada gene-alvo em um construto de iRNA são opcionalmente utilizados para amplificar e
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157/164 confirmar a produção do mRNA pré-processado necessário para a produção de siRNA in planta. A amplificação das bandas desejadas para cada gene-alvo confirma a expressão do RNA de grampo em cada planta Glycine max transgênico. O processamento do dsRNA de grampo dos genes-alvo em siRNA é subsequentemente confirmado opcionalmente em linhagens transgênicas independentes utilizando hibridações por transferência de RNA.
[000306] Moléculas de iRNA tendo sequências de incompatibilidade com mais de 80% de identidade de sequência com os genes-alvo afetam o BSB de uma forma semelhante à vista com moléculas de iRNA possuindo 100% de identidade de sequência com os genes-alvo. O emparelhamento da sequência de incompatibilidade com sequências nativas para formar um dsRNA de grampo na mesma construção de iRNA proporciona siRNAs processados em plantas capazes de afetar o crescimento, desenvolvimento e viabilidade da alimentação de pragas de hemíptero.
[000307] Na entrega in planta de dsRNA, siRNA, shARN ou miRNA correspondente aos genes-alvo e a subsequente absorção por pragas de hemíptero através da alimentação resulta na regulação para baixo dos genes-alvo na praga do hemíptero através de silenciamento de genes mediado por RNA. Quando a função de um gene-alvo é importante em um ou mais estágios de desenvolvimento, o crescimento, desenvolvimento e viabilidade da alimentação da praga hemíptera são afetados, e no caso de pelo menos um de Euschistusheros, Piezodorus guildinii, Halyomorpha halys, Nezara viridula, Euschistus servus, Dichelops melacanthus, Dichelops furcatus, Edessa meditabunda, Thyanta perditor, chinavia marginatum, Horcias nobilellus, Taedia stigmosa, Dysdercus peruvianus, Neomegalotomus parvus, Leptoglossus zonatus, Niesthrea sidae e Lygus lineolaris levar ao fracasso ao infestar, alimentar, desenvolver
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158/164 de modo bem-sucedido e/ou levar à morte da praga hemíptera. A escolha dos genes-alvo e a aplicação bem-sucedida de iRNA são então utilizadas para controlar pragas hemípteras.
[000308] Comparação fenotípica de linhagens de iRNA transgênicas e Glycina max não transformada. Os genes ou sequências de pragas de hemípteros alvo selecionados para a criação de dsRNA de grampo não têm semelhança com qualquer sequência de gene de planta conhecida. Por conseguinte, não se espera que a produção ou a ativação de iRNA (sistêmico) por construtos tendo como alvo estes genes ou sequências de pragas hemípteras terá qualquer efeito nocivo sobre plantas transgênicas. No entanto, o desenvolvimento e as características morfológicas das linhagens transgênicas são comparados com plantas não transformadas, bem como as de linhagens transgênicas transformadas com um vetor vazio sem gene que expressa em grampo. As características da raiz, da planta, da folhagem e da reprodução da planta são comparadas. Não há diferença observável no comprimento da raiz e nos padrões de crescimento de plantas transgênicas e não transformadas. As características das plantas, tais como altura, número de folhas e tamanhos, tempo de floração, tamanho floral e aparência são semelhantes. Em geral, não há diferenças morfológicas observáveis entre linhagens transgênicas e aquelas sem expressão de moléculas de iRNA alvo quando cultivadas in vitro e em solo na estufa.
EXEMPLO 15: Bioensaios de E. heros em Dieta Artificial.
[000309] Em ensaios de alimentação de dsRNA em dieta artificial, bandejas de 32 poços são ajustadas com um pélete de 18 mg de dieta artificial e água, como para experiências de injeção (vide EXEMPLO 12). Adiciona-se dsRNA a uma concentração de 200 ng/pL ao alimento e à amostra de água; 100 pL para cada um dos dois poços. Cinco ninfas de E. heros 2° ínstar são introduzidas em cada poço. As
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159/164 amostras de água e dsRNA que se dirige a uma transcrição de YFP são utilizadas como controles negativos. As experiências são repetidas em três dias diferentes. Os insetos sobreviventes são pesados, e as taxas de mortalidade são determinadas após 8 dias de tratamento. Mortalidade e/ou inibição de crescimento são observadas nos poços providos com dsRNA de BSB_rpb7, em comparação com os poços de controle.
