JP3234598B2 - 単子葉植物の形質転換方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、単子葉植物全般、特にイネ科植物、特定的
にはトウモロコシ及び他の主要穀類の迅速且つ効率的な
形質転換方法に係る。本発明は特に、トランスジェニッ
ク単子葉植物を得るための、緻密な胚形成カルスを形成
することが可能な無傷組織又はこのような組織から得ら
れる緻密な胚形成カルスの使用に係る。

本発明は更に、本発明の形質転換方法により得られる
新規トランスジェニックイネ科植物、特に穀類に係る。

発明の背景 近年、植物の遺伝子操作の可能性はめざましく拡大し
ている。多数のトランスジェニック双子葉植物種が得ら
れた。しかしながら、多くの植物種、特に単子葉類、特
定的にはトウモロコシ、コムギ及びイネのような経済的
に重要な種を含むイネ科に属する植物は、安定的な遺伝
子形質転換が非常に困難であるとされている。

問題は、ａ）単子葉植物細胞をDNAで組込み的に形質
転換（即ち単子葉植物細胞の核ゲノムにDNAを安定的に
挿入）する点、及びｂ）正常表現型稔性成体単子葉植物
のような正常表現型単子葉植物を形質転換細胞からの再
生する点の両方にある。このような問題は主に１）DNA
取り込み、２）取り込まれたDNAによる組込み的形質転
換及び３）形質転換細胞から正常表現型単子葉植物を再
生するという点に関してコンピテントな単子葉細胞が得
られないことに起因すると示されている（Potrykus（19
90）Bio/Technology 9:535）。一般に、（ポリエチレ
ングリコール処理及び／又はエレクトロポレーションを
使用して）プロトプラストに遺伝子を直接移入すると、
成功の可能性が最も高いと考えられている。このような
直接遺伝子移入方法で使用されるプロトプラストは、ほ
とんどの場合は胚形成細胞懸濁液培養物から得られる
（Lazzeri及びＬrz（1988）Advances in Cell Cul
ture,Vol.6,Academic press,p.291;Ozias−Akins及び
Ｌrz（1984）Trends in Biotechnology 2:119）。
しかしながら、ほとんどの遺伝子型ではプロトプラスト
から正常表現型植物を再生し難いという事実により、こ
のような方法の成功は制限されている。

最近になって特定の系統のイネ（Shimomotoら（198
9）Nature 338:274;Dattaら（1990）Bio/Technology
8:736;及びHayashimotoら（1990）Plant Physiol.93:8
57）及びトウモロコシ（Gordon−Kammら（1990）Bio/Te
chnology 2:603;Frommら（1990）Bio/Technology 8;8
33;Gouldら（1991）Plant Physiology 95:426;並びに
PCT公開明細書WO91/02071及びWO89/12102）を形質転換
し、これらの系統から正常表現型植物を再生するのに成
功したことが報告された。しかしながら、これらの形質
転換及び再生方法を単子葉類全般、特にイネ科植物、よ
り特定的には穀類に適用できるかどうかはこのような報
告からは明らかでない。

発明の要約 本発明は単子葉植物、特に主要穀類（例えばトウモロ
コシ、コムギ、イネ、ライムギ等）のようなイネ科植物
のゲノムを効率的且つ再現可能に形質転換するための新
規方法を提供する。この方法は、ａ）緻密な胚形成カル
スを形成することが可能な単子葉植物の無傷組織又は
ｂ）このような無傷組織から得られる緻密な胚形成カル
ス、特にその胚形成セクターのいずれか一方の細胞をDN
Aで形質転換することからなり、このような細胞は１）D
NAの取り込み、２）DNAによる植物ゲノム、好ましくは
その核ゲノムの組込み的形質転換及び３）これらのゲノ
ムの形質転換後に細胞から正常表現型植物（例えば正常
表現型稔性成体植物）を再生する点に関してコンピテン
トである。このようなコンピテント細胞は好ましくは植
物の無傷組織又は緻密な胚形成カルスを損傷及び／又は
分解することにより得られ、例えばａ）無傷組織及びそ
の細胞又はこのような無傷組織から得られる緻密な胚形
成カルス及びその細胞を切断し、及び／又はｂ）無傷組
織又は緻密な胚形成カルスの性質に依存して、無傷組織
又は緻密な胚形成カルスを酵素で処理し、無傷組織又は
緻密な胚形成カルスの細胞壁を分解することにより得ら
れる。

こうして損傷及び／又は分解され、本発明のコンピテ
ント細胞を含む無傷組織又は緻密な胚形成カルスは、好
ましくはエレクトロポレーションのような直接遺伝子移
入により１個以上のDNAフラグメント（例えば外来DNAフ
ラグメント）、好ましくは線状DNAフラグメントで形質
転換することができる。好ましくは、DMAフラグメント
の少なくとも１個は、形質転換植物細胞の選択可能又は
スクリーン可能なマーカー、好ましくは選択可能なマー
カーとして機能し得る遺伝子を含む。このようなマーカ
ーDNAフラグメントは別の着目遺伝子と同一のDNAフラグ
メント又は別のDNAフラグメント上に配置され得る。

形質転換細胞は、従来通りに選択的培地で好ましくは
長時間培養することにより非形質転換細胞から分離する
ことができ、こうして選択された形質転換細胞は、その
ゲノム、特に核ゲノムに安定的に組み込まれた着目遺伝
子を有する正常表現型植物（例えば成熟植物）に従来通
りに再生され得る。

本発明は更に、１個以上のDNAフラグメントで安定的
に形質転換されたゲノムを有する単子葉植物、特にイネ
科植物、特に穀類植物の新規コンピテント細胞；このよ
うな形質転換細胞から構成される細胞培養物；このよう
な形質転換細胞から再生された正常表現型植物（例えば
正常表現型稔性植物）；及びこのような形質転換植物の
種子を提供する。このような形質転換細胞、細胞培養
物、植物及び種子としては、タンパク質が発現される植
物細胞を死滅又は不能にすることが可能なタンパク質を
コードし且つタペート特異的PTA29プロモーターの制御
下にあり、従って植物を雄性不稔性にする遺伝子を含む
DNAフラグメントで形質転換されたこのような形質転換
細胞、細胞培養物、植物及び種子を挙げることができ
る。本発明の形質転換イネ科植物、特に形質転換トウモ
ロコシ及びイネは、特にこのような植物系統の未形質転
換プロトプラスト10000あたり、約500以下、特に約100
以下、特定的には約10以下、より特定的には約１以下し
か正常表現型植物を再生することができない場合、正常
表現型植物のような形質転換植物を再生させることが従
来技術では事実上不可能であるような植物系統、形質転
換胚形成懸濁液培養物又は形質転換プロトプラストに由
来することを特徴とする。

図面の簡単な説明 図1:未成熟接合体胚のエレクトロポレーションにより得
られる５個のトウモロコシ形質転換株の実施例２のNpt
IIゲルアッセイ。

図2:配列番号２に示す配列をプローブとして使用した実
施例１のトウモロコシ形質転換株（H99−M148−１）の
１種のゲノムDNAの実施例２のサザンブロット。標準フ
ラグメントの長さを表示する。起点は０により表示す
る。

レーン 1:λファージのPst I消化DNA＋Hind III消化pT
TM1（陽性対照−プローブは2824bp pTTM1フラグメント
にハイブリダイズする） 2:Bgl II消化ゲノムDNA 3:EcoR I消化ゲノムDNA 4:EcoR V消化ゲノムDNA 5:Hind III消化ゲノムDNA 6:BamH I消化ゲノムDNA 7:Pvu I消化ゲノムDNA 8:Pvu II消化ゲノムDNA 9:Pst I消化ゲノムDNA 10:未形質転換H99植物のEcoR I消化植物ゲノム
DNA（陰性対照） 図3:未成熟接合体胚に由来する緻密な胚形成カルスフラ
グメントのエレクトロポレーションにより得られた７個
の形質転換株の実施例４のNpt IIゲルアッセイ。

図4:配列番号２に示す配列をプローブとして使用した実
施例３のトウモロコシ形質転換株（Pa91−M146−２）の
１個のゲノムDNAの実施例４のサザンブロット。標準フ
ラグメントの長さを表示する。起点は０により表示す
る。

レーン 1:λファージのPst I消化DNA＋Hind III消化pT
TM1（陽性対照−プローブは2824bp pTTM1フラグメント
にハイブリダイズする） 2:Bgl II消化ゲノムDNA 3:EcoR I消化ゲノムDNA 4:EcoR V消化ゲノムDNA 5:Hind III消化ゲノムDNA 6:BamH I消化ゲノムDNA 7:Pvu I消化ゲノムDNA 8:Pvu II消化ゲノムDNA 9:Pst I消化ゲノムDNA 10:EcoR I消化植物ゲノムDNA（陰性対照） 配列表 配列番号1:pDE108の配列。

配列番号2:サザンハイブリダイゼーションでキメラneo
遺伝子を検出するために使用されるプローブの配列。

配列番号3:プラスミドpVE107及びpVE108の構築に使用さ
れ且つタバコのTA29遺伝子からのプロモーター及びバル
ナーゼ（barnase）遺伝子を含むプラスミドpTTM8のDNA
フラグメントの配列。

配列番号4:pDE110の配列。

発明の詳細な説明 単子葉類において、胚形成カルスは２種の異なる周知
の型をとり得る（Vasil（1988）Bio/Technology 6:39
7;Armstrong及びGreen（1988）Crop Sci.28:363）。胚
形成カルスの一方の型は、緻密及び／又は結節状と説明
すると最適であり、しばしば有機化しているとみなされ
得る。本明細書中で「緻密な胚形成カルス」と呼称する
このようなカルスは本発明に従って使用される。他方の
一般により発生頻度の低い胚形成カルスの型は、軟弱で
砕けやすく、胚形成能が高いと説明すると最適であり、
本明細書中で「砕けやすい胚形成カルス」と呼称するこ
のようなカルスは、一般に緻密な胚形成カルスよりも迅
速に増殖する。どちらの型のカルスからも正常表現型植
物を再生することができ、どちらの型のカルスでも種々
の発生段階に本細胞胚が存在する。２種のカルスの外観
及び最終形態は種々の単子葉種、特に種々の穀類種で異
なり得る。しかしながら、２種のカルスは種々の単子葉
種の組織培養物を形成及び操作する当業者により容易に
区別することができる。

トウモロコシにおいて、緻密な胚形成カルス及び砕け
やすい胚形成カルスは夫々タイプＩカルス及びタイプII
カルスとしてのほうがよく知られている。タイプＩ及び
タイプIIトウモロコシカルスの構造及び特性の種々の顕
著な特徴は、Armstrong及びPhillips（1988）Crop Sc
i.28:363;Springerら（1979）Protoplasma 101:269;Fr
ansz（1988）“Cytodifferentiation during callus
initiation and somatic embryogenesis in Zea
mays L.",Ph.D.Thesis,University of Wageninge
n,The Netherlands;Ozias−Akinsら（1982）Protoplas
ma 110:95;Novakら（1983）Maydica 28:381;Hoら（19
83）Protoplasma 118:169;Greenら（1975）Crop Sci.
15:417;Freelingら（1976）Maydica 21:97;Luら（198
2）Theor.Appl.Genet.62:109;Vasilら（1985）Protopla
sma 127:1;Dunstanら（1978）Protoplasma 97:251;Va
silら（1982）Bot.Gaz.143:454;Green（1983）In:Basic
biology of new developments in biotechnolog
y,Hollaenderら編,Plenum Pless,New York,pp.195−2
09;Vasilら（1984）Am.J.Bot.71:158;及びKamoら（198
5）Bot.Gaz.146:327のような文献に記載されている。

タイプＩトウモロコシカルスはほぼ白色、青みがかっ
た白色又は黄色がかった緻密な外観を呈しており、多く
の場合は結節状表面を有しており、その結節状外観に示
されるように組織の有機化集合体として発生及び増殖す
る。該カルスは細胞会合及び分化の程度が高いことと、
根、葉構造及び維管束要素のような種々の構造とにより
特徴付けられる。体細胞胚が一般に認識され得る。再生
された苗条の起源は必ずしも明白ではなく、外見からは
体細胞胚形成及び器官形成の両方により形成されるよう
に見える。体細胞胚発生中に胚様体は融合して堅く白色
のカルスを生じるか、又は二次体細胞胚に生長し得る。

