ES2607688T3 - Fitasas, ácidos nucleicos que las codifican y métodos para su producción y uso - Google Patents

Abstract

Una fitasa aislada, sintética o recombinante que tiene tanto una tolerancia térmica mejorada como una mayor labilidad gástrica en comparación con la SEC ID No: 2; donde la fitasa es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con, o que tiene la secuencia de aminoácidos de, la SEC ID No: 2 y al menos una mutación seleccionada entre: I427T, A232P, A236H, A236T, A274I, A274L, G257A, G67A, H263P, I174P, L157P, L167S, L296T, L50W, M51L, P149L, P217D, P217G, P217S, P343E, P343L, P343N, P343R, P343V, Q246W, Q275H, Q377R, S211H, S218Y, T291V, T48F, T48H, T48I, T48K, T48L, T48M, T48W, T48Y, Y79H, Y79N y Y79S

Description

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La invención proporciona gránulos comestibles o que pueden absorberse que comprenden un vehículo granulado comestible o que puede absorberse y el polipéptido de la invención, o un homodímero o heterodímero de la divulgación. Opcionalmente, el polipéptido está glucosilado y opcionalmente la actividad fitasa es termotolerante o

5 termoestable. El gránulo puede ser elaborado en forma de gránulo, o como una píldora, comprimido, cápsula, gel, comprimido recubierto con película, aerosol, polvo, formulación liofilizada, formulación farmacéutica, forma líquida o como una suspensión o pasta espesa, o se produce usando aditivos revestidos con polímero o se elabora en forma granulada, o se produce mediante secado por pulverización.

Una harina de soja puede comprender un polipéptido de la invención, o un homodímero o heterodímero de la divulgación, opcionalmente elaborado como un gránulo, píldora, comprimido, cápsula, gel, comprimido recubierto con película, aerosol, polvo, formulación liofilizada o en forma líquida.

Los métodos para aumentar la resistencia de un polipéptido fitasa a la inactivación enzimática en un sistema

15 digestivo de un animal comprenden realizar la glucosilación de un polipéptido fitasa que comprende el polipéptido de la invención, aumentando de esta manera la resistencia del polipéptido fitasa a la inactivación enzimática en un sistema digestivo de un animal. Opcionalmente, la glucosilación es N-glucosilación y, opcionalmente, el polipéptido fitasa está glucosilado como resultado de la expresión in vivo de un polinucleótido que codifica la fitasa en una célula. Una célula de este tipo puede ser una célula eucariota, una célula fúngica, una célula vegetal o una célula de mamífero.

Los métodos para procesar granos de maíz y de sorgo pueden comprender: (a) proporcionar un polipéptido de la invención; (b) proporcionar una composición que comprenda un licor de maceración de maíz o un licor de maceración de sorgo; y (c) poner en contacto el polipéptido de (a) en la composición de (b) en condiciones en las

25 que el polipéptido pueda escindir un enlace inositol-fosfato inorgánico.

La invención proporciona composiciones farmacéuticas o formulaciones dietéticas que comprenden un polipéptido o un heterodímero de la invención; donde opcionalmente el polipéptido está glucosilado, y opcionalmente la actividad fitasa es termotolerante o termoestable. La composición farmacéutica o una formulación dietética puede formularse como gránulo, píldora, comprimido, cápsula, gel, comprimido recubierto con película, aerosol, polvo, loción o forma líquida, o se produce usando aditivos revestidos con polímeros, o como un implante, o se elabora en forma granulada, o se produce mediante secado por pulverización.

La invención proporciona composiciones que comprenden un polipéptido de la invención; y (b) cualquier producto

35 como se indica en la Tabla 2, o cualquiera de las composiciones enumeradas en la Tabla 1, donde opcionalmente el polipéptido está glucosilado, y opcionalmente la actividad fitasa es termotolerante o termoestable.

Una unidad de comida individual lista para consumir (MRE, Meal Ready to Eat), una bebida o un agente hidratante puede comprender un polipéptido o un heterodímero de la invención; donde opcionalmente el polipéptido está glucosilado, y opcionalmente la actividad fitasa es termotolerante o termoestable.