EXEMPLO 16: Arabidopsis thaliana transgênica que compreende sequências de pragas de hemíptero [000310] Vetores de transformação de Arabidopsis contendo um construto de gene-alvo para a formação de grampo que compreende segmentos de rpb7 (SEQ ID NO: 78) são produzidos utilizando métodos moleculares padrão semelhantes ao EXEMPLO 4. A transformação de Arabidopsis é realizada utilizando o procedimentopadrão baseado em Agrobacterium. As sementes T1 são selecionadas com o marcador selecionável de tolerância ao glufosinato. As plantas T1 transgênicas de Arabidopsis são geradas e as plantas transgênicas T2 de cópia simples homozigóticas são geradas para estudos de insetos. Os bioensaios são realizados em plantas de Arabidopsis com inflorescências. Cinco a dez insetos são colocados em cada planta e monitorados para sobrevivência dentro de 14 dias.
[000311 ] Construção de vetores de transformação de Arabidopsis. Clones de entrada baseados em um vetor de entrada que aloja um construto de gene-alvo para formação de grampo compreendendo um segmento de BSB_rpb7 (SEQ ID NO: 78) são montados utilizando uma combinação de fragmentos quimicamente sintetizados (DNA2.0, Menlo Park, cA) e métodos de clonagem molecular padrão. A formação de grampo intramolecular por transcritos primários de RNA é facilitada arranjando (dentro de uma única unidade de transcrição) duas cópias de um segmento de gene-alvo em orientações opostas,
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160/164 sendo os dois segmentos separados por uma sequência de ligação (por exemplo, uma alça (tal como SEQ ID NO: 96) ou um íntron STLS1) (Vancanneyt et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 220 (2): 245-50). Assim, a transcrição de mRNA primário contém as duas sequências de segmento de gene rpb7 como grandes repetições invertidas uma da outra, separadas pela sequência ligante. Uma cópia de um promotor (por exemplo, o promotor de ubiquitina 10 de Arabidopsis thaliana (Callis et al. (1990) J. Biological Chem. 265: 12486-12493)) é utilizada para conduzir a produção da transcrição primária de mRNA em pelos, e um fragmento compreendendo um fragmento 3' não traduzido do Quadro de Leitura Aberto 23 de Agrobacterium tumefaciens (AtuORF23 3' UTR v1; patente US 5 428 147) é utilizado para terminar a transcrição do gene que expressa o RNA de grampo.
[000312] Os clones de grampo dentro dos vetores de entrada são usados em reações de recombinação GATEWAY® padrão com um vetor de destino binário típico para produzir vetores de transformação de expressão de RNA em pelos para a transformação de Arabidopsis mediada por Agrobacterium.
[000313] Um vetor de destino binário compreende um gene de tolerância a herbicida, DSM-2v2 (Publicação N° 2011/0107455), sob a regulação de um promotor do vírus do mosaico da veia de mandioca (Promoter CsVMV v2, Patente US 7.601.885, Verdaguer et al. (1996) Plant Mol. Biol. 31: 1129-39). Um fragmento que compreende uma região 3' não traduzida a partir do Quadro de Leitura Aberta 1 de Agrobacterium tumefaciens (AtuORF1 3' UTR v6, Huang et al. (1990) J. Bacteriol 172: 1814-22) é utilizado para terminar a transcrição do mRNA de DSM2v2.
[000314] Um construto binário de controle negativo que compreende um gene que expressa um RNA de grampo YFP é construído por meio de reações de recombinação padrão GATEWAY® com um vetor de
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161/164 destino binário típico e vetor de entrada. O construto de entrada compreende uma sequência de grampo YFP sob o controle de expressão de um promotor de ubiquitina 10 de Arabidopsis (como acima) e um fragmento compreendendo uma região não traduzida 3'
ORF23 a partir de Agrobacterium tumefaciens (como acima).
[000315] Produção de Arabidopsis transgênica compreendendo RNAs inseticidas: transformação mediada por Agrobacterium.