タイプIIトウモロコシカルスは主に軟弱で砕けやす
く、白色又は青みががった黄色の多少透明な外観を有し
ており、胚形成能が高い。該カルスは迅速に増殖し、維
管束要素を含まない。タイプIIカルスは、胚様体をカル
スに付着させる胚柄様構造を有し得る多数の平滑で球状
の胚様体を含むという点が砕けやすい非胚形成カルスと
異なる。胚様体は十分に有機化された体細胞胚にも生長
し得る。

２種のトウモロコシカルスタイプに見いだされるほぼ
同一の顕著な特徴を使用して、他の単子葉種、特にイネ
（Kyozukaら（1988）Theor.Appl.Genet.76:887）、コム
ギ（Redwayら（1990）Theor.Appl.Genet.76:609;Redway
ら（1990）Plant Cell Reports 8:714）及びオオム
ギのような穀類種の緻密な胚形成カルスと砕けやすい胚
形成カルスとを区別することができる。

単子葉植物全般からでは、本発明の緻密な胚形成カル
スは未成熟接合体胚、成熟種子、葉基部、葯、小胞子、
幼花序等のような外植片のin vitro培養により得られ
る。トウモロコシにおいてタイプＩカルスは未成熟接合
体胚から最も効率的に発生する。緻密な胚形成カルスは
適切な外植片から誘導され得、十分に確立された方法に
従って培地に維持される（Hodgesら（1986）Bio/Techno
logy 4:219）。カルス培養物の保存中には胚形成細胞
を含むカルスの胚形成セクターのみを選択及びサブ培養
するように注意すべきである。このような細胞は一般に
小型で緊密に充填され、壁が薄く、細胞質が豊富であ
り、多数の小さい気孔、脂質液滴及び澱粉粒子を含む高
好塩基性細胞として特徴付けることができる（Vasil（1
988）前出）。緻密な胚形成カルスを形成することが可
能であるとして知られている組織を植物から取り出す最
も簡便な方法は切解である。

本発明のコンピテント細胞は、注意な胚形成カルスを
形成することが可能な無傷組織を植物から従来方法で切
断することにより単子葉植物から直接得られる。このよ
うに損傷させた無傷組織の細胞はその後、安定的に形質
転換することができる。しかしながら、このような損傷
完全細胞をより小さいフラグメントに細分し、このよう
な組織を更に損傷させ、形質転換のためのよりコンピテ
ントな細胞を提供すると好適である。組織フラグメント
の平均寸法は好ましくは長さ0.1〜5mm、特に長さ１〜2.
5mm、より好ましくは長さ1.25〜1.75mmである。この点
で本発明の損傷無傷組織は、植物から切断された任意の
組織片又は任意のそのフラグメント（例えば切断片）で
あり得る。即ち、「無傷組織」なる用語は組織培養段階
を挟まずに天然に存在する植物部分から得られる単子葉
植物細胞の集合体を意味するものと理解すべきである。

本発明のコンピテント細胞を生成するためには、植物
から無傷組織を切断し、場合により更に破壊又は損傷さ
せるように切断することにより無傷組織及びその個体細
胞を機械的に破壊又は損傷させれば一般に十分である。
この点で「機械的破壊」及び「損傷」なる用語は、細胞
を暴露し、本発明に従ってDNAフラグメントを挿入する
ために、無傷組織の１個以上の細胞の細胞壁を著しく損
傷させることを意味する。従って、本発明による「機械
的破壊」又は「損傷」は細胞壁の切断に制限されず、細
胞壁をこすったり、押し潰したり、又はたたくなどの方
法で細胞壁の１部分以上を物理的に除去するか又は細胞
壁を１カ所以上不連続にする他の方法も包含する。

しかしながら、本発明に従って無傷組織を機械的に破
壊又は損傷する操作に加えて又はこの操作の代わりに、
特に無傷組織が比較的大きい場合には無傷組織を酵素又
は酵素混合物で処理して植物細胞壁を分解してもよい。
酵素処理は従来通りに実施することができる。好ましく
は、酵素を無傷組織に加えてまず最初に細胞壁に穴をあ
ける。従って、酵素処理は組織を完全に破壊しないよう
に比較的短時間（例えば無傷組織の性質及びコンシステ
ンシーに依存して１〜10分間）行うと好適である。植物
の種類に応じてPowell及びChapman（1985）“Plant Ce
ll Culture,A Practical Approach",R.A.Dixon編，
第３章に記載されているような種々の酵素又は酵素溶液
を使用することができる。

植物から得られる無傷組織が小さすぎて損傷（例えば
切断）できない場合又は損傷させた無傷組織が小さすぎ
てそれ以上損傷（例えばより小片に細分）できない場合
には、酵素処理を使用して付加的なコンピテント細胞を
生成することができる。このような酵素処理は特に胚、
特に生長中の種子から単離された未成熟接合体胚及び例
えばトウモロコシの成熟（例えば乾燥）種子から単離さ
れた成熟接合体胚で本発明のコンピテント細胞を形成す
るために特に有用であり得る。胚は一般に種子から取り
出すために切断されず、一般に緻密な胚形成カルスを生
成する能力を損なわずに著しく小さいフラグメントに細
分することはできない。未成熟胚は緻密な胚形成カルス
の唯一の適切且つ信頼できるソースであるので、トウモ
ロコシでは特に重要である。イネ及び他の単子葉類では
成熟胚を使用することもできる。これに関連して、トウ
モロコシのような植物の場合、無傷組織（例えば未成熟
トウモロコシ胚）は約0.5〜2mm、好ましくは0.5〜1.5mm
の最大長を有することが好ましいが、もっと短い0.5〜1
mmの長さも使用できる。

本発明によると、無傷組織を好ましくは例えば約15分
間以上、好ましくは約30分間〜約５時間、特に２〜３時
間予備原形質分離にかけ、後述するエレクトロポレーシ
ョン用緩衝液のような従来の高張液中に組織を置く。こ
の予備原形質分離処理の目的は、無傷組織の細胞中でそ
のプロトプラスト、好ましくはその細胞膜の全部又は少
なくとも一部をその細胞壁から分離することである。こ
のような予備原形質分離は好ましくは無傷組織の損傷後
で無傷組織の酵素処理前に実施される。無傷組織が既に
酵素処理により分解されている場合には、その後の予備
原形質分離を短時間だけ行い、上述のようにトウモロコ
シの未成熟胚の酵素処理後、このような原形質分離を全
く行わないことが好適である。

本発明のコンピテント細胞は、本発明の無傷組織をin
vitro培養して、緻密な胚形成カルスを生成し、次に
カルスをより小さいフラグメントに細分することによっ
ても得られる。得られるカルスフラグメントは、カルス
の胚形成セクター又は部分を完全又は少なくとも部分的
に含むべきである。カルスフラグメントは更に好ましく
は、0.5〜2.5mm、特に１〜2mm、より特定的には1.25〜
1.75mmの平均最大長を有しており、好ましくは約0.1mm
の最小長を有する。十分な量の緻密な胚形成カルスを得
るためには、組織外植片から得られるような一次カルス
を少なくとも１カ月間増殖させ、このような一次カルス
の胚形成セクターをこの期間に少なくとも１回サブ培養
すると好適である。本発明のコンピテント細胞を生成す
るためには、緻密な胚形成カルスの胚形成セクター及び
その細胞を例えば切断により機械的に破壊又は損傷させ
れば十分であると考えられる。しかしながら、カルスを
機械的に破壊する操作に加えて又はこの操作の代わり
に、特に緻密な胚形成カルスフラグメントがまだ比較的
大きい場合にはカルス細胞壁を酵素処理してカルス細胞
壁を分解してもよい。この酵素処理は従来通りに実施す
ることができる。酵素処理は好ましくはまず最初にカル
スフラグメントの細胞の細胞壁に穴をあけるように実施
され、従って、酵素処理は組織を完全に破壊しないよう
に比較的短時間（例えばカルスフラグメントの性質及び
コンシステンシーに依存して１〜10分間）行うと好適で
ある。単子葉植物に依存してPowell及びChapman（198
5）前出に記載されているような種々の酵素又は酵素溶
液を使用することができる。好ましくは、緻密な胚形成
カルスフラグメントを同様に上述のように一定時間（例
えば２〜３時間）原形質分離する。

次に本発明のコンピテント単子葉植物細胞を形質転換
させるために、上述のように得られた損傷及び／又は分
解した無傷組織又は緻密な胚形成カルスフラグメント、
特にその胚形成セクターを、着目遺伝子を含む１個以上
のDNAフラグメントと接触させる。着目遺伝子の少なく
とも１個が形質転換単子葉植物細胞中で選択可能なマー
カーとして機能するように構成すると好適である。直接
遺伝子移入、特にエレクトロポレーションは最適な形質
転換効率を提供すると考えられる。しかしながら、ポリ
エチレングリコール、DNAで被覆した微小発射体の撃ち
込み（即ち例えば粒子銃を使用するバイオリスティック
（biolistic）な形質転換）及びAgrobacteriumで媒介さ
れる形質転換を使用する直接遺伝子移入のような他の既
知のDNA移入技術を使用してもよい。

本発明の植物形質転換方法を実施する際に使用される
緻密な胚形成カルスは、砕けやすい胚形成カルスのいく
つかの特徴を有する。この点で緻密な胚形成カルス又は
砕けやすい胚形成カルスは緻密な胚形成カルスのいくつ
かの特徴と砕けやすい胚形成カルスのいくつかの特徴と
を有する型のカルスに変異すること又は変異させること
ができる。その結果、このような中間型のカルス及びそ
の胚形成部分は本発明に従って形質転換され得る。実際
に中間型のカルス及び砕けやすい胚形成カルスで発生す
る体細胞胚は上述のように単離し、損傷及び／又は分解
した後、形質転換することができる。即ち、本発明の方
法を実施するにあたり、中間型カルス又は砕けやすい胚
形成カルスから得られるこのような体細胞胚は、特に体
細胞胚の細胞を形質転換するための手段としてエレクト
ロポレーションを使用する場合、生長中又は成熟した種
子から得られる未成熟又は成熟接合体胚と等価であると
みなすことができる。

本発明によると、エレクトロポレーションは従来通り
に実施され得る。この点で損傷及び／又は分解した無傷
組織又はカルスフラグメント、特にその分裂又は胚形成
セクション、より特定的にはその胚形成セクションを
（例えばDekeyserら（1990）The Plant Cell 2:591
に記載されているように）エレクトロポレーション装置
で使用するのに適したキャベットに移すことができる。
好ましくは、エレクトロポレーション緩衝液200μｌ当
たり約10〜500mg、特に約50〜200mg、最適には約100〜1
50mgの無傷組織又はカルスフラグメントをキュベットに
移す。トウモロコシのような穀類の場合（特に酵素処理
した未成熟無傷胚を使用するのが好適な場合）には、エ
レクトロポレーション緩衝液200μｌ中に約10〜500個、
特に約50〜150個、より特定的には約75〜125個の胚をキ
ュベットに移すことが好ましい。次にDNAをキュベット
に加え、エレクトロポレーションを行う。好ましくは、
エレクトロポレーションの前にDNAを無傷組織又はカル
スフラグメントと共に（例えば約１時間）コインキュベ
ートすると好適である。円形よりもむしろ線状で比較的
小寸法、好ましくは約20kb未満、特に15kb未満、特定的
には10kb未満、より特定的には6kb未満（例えば約２〜3
kbまで）のDNAで最良の結果が得られると考えられる。
この点で、本発明のコンピテント細胞を複数の着目遺伝
子で形質転換するために異なる組成の複数の線状DNAフ
ラグメントを使用することができる。好ましくは、無傷
組織又はカルスフラグメントを含むキュベットに約５〜
30μｇ、特に約10〜25μｇ、より特定的には約20μｇの
DNAを加える。特定のエレクトロポレーション条件に限
定する必要はなく、例えば150mM NaCl又は80mM KClを
含有するエレクトロポレーション緩衝液を使用して900
μＦキャパシタから375V/cmの電界強度でパルス放電す
ることにより良好な結果が得られる（Dekeyserら（199
0）前出）。