Los métodos para mejorar (retrasar el progreso de, tratar o prevenir) la osteoporosis puede comprender administrar a un individuo que lo necesite una cantidad eficaz (dosificación) de una composición que comprenda un polipéptido de la invención; donde opcionalmente el polipéptido está glucosilado, y opcialmente la actividad fitasa es

45 termotolerante o termoestable.

El incremento de la labilidad gástrica de una fitasa se consigue proporcionando un polipéptido de la invención: reemplazando uno o más aminoácidos en la secuencia que codifica el polipéptido con arginina, histidina, prolina, leucina, serina, treonina o tirosina.

Los métodos para alterar al menos dos propiedades diferentes de una enzima, según se describe detalladamente en el Ejemplo 2 más adelante, comprenden (a) proporcionar un polipéptido con una actividad enzimática; (b) crear variantes del polipéptido de (a), donde cada variante tiene un único cambio de aminoácido respecto al polipéptido de (a); (c) explorar las variantes de (b) para las dos propiedades diferentes; (d) seleccionar las variantes deseadas de 55 (c) e identificar el cambio de aminoácido único en cada variante seleccionada; (e) crear nuevas variantes que comprendan diferentes combinaciones de los cambios de aminoácidos únicos seleccionados de (d); (f) explorar las variantes de (e) para las dos propiedades alteradas; y (g) seleccionar las variantes deseadas de (f) con las dos propiedades alteradas. Los métodos alternativos para alterar al menos dos propiedades diferentes de una enzima comprenden (a) proporcionar un polipéptido con una actividad enzimática; (b) crear variantes del polipéptido de (a), donde cada variante tiene un único cambio de aminoácido respecto al polipéptido de (a); (c) explorar las variantes de

(b) para una propiedad alterada; (d) explorar las variantes de (b) para otra propiedad alterada; (e) seleccionar las variantes deseadas de (c) y (d) e identificar el cambio de aminoácido único en cada variante seleccionada; (f) crear nuevas variantes que comprendan diferentes combinaciones de los cambios de aminoácidos únicos seleccionados de (c) y (d); (g) explorar las variantes de (f) para las dos propiedades alteradas; y (h) seleccionar las variantes

65 deseadas de (g) con las dos propiedades alteradas. Algunos métodos ilustrativos para crear las variantes se basan en la evolución de GSSM, evolución de GeneReassembly y/o evolución de TMCA.

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MeUMB-fosfato, como se describe más adelante con detalle en el Ejemplo 1. La Figura 9 ilustra esquemáticamente el protocolo de una exploración de biblioteca ejemplar, como se describe en la Figura 8, como se describe más adelante con detalle en el Ejemplo 1. La Figura 10 ilustra un proceso alcohólico ejemplar que puede incorporar el uso de las fitasas de la invención.

5 Las Figuras 11A y 11B ilustran resúmenes de termoestabilidad y labilidad en FGS de la fitasa appA (no de acceso de GenBank M58708), intermedios de SEC ID No: 2 de appA, y SEC ID No: 2, según se describe detalladamente en el Ejemplo 2 más adelante.

La Figura 12 ilustra el efecto de un marcador de his sobre la estabilidad en FGS, que se determina mediante ensayos en FGS de versiones purificadas con el marcador de his y sin el marcador de his de la fitasa parental (SEC ID No: 2), según se describe detalladamente en el Ejemplo 2 más adelante.

La Figura 13 ilustra la termotolerancia de variantes de SEC ID No: 2 con eliminación de la glucosilación (Variantes 15 GLY1 -GLY4) y dos controles de SEC ID No: 2, según se describe detalladamente en el Ejemplo 2 más adelante.

La Figura 14 ilustra la estabilidad en FGS de SEC ID No: 2-HIS y la variante SEC ID No: 2-6X, según se describe detalladamente en el Ejemplo 2 más adelante.

La Figura 15 ilustra la pérdida de actividad en FGS de mutantes seleccionados a partir de la evolución de GSSM de la SEC ID No: 2, según se describe detalladamente en el Ejemplo 2 más adelante.

La Figura 16 ilustra el efecto de diferentes aminoácidos sobre la labilidad en FGS, según se describe detalladamente en el Ejemplo 2 más adelante.