Plasmídeos binários contendo sequências de dsRNA de grampo são eletroporados na cepa GV3101 de Agrobacterium (pMP90RK). Os clones recombinantes de Agrobacterium são confirmados por análise de restrição de preparações de plasmídeos das colônias de Agrobacterium recombinantes. Um Kit Qiagen Plasmid Max (Qiagen, cat # 12162) é utilizado para extrair plasmídeos de culturas de Agrobacterium seguindo o protocolo de fabricação recomendado. [000316] Transformação de Arabidopsis e Seleção de T1. Doze a quinze plantas de Arabidopsis (cv Columbia) são cultivadas em vasos de 4 em estufa, com uma intensidade de luz de 250 pmol/m2, 25 °C e 18:6 horas de condições de luz:escuras. Caules de flores primárias são cortados antes da transformação. Inóculos de Agrobacterium são preparados por incubação de 10 pL de estoque de Agrobacterium glicerol recombinante em 100 mL de caldo LB (Sigma L3022) + 100 mg/L de Espectinomicina + 50 mg/L de canamicina a 28 °C e agitação a 225 rpm durante 72 horas. Células de Agrobacterium são colhidas e suspensas em 5% de sacarose + 0,04% de Silwet-L77 (Lehle Seeds Cat # VIS-02) + 10 pg/L de solução de benzamino-purina (BA) até OD600 0,8 ~ 1,0 antes do mergulho floral. A planta é mergulhada na solução de Agrobacterium por 5-10 minutos, com agitação suave. As plantas são então transferidas para a estufa para o crescimento normal com rega regular e fertilização até ajuste de semente. EXEMPLO 17: Crescimento e Bioensaios de Arabidopsis
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Transgênica [000317] Seleção de Arabidopsis T1 Transformadas com construtos de dsRNA. Até 200 mg de sementes T1 de cada transformação são estratificados em solução de agarose a 0,1%. As sementes são plantadas em bandejas de germinação (10,5 x 21 x 1, T.O. Plastics Inc., clearwater, MN) com meios Sunshine # 5. Os transformantes são selecionados para tolerância a Ignite® (glufosinato) a 280 g/ha aos 6 e 9 dias após a plantação. Os eventos selecionados são transplantados em vasos de 4 de diâmetro. A análise de cópia de inserção é realizada dentro de uma semana de transplante através de hidrólise quantitativa de PCR em Tempo Real (qPCR) utilizando Roche LightCycler480™. Os iniciadores de PCR e as sondas de hidrólise foram concebidos contra o marcador selecionável DSM2v2 utilizando o software 2.0 Probe Design LightCycler™ (Roche). As plantas são mantidas a 24 °C, com um fotoperíodo luz:escuro de 16:8 horas sob luzes fluorescentes e incandescentes com intensidade de 100-150 mE/m2s.
[000318] Bioensaios de alimentação de plantas de E. heros. Pelo menos quatro cópias baixas (1-2 inserções), quatro cópias médias (2-3 inserções) e quatro cópias altas (> 4 inserções) para cada construto são selecionadas. As plantas são cultivadas até um estágio reprodutivo (plantas contendo flores e siliques). A superfície do solo é coberta com ~ 50 ml de volume de areia branca para fácil identificação de insetos. Cinco a dez ninfas de E. heros de segundo ínstar são introduzidas em cada planta. As plantas são cobertas com tubos de plástico de 3 de diâmetro, 16 de altura e com espessura de parede de 0,03 (Item N° 484485, Visipack Fenton MO); os tubos são cobertos com malha de náilon para isolar os insetos. As plantas são mantidas sob condições normais de temperatura, luz e rega em um conviron. Em 14 dias, os insetos são coletados e pesados; percentagem de
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163/164 mortalidade, bem como a inibição do crescimento (1 - peso do tratamento / controle do peso). Plantas expressando grampo YFP são usadas como controles. A mortalidade significativa e/ou inibição do crescimento são observadas em ninfas alimentando-se de plantas transgênicas BSB_rpb7 dsRNA, em comparação com a de ninfas em plantas de controle.
[000319] Geração de sementes de Arabidopsis T2 e bioensaios T2. A semente T2 é produzida a partir de eventos selecionados de baixa cópia (1-2 inserções) para cada construto. As plantas (homozigóticas e/ou heterozigóticas) são submetidas a bioensaio de alimentação de
E. heros, como descrito acima. A semente T3 é colhida a partir de homozigotos e armazenada para futura análise.
EXEMPLO 18: Transformação de Espécies de Culturas Adicionais [000320] Cóton é transformado com um transgene de dsRNA de rpb7 para proporcionar controle de insetos hemípteros utilizando um método conhecido dos versados na técnica, por exemplo, substancialmente as mesmas técnicas anteriormente descritas no EXEMPLO 14 da Patente US 7 838 733, ou no Exemplo 12 da Publicação de Patente Internacional PCT N° WO 2007/053482. EXEMPLO 19: dsRNA rpb7 em manipulação de Insetos [000321] Os transgenes dsRNA rpb7 são combinados com outras moléculas de dsRNA em plantas transgênicas para proporcionar controle redundante de insetos e efeitos iRNA combinados. As plantas transgênicas incluindo, por exemplo e sem limitação, o milho, a soja e o algodão que expressam dsRNA que se destina a rpb7 são úteis para prevenir danos à alimentação por insetos coleópteros e hemípteros. Os transgenes dsRNA rpb7 também são combinados em plantas com Bacillus thuringiensis, PIP-1 e/ou a tecnologia de proteína inseticida AflP para representar novos modos de ação em pirâmides de genes de Manipulação de Resistência a Insetos. Quando combinado com
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164/164 outras moléculas de dsRNA que visam pragas de insetos e/ou com proteínas inseticidas em plantas transgênicas, observa-se um efeito inseticida combinado que também mitiga o desenvolvimento de populações de insetos resistentes.