（例えばエレクトロポレーションにより）形質転換が
完了したら、形質転換した単子葉細胞を含む無傷組織又
はカルスフラグメントを適切な培養培地、好ましくは選
択培地（形質転換細胞が選択可能なマーカーを含む場
合）に移す。この転移は形質転換後できるだけ早く、好
ましくは形質転換直後、特に形質転換後１〜３日間以内
に実施すべきである。好ましくは、選択可能なマーカー
で形質転換された無傷組織又はカルスフラグメントを、
従来の培養条件及び選択剤を補充した培養培地（例えば
Vasil（1988）前出の引用文献参照）を使用して培養す
る。選択剤の選択は、以下に記載するように無傷組織の
細胞又はカルスフラグメントを形質転換するためにDNA
フラグメント中で使用される選択可能なマーカーに依存
する。選択剤の濃度は、選択可能なマーカーを含有する
DNAフラグメントを細胞のゲノムに好ましくは完全に組
み込んだ安定的形質転換株のみが生存し、単離できるよ
うに、形質転換細胞に非常に高い選択的圧力を提供する
ように設定すべきである。このような形質転換無傷組織
又はカルスフラグメントを非選択培地上で数日間培養す
ることもできるが、選択培地にできるだけ早く移し、正
常表現型植物を再生するために使用可能な形質転換した
緻密な胚形成カルスのような形質転換形態形成カルスを
十分量生成するように長期間（例えば６カ月間）、好ま
しくは少なくとも１カ月、特に２〜３カ月間維持するこ
とが好ましい。更に、培地の高張性は例えば培地にマン
ニトールを補充することにより短期間（例えば２〜３週
間まで）維持すると好適である。

本発明によると、単子葉植物のゲノム、特に核ゲノム
に任意のDNAフラグメントを組み込むことができる。一
般に、DNAフラグメントは形質転換植物細胞において機
能的であり且つこのような細胞及び細胞から再生される
植物に付加的な特性を与える外来もしくは内在遺伝子又
は他のDNA配列を含む。このために、DNAフラグメントは
好ましくは次の作動的に連係するDNA配列:1）植物細胞
中でコーディング配列を発現させることが可能なプロモ
ーター配列（「プロモーター」）、２）植物細胞内で特
異的活性を有するタンパク質（「着目タンパク質」）を
コードする配列（「コーティング配列」）、及び３）適
切な３′転写調節シグナルを含む１個以上のキメラ遺伝
子を含む。タンパク質の必要な機能を得るためには、シ
トソール、ミトコンドリア、クロロプラスト又は小胞体
のような植物細胞の１個以上の特定の区画にタンパク質
を標的することも必要であり得る。シトソールに標的す
るためには、上述のようなキメラ遺伝子をそのまま使用
することができる。一方、他の区画に標的するために
は、キメラ遺伝子のDNAフラグメント１）及び２）の間
に付加的な配列（「標的配列」）が存在することが必要
である。必要に応じてキメラ遺伝子は更に転写及び／又
は翻訳エンハンサーを含んでもよく、DNA配列のコドン
使用を植物細胞における発現のために最適化することが
できる。

本発明のキメラ遺伝子は十分に確立された原理及び方
法に従って構築することができる。この点では、種々の
DNA配列はタンパク質のコーディング配列（又は標的配
列が存在する場合には標的配列）の開始コドンで翻訳が
開始するように連係すべきである。

形質転換双子葉植物で遺伝子を発現させるために現在
使用されている器官及び組織特異的な種々の構成プロモ
ーターは本発明の形質転換単子葉類で使用するためにも
適切であると考えられる。この点では着目タンパク質を
コードするコーディング配列と、その上流（即ち５′）
でコーディング配列の発現に適切な外来又は内在プロモ
ーターとを含むキメラ遺伝子で特定の植物細胞を形質転
換させることができる。適切な外来構成プロモーター
は、異種遺伝子を構成的に発現させる（Odellら（198
3）Nature 313:810）カリフラワーモザイクウイルス
（CaMV）単離株CM1841（Gardnerら（1981）Nucl.Acids.
Res.9:2871）及びCabbB−Ｓ（Franckら（1980）Cell,2
1:285）（「35Sプロモーター」）;CaMV単離物CabbB−JI
（Hull及びHowell（1978）Virology 86:482）から単離
することができ且つその配列（35S3プロモーターの配列
はヨーロッパ特許公開明細書（EP）第359617号に開示さ
れている）及びトランスジェニック植物における高活性
（Harpsterら（1988）Mol.Gen.Genet.212:182）におい
て35S3プロモーターと異なる関連プロモーター（「35S3
プロモーター」）；並びにAgrobacterium（Veltenら（1
984）EMBO J.3:2723）のＴ−DNAの夫々１′及び２′遺
伝子を発現させ且つ損傷誘導プロモーターであるTR1′
及びTR2′プロモーターを含む。器官特異的、組織特異
的及び／又は誘導可能な適切な外来プロモーターも知ら
れており（例えばKuhlemeierら（1987）Ann.Rey.Plant
Physiol.38:221の引用文献参照）、例えば光合成組織
中のみで活性な光誘導プロモーター（Krebbersら（198
8）Plant Mol.Biol.11:745）であるArabiodopsis tha
lianaの1,5−リブロース二リン酸カルボキシラーゼの小
サブユニット遺伝子（例えば1A遺伝子）のプロモーター
（「ssu」プロモーター）； ヨーロッパ特許第344029号に開示されている葯特異的
プロモーター；並びに例えばArabiodopsis thalianaの
種子特異的プロモーター（Krebbersら（1988）Plant P
hysiol.87:859）を挙げることができる。ヨーロッパ特
許第344029号に記載されているように単子葉類を雄性不
稔性にするように形質転換するために特に有用なプロモ
ーターは、タペート特異的プロモーターPTA29,PTA26及
びPTA13、特にヨーロッパ特許第344029号のPTA29であ
る。

同様に、形質転換した双子葉植物で使用される既知の
３′転写調節配列及びポリアデニル化シグナルも本発明
の形質転換単子葉類で使用できると考えられる。このよ
うな３′転写調節シグナルはコーディング配列の下流
（即ち３′）に提供され得る。この点では、キメラ遺伝
子の発現を得るために適切な外来又は内在転写終結及び
ポリアデニル化シグナルのいずれかを含むキメラ遺伝子
で特定の植物細胞を形質転換することができる。例え
ば、遺伝子７（Velten及びSchell（1985）Nucl.Acids
Res.13:6998）、オクトピンシンターゼ遺伝子（Gielen
ら（1983）EMBO J.3:835）及びAgrobacterium tumefa
ciens TiプラスミドのＴ−DNA領域のノパリンシンター
ゼ遺伝子のような遺伝子の外来３′未翻訳末端を使用す
ることができる。

形質転換した植物細胞中、好ましくはその細胞質中で
発現可能なキメラ遺伝子を構築し、その後、その着目タ
ンパク質を細胞のミトコンドリア、クロロプラスト及び
／又は小胞体の内腔に転位させるために、適切な標的配
列が知られている。このような標的配列の選択は限定的
ではなく、遺伝子の発現産物を転位させる標的ペプチド
をコードする外来又は内在標的配列を含むキメラ遺伝子
で特定の植物細胞を形質転換することができる。「標的
ペプチド」なる用語は、一般に真核細胞内でクロロプラ
ストタンパク質、ミトコンドリアタンパク質、タンパク
質のサブユニット、又は小胞体に転位したタンパク質と
会合しており且つ細胞の核DNAによりコードされる前駆
物質タンパク質の一部として細胞中で産生されるポリペ
プチドフラグメントを意味する。標的ペプチドは核コー
ドされたクロロプラストタンパク質、ミトコンドリアタ
ンパク質又はサブユニットがクロロプラスト、ミトコン
ドリア又は小胞体の内腔に転位する過程に関与する。転
位過程中に標的ペプチドはタンパク質又はサブユニット
から分離又はタンパク分解により除去される。ヨーロッ
パ特許出願（EPA）第85402596.2号及び88402222.9号に
概説されているように発現された着目タンパク質を形質
転換植物細胞内で転位させ得る標的ペプチドを発現させ
るためには、キメラ遺伝子に標的配列を配置すればよ
い。クロロプラストに輸送するために適切な標的ペプチ
ドは、酵素1,5−リブロース二リン酸カルボキシラーゼ
の小サブユニットのトランジットペプチド（Krebbersら
（1988）Plant Mol.Biol.11:745;EPA 85402596.2）で
あるが、Watson（1984）Nucl.Acids Res.12:5145及びV
on Heijneら（1991）Plant Mol.Biol.Rep.9:104に記
載されているような他のクロロプラストトランジットペ
プチドも使用できる。適切なミトコンドリア標的ペプチ
ドはSchatz（1987）Eur.J.Biochem.165:1及びWatson（1
984）前出に記載されているようなミトコンドリアトラ
ンジットペプチドである。着目タンパク質を植物細胞の
小胞体の内腔に転位させ得る適切な標的ペプチドは、例
えばVon Heijne（1988）Biochem.Biophys.Acta 947:3
07及びWatson（1984）前出に記載されているようなシグ
ナルペプチドである。

トランスジェニック双子葉植物の作出に使用可能なコ
ーディング配列は周知であり（例えばWeisingら（198
8）Annual Rev.Genet.22:421に記載されているコーデ
ィング配列を参照のこと）、このようなコーディング配
列は本発明の形質転換単子葉植物で同様に良好に使用で
きると考えられる。この点ではコーディング配列は植物
に対して外来でも内在的でもよく、例えば昆虫種に対し
て毒性であり、従って植物を昆虫の攻撃から保護し（EP
193259,EP305275及びEP358556）；植物をストレス条件
から保護し（EP359617）；特定の除草剤に対する耐性を
植物に与え（EP242236）；コーディング配列が雄性又は
雌性器官特異的プロモーターの制御下にあるときに、タ
ンパク質が植物を夫々雄性稔性（EP344029）又は雌性稔
性（EP412006）にできるようにタンパク質が発現される
植物細胞を死滅又は不能にし；植物又は選択された植物
器官から抽出することができ、場合により経済的に重要
なペプチド又はタンパク質源として使用できるように更
に処理することができ（EP319353）；又はタンパク質が
発現される形質転換植物又はその器官を高栄養レベルの
食品として動物又はヒトに使用できるように栄養的に重
要なアミノ酸が豊富であるタンパク質を例えばコードす
ることができる。

単子葉類を昆虫耐性にするように形質転換するために
特に有用なコーディング配列は、殺虫性結晶タンパク質
及びその殺虫性ポリペプチド毒素をコードするBacillus
thuringiensis（Bt）株及びその截頭部分から単離し
た遺伝子である（参考のためにＨfte及びWhiteley（1
989）Microbiol.Rev.53:242を参照）。穀類（例えばト
ウモロコシ、イネ、コムギ及びオオムギ）における昆虫
駆除に特に重要であると考えられるBt遺伝子としては、
Helicoverpa種（例えばH.zea及びH.armigera）の駆除用
としてCryIAb遺伝子（EP193259）及びCryIAc遺伝子；ト
ウモロコシにおけるOstrinia種（例えばO.nubilalis）
の駆除用としてCryIAb遺伝子及びCryIb遺伝子（EP35855
7）；トウモロコシ及びコムギにおけるAgrotis種の駆除
用としてCryIAc遺伝子；及びトウモロコシにおけるSpod
optera種（例えばS.frugiperda）の駆除用としてCryID
及びCryIE遺伝子（EP358557）などの遺伝子が挙げられ
る。トランスジェニック植物の組織でこのような遺伝子
を十分に発現させるためには、PCT出願PCT/EP 91/0073
3（PCT公開WO91/16432）に記載されているように遺伝子
を修飾すると好適である。