25 La Figura 17 ilustra los puntos importantes para la mutación de FGS, según se describe detalladamente en el Ejemplo 2 más adelante.

La Figura 18 ilustra la labilidad en FGS de la SEC ID No: 2-HIS y la Variante O para diferentes dosis de pepsina, según se describe detalladamente en el Ejemplo 2 más adelante.

La Figura 19 ilustra la semivida de la SEC ID No: 2-HIS y la Variante O, según se describe detalladamente en el Ejemplo 2 más adelante.

35 La Figura 20 ilustra la actividad residual de las variantes de fitasa lábiles en FGS, según se describe detalladamente en el Ejemplo 2 más adelante.

La Figura 21 ilustra la actividad específica de las fitasas variantes lábiles en FGS en comparación con la SEC ID No: 2, según se describe detalladamente en el Ejemplo 2 más adelante.

En los diversos dibujos los mismos símbolos de referencia indican los mismos elementos.

Descripción detallada de la invención

45 La invención se refiere a polipéptidos fitasa que tienen, comprenden, las modificaciones de restos específicos en la SEC ID Nº: 2, como se ha descrito anteriormente, y a polinucleótidos que los codifican, (por ejemplo, que comprenden las modificaciones de los pares de bases específicos de la SEC ID Nº: 1, como se ha descrito anteriormente), así como a métodos de uso de los polinucleótidos y polipéptidos. La Figura 6 ilustra fitasas ejemplares que tienen modificaciones de restos sencillos en la SEC ID Nº: 2 parental y la Figura 5 ilustra fitasas ejemplares que tienen modificaciones de restos múltiples en la SEC ID Nº: 2 parental.

La actividad fitasa de los polipéptidos de la invención puede incluir enzimas que tienen una actividad fitasa, por ejemplo, enzimas que pueden catalizar la degradación de fitato, por ejemplo, la catálisis de fitato (hexafosfato de mioinositol) a inositol y a fosfato inorgánico. Las fitasas de la invención incluyen enzimas termotolerantes y

55 termorresistentes.

Las fitasas y polinucleótidos que codifican las fitasas de la invención son útiles en diversos procesos, métodos y composiciones. Por ejemplo, como se ha indicado anteriormente, una fitasa puede usarse en piensos y en complementos para piensos de animales, así como en tratamientos para degradar o eliminar el exceso de fitato del medio o de una muestra. Otros usos serán obvios para los expertos en la técnica basándose en las enseñanzas proporcionadas en el presente documento, incluidas las comentadas anteriormente.

En un aspecto, las moléculas de fitasa de la invención-en solitario o en combinación con otros reactivos (incluyendo pero sin limitación enzimas, tales como proteasas, amilasas y similares) -se usan en el tratamiento de productos

65 alimenticios, por ejemplo, para la prevención del sedimento residual de maíz no deseado, y en otras aplicaciones donde la hidrólisis de fitato es deseable.

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viral (por ejemplo, de la vacuna, adenovirus, virus de la viruela, pseudorrabia y derivados de SV40), cromosomas artificiales basados en P1, plásmidos de levadura, cromosomas artificiales de levadura, y cualquier otro vector específico de hospedadores específicos de interés (tales como Bacillus, Aspergillus y levaduras). Por tanto, por ejemplo, el ADN puede incluirse en una cualquiera de una diversidad de vectores de expresión para expresar un

5 polipéptido. Dichos vectores incluyen secuencias de ADN sintéticas, cromosómicas y no cromosómicas. Los expertos en la técnica conocen un gran número de vectores adecuados y se encuentran disponibles en el comercio. Como ejemplo se proporcionan los siguientes vectores: bacterianos: vectores pQE (Qiagen), plásmidos pBluescript, vectores pNH, (vectores lambda-ZAP (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pDR540, pRIT2T (Pharmacia); eucariotas: pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVLSV40 (Pharmacia). Sin embargo puede usarse cualquier otro plásmido u otro vector siempre que sean replicables y viables en el hospedador. Con la presente invención pueden emplearse vectores con número de copias bajo o con número de copias elevado.