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Claims (60)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Ácido nucleico isolado, compreendendo pelo menos um polinucleotídeo ligado operacionalmente a um promotor heterólogo, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em:
    SEQ ID NO: 1; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 1; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1; o complemento ou complemento inverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NOs: 7 e 10; o complemento ou complemento inverso de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NOs: 7 e 10; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NOs: 7 e 10; o complemento ou complemento inverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NOs: 7 e 10;
    SEQ ID NO: 3; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 3; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 3; o complemento ou complemento inverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 3; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO: 8; o complemento ou complemento inverso de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO: 8; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificadora nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO: 8; o complemento ou complemento inverso de um fragmento
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  2. 2/17 de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ
    ID NO: 8;
    SEQ ID NO: 5; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 5; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 5; o complemento ou complemento inverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 5; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO: 9; o complemento ou complemento inverso de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO: 9; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificadora nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO: 9; o complemento ou complemento inverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO: 9;
    SEQ ID NO: 78; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 78; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 78; o complemento ou complemento inverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 78; uma sequência de codificação nativa de um organismo de Euschistus compreendendo SEQ ID NO: 80; o complemento ou complemento inverso de uma sequência de codificação nativa de um organismo de Euschistus compreendendo SEQ ID NO: 80; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificadora nativa de um organismo de Euschistus compreendendo SEQ ID NO: 80; e o complemento ou complemento inverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo de Euschistus
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  3. 3/17 compreendendo SEQ ID NO: 80.
    2. Polinucleotídeo como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 5; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1; o complemento ou complemento reverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 3; o complemento ou complemento inverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 3; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 5; o complemento ou complemento inverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 5; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO: 7-10; o complemento ou complemento inverso de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO: 7-10; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO: 7-10; e o complemento ou complemento inverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificadora nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO: 7-10.
    3. Polinucleotídeo como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:
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  4. 4/17
  5. 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ
    ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, e o complemento ou complemento inverso de qualquer dos anteriores.
    4. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o organismo é selecionado a partir do grupo que consiste em D. v. virgifera LeConte; D. barberi Smith and Lawrence; D. u. howardi; D. v. zeae; D. balteata LeConte; D. u. tenella;
    D. speciosa; D. u. undecimpunctata Mannerheim; Euschistus heros (Fabr.) (Neotropical Brown Stink Bug), Nezara viridula (L.) (Southern Green Stink Bug), Piezodorus guildinii (Westwood) (Red-banded Stink Bug), Halyomorpha halys (Stál) (Brown Marmorated Stink Bug), Chinavia hilare (Say) (Green Stink Bug), Euschistus servus (Say) (Brown Stink Bug), Dichelops melacanthus (Dallas), Dichelops furcatus (F.), Edessa meditabunda (F.), Thyanta perditor (F.) (Neotropical Red Shouldered Stink Bug), Chinavia marginatum (Palisot de Beauvois), Horcias nobilellus (Berg) (Cotton Bug), Taedia stigmosa (Berg), Dysdercus peruvianus (Guérin-Méneville), Neomegalotomus parvus (Westwood), Leptoglossus zonatus (Dallas), Niesthrea sidae (F.), Lygus hesperus (Knight) (Western Tarnished Plant Bug), e Lygus lineolaris (Palisot de Beauvois).
    5. Vetor de transformação de plantas, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.
  6. 6. Molécula de ácido ribonucleico (RNA), caracterizada pelo fato de que é transcrita a partir do polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.
  7. 7. Molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo, caracterizada pelo fato de que é produzida a partir da expressão do polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.
  8. 8. Molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo de
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    5/17 acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o contato da sequência polinucleotídica com um inseto coleóptero ou hemíptero inibe a expressão de uma sequência de nucleotídeos endógena especificamente complementar ao polinucleotídeo.
  9. 9. Molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o contato da referida molécula de ribonucleotídeo com um inseto coleóptero ou hemíptero mata ou inibe o crescimento, a viabilidade e/ou a alimentação do inseto.