本発明の選択可能なマーカーはキメラ遺伝子であり、
該遺伝子のコーディング配列は、該遺伝子が発現される
植物細胞に抗生物質及び／又は除草剤のような選択剤に
対する耐性を与えるタンパク質をコードする。本発明の
スクリーン可能なマーカーはキメラ遺伝子であり、該遺
伝子のコーディング配列は、該遺伝子が発現される植物
細胞に異なる色のような異なる外観を与えるタンパク質
をコードし、こうしてスクリーン可能なマーカーで形質
転換された植物を手動的に分離できるようにする。本発
明に従って単子葉植物を形質転換するための選択可能又
はスクリーン可能なマーカー、好ましくは選択可能なマ
ーカーの選択は非限定的であり、従来の選択可能なマー
カー及びスクリーン可能なマーカー（例えばWeisingら
（1988）前出に記載されているようなマーカー）を使用
することができる。選択可能なマーカーの適切なコーデ
ィング配列の例は、抗生物質カナマイシンに対する耐性
を与える酵素ネオマイシンホスホトランスフェラーゼを
コードするneo遺伝子（Beckら（1982）Gene 19:32
7）；抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を与える
酵素ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼをコー
ドするhyg遺伝子（Gritz及びDavies（1983）Gene 25:1
79）；及び除草剤ホスフィノトリシン（phosphinothric
in）に対する耐性を与えるホスフィノトリシンアセチル
トランスフェラーゼをコードするbar遺伝子（EP 24223
6）である。クロロプラスト代謝に作用する除草剤又は
他の選択剤に対する耐性を与えるタンパク質をコードす
る選択可能なマーカー遺伝子（例えばbar遺伝子）を使
用する場合には、マーカー遺伝子は上記のようなクロロ
プラスト標的配列を有するキメラ構造の一部であると好
適である。スクリーン可能なマーカーの適切なコーディ
ング配列の例は、β−グルクロニダーゼをコードするgu
s遺伝子（Jeffersonら（1986）Proc.Natl.Acad.Sci.USA
6:3901）及びルシフェラーゼ遺伝子（Owら（986）Sci
ence 234:856）である。

上述のように、選択剤の存在により提供される選択圧
力は、選択可能なマーカーを含む本発明の形質転換植物
細胞の培養中にかなり高いことが好ましい。例えば、ne
o遺伝子を選択可能マーカーとして使用する場合には、
カナマイシンを培地中に少なくとも約100〜200mg/l、好
ましくは少なくとも約200mg/lの濃度で使用すべきであ
る。このような高い選択圧力は更に長期間（例えば２〜
４カ月）維持すべきである。しかしながら、特定の選択
圧力及び期間に限定する必要はなく、選択圧力及びその
期間は従来通りに選択できると考えられる。一方、bar
遺伝子を選択可能マーカー遺伝子として使用する場合に
は、ホスフィノトリシン（PPT）を培地中に0.5〜50、特
に２〜20mg/lの濃度で使用すると好ましい。

本発明の緻密な胚形成カルスの損傷及び／又は分解し
た無傷組織又は損傷及び／又は分解した胚形成セクター
の形質転換細胞の培養で産生される形態形成カルス、好
ましくは胚形成カルスの形態形成セクター、好ましくは
胚形成セクターを次に従来方法（例えばVasil（1988）
前出及びLazzeri及びＬrz（1988）前出の引用文献参
照）で正常表現型（例えば成熟及び稔性）植物に再生す
ることができる。こうして得られた再生植物はトランス
ジェニックであり、核ゲノムに安定的に組み込まれた選
択可能又はスクリーン可能なマーカー、好ましくは選択
可能なマーカーを少なくとも有する。次に例えばサザン
ブロッティング及び／又はポリメラーゼ鎖反応（Sambro
okら（1990）Molecular Cloning:A Laboratory Manu
al,Cold Spring Harbor Laboratory）のような従来
方法で他の着目遺伝子の存在及び発現を調べることがで
きる。

本発明の目的では、本発明の形質転換及び再生手順に
より産生されるような正常表現型植物は、形質転換中に
植物のゲノムに導入されるDNAフラグメントの発現によ
り付加又は変化した特徴以外の如何なる表現型特徴にお
いても同一系統の未形質転換植物と実質的に相異しない
少なくとも１種の植物として理解されるべきである。当
然のことながら、植物を形質転換するためのどの手順を
使用した場合にも、種々の表現型を示す多数のトランス
ジェニック植物が通常生成され、そのうちで一部のみが
上記に定義したような正常表現型である。

本発明の方法は未成熟及び成熟接合体胚、葉基部、花
序等のような種々の外植片から誘導される外植片のin
vitro培養中に緻密な胚形成カルスのような緻密な形態
形成カルスが得られる全単子葉植物種に適用することが
できる。本発明の方法は経済的に重要なイネ科作物、特
にトウモロコシ、コムギ、イネ、エンバク、オオムギ、
モロコシ、ライムギ及びアワのような主要穀類の形質転
換に特に有用である。本発明のトランスジェニック植物
は、農学的価値の高い新規系統及び／又は栽培変種植物
を迅速且つ効率的に創製するために使用することができ
る。この点で、本発明によると、（参考資料として本明
細書の一部に加える）EP412006に開示されているような
ハイブリッド種子の作出用授粉植物、例えば雌性不稔性
授粉植物として使用可能なトランスジェニック植物を創
製することができる。

本発明は、形質転換した形態形成カルス、好ましくは
緻密な胚形成カルスの培養物を生成するために無傷組織
又は緻密な胚形成カルスを使用して単子葉植物を形質転
換するための迅速で効率的で且つ再現可能な方法を提供
する。無傷組織も緻密な胚形成カルスも一般には安定的
形質転換株を得るために適切な出発物質として認められ
ていない（Vasil（1990）Bio/Technology 8:797）の
で、これは驚くべき知見である。本発明に従って無傷組
織又は緻密な胚形成カルスを使用すると、１）DNA取り
込み、２）組込み的形質転換及び３）効率的で再現可能
な単子葉植物再生に関してコンピテントな砕けやすい胚
形成カルス、胚形成細胞懸濁液培養物及び／又はプロト
プラストを使用することが必要であった既存の単子葉形
質転換方法を著しく改善することができる。従来ではこ
のようなコンピテンスの必要により、単子葉類の安定的
形質転換は非常に特定の組織培養物特性を有する植物系
統に限られていた。例えばトウモロコシでは、コンピテ
ントな懸濁液培養物及び／又はプロトプラストを相当の
頻度で得られる十分なタイプIIカルスを形成する（即ち
10％以上、例えば80％以上までの頻度でタイプIIカルス
を形成する）能力を有するのは、近交系A188のような特
定の系統に限られていた。しかしながら、このようなト
ウモロコシ系統はいずれも農業的価値が低く、従って、
適当な組織培養特性を形質転換可能な低価値系統から有
用なトウモロコシ系統に移入するといった労力のかかる
育種プログラムを使用しなければ、経済的に価値のある
トウモロコシ系統を形質転換することはできなかった。

本発明の方法は比較的短時間のin vitro培養しか必
要としないので、従来方法よりも時間及び労力を著しく
節約できる。組織培養時間が短いため、ソマクローナル
変異の発生を少なくすることもできる。

本発明の方法は、核ゲノムに安定的に組み込まれた少
なくとも１個の（外来）着目遺伝子で形質転換された新
規な正常表現型（例えば稔性）トランスジェニック単子
葉植物、特にイネ科植物、より特定的には穀類、最も特
定的にはトウモロコシ及びイネを提供する。本発明の方
法は、形質転換される植物の遺伝子型から独立してお
り、緻密な胚形成カルスがその組織の少なくとも１個か
ら得られるような任意の植物の細胞を形質転換すること
が可能であると考えられる。従って、単子葉種の大部分
及び各種内の実質的数の系統を形質転換することが可能
になる。更に、緻密な胚形成組織を形成する能力を有す
るある系統から有さない別の系統に従来の育種プログラ
ムによりこのような能力を伝達することができる。

形質転換した形態形成カルス、特に形質転換した緻密
な胚形成カルスから再生される本発明の新規トランスジ
ェニック単子葉植物は、例えばDattaら（1990）前出、S
himamotoら（1989）前出、Hayashimotoら（1990）前
出、Gordon−Kammら（1990）前出、及びFrommら（199
0）前出に記載されているような従来の培養条件を使用
してこのような単子葉植物から胚形成懸濁液培養物及び
／又はプロトプラストを得ることが実際に不可能である
こと又は、安定的に形質転換された後に正常表現型（例
えば稔性）トランスジェニック植物として再生される十
分な能力を有する胚形成懸濁液培地及び／又はプロトプ
ラストを得ることが実際に不可能であることを特徴とす
る。この第２番目の特徴に関しては、１）正常表現型植
物に再生できる確率が高く、２）DNA取り込み及びこう
して取り込まれたDNAの組込み的形質転換に関してコン
ピテントである確率が高く、３）こうして形質転換され
た場合に正常表現型トランスジェニック植物に再生でき
る確率が高いこのような単子葉植物の胚形成懸濁液培養
物又はプロトプラストを得ることは実際的でないと考え
られる。

特に本発明は、例えばLiら（1990）Plant Mol.Biol.
Report.8:276,Dattaら（1990）Plant Sci.67:83及びDa
ttaら（1990）Plant Cell Rep.9:253に記載の手順に
従って（取得可能な場合に）胚形成懸濁液培養物を一般
に取得することができ、例えばLi及びMurai（1990）Pla
nt Cell Rep.9:216により記載されている手順に従っ
て胚形成懸濁液培養物から（取得可能な場合に）プロト
プラストを一般に取得できるようなイネ系統の新規トラ
ンスジェニックイネ植物を提供する。一方、例えばShim
amotoら（1989）前出、Dattaら（1990）前出及びHayash
imotoら（1990）前出に記載されているような従来の培
養条件下では、このようなイネ系統の胚形成懸濁液培養
物又はプロトプラストから正常表現型（例えば稔性）植
物を再生することはできない。

本発明は更に、例えばShillitoら（1989）Bio/Techno
logy 7:581,Prioli及びＳndahl（1989）Bio/Technol
ogy 7:589,Gordon−Kammら（1990）前出，並びにFromm
ら（1990）前出により記載されている手順に従って（取
得可能な場合に）胚形成懸濁液培養物を一般に取得する
ことができ、例えばShillitoら（1989）前出並びにPrio
li及びＳndahl（1989）前出により記載されている手
順に従ってこのような胚形成懸濁液培養物から（取得可
能な場合に）プロトプラストを一般に取得できるような
トウモロコシ系統の新規トランスジェニックトウモロコ
シ植物を提供する。一方、例えばShillitoら（1989）前
出、Prioli及びＳndahl（1989）前出、Gordon−Kamm
ら（1990）前出並びにFrommら（1990）前出により記載
されているような従来の培養条件下では、このようなト
ウモロコシ系統の胚形成懸濁液培養物又はプロトプラス
トから正常稔現型（例えば稔性）植物を再生することは
できない。更に、このようなトウモロコシ系統は高頻度
でタイプＩカルスを形成する能力を有するが、10％以上
の頻度、特に１％以上、より特定的には0.1％以上、更
に特定的には0.01％以上の頻度でのタイプIIカルスを形
成する能力をもたない。タイプIIトウモロコシカルス
は、安定的に形質転換できる胚形成懸濁液培養物及び再
生可能なプロトプラストが適切に得られるトウモロコシ
カルス組織の唯一の型であり、従って、特定のトウモロ
コシ系統でタイプIIカルスを得られないことは、このよ
うなトウモロコシ系統の形質転換カルスから正常表現型
（例えば成熟）トランスジェニックトウモロコシ植物を
従来再生できなかったことを意味する。特定のトウモロ
コシ系統からタイプIIカルスを実際に得られるか否か
は、Gordon−Kammら（1990）前出及びFrommら（1990）
前出とその引用文献により記載されている一般手順によ
り調べることができる。この検査によると、例えばトウ
モロコシ系の1000個の未成熟胚からカルス培養を開始す
ることができ、３週間おきにサブクローニングすること
により培養を維持することができ、典型的なタイプIIカ
ルスに最も近似する培養物のみを継代培養することがで
き、６カ月後にどの程度の頻度で均質なタイプIIカルス
が得られるかを決定することができる。