Un vector ejemplar para su uso en la presente invención contiene un origen de replicación del factor f. El factor f (o factor de fertilidad) en E. coli es un plásmido que efectúa transferencia a alta frecuencia de sí mismo durante la

15 conjugación y transferencia menos frecuente del propio cromosoma bacteriano. Un aspecto utiliza vectores de clonación, denominados “fósmidos” o vectores de cromosomas artificiales bacterianos (BAC). Estos derivan del factor f de E. coli que puede integrar establemente grandes segmentos de ADN genómico. Cuando se integra con ADN de una muestra ambiental no cultivada mixta, hace que sea posible conseguir grandes fragmentos genómicos en forma de una “biblioteca de ADN ambiental” estable.

Otro tipo de vector para su uso en la presente invención es un vector de cósmido. Los vectores de cósmidos se diseñaron en principio para clonar y propagar grandes segmentos de ADN genómico. La clonación en vectores de cósmidos se describe con detalle en “Molecular Cloning: A laboratory Manual” (Sambrook et al., 1989).

25 La secuencia de ADN en el vector de expresión está unida operativamente a una secuencia (o secuencias) de control de la expresión apropiada (promotor) para dirigir la síntesis del ARN. Los promotores bacterianos particulares incluyen lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda PR, PLy trp. Los promotores eucariotas incluyen CMV inmediato temprano, HSV timidina quinasa, SV40 temprano y tardío, LTR de retrovirus y metalotioneína I de ratón. La selección del vector y promotor apropiado está bien dentro del nivel de experiencia en la técnica. El vector de expresión también contiene un sitio de unión al ribosoma para iniciar la traducción y un terminador de la transcripción. El vector también puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión. Pueden seleccionarse regiones promotoras de cualquier gen deseado usando vectores CAT (cloramfenicol transferasa) u otros vectores con marcadores de selección. Además, los vectores de expresión pueden contener uno o más genes marcadores de selección para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de células hospedadoras transformadas tales como dihidrofolato reductasa, o

35 resistencia a neomicina para el cultivo de células eucariotas, o tetraciclina o resistencia a tetraciclina o ampicilina en

E. coli. En un aspecto, los casetes de expresión de la invención comprenden una secuencia de la invención y una secuencia de nucleótidos que puede afectar a la expresión de un gen estructural (es decir, una secuencia que codifica una proteína, tal como una fitasa de la invención) en un hospedador compatible con dichas secuencias. Los casetes de expresión incluyen al menos un promotor unido operativamente con la secuencia polipeptídica codificante; y, opcionalmente, con otras secuencias, por ejemplo, señales de terminación de la transcripción. También pueden usarse factores adicionales necesarios o útiles para efectuar la expresión, por ejemplo, potenciadores. En un aspecto, “unido operativamente”, como se usa en el presente documento, se refiere a la unión de un promotor aguas arriba de una secuencia de ADN de tal manera que el promotor media la transcripción de la secuencia de ADN. Por

45 tanto, los casetes de expresión también incluyen plásmidos, vectores de expresión, virus recombinantes, cualquier forma de vector de “ADN desnudo” recombinante y similar. En un aspecto, un “vector” comprende un ácido nucleico que puede infectar, transfectar, transducir, transitoria o permanentemente, una célula. Un vector puede ser un ácido nucleico desnudo, o un ácido nucleico formando complejos con proteínas o lípidos. Opcionalmente el vector comprende ácidos nucleicos y/o proteínas virales o bacterianas, y/o membranas (por ejemplo, una membrana celular, una envoltura lipídica viral, etc.). En un aspecto, los vectores incluyen, pero sin limitación, replicones (por ejemplo, replicones de ARN, bacteriófagos) a los cuales pueden unirse fragmentos de ADN y comenzar a replicarse. En un aspecto, los vectores incluyen, pero sin limitación, ARN, ARN o ADN circular o lineal autónomo autorreplicante (por ejemplo, plásmidos, virus y similares, véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.217.879), e incluye tanto plásmidos de expresión como de no expresión. Cuando un microorganismo recombinante o un cultivo celular

55 se describe como hospedador de un “vector de expresión”, esto incluye ADN circular y lineal extra-cromosómico y ADN que se ha incorporado en el cromosoma (o cromosomas) del hospedador. Cuando un vector se conserva en una célula hospedadora, las células pueden replicar establemente el vector durante la mitosis como una estructura autónoma, o se incorpora dentro del genoma del hospedador.