  10. 10. RNA de duplo filamento de como definido na reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende um primeiro, um segundo e um terceiro segmento de RNA, em que o primeiro segmento de RNA compreende o polinucleotídeo, em que o terceiro segmento de RNA está ligado ao primeiro segmento de RNA pela segunda sequência polinucleotídica e em que o terceiro segmento de RNA é substancialmente o complemento inverso do primeiro segmento de RNA, de modo que o primeiro e o terceiro segmentos de RNA hibridam quando são transcritos em um ácido ribonucleico para formar o RNA de duplo filamento.
  11. 11. RNA como definido na reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que é selecionado a partir do grupo consistindo em uma molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo e uma molécula de ácido ribonucleico de filamento simples compreendida entre cerca de 15 e cerca de 30 nucleotídeos de comprimento.
  12. 12. Vetor de transformação de plantas compreendendo o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o promotor heterólogo é funcional em uma célula de planta.
  13. 13. Célula, caracterizada pelo fato de que é transformada com o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.
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  14. 14. Célula de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula procariótica.
  15. 15. Célula de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula eucariótica.
  16. 16. Célula de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula vegetal.
  17. 17. Planta, caracterizada pelo fato de que é transformada com o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.
  18. 18. Semente da planta como definida na reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a semente compreende o polinucleotídeo.
  19. 19. Produto de base produzido a partir da planta como definida na reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o produto de base compreende uma quantidade detectável do polinucleotídeo, sendo o produto de base preferivelmente um alimento ou óleo.
  20. 20. Planta de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que pelo menos um polinucleotídeo é expresso na planta como uma molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo.
  21. 21. Célula de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula de milho, soja ou algodão.
  22. 22. Planta de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a planta é milho, soja ou algodão.
  23. 23. Planta de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que pelo menos um polinucleotídeo é expresso na planta como uma molécula de ácido ribonucleico e a molécula de ácido ribonucleico inibe a expressão de um polinucleotídeo endógeno que é especificamente complementar a pelo menos um polinucleotídeo quando um inseto coleóptero ou hemíptero ingere uma parte da planta.
  24. 24. Polinucleotídeo como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda pelo menos um
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    7/17 polinucleotídeo adicional que codifica uma molécula de RNA que inibe a expressão de um gene de inseto endógeno.
  25. 25. Vetor de transformação de plantas compreendendo o polinucleotídeo como definido na reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que os polinucleotídeos adicionais são, cada um, operativamente ligados a um promotor heterólogo funcional em uma célula vegetal.
  26. 26. Método para controlar uma população de pragas de coleópteros ou hemípteros, o método caracterizado pelo fato de que compreende proporcionar um agente compreendendo uma molécula de ácido ribonucleico (RNA) que funciona em contato com a praga para inibir uma função biológica dentro da praga, em que o RNA é especificamente hibridável com um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em qualquer uma das SEQ ID NOs: 86-88 e 93; o complemento ou complemento inverso de qualquer uma das SEQ ID NO: 86-88 e 93; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 86-88 e 93; o complemento ou complemento inverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 86-88 e 93; uma transcrição de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, 3, 5 e 78; o complemento ou complemento inverso de uma transcrição de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, 3, 5 e 78; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma transcrição de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, 3, 5 e 78; e o complemento ou complemento inverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma transcrição de qualquer uma das SEQ ID NO: 1,3, 5 e 78.
  27. 27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o RNA do agente é especificamente hibridizável com um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em qualquer uma das SEQ ID NO: 89-92 e 94; o
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    8/17 complemento ou complemento inverso de qualquer uma das SEQ ID NO: 89-92 e 94; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NO: 89-92 e 94; o complemento ou complemento inverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NO: 89-92 e 94; uma transcrição de qualquer uma das SEQ ID NO: 7-10 e 80; o complemento ou complemento inverso de uma transcrição de qualquer uma das SEQ ID NO: 7-10 e 80; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma transcrição de qualquer uma das SEQ ID NOs: 7-10 e 80; e o complemento ou complemento inverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma transcrição de qualquer uma das SEQ ID NO: 7-10 e 80.
  28. 28. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o agente é uma molécula de RNA de duplo filamento.