より一般的には、単子葉種の特定の系統から再生可能
なプロトプラストを実際に得られるか否かを決定するた
めには、以下に述べるような周知手順をとることができ
る。これについては、任意の特定の単子葉類で従来手段
により生成及び維持され得る胚形成懸濁液培養物から、
再生可能なプロトプラストが効率的且つ確実に生成され
ると考えられる。胚形成懸濁液培養の程度及び品質は一
般にその遺伝子型に依存し、一般に胚形成懸濁液培養物
が植物を再生可能である場合には形質転換のために植物
系統のプロトプラストを形成することしか価値がない。
胚形成懸濁液培養物は一般に、細胞質に富んだ胚形成細
胞の十分に分散した小群から構成され、カルス組織又は
有機化分裂組織を含まず、27〜32時間の細胞倍加時間を
有しており、体細胞胚及び植物を形成することが可能で
あるという特徴を有する（Vasil（1988）Bio/Technolog
y 6:397）。単子葉種の特定の系統の胚形成懸濁液培養
物が植物再生に適切であるか否かを決定するには、多数
（即ち少なくとも100個）の細胞集合体を適切な再生培
地におき、どの程度の割合の集合体が正常表現型稔性植
物をもたらすかを決定すればよい。正常粘性植物が細胞
集合体の50％以上から得られる場合には、一般にプロト
プラスト生成を続行すべきであると判断される。一方、
従来のプロトプラスト単離、培養及び植物再生技術を使
用してプロトプラスト10000個当たり約500以下、特に約
100以下、特定的には約10以下、より特定的には約１以
下の正常表現型（例えば稔性）植物しか再生できない場
合には、特定の単子葉系統は植物形質転換に適切な再生
可能なプロトプラストを提供するために適切でないと判
断することができる。

以下、実施例により本発明を説明する。特に指定しな
い限り組換DNAを操作するための全実験手順は、Sambroo
kら（1990）Molecular Cloning:A Laboratory Manua
l,Cold Spring Harbor Laboratoryに記載されている
標準化手順により実施した。オリゴヌクレオチドはKram
er及びFritz（1968）Methods in Enzymology 154:35
0に要約されている一般規則に従って設計し、Beaucage
及びCaruthers（1981）Tetrahedron Letters 22:1859
のホスホラミジト法によりApplied Biosystems 380A
DNA合成器（Applied Biosystems B.V.,Maarssen,Ne
therlands）で合成した。実施例で使用した以下の細菌
株及びプラスミドはDeutsche Sammlung ｆｒ Mikr
oorganismen und Zellkulturen（DSM）,Mascheroder
Weg 1B,Braunschweig,Germanyから入手可能である。

実施例1:DNAを接合体の未熟な胚にエレクトロポレーシ
ョンすることによる選択可能なマーカー遺伝子を持つト
ウモロコシの形質転換 約0.5〜1mmの接合体の未熟な胚を、２種類のトウモロ
コシの自家授粉系（Pa91及びH99）から生長させた種か
ら単離した。新しく単離した胚を、酵素溶液II［10％マ
ンニトール及び5mM 2−［Ｎ−モルフォリノ］エタンス
ルホン酸（MES）,pH5.6を含むCPW塩（Powell ＆ Chapma
n:1985“Plant Cell Culuture,A Practical Approach",
R.A.Dixon編.,第３章）中の0.3％macerozyme（Kinki Ya
kult,Nishinomiya,Japan）］で１〜２分酵素処理した。
この酵素溶液中で１〜２分インキュベーションした後、
胚を注意深く、N6aph溶液（6mMアスパラギン、12mMプロ
リン、1mg/チアミン−HCl、0.5mg/ニコチン酸、100
mg/カゼイン水解物、100mg/イノシトール、30g/
蔗糖及び54g/マンニトールを補ったN6培地［Chuら（1
975）Sci.Sin.Peking 18:659］のマクロ−及びミクロ−
エレメント）で洗浄した。洗浄後、胚をトウモロコシエ
レクトロポレーション緩衝液、EPM−NaCl［150mM NaCl,
5mM CaCl₂,10mM HEPES（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペ
ラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸）及び0.425Mマン
ニトール,pH7.2］中でインキュベートした。200μ EP
M−NaCl中の約100個の胚を、各キュベットに載置した。
Hind IIIで直線化したプラスミドDNA、pDE108約20μｇ
を各キュベットに添加した。pDE108は、5399bpプラスミ
ドであり、その全配列はSeq.Id.No.1に記載されてお
り、35S3プロモーター（EP359617）の制御下でカナマイ
シン耐性遺伝子（neo）からなるキメラ遺伝子を含む。

外植片で１時間DNAをインキュベーションした後、キ
ュベットを氷浴に移した。氷上で10分インキュベーショ
ン後、エレクトロポレーションを実施した:375V/cmの電
界強度のパルス１個を900μＦコンデンサーから抜き出
した。エレクトロポレーション装置は、Dekeyserら（19
90）の記載と同じものであった（The Plant Cell 2:59
1）。エレクトロポレーション直後、新しい液体N6aph基
質を、キュベット中の外植片に添加し、この後、外植片
をさらに氷上で10分間インキュベーションした。

その後、胚を0.2Mマンニトールを補った、Mahl VII基
質［100mg/カゼイン水解物,6mMプロリン,0.5g/ ME
S,1mg/ 2,4−ジクロロフェノキシ酢酸（2,4−Ｄ）並
びに0.75g/ MgCl₂及び1.6g/ Phytagel（Sigma Chem
ical Company,St Louis,Mo,U.S.A.）で固化した２％蔗
糖,pH5.8を補ったN6培地のビタミン並びにマクロ及びミ
クロエレメント］に移した。系H99及びで３日及び系Pa9
1で２日後、胚を200mg/カナマイシンを補った同一基
質に移した。約14日後、胚をカナマイシンを補った、マ
ンニトールを含まないMahl VII基質に移した。さらに胚
を約２月間、この選択的基質上で継代培養し、約３週間
の間隔をあけて継代培養した。誘導した胚形成組織を注
意深く単離し、系H99に関しては5mg/ 6−ベンジルア
ミノプリンを、系Pa91に関しては5mg/ゼラチンを補っ
たMS培地［Murashige及びSkoog（1962）Physiol.Plant
15:473］に移した。胚形成組織をこの培地上で約14日間
保持し、次いで、系H99に関してはホルモン及び６％蔗
糖を含まない、系Pa91に関しては３％蔗糖を含まないMS
培地に移した。発育した芽をさらに通常の苗に発育する
間、1.5％蔗糖を含む1/2 MS培地に移した。これらの苗
を土壌に移し、室温栽培した。

実施例2:実施例１で形質転換したトウモロコシ植物の特
徴付け 実施例１からの17本の植物を、ポリメラーゼ鎖反応
（PCR）によりキメラneo遺伝子の存在下で分析した。約
10〜20mgの組織量に合わせたDellaportaら［（1983）Pl
ant Mol.Biol.Reporter 1:19］により記載されたプロト
コルに従ってDNAを調製した。各植物毎に、特定量の組
織をミクロファージ管中の抽出緩衝液でふやかした。ne
o遺伝子のコード配列の一部に対応する706bpフラグメン
トを、ヌクレオチド1384〜1406及び2089〜2067（Seq.I
d.No.1の番号）のプラスミドpDE108の配列に相補的なオ
リゴヌクレオチドプローブを使用して、Sambrookら
［（1990），同上］により記載のプロトコルに従ってポ
リメラーゼ鎖反応で増幅した。アニール温度50℃で全部
で35サイクル実施した。最終DNAを、1.5％アガロースゲ
ル上の電気泳動により分析した。706bpフラグメントが
全部で13本の植物で同定された。後段で陽性の植物のう
ち１本が枯死した。

neo遺伝子［即ち、ネオマイシンホスホトランスフェ
ラーゼII（NPTII）］の発現産物の活性を、以下の如く
植物９本で分析した。粗抽出物を、抽出緩衝液［McDonn
elら（1987）Plant Molecular Biol.Reporter 5:380］
中で植物組織を粉砕することにより調製した。抽出物を
Reissら［（1984）Gene 30:211］に記載のプロトコルに
従って、非−変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動にか
けた。NPTII活性を、基質［McDonnellら（1987）上述］
として［γ−³²P］ATPを使用するカナマイシンのin sit
uホスホリル化により分析した。NPTII活性は、試験した
植物の内８本で知見された（図１）。

PCR及びNPTIIの両方のアッセイで陽性であることが知
見された植物の内１本（H99−M148−１）をさらに、サ
ザンハイブリダイゼーションにより分析した。ゲノムDN
Aは、残りのRNAを除去するためにRnaseを用いる処理を
補ったDellaportaら［（1983）上述］に記載のプロトコ
ルに従って植物組織から調製した。形質転換していない
H99植物を対照として使用した。DNAサンプルを以下の制
限酵素:Bal II、EcoR I、EcoR V、Hind III、BamH I、P
vu I、Pvu IIまたはPst Iで消化し、次いで水平方向ア
ガロース電気泳動にかけた。製造業者（Amersham Hybon
d−Ｎ＋リーフレット）により推奨されたように、“Alk
ali Blotting of DNA"プロトコル及び続くハイブリダイ
ゼーションによりHybond＋（Amersham International P
LC,Amersham,United Kingdom）膜へのサザントランスフ
ァーを実施した。公開方法［Feinberg及びVogelstein
（1983）Anal.Biochem.132:6］から誘導した製造業者に
より供給されたプロトコルに従って、マルチ−プライム
DNAラベルキット（Amersham）を用いて放射性プローブ
を調製した。プローブとして、もう一つのプラスミドか
ら誘導した1184bp EcoR I−Hind IIIフラグメントを使
用した。このプラスミドの配列は、Seq.Id.No.2に記載
されている。バンドパターン（例えば、図２参照）か
ら、少なくともキメラneo遺伝子は、植物のゲノムDNAに
組込まれたことが知見された。

この形質転換した植物（H99−m148−１）の詳細分析
から、プラスミドpDE108の２個の殆ど完全なコピー及び
３番目が転移したコピーの一部を保持していることが知
見された。２個の殆ど完全なコピーは明らかにヘッド〜
テイルのコンカテマーの植物ゲノムに挿入される。しか
しながら、幾つかの転移は、追加のNco I部位及び追加
のBgl II部位が作り出されるように起きなければならな
かったが、２個のコピーの結合部でのHind III部位（エ
レクトロポレーション前のpDE108の直線化に使用した）
が欠失していた。植物ゲノムで組込んだように、２個の
プラスミドコピーの結合部のシークエンシングから、Hi
nd III部位の突出５′末端のみが欠失していることが明
らかになった。これにより、Nco I部位は以下のよう
に： （欠失した塩基には下線を引き、結合部に作り出したNc
o I部位を強調した）作り出された。さらなる分析か
ら、Hind III部位の回りでは植物ゲノムをフランキング
するプラスミドDNA配列は、全くまたは殆ど欠失してい
なかった。他の植物はこの方法では試験しなかったが、
PCR及びNPTII分析から、キメラ遺伝子が存在し且つ発現
することが知見された。

成熟した形質転換植物は繁殖可能であり、且つ表現型
的にも全く正常であった。サザンハイブリダイゼーショ
ンにより予備分析した植物を、形質転換していない植物
（トウモロコシ自家授粉系H99から２本及びトウモロコ
シ自家授粉系Pa91から１本）を用いた３つの交雑に於い
て花粉媒介植物として使用した。全部で44本のF1子孫の
植物を上記記載の如くPNTII活性に関して分析し、その
内の20本が陽性であることが知見された。これは、通常
のメンデルの分離の法則下で予想された1:1比とは大き
く違っておらず、形質転換した花粉媒介植物がキメラne
o遺伝子（X²＝0.36）の１つの活性コピー（または、あ
るいは、複数の密接に結合した活性コピー）を持ってい
たと考えられる。

実施例3:未成熟な胚の接合体から誘導したＩ型カルスに
DNAをエレクトロポレーションすることによる選択的マ
ーカー遺伝子を用いるトウモロコシの形質転換 長さ約0.5〜1mmの未成熟な胚の接合体を、トウモロコ
シ自家授粉系Pa91の発芽種から単離し、次の継代培養ま
での間隔を約14日間として、MahI VII基質上で培養し
た。胚形成組織を発育型（developing type）Ｉカルス
から注意深く切開した。最後にEPM中の胚形成組織（NaC
lを含まないEPM−NaCl）を、最大長約1.5mmのフラグメ
ントに切断した。得られたカルスフラグメントをこの緩
衝液中で３時間、予備原形質分離した。３時間後、カル
スフラグメントをEPM−NaClに移入した。カルスフラグ
メント約100〜150mgを、キュベット１個当たり200μ
EPM−NaClに移入した。Hind IIIで直線化したプラスミ
ドpDE108（Seq.Id.No.1）の20μg DNAを各キュベットに
添加した。DNAを１時間カルスフラグメントとインキュ
ベートし、その後、キュベットを氷浴に移した。