El vector de expresión puede comprender un promotor, un sitio de unión a ribosoma para el inicio de la traducción y un terminador de la transcripción. El vector también puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión. Los vectores de expresión de mamíferos pueden comprender un origen de replicación, cualquiera de los sitios de unión a ribosoma necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios donantes y aceptores de corte y empalme, secuencias de la terminación transcripcional, y secuencias flanqueantes no transcritas en posición 5’. En algunos

65 aspectos, pueden usarse las secuencias de ADN derivadas de los sitios de corte y empalme y de poliadenilación del SV40 para proporcionar los elementos genéticos no transcritos necesarios.

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las células pueden cultivarse durante un periodo adicional para permitirlas producir el polipéptido deseado o fragmento del mismo.

Las células pueden recuperarse por centrifugación, pueden destruirse por medios físicos o químicos y el extracto

5 bruto resultante se conserva para purificación adicional. Las células microbianas empleadas para la expresión de proteínas pueden destruirse mediante cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelación/descongelación, tratamiento con ultrasonidos, interrupción mecánica, o uso de agentes de lisado celular. Dichos métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica. El polipéptido expresado, o fragmento del mismo, puede recuperarse y purificarse a partir de cultivos de células recombinantes por métodos que incluyen precipitación con etanol o sulfato de amonio, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía con fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía con hidroxiapatita y cromatografía con lecitina. Las etapas de replegamiento proteico pueden usarse, según sea necesario, para completar la configuración del polipéptido. Si se desea, para las etapas de purificación final puede emplearse cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC).

15 Las construcciones en células hospedadoras pueden usarse de manera convencional para producir el producto génico codificado por la secuencia recombinante. Dependiendo del hospedador empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos producidos por células hospedadoras que contienen el vector pueden estar glucosilados o pueden estar no glucosilados. Los polipéptidos de la invención también pueden incluir o no un resto de aminoácido de metionina inicial.

Los sistemas de traducción acelulares también pueden emplearse para producir un polipéptido de la invención. Los sistemas de traducción acelulares pueden usar ARNm transcritos a partir de una construcción de ADN que comprenda un promotor unido operativamente a un ácido nucleico que codifica el polipéptido o fragmento del mismo.

25 En algunos aspectos, la construcción de ADN puede linealizarse antes de realizar una reacción de transcripción in vitro. Después, del ARNm transcrito se incuba con un extracto de traducción acelular apropiado, tal como un extracto de reticulocitos de conejo, para producir el polipéptido deseado o fragmento del mismo.

Los vector de expresión pueden contener uno o más genes marcadores de selección para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de células hospedadoras transformadas tal como dihidrofolato reductasa o resistencia a neomicina para cultivo de células eucariotas, o tales como resistencia a tetraciclina o ampicilina en E. coli.

Los ácidos nucleicos de la invención pueden expresarse, o sobreexpresarse, en cualquier sistema de expresión in vitro o in vivo. Puede emplearse cualquier sistema de cultivo celular para expresar, o sobreexpresar, proteínas

35 recombinantes, incluyendo cultivos de bacterias, insectos, levaduras, fúngicos o de mamíferos. La sobreexpresión puede efectuarse por elección apropiada de promotores, potenciadores, vectores (por ejemplo, el uso de vectores de replicón), vectores dicistrónicos (véase, por ejemplo, Gurtu (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 229: 295-8)), medios, sistemas de cultivo y similar. En un aspecto, para sobreexpresar los polipéptidos de la invención se usa la amplificación génica usando marcadores de selección, por ejemplo, glutamina sintetasa (véase, por ejemplo, Sanders (1987) Dev. Biol. Stand. 66: 55-63), en sistemas de células.