  29. 29. Método para controlar uma população de pragas de coleópteros, o método caracterizado pelo fato de que compreende:
    proporcionar um agente compreendendo uma primeira e uma segunda sequências de polinucleotídeos que funcionam em contato com a praga de coleópteros para inibir uma função biológica dentro da praga de coleópteros, em que a primeira sequência de polinucleotídeos compreende uma região que exibe de cerca de 90% a cerca de 100% de identidade de sequência de cerca de 15 a cerca de 30 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NO: 86-92 e em que a primeira sequência polinucleotídica é especificamente hibridizada com a segunda sequência polinucleotídica.
  30. 30. Método para controlar uma população de pragas de hemípteros, o método caracterizado pelo fato de que compreende:
    proporcionar um agente compreendendo uma primeira e uma segunda sequências de polinucleotídeos que funcionam em
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    9/17 contato com a praga de hemíptero para inibir uma função biológica dentro da praga de hemíptero, em que a primeira sequência de polinucleotídeos compreende uma região que exibe de cerca de 90% a cerca de 100% de identidade de sequência de cerca de 15 a cerca de 30 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 93 e SEQ ID NO: 94 e em que a primeira sequência de polinucleotídeos é especificamente hibridizada com a segunda sequência polinucleotídica.
  31. 31. Método para o controle de uma população de pragas de insetos coleópteros ou hemípteros, o método caracterizado pelo fato de que compreende:
    proporcionar em uma planta hospedeira de uma praga de inseto coleóptero ou hemíptero uma célula de planta transformada compreendendo o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1, em que o polinucleotídeo é expresso para produzir uma molécula de ácido ribonucleico que atua no contato com uma praga de coleópteros pertencentes à população para inibir a expressão de uma sequênciaalvo dentro da praga de coleópteros e resulta em uma diminuição do crescimento e/ou sobrevivência da população de pragas ou de pragas de coleópteros, relativamente à reprodução da mesma espécie de praga em uma planta da mesma espécie de planta hospedeira que não compreende o polinucleotídeo.
  32. 32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido ribonucleico é uma molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo.
  33. 33. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a população de pragas de coleópteros ou hemípteros é reduzida em relação a uma população da mesma espécie de praga que infesta uma planta hospedeira da mesma espécie de planta hospedeira sem a célula de planta transformada.
  34. 34. Método de acordo com a reivindicação 32,
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    10/17 caracterizado pelo fato de que a população de pragas de coleópteros é reduzida em relação a uma população de pragas de coleópteros infestando uma planta hospedeira da mesma espécie sem a célula de planta transformada.
  35. 35. Método para controlar a infestação de pragas de insetos em uma planta, o método caracterizado pelo fato de que compreende proporcionar na dieta de uma praga de inseto um ácido ribonucleico (RNA) que é especificamente hibridável com um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em:
    SEQ ID NO: 86- 88 e 93;
    o complemento ou complemento inverso de qualquer uma das SEQ ID NO: 86-88 e 93;
    um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 86-88 e 93;
    o complemento ou complemento inverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 86-88 e 93;
    uma transcrição de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, 3, 5 e 78;
    o complemento ou complemento inverso de uma transcrição de qualquer uma das SEQ ID NO: 1,3, 5 e 78;
    um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma transcrição de qualquer uma das SEQ ID NO: 1,3, 5 e 78; e o complemento ou complemento inverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma transcrição de qualquer uma das SEQ ID NO: 1,3, 5 e 78.
  36. 36. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a dieta compreende uma célula de planta transformada para expressar o polinucleotídeo ou uma isca de iRNA compreendendo o RNA.
    Petição 870170007315, de 02/02/2017, pág. 328/385
    11/17
  37. 37. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o RNA especificamente hibridável está compreendido em uma molécula de RNA de duplo filamento.
  38. 38. Método para controlar a infestação de pragas de insetos em uma planta, o método caracterizado pelo fato de que compreende o contato de uma praga de inseto com um ácido ribonucleico (RNA) que é hibridizável especificamente com um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em:
    SEQ ID NOs: 86-88 e 93;
    o complemento ou complemento inverso de qualquer uma das SEQ ID NO: 86-88 e 93;
    um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 86-88 e 93;
    o complemento ou complemento inverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 86-88 e 93;
    uma transcrição de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, 3, 5 e 78;
    o complemento ou complemento inverso de uma transcrição de qualquer uma das SEQ ID NO: 1,3, 5 e 78;
    um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma transcrição de qualquer uma das SEQ ID NO: 1,3, 5 e 78; e o complemento ou complemento inverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma transcrição de qualquer uma das SEQ ID NO: 1,3, 5 e 78.
  39. 39. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o contato da praga de inseto com o RNA compreende a pulverização da planta com uma composição compreendendo o RNA.