氷上で10分インキュベーション後、エレクトロポレー
ションを実施した。375V/cmの電界強度のパルス１個
を、900μＦコンデンサから取り出した。エレクトロポ
レーション装置は、Dekeyserら［（1990）上述］の記載
と同じものであった。エレクトロポレーション直後、6m
Mアスパラギン、12mMプロリン、1mg/チアミン−HCl、
0.5mg/ニコチン酸、100mg/カゼイン水解物、100mg/
イノシトール、300g/蔗糖及び54mg/マンニトール
を補った、新しい液体N6aph基質をカルスフラグメント
に添加し、次いでさらに氷上で10分間インキュベートし
た。

1mg/ 2,4−Ｄを補った液体N6aph基質中で１日培養
後、カルスフラグメントを、0.2Mマンニトール及び200m
g/カナマイシンを補ったMahI VII基質に移した。14日
後、カルスフラグメントを、マンニトールを含まない同
一の選択基質で継代培養し、次いで約３週間の継代培養
間隔を空けて約２月この基質でさらに培養した。得られ
たカルスの胚形成区域を、べとべとした組織から単離
し、３％蔗糖及び発芽させるために5mg/ゼラチンを補
ったMS基質［Murashige及びSkoog（1962）Physiol.Plan
t 15:473］に移した。組織をこの培地上で約２週間保持
し、続いて３％または６％蔗糖を含むMS培地に移した。
この基質上に発育した芽を、さらに通常の苗に発育させ
るために1.5％蔗糖を含む半分の強度のMS培地に移し
た。これらの苗を土壌に移し、温室栽培した。

実施例4:実施例３の形質転換したトウモロコシ植物の特
徴付け 実施例３由来の29本の植物を、ポリメラーゼ鎖反応に
よりキメラneo遺伝子の存在について分析した。DNAは、
約10〜20mgの組織量に適用するために合わせたDellapor
taら［（1983）Plant Mol.Biol.Reporter 1:19］に従っ
て調製した。各植物に毎に、特定量の組織をマイクロヒ
ュージ管中の抽出緩衝液中にふやかした。neo遺伝子の
コード配列の一部に対する706bpフラグメントを、ヌク
レオチド1384〜1406及び2089〜2067（Seq.Id.No.1の番
号）のプラスミドpDE108の配列に相補的なオリゴヌクレ
オチドプローブを使用してSambrookら［（1990）上述］
に記載のプロトコルに従ったポリメラーゼ鎖反応で増幅
した。アニール温度50℃で全部で35サイクル実施した。
最終DNAを1.5％アガロースゲル上で電気泳動により分析
した。706bpフラグメントが全部で14本の植物で同定で
きた。陽性の植物の内１つは後段で枯死した。

neo遺伝子のNPTII発現産物の活性を、以下のように24
本の植物で分析した。粗抽出物は、植物組織を抽出緩衝
液［McDonnellら（1987）Plant Molecular Biol.Report
er 5:380］中で粉砕することにより調製した。次いで抽
出物をRessら［（1984）Gene 30:211］に記載の方法に
従って非−変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ
た。NPTII活性を、基質（McDonnellら，同上）として
［γ−³²P］ATPを使用して、カナマイシンのin situホ
スホリル化により分析した。NPTII活性は試験した植物
のうち14本で知見された（図３）。NPTII陽性であった
２本の植物は、PCRアッセイでは陰性であった。

PCR及びNPTIIアッセイの両方で陽性であったことが知
見された植物のうち２本（Pa91−M146−２及びPa91−M1
49−１）を、サザンハイブリダイゼーションによりさら
に分析した。ゲノムDNAは、残りのRNAを除去するために
RNaseとの処理を補ったDellaportaら［（1983）上述］
に従って植物組織から調製した。形質転換していないPa
91植物を対照として使用した。DANサンプルを以下の制
限酵素:Bal II、EcoR I、EcoR V、Hind III、BamH I、P
vu I、Pvu IIまたはPst Iのうちの１種で消化し、次い
で水平方向アガロース電気泳動にかけた。製造業者（Am
ersham）により推奨されたように、“Alkali Blotting
of DNA"プロトコル及び続くハイブリダイゼーションに
よりHybond＋膜へのサザントランスファーを実施した。
公開方法［Feinberg及びVogelstein（1983）Anal.Bioch
em.132:6］から誘導した製造業者により供給されたプロ
トコルに従って、マルチ−プライムDNAラベルキット（A
mersham）を用いて放射性プローブを調製した。プロー
ブとして、もう１個のプラスミドから誘導した1184bp E
coR I−Hind IIIフラグメントを使用した。このプラス
ミドの配列は、Seq.Id.No.2に記載されている。バンド
パターン（例えば、図４参照）から、少なくともキメラ
neo遺伝子は、植物のゲノムDNAに組込まれたことが知見
された。

この形質転換した植物（H99−m146−２）のさらなる
分析から、プラスミドpDE108の２個の殆ど完全なコピー
は、ヘッド〜テイル配置で保持されていることが知見さ
れた。２個のコピーの結合部でのHind III部位（エレク
トロポレーション前のpDE108の直線化に使用した）が欠
失していた。植物ゲノムで組み込んだように、２個のプ
ラスミドコピーの結合部のシークエンシングから、Hind
III部位の突出５′末端＋Hind III部位の一方の下流の
１個の塩基が以下のように： 欠失していることが明らかになった（欠失した塩基には
下線を引いた）。さらなる分析から、植物ゲノムをフラ
ンキングするHind III部位の回りではプラスミドDNA
は、全くまたは殆ど欠失していなかった。他の植物はこ
の方法では試験しなかったが、PCR及びNPTIIアッセイか
ら、キメラ遺伝子が存在し且つ発現することが知見され
た。

成熟した形質転換植物は繁殖可能であり、且つ表現型
的にも完璧に正常であった。サザンハイブリダイゼーシ
ョンにより予備分析した植物のうち１本を、形質転換し
ていない植物（トウモロコシ自家授粉系H99）を用いた
交雑に於いて花粉媒介植物として使用した。全部で20本
のF1子孫の植物を上記記載の如くNPTII活性に関してア
ッセイし、その内の６本が陽性であることが知見され
た。これは、通常のメンデルの分離の法則下で予想され
た1:1比とは大きく違っておらず、形質転換した花粉媒
介植物がキメラneo遺伝子（X²＝3.2）の１個の活性コピ
ーを持っていたと考えられる。

実施例5:未熟成の胚の接合体にDNAを遺伝子エレクトロ
ポレーションすることによる雄性不稔性遺伝子及び選択
可能なマーカーを有するトウモロコシの形質転換 約１〜1.5mmの未成熟の胚の接合体を、トウモロコシ
自家授粉系H99の発育した種から単離した。新しく単離
した胚を酵素的に処理し、実施例１の記載通りに洗浄し
た。洗浄後、胚をトウモロコシエレクトロポレーション
緩衝液、EPM−KCl（80mM KCl,5mM CaCl₂、10mM HEPES及
び0.425Mマンニトール,pH7.2）に載置した。200μ EP
M−KCl中の約100個の胚を各キュベットに載せた。プラ
スミドDNA、Hind IIIで直線化したpVE107約20μｇを各
キュベットに添加した。pVE107は、pTTM8の1287bpのEco
R V−EcoR Iフラグメント（Ep 344029;Seq.Id.No.3）を
プラスミドpDE108（Seq.Id.No.1）の大きなXba I（クレ
ノウで充填した）−EcoR Iフラグメントに結合すること
により得られた6659bpプラスミドである。pVE107は、35
S3プロモーターの制御下でカナマイシン耐性遺伝子（ne
o）からなるキメラ遺伝子及びNicotiana tabacumのTA29
遺伝子の芽胞−特異的プロモーターの制御のでbarnase
遺伝子［Hartley（1988）J.Mol.Biol.202:913］からな
るもう１個のキメラ遺伝子を含む。

barnase遺伝子のフラグメントを含む全ベクター構築
は、プラスミドpMc5BSを含むE.coli株WK6で実施した。p
Mc5BSは、tacプロモーターの制御下でbarstar遺伝子（b
arnase阻害剤をコードする）を含む［De Boerら（198
3）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:21］。このプラスミド
は、 プラスミドpMT416のEcoR I−Hind IIIフラグメント［Ha
rtley（1988）参照］をプラスミドpMc5−８（DSM 456
6）のEcoR I及びHind III部位にクローニングし；次い
で Sollazoら［（1985）Gene 37:199］に通常記載のloopin
g−out突然変異発生により、phoAシグナル配列の開始コ
ドンで始まり、barstarコード領域の翻訳開始コドンの
前の最後のヌクレオチドで終端する配列を除去する ことにより構築する。

DNAを外植片と１時間インキュベーションした後、キ
ュベットを氷浴に移した。氷上で10分間インキュベーシ
ョン後、実施例１に記載の如くエレクトロポレーション
を実施した。エレクトロポレーション直後、新しい液体
N6aph基質をキュベット中の外植片に添加し、この後、
外植片を氷上でさらに10分間インキュベートした。

その後、胚を0.2Mマンニトール及び200mg/カナマイ
シンを補ったMahI VII基質に移した。約14日後、胚をマ
ンニトールを含まないが、同一選択剤、カナマイシンを
含むMahI VII基質に移した。胚を、約３〜４週の継代培
養期間隔で、約２箇月この選択的基質上でさらに継代培
養した。誘導した胚形成組織を注意深く単離し、5mg/
6−ベンジルアミノプリンを補ったMS培地［Murashige
及びSkoog（1962）同上］に移した。胚形成組織をこの
培地上で約14日間保持し、次いでホルモン及び蔗糖を含
まないMS培地に移した。生長した新芽を、通常の苗に生
長させるために、1.5％蔗糖を含む1/2 MS培地に移し
た。これらの苗を土壌に移し、温室で栽培した。

実施例6:実施例５の形質転換した植物の特徴付け 実施例５からの７本の植物、RZM19−２、RZM19−３、
RZM19−４、RZM19−５、RZM19−６、RZM19−７及びRZM1
9−８を、同一胚形成カルス集団から誘導した。これら
を拡張サザン分析にかけた。この場合、BamH I−Nco I
で消化した植物のゲノムDNAをpVE107及びPTTM8の小さな
EcoR V−Xba Iフラグメント（PTA29−barnaseを含む;Se
q.Id.No.3参照）でプローブした。総ての植物に於い
て、最も強く検出された帯は、予想した1400bpフラグメ
ントであった。しかしながら、これら及び他のサザンブ
ロットで知見されたパターンは、非常に複雑で、形質転
換によりpVE107の総てまたは一部が植物のゲノムに多く
挿入されたことを示していた。pVE107の挿入されたコピ
ーの幾つかは、明らかに不完全であるか及び／または転
位が起きていた。しかしながら、幾つかの複雑な組込み
パターンは７本の植物総てに知見された。これは、７本
の形質転換体が総て１個の胚形成カルス集団から誘導さ
れたという事実により説明できた。

形質転換した植物は、不稔性の雄株であったが、これ
以外には表現型的にも完全に正常であった。雌株の生殖
力は正常であった。雄花の小穂花は、ほとんど正常の長
さであったがしかし非常に薄く、空のようであり、全く
開かなかった。詳細な分析から葯は殆ど微細な構造に縮
んでいることが知見された。この表現型は、barnase遺
伝子の少なくとも１個のコピーが発現されただけでな
く、葯の組織の一部または全体で選択的に発現したこと
も示している。