Pueden emplearse diversos sistemas de cultivo de células de mamífero para expresar las proteínas recombinantes, los ejemplos de sistemas de expresión de mamíferos incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos de riñón de mono, descritas en “SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants” (Gluzman, 1981), y otras

45 líneas celulares capaces de expresar un vector compatible, por ejemplo, las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamíferos comprenderán un origen de replicación, un promotor y un potenciador adecuados y también cualquiera de los sitios de unión a ribosoma necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios donantes y aceptores de corte y empalme, secuencias de la terminación transcripcional, y secuencias flanqueantes no transcritas en posición 5’. Secuencias de ADN derivadas de los sitios de corte y empalme y de poliadenilación del SV40 para proporcionar los elementos genéticos no transcritos necesarios.

Las células hospedadoras que contienen los polinucleótidos de interés pueden cultivarse en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para la activación de promotores, selección de transformantes o amplificación de genes. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las previamente 55 usadas con la célula hospedadora seleccionada para la expresión, y serán obvias para el experto habitual en la técnica. Los clones que se identifican como que tienen la actividad enzimática específica pueden después secuenciarse para identificar la secuencia polinucleotídica que codifica una enzima que tiene la actividad potenciada.

Amplificación de ácidos nucleicos

En la práctica de la invención, los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de la invención, o ácidos nucleicos modificados, pueden reproducirse, por ejemplo, por amplificación. Los pares de secuencias cebadoras de amplificación para amplificar ácidos nucleicos que codifican polipéptidos con una actividad fitasa, o secuencias de los mismos, pueden amplificar secuencias de ácidos nucleicos incluyendo la SEC ID Nº: 1 ejemplar y al menos una 65 de las modificaciones de secuencia específicas expuestas anteriormente. Un experto en la técnica puede diseñar pares de secuencias cebadoras de amplificación para cualquier parte de o para la longitud completa de estas

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secuencias; por ejemplo:

La SEC ID Nº: 1 “parental” es como se muestra anteriormente. Por tanto, un par de secuencias cebadoras de amplificación para amplificar esta secuencia parental, o una de las secuencias ejemplares de la invención que tiene

5 al menos una de las modificaciones de secuencias específicas expuestas en el presente documento, pueden ser los restos 1 a 21 de la SEC ID Nº: 1 (es decir, ATGAAAGCGATCTTAATCCCA) y la cadena complementaria de los 21 últimos restos de la SEC ID Nº: 1 (es decir, la cadena complementaria de TGCAGTTTGAGATCTCATCTA).

También pueden usarse reacciones de amplificación para cuantificar la cantidad de ácido nucleico en una muestra (tal como la cantidad de mensaje en una muestra celular), marcar el ácido nucleico (por ejemplo, para aplicarlo a una matriz o a una transferencia), para detectar el ácido nucleico, o para cuantificar la cantidad de un ácido nucleico específico en una muestra. El mensaje aislado de una célula o una biblioteca de ADNc puede ser amplificado. El experto puede seleccionar y diseñar cebadores de amplificación oligonucleotídicos adecuados. Los métodos de amplificación son bien conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa, PCR

15 (véanse, por ejemplo, PCR PROTOCOLS, A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, ed. Innis, Academic Press, N.Y. (1990) y PCR STRATEGIES (1995), ed. Innis, Academic Press, Inc., N.Y., reacción en cadena de la ligasa (LCR) (véanse, por ejemplo, Wu (1989) Genomics 4: 560; Landegren (1988) Science 241: 1077; Barringer (1990) Gene 89: 117); amplificación de transcripción (véase, por ejemplo, Kwoh (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 86: 1173); y replicación de secuencia autosostenida (véase por ejemplo, Guatelli (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 87: 1874); amplificación mediante Q Beta replicasa (véase, por ejemplo, Smith (1997) J. Clin. Microbiol. 35: 1477-1491), ensayo de amplificación de Q-beta replicasa automatizado (véase, por ejemplo Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10: 257-271) y otras técnicas mediadas por ARN polimerasa (por ejemplo, NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario); véanse también Berger (1987) Methods Enzymol. 152: 307-316; Sambrook; Ausubel; Patentes de Estados Unidos Nº 4.683.195 y 4.683.202; Sooknanan (1995) Biotechnology 13: 563-564.