  40. 40. Método de acordo com a reivindicação 38,
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    12/17 caracterizado pelo fato de que o RNA especificamente hibridável está compreendido em uma molécula de RNA de duplo filamento.
  41. 41. Método para melhorar o rendimento de uma cultura vegetal, o método caracterizado pelo fato de que compreende:
    introdução do ácido nucleico como definido na reivindicação 1 em uma planta para produzir uma planta transgênica; e cultivar a planta para permitir a expressão de pelo menos um polinucleotídeo; em que a expressão do pelo menos um polinucleotídeo inibe a reprodução ou crescimento de pragas de insetos e a perda de rendimento devido à infecção de pragas de insetos.
  42. 42. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que a expressão do pelo menos um polinucleotídeo produz uma molécula de RNA que suprime pelo menos um primeiro gene-alvo em uma praga de inseto que tenha contatado uma porção da planta de milho.
  43. 43. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, e o complemento ou complemento inverso de qualquer dos anteriores.
  44. 44. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que a planta é uma planta de milho, soja ou algodão.
  45. 45. Método para a produção de uma célula vegetal transgênica, o método caracterizado pelo fato de que compreende:
    transformar uma célula vegetal com um vetor compreendendo o ácido nucleico como definido na reivindicação 1;
    cultivar a célula vegetal transformada em condições
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    13/17 suficientes para permitir o desenvolvimento de uma cultura de células vegetais compreendendo uma pluralidade de células vegetais transformadas;
    selecionar para células de plantas transformadas que integraram o pelo menos um polinucleotídeo nos seus genomas;
    triar as células vegetais transformadas para a expressão de uma molécula de ácido ribonucleico (RNA) codificada pelo pelo menos um polinucleotídeo; e selecionar uma célula vegetal que expresse o RNA.
  46. 46. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende um polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 3; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; o complemento ou complemento inverso de SEQ ID NO: 5; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3 e 5; o complemento ou complemento inverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NO: 1,3 e 5; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO: 7-10; o complemento ou complemento inverso de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO: 7-10; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO: 7-10; e o complemento ou complemento inverso de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência codificadora nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO: 7-10.
  47. 47. Método de acordo com a reivindicação 45,
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    14/17 caracterizado pelo fato de que a molécula de RNA é uma molécula de
    RNA de duplo filamento.
  48. 48. Método para a produção de plantas transgênicas protegidas contra uma praga de coleópteros, o método caracterizado pelo fato de que compreende:
    proporcionar a célula vegetal transgênica produzida pelo método de acordo com a reivindicação 46; e regenerar uma planta transgênica a partir da célula vegetal transgênica, em que a expressão da molécula de ácido ribonucleico codificada pelo pelo menos um polinucleotídeo é suficiente para modular a expressão de um gene-alvo em uma praga de coleóptero que contata a planta transformada.
  49. 49. Método para a produção de uma célula vegetal transgênica, o método caracterizado pelo fato de que compreende:
    transformar uma célula vegetal com um vetor que compreende um meio rpb7 para proporcionar proteção contra uma praga de coleópteros a uma planta;
    cultivar a célula vegetal transformada em condições suficientes para permitir o desenvolvimento de uma cultura de células vegetais compreendendo uma pluralidade de células vegetais transformadas;
    selecionar para células de plantas transformadas que integraram os meios de rpb7 para proporcionar a proteção de pragas de coleópteros a uma planta em seus genomas;
    triar as células vegetais transformadas para a expressão de um meio rpb7 para inibição da expressão de um gene essencial em uma praga de coleópteros; e selecionar uma célula vegetal que expressa os meios rpb7 para inibição da expressão de um gene essencial em uma praga coleópteros.
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    15/17
  50. 50. Método para a produção de uma planta transgênica protegida contra uma praga de coleópteros, o método caracterizado pelo fato de que compreende:
    proporcionar a célula vegetal transgênica produzida pelo método de acordo com a reivindicação 49; e regenerar uma planta transgênica a partir da célula de planta transgênica, em que a expressão dos meios de rpb7 para inibição da expressão de um gene essencial em uma praga de coleópteroos é suficiente para modular a expressão de um gene-alvo em uma praga de coleóptero que contata a planta transformada.