形質転換体RZM19−３は、形質転換していないH99植物
からの花粉で授粉し、53本の子孫の苗を回収した。53本
の苗の内、32本（60％）は、NPTIIアッセイで陽性であ
ったが、21本（40％）はNPTII陰性であった。F1子孫に
於けるこの割合は、通常のメンデルの分離の法則下で予
測された1:1比とは大きく離れておらず、形質転換した
雌親がキメラneo遺伝子（X²＝2.28）の１個の活性コピ
ーを有していたと仮定できる。NPTII陰性の子孫は生殖
力のある雄株であったが、NPTII陽性の子孫は不稔性で
あった。

NPTII陽性の子孫植物31本を、サザン分析にかけた。
これらの植物のうち28本は、これらが誘導された元の形
質転換体RZM19−３と同じ組込みパターンを示した。残
りの３本の植物は、やや異なったパターンを有してい
た。

実施例7:DNAの未熟な接合体胚へのエレクトロポレーシ
ョンによる不稔性の雄の遺伝子及び除草剤耐性遺伝子を
もつトウモロコシの形質転換 トウモロコシ近親自家受粉系H99の接合体の胚を単離
し、酵素的に処理し、洗浄し、次いで実施例５に記載の
如くエレクトロポレーション緩衝液に載置した。各キュ
ベット毎に200μ EPM−KCl中の約100個の胚を載置し
た。Hind IIIで直線化したプラスミドDNA、pVE108約20
μｇを各キュベットに添加した。pVE108は、PTTM8の128
7bp EcoR V−EcoR Iフラグメント（EP 344029;Seq.Id.N
o.3）をプラスミドpDE110の大きなEcoR I−Stu Iフラグ
メント（Seq.Id.No.4）に結合することにより得られた5
620bpプラスミドである。pVE108は、35S3プロモーター
の制御下で、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェ
ラーゼ（PAT）をコードし、除草剤のグルタミンシンセ
ターゼ阻害剤（例えば、ホスフィノトリシン:PPT）に対
する耐性を与えるbar遺伝子を含むキメラ遺伝子（EP242
236）；及びN.tabacumのTA29遺伝子（EP344029）の芽胞
−特異性プロモーターの制御下で、barnase遺伝子［Har
tley（1988）同上］からなるもう１個のキメラ遺伝子を
含む。barnase遺伝子からなるDNAフラグメントを含む全
ベクター構築を、実施例５のプラスミドpMa5BSを含むE.
coli株WK6で実施した。

DNAを外植片と１時間インキュベーションした後、キ
ュベットを氷浴に移した。氷上で10分インキュベーショ
ン後、実施例１に記載の如くエレクトロポレーションを
実施した。エレクトロポレーション直後、新しい液体N6
aph基質をキュベット中の外植片に添加し、この後、外
植片を氷上でさらに10分インキュベートした。

その後、一つのエレクトロポレーション実験からの胚
を、0.2Mマンニトール及び2mg/ PPTを補ったMahl VII
基質に移した。約14日後、胚をマンニトールを含まな
い、2mg/ PPTを補ったMhl VII基質（実施例１のMahl
VII基質であるが、プロリン及びカゼイン水解物を含ま
ない）に移した。約４週間後、胚を、10mg/ PPTを補
ったMhl VII基質上でもう１箇月継代培養した。誘導し
た胚形成組織を注意深く単離し、5mg/ 6−ベンジルア
ミノプリンを補ったMS培地に移した。胚形成組織をこの
培地上で約14日間保持し、続いて、ホルモン及び蔗糖を
含まないMS培地に移した。生長した新芽をさらに通常の
苗に生長させるために、1.5％蔗糖を含む1/2 MS培地に
移した。これらの苗は、２/haに相当するBASTA（登録
商標;Hoechst AG製,Frankfurt am Main,Germany）をin
vitroで噴霧しても生存した。次いで、これらの苗を土
壌に移し、温室栽培した。この形質転換した苗のうち２
本、RZM35−１及びRZM35−18をさらに特徴つけた（実施
例８参照）。

第２のエレクトロポレーション実験からの胚を、2mg/
PPT及び0.2Mマンニトールを補ったMhl VII基質に移
した。約14日後、胚を、マンニトールを含まないが2mg/
PPTを補ったMhl VII基質に移した。さらに約３週間
後、胚をマンニトールを含まない、10mg/ PPTを補っ
たMhl VII基質に移した。さらに３週間後、誘導した胚
形成組織を注意深く単離し、2mg/ PPT及び5mg/ 6−
ベンジルアミノプリンを補ったMS培地に移した。胚形成
組織をこの培地上で約14日間保持し、続いて、ホルモ
ン、蔗糖またはPPTを含まないMS培地に移した。さらに
通常の苗に生長させるために、生長した新芽を1.5％蔗
糖を補った1/2 MS培地に移した。得られた苗を土壌に移
して、温室栽培した。形質転換した苗のうち３本、RZM3
4−１、RZM34−12及びRZM34−14をさらに特徴つけた
（実施例８参照）。

実施例8:実施例７の形質転換したトウモロコシ植物の特
徴つけ 実施例７のRZM34−１、RZM34−12、RZM34−14、RZM35
−１及びRZM35−18を温室内で生長させた。植物の葉に
於けるbar遺伝子の発現産物の活性を、以下の“PATアッ
セイ”で分析した。各植物からの葉の組織100mgを、酸
で処理した海砂（Merck,Darmstadt,Germany）50mg及び
ポリビニルポリピロリドン（PVPP）5mgと一緒に、エッ
ペンドルフ管中、抽出緩衝液（25mM Tris−HCl pH7.5,1
mM Na₂−EDTA:エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩,
0.15mg/mlフェニルメチルスルホニルフルオリド;PMSF,
0.3mg/mlジチオトレイトール;DTT及び0.3mg/mlウシ血清
アルブミン）50μ中でガラス棒で粉砕した。抽出物
を、マイクロヒュージ管中、16000rpmで５分間遠心分離
した。上清を回収し、TE 25/（25mM Tris−HCl pH7.
5,1mM Na₂−EDTA）で10倍に希釈した。希釈した抽出物1
2μに、1mM PPTのTE 25/中の１μ、2mMアセチル
補酵素ＡのTE 25/中の１μ及び［¹⁴C］アセチル補
酵素Ａ（60mci/mmol,0.02mCi/ml;NEN Research Product
s,DUPONT,Wilmington,Dekaware,USA）２μに添加し
た。反応混合物を37℃で30分インキュベートし、濃縮領
域を有するアルミニウムシートシリカゲル60t.l.c.プレ
ート（Merck）にスポットした。上昇クロマトグラフィ
ーを、１−プロパノール及びNH₄OHの３対２混合物（25
％ NH₃）で実施した。オートラジオグラフィー（XAR−5
Kodak film）に一晩かけることにより、¹⁴Cを視覚化し
た。

除草剤BASTA（登録商標）に対する耐性を、植物１本
当たり葉１枚の上面に近い小領域に除草剤１％溶液をは
けで塗り、塗った部位及び近隣に於ける損傷兆候を観察
することにより試験した。RZM34−１、RZM35−１及びRZ
M35−18は、全く損傷兆候を示さなかったが、RZM34−12
及びRZM34−14は、塗った部位がやや茶色になり、乾燥
していた。

RZM34−１、RZM34−12、RZM34−14、RZM35−１及びRZ
M35−18は、不稔性の雄株であることが判明した。これ
らの植物の各々の表現型は、実施例６で分析した実施例
５の形質転換体に関して記載したものと同一であった。

サザン分析から、RZM35−１及びRZM35−18は、各々の
ゲノムにプラスミドpVE108の１個のコピーが存在する、
同一組込みパターンを有することが知見された。Hind I
II部位の近隣のプラスミドDNA配列の小さな部分（エレ
クトロポレーション前に直線化するために使用した）
は、組込みコピーには存在しないようであった。RZM34
−１、RZM34−12及びRZM34−14のサザン分析から、これ
らの植物の各々は、多分そのゲノム中に組込まれたpVE1
08の一部または全部の２個または３個のコピーを有して
いることが知見された。このコピーは、コンカテマー配
置中に殆ど同様には挿入されない。

形質転換体RZM35−１及びRZM34−１を、形質転換して
いないH99植物からの花粉で授粉し、子孫の苗を回収し
た。RZM35−１から回収した苗35本のうち、16本（46
％）はPATアッセイで陽性であったが、19本（54％）はP
AT陰性であった。F1子孫に於けるこの割合は、キメラba
r遺伝子（X²＝0.26）の１個の活性コピーの通常のメン
デルの分離の法則下で予測された1:1比とは大きくずれ
ていない。

RZM34−１から回収した苗34本のうち、19本（56％）
はPATアッセイで陽性であり、15本（44％）はPAT陰性で
あった。F1子孫に於けるこの比は、通常のメンデルの分
離の法則下で予測した1:1比から大きくずれておらず、
形質転換した雌親が、キメラbar遺伝子（X²＝0.47）の
１個の活性コピーまたは活性であるが、密着結合した複
数のコピーを有していたと考えられる。

実施例9:乾燥種から誘導した圧縮胚形成カルスにDNAを
エレクトロポレーションすることによる、除草剤耐性遺
伝子を有するコメの形質転換 コメ栽培変種植物Nipponbareの皮を剥いた成熟種を、
表面滅菌し、0.5mg/ニコチン酸、0.5mg/ピリドキシ
ン−HCl、1.0mg/チアミン−HCl、2.0mg/ 2,4−Ｄ、
30g/蔗糖及び2.0g/ Phytagel,pH5.8を補った固体2N
6培地［N6培地（Chuら,1975,同上）］に載置し、27℃で
暗所培養した。カルスが３〜４週間以内に胚の胚盤から
生長した。一次（primary）カルスの胚形成部分を、圧
縮胚形成カルスに増殖させるために、0.5mg/ニコチン
酸、0.5mg/ピリドキシン−HCl、1.0mg/チアミン−H
Cl、2.0g/カサミノ酸（Vitamin assay,Difco）、1.0m
g/ 2,4−Ｄ、0.5mg/ 6−ベンジルアミノプリン、20
g/蔗糖、30g/ソルビトール及び2.0g/ Phytagel,p
H5.8を補ったN67培地（N6培地;Chuら,1975,同上）に移
した。

継代培養して３〜４週間後、胚形成カルスを形質転換
実験に使用した。カルスを、最大長さ約1.5〜2mmのフラ
グメントに切り出した。カルス片をEPM中で２回洗浄
し、次いで、室温（25℃）で30分から３時間、この緩衝
液中で前原形質分離した。次いで、カルスフラグメント
をEPM−KClで２回洗浄し、エレクトロポレーションキュ
ベットに移した。各キュベットには、100〜200μ EPM
−KCl中のカルスフラグメント約150〜200mgを載置し
た。プラスミドDNA、環状pDE110またはHind III若しく
はEcoR Iで直線化したpDE110の10〜20μｇを各キュベッ
トに添加した。pDE110は4883bpプラスミドであり、その
全配列はSeq.Id.No.4に記載済みである。このプラスミ
ドは、35S3プロモーターの制御下でbar遺伝子からなる
キメラ遺伝子を含んでいる。

DNAを、室温で約１時間カルスフラグメントとインキ
ュベートした。次いで実施例１に記載の如くエレクトロ
ポレーションを実施した。エレクトロポレーション後、
カサミノ酸を含まない液体N67培地をカルスフラグメン
トに添加した。次いでカルスフラグメントを、カサミノ
酸を含まないが、５、10または20mg/ PPTを補った固
体N67培地に載置し、約４週間、16/8時間の明／暗レジ
メ下で、27℃でこの選択培地上で培養した。生長したPP
T−耐性カルスを単離し、カサミノ酸を含まないが5mg/
PPTを含む新しいN67培地上で約２〜３週間継代培養
した。その後、選択したPPT−耐性カルスを、5mg/ PP
Tを補った植物再生培地N6M25［0.5mg/ニコチン酸、0.
5mg/ピリドキシン−HCl、1.0mg/チアミン−HCl、28
8mg/アスパルチン酸、174mg/アルギニン、7.0mg/
グリシン、1.0mg/ O−ナフタレン酢酸（NAA）、5.0mg
/カイネチン、20g/蔗糖及び2.0g/ Phytagelを補
ったN6培地（Chuら;1975,同上）］に移した。苗を約１
箇月生長させ、次いで0.5mg/ニコチン酸、0.5mg/ピ
リドキシン−HCl、1.0mg/チアミン−HCl、1.0g/カ
サミノ酸、20g/蔗糖及び2.0g/ Phytogel,pH5.8を補
ったホルモンを含まないN6培地（Chuら,1975,同上）に
移した。この上でさらに２〜３週間保持し、その後、土
壌に移して温室栽培した。

上記の2N6、N67、N6M25及びホルモンを含まないN6培
地の組成は、Japan Tabacco Inc.,Plant Breeding and
Genetics Research Laboratory,700 Higashibara,Toyod
a,Iwata,Shizuoka 438,JAPANから提供を受けた。

実施例10:実施例９の形質転換したコメ植物の特徴付け 種々の形質転換実験で得られた実施例９の２本の形質
転換したコメ植物を、土壌で４週間栽培し、次いで２
/haに対応する用量でBASTA（登録商標）を噴霧した。２
本の植物はBASTA（登録商標）耐性であり、除草剤処理
でも生存したが、形質転換していない対照の植物は、茶
変し、除草剤を噴霧して４日以内に枯死した。

実施例９の２種類の形質転換実験から誘導した２本の
植物及び他の４本のin vitro苗を、Pvu IIで消化した植
物ゲノムDNAをpDE110でプローブしたサザンハイブリダ
イゼーションにより分析した。この分析から、分析した
総ての植物に於いて、pDE110の少なくとも１個のコピー
がコメゲノムに組込まれたことが知見された。６本の植
物のうち５本に於いて、35S−barキメラ遺伝子の殆どを
含むpDE110フラグメントに対応する1.6kbフラグメント
が、はっきりと同定できた。

実施例11:実施例２及び４の形質転換したトウモロコシ
植物を用いる圃場試験 実施例２のトウモロコシ形質転換体H99−M148−１及
び実施例４のトウモロコシ形質転換体Pa91−M146−２の
子孫を、ベルギー（Afsnee）のPlant Genetic Systems,
N.V.実験農場で圃場条件下で試験した。圃場試験は、登
録番号BIOT/91/M06でベルギー農業省により許可され
た。F1、F2及びF3子孫が、以下の表１に要約されたよう
に交雑から得られた。総ての場合に於いて、親のうち１
個はneo遺伝子に関するヘテロ接合体であると考えられ
る。

各種ロットの内100個以下の種を、長さ5mの平行な５
列に撒いた。個々の植物は0.25m離れており、列間の距
離は1mであった。実験植物の10列の内、対照として形質
転換していないH99が１列、形質転換していないPa91植
物が１列入っていた。１区画は、対照を含むF1及びF2実
験植物からなっていた。これらの区画の各々は、 ｉ）1m幅の通路及び ii）形質転換していないトウモロコシ植物（Variety Sa
nora）３列（1m離れている） により囲まれていた。

実験区画を調製し、種を撒き、次いで以下の表２に記
載の計画に従って保持した。種撒きに関しては、植物の
穴は、プラントスティックで開け、４〜5cmの深さに手
で種を入れた。

圃場試験は、実験植物の穂軸（cobs）全体を手で除去
し、続いてスチームすることにより終了した。残りの植
物は、刈り取り機で機械的に切り刻んだ。

以下の観察を実施した。２〜３葉齢段階で、発芽した
種の総数を各種ロット毎に数えた。以下の表３に見られ
るように、種ロットP4482で種の42％しか発芽しなかっ
たことを除いては、発芽率は６〜100％であった。形質
転換していないH99及びPa91植物の種ロットの発芽率
は、25〜75％であった。

３〜４葉齢段階で、トランスジェニックneo遺伝子の
表現型を以下のようにアッセイした。各植物に於いて、
小さなはさみで２枚の葉に葉脈の途中までの切れ目を入
れた。次いで切れ目を、４％カナマイシン及び0.2％ SD
Sの水性懸濁液に浸した１片の綿花で拭った。幾つかの
植物は、５％カナマイシン及び0.1％ SDSの懸濁液で処
理した。新しく形成した葉が黄変したら、その植物は感
受性であり、活性neo遺伝子を欠損していると記載し
た。新しく形成した葉が正常で脱色していなかったら、
その植物は耐性があり、活性neo遺伝子を保持している
と記載した。新しく形成した葉の脱色は、拭ってから約
10日後に評価した。試験した植物の５〜８％は、感受性
または耐性であるとはっきりと記載できず、中間の表現
型を有していた。これは、最適カナマイシン（及び／ま
たはSDS）濃度以下であること及び試験した植物の環境
条件及び／または生長段階での変動に依存するものと考
えた。

後段の分析に於いて、中間の表現型は感受性の植物と
一緒にプールした。各交雑または自家授粉に関するカナ
マイシン耐性植物対カナマイシン感受性植物（中間表現
型を含む）の比は、neo遺伝子の１遺伝子座のメンデル
の分離の法則を仮定した場合の適応試験のchisquare go
odness［Snedecor and Cochran（1967）“Statistical
Methods",Iowa State University Press,Ames,Iowa,U.
S.A.］により決定した。結果を以下の表３に要約する。

表３のデータから、導入されたneo遺伝子は、自家授
粉、戻し交雑または、関連しない系との異系交雑から得
られたかに関係なく、３世代にわたって安定であった。
分離のパターンは、neo遺伝子の密接に結合した活性コ
ピーをたった１個または複数有する各々の元の形質転換
体及び、通常のメンデルの１遺伝子座の遺伝的性質を有
するneo遺伝子形質と一致した。

総ての場合に於いて、実験植物は、形質転換していな
い対照の植物と比較すると、形態学的に全く正常であっ
た。

配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人:PLANT GENETIC SYSTEM N.V. （ii）発明の名称： 単子葉植物を形質転換する方法 （iii）配列の数:4 （iv）連絡先： （Ａ）住所:Plant Genetic Systems N.V. （Ｂ）通り:Plateaustraat 22, （Ｃ）郵便番号及び市:9000 Ghent, （Ｄ）国：ベルギー （ｖ）コンピューター読取可能形式： （Ａ）媒体の種類:5.25インチディスク,DS,高密度
1.2Mbフロッピーディスク （Ｂ）コンピューター:IBM PC/AT （Ｃ）操作システム:DOS Version 3.3 （Ｄ）ソフトウェア:WordPerfect （iv）本出願データ： （vii）優先権出願データ： 欧州特許出願番号91401888.2,1991年７月８日 欧州特許出願番号90403332.1,1990年11月23日 （２）配列番号:1の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）型：核酸 （Ｂ）長さ:5399bp （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：環状 （ii）配列の種類:pDE108: E.coli中に複製可能なプラスミドDNA （ix）特徴： １−451:pUC誘導配列 452−1284:カリフラワーモザイクウイルス単離物Ca
bbB−JIから誘導した“35S3"プロモーター配列 1285−2100:ネオマイシンホスホトランスフェラー
ゼ遺伝子のコード配列 2101−3160:Agrobacterium T−DNAオクトピンシン
ターゼ遺伝子から誘導したポリアデニル化部位を含む
３′調節配列 3161−5399:pUC18誘導配列 他の情報：プラスミドはE.coli中で複製可能であ
り、バクテリアにアンピシリン耐性を与える （xi）配列の説明 （３）配列番号:2の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）型：核酸 （Ｂ）長さ:1186bp （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）配列の種類:neo遺伝子に対するプローブとして
使用したDNA: （ix）特徴： １−8:Nicotiana tabacumの芽胞特異的プロモータ
ーから誘導した配列 ９−790:ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺
伝子のコード配列 791−終:Agrobacterium T−DNA遺伝子７から誘導し
たポリアデニル化部位を含む３′調節配列 （xi）配列の説明 （４）配列番号:3の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）型：核酸 （Ｂ）長さ:1287bp （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）配列の種類：キメラ遺伝子を含むDNA （ix）特徴： １−545:Nicotiana tabacumからのTA29遺伝子から
のプロモーター 546−881:barnase遺伝子のコード配列 882−:Agrobacterium T−DNAからのノパリンシンタ
ーゼ遺伝子から誘導したポリアデニル化部位を含む３′
調節配列 （xi）配列の説明 （５）配列番号:4の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）型：核酸 （Ｂ）長さ:4883bp （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：環状 （ii）配列の種類:pDE110: E.coli中で複製可能なプラスミドDNA （ix）特徴： １−395:pUC18誘導配列 396−1779:カリフラワーモザイクウイルス単離物Ca
bbB−JIから誘導した“35S3"プロモーター配列 1780−2331:ホスフィノトリシンアセチルトランス
フェラーゼ遺伝子のモード配列 2332−2619:Agrobacterium T−DNAノパリンシンタ
ーゼ遺伝子から誘導したポリアデニル化部位を含む３′
調節配列 2620−4883:pUC誘導配列 他の情報：プラスミドはE.coli中で複製可能であ
り、バクテリアに対するアンピシリン耐性を与える （xi）配列の説明

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭63−301792（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−9378（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 A01H 5/00 C12N 5/10 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (14)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】トウモロコシ、コムギまたはイネ植物の細
   胞中で機能する遺伝子を含むDNAのトウモロコシ、コム
   ギまたはイネ植物の核ゲノムへの安定な組込み方法であ
   って、 （ａ）前記トウモロコシ、コムギまたはイネ植物の緻密
   な胚形成カルスまたは前記トウモロコシ植物の未成熟胚
   を得る段階と、 （ｂ）緻密な胚形成カルスを損傷させ、前記緻密な胚形
   成カルス中の細胞の核ゲノムに前記DNAを移入し形質転
   換細胞を産生させ又は前記未成熟胚を未成熟胚の細胞壁
   を分解し得る酵素で組織の完全な崩壊をもたらさないよ
   うに短時間処理することにより分解させ、前記DNAを未
   成熟胚細胞に移入し形質転換細胞を産生させる段階と、 （ｃ）前記形質転換細胞から形質転換トウモロコシ、コ
   ムギまたはイネ植物を再生する段階とを含む方法。
2. 【請求項２】未成熟胚が最大寸法0.5〜1.5mmである請求
   項１に記載の方法。
3. 【請求項３】前記DNAの移入の前に緻密な胚形成カルス
   を損傷させるかまたは未成熟胚を分解させる請求項１に
   記載の方法。
4. 【請求項４】緻密な胚形成カルスをカルス片に切断する
   ことにより損傷させる請求項３に記載の方法。
5. 【請求項５】前記カルス片が最大寸法0.5〜2.5mmである
   請求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】前記カルス片が最大寸法１〜2mmである請
   求項４に記載の方法。
7. 【請求項７】未成熟胚が１〜10分間前記酵素により処理
   される請求項１に記載の方法。
8. 【請求項８】未成熟胚が１〜２分間前記酵素により処理
   される請求項１に記載の方法。
9. 【請求項９】緻密な胚形成カルス若しくはカルス片又は
   未成熟胚を前記DNAの移入の前に一定時間原形質分離さ
   せる請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 【請求項１０】前記DNAを前記緻密な胚形成カルス又は
    前記未成熟胚の細胞の核ゲノムにエレクトロポーレーシ
    ョン、ポリエチレングリコールを用いた直接移入法、DN
    Aで被覆した微小発射体の撃ち込み又はアグロバクテリ
    ウムで媒介されるDNA移入により組込む請求項１〜９の
    いずれか１項に記載の方法。
11. 【請求項１１】前記DNAを前記胚形成カルス又は前記未
    成熟胚の細胞の核ゲノムにエレクトロポーレーションに
    より組込む請求項10に記載の方法。
12. 【請求項１２】請求項１に記載の方法の段階（ｂ）がDN
    Aで被覆した微小発射体を用いての前記緻密な胚形成カ
    ルスのへの撃ち込みにより実行される請求項１に記載の
    方法。
13. 【請求項１３】遺伝子が配列番号３のヌクレオチド１〜
    545の配列を有するタバコのTA29遺伝子の雄ずい特異的
    プロモーターの制御下でバルナーゼをコードするDNAを
    含む請求項１〜12のいずれか１項に記載の方法。
14. 【請求項１４】遺伝子がホスフィノトリシンアセチルト
    ランスフェラーゼ又はネオマイシンホスホトランスフェ
    ラーゼをコードするDNAを含む請求項１〜12のいずれか
    １項に記載の方法。