  51. 51. Método para produzir uma célula vegetal transgênica, o método caracterizado pelo fato de que compreende:
    transformar uma célula vegetal com um vetor que compreende um meio rpb7 para proporcionar proteção contra pragas hemípteras a uma planta;
    cultivar a célula vegetal transformada em condições suficientes para permitir o desenvolvimento de uma cultura de células vegetais compreendendo uma pluralidade de células vegetais transformadas;
    selecionar para células de plantas transformadas que integraram os meios de rpb7 para proporcionar proteção de pragas de hemípteros a uma planta em seus genomas;
    triar as células vegetais transformadas para expressão de um meio rpb7 para inibição da expressão de um gene essencial em uma praga hemíptera; e selecionar uma célula vegetal que expresse os meios rpb7 para inibição da expressão de um gene essencial em uma praga hemíptera.
  52. 52. Método para produzir uma planta transgênica protegida contra uma praga de hemíptero, o método caracterizado pelo fato de
    Petição 870170007315, de 02/02/2017, pág. 333/385
    16/17 que compreende:
    proporcionar a célula de planta transgênica produzida pelo método de acordo com a reivindicação 51; e regenerar uma planta transgênica a partir da célula vegetal transgênica, em que a expressão dos meios rpb7 para inibição da expressão de um gene essencial em uma praga hemíptera é suficiente para modular a expressão de um gene-alvo em uma praga hemíptera que contata a planta transformada.
  53. 53. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de Bacillus thuringiensis, um polipeptídeo PIP-1 ou um polipeptídeo AflP-1A.
  54. 54. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de B. thuringiensis que é selecionado a partir de um grupo compreendendo Cry1B, cry1I, cry2A, cry3, cry7A, cry8, cry9D, cry14, cry18, cry22, cry23, cry34, cry35, cry36, cry37, cry43, cry55, cyt1A e Cyt2C.
  55. 55. Célula de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a célula compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de Bacillus thuringiensis, um polipeptídeo PIP-1 ou um polipeptídeo AflP-1A.
  56. 56. Célula de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de B. thuringiensis que é selecionado a partir de um grupo que compreende Cry1B, cry1I, cry2A, cry3, cry7A, cry8, cry9D, cry14, cry18, cry22, cry23, cry34, cry35, cry36, cry37, cry43, cry55, cyt1A e Cyt2C.
  57. 57. Planta de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a planta compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de Bacillus thuringiensis, um polipeptídeo PIP-1 ou
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    17/17 um polipeptídeo AflP-1A.
  58. 58. Planta de acordo com a reivindicação 57, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de B. thuringiensis que é selecionado a partir de um grupo que compreende Cry1B, cry1I, cry2A, cry3, cry7A, cry8, cry9D, cry14, cry18, cry22, cry23, cry34, cry35, cry36, cry37, cry43, cry55, cyt1A e Cyt2C.
  59. 59. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a célula vegetal transformada compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de Bacillus thuringiensis, um polipeptídeo PIP-1 ou um polipeptídeo AflP1A.
  60. 60. Método de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de B. thuringiensis que é selecionado a partir de um grupo que compreende Cry1B, cry1I, cry2A, cry3, cry7A, cry8, cry9D, cry14, cry18, cry22, cry23, cry34, cry35, cry36, cry37, cry43, cry55, cyt1A e Cyt2C.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7612194B2 (en) * 2001-07-24 2009-11-03 Monsanto Technology Llc Nucleic acid sequences from Diabrotica virgifera virgifera LeConte and uses thereof
US8088976B2 (en) * 2005-02-24 2012-01-03 Monsanto Technology Llc Methods for genetic control of plant pest infestation and compositions thereof
PL2431473T3 (pl) * 2005-09-16 2017-05-31 Monsanto Technology Llc Sposoby genetycznej kontroli inwazji owadów u roślin i kompozycje do tego przeznaczone
JP5474356B2 (ja) * 2006-01-12 2014-04-16 デブジェン エヌブイ ＲＮＡｉを使用する害虫を制御する方法
BR122018067925B8 (pt) * 2009-08-28 2022-12-06 Du Pont Polinucleotídeo isolado, cassete de expressão, método para controlar uma praga de plantas do tipo coleoptera e método para obtenção de uma planta
CA2890235A1 (en) * 2012-06-22 2013-12-27 Syngenta Participations Ag Biological control of coleopteran pests
US20160230186A1 (en) * 2013-03-14 2016-08-11 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling diabrotica
BR102014031844A2 (pt) * 2013-12-20 2015-10-06 Dow Agrosciences Llc ras oposto (rop) e moléculas de ácido nucleico relacionadas que conferem resistência a pragas de coleópteros e hemípteros
KR20170013885A (ko) * 2014-05-06 2017-02-07 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 딱정벌레류 및 노린재류 해충에 대한 저항성을 부여하는 sec23 핵산 분자

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