25 Determinación del grado de identidad de secuencia

La invención proporciona un ácido nucleico aislado, sintético o recombinante, que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de secuencia de al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más con la SEC ID Nº: 1, y que incluye las modificaciones de la SEC ID Nº:1, enumeradas específicamente, indicadas anteriormente. El grado de identidad de secuencia (homología) puede determinarse usando cualquier programa informático y parámetros asociados, incluyendo los descritos en el presente documento, tales como BLAST 2.2.2. o FASTA versión 3.0t78, con los parámetros por defecto.

35 Las secuencias homologas también incluyen secuencias de ARN en las cuales las uridinas sustituyen a las timidinas en las secuencias de ácidos nucleicos. Las secuencias homólogas pueden obtenerse usando cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, o pueden ser el resultado de la corrección de un error de secuenciación. En este aspecto de la invención se usan diversos programas de comparación de secuencias identificados en el presente documento. Las identidades de las secuencias de proteínas y/o de aminoácidos (homologías) pueden evaluarse usando cualquiera de una diversidad de algoritmos y programas de comparación de secuencias conocidos en la técnica. Dichos algoritmos y programas incluyen, pero sin limitación, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA y CLUSTALW (Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 85(8): 24442448, 1988; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3): 403-410, 1990; Thompson et al., Nucleic Acids Res. 22(2): 46734680, 1994; Higgins et al., Methods Enzymol. 266: 383-402, 1996; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3): 403-410, 1990;

45 Altschul et al., Nature Genetics 3: 266-272, 1993.

La homología o identidad puede medirse usando el software de análisis de secuencias (por ejemplo el Paquete Informático de Análisis de Secuencia de Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Dicho software empareja secuencias similares asignando grados de homología a diversas supresiones, sustituciones y otras modificaciones. Los términos “homología” e “identidad” en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o de polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas o que tienen un porcentaje específico de restos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales cuando se comparan o se alinean en busca de la máxima correspondencia a lo largo de una ventana de comparación o región designada según se mide usando cualquier número de algoritmos de comparación

55 de secuencia o mediante alineamiento anual e inspección visual. Para la comparación de las secuencias, una secuencia puede actuar como una secuencia de referencia (una secuencia ejemplar de la invención) con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de ensayo y de referencia se introducen en un ordenador, las coordinadas de subsecuencias se designan, si fuera necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmo de secuencias. Pueden usarse los parámetros por defecto del programa, o pueden diseñarse parámetros alternativos. Después, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidades de secuencia para las secuencias de ensayo con respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.

Una “ventana de comparación”, como se usa en el presente documento, incluye la referencia a un segmento de uno

65 cualquiera del número de restos contiguos. Por ejemplo, en aspectos alternativos de la invención, restos contiguos que varían entre cualquiera de 20 con respecto a la longitud completa de una secuencia ejemplar de la invención, se

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Cualquiera de los varios agentes solos o en combinación con otros agentes pueden recubrirse sobre las sustancias biocompatibles, incluyendo polipéptidos (por ejemplo, enzimas, anticuerpos, citoquinas o moléculas pequeñas terapéuticas), y antibióticos, por ejemplo. Ejemplos de agentes útiles particulares se enumeran en la Tabla 1 y 2, a 5 continuación. También se contempla que las células pueden encapsularse en el material biocompatible de la divulgación y usarse para suministrar las enzimas o agentes terapéuticos. Por ejemplo, pueden diseñarse sustancias porosas que tengan poros suficientemente grandes para que las células crezcan en y a través y que estos materiales porosos después puedan llevarse al tracto digestivo. Por ejemplo, la sustancia biocompatible puede comprender una pluralidad de entornos de microflora (por ejemplo, diferente porosidad, pH, etc.) que proporcionan

10 soporte para una pluralidad de tipos celulares. Las células pueden modificarse por ingeniería genética para suministrar un fármaco, enzima o agente químico particular al organismo. Las células pueden ser eucariotas o procariotas.

Tabla 1

Clase de tratamiento

Agente químico Descripción

Antibióticos

Amoxicilina y su inyección Mastox de combinación (Amoxicilina y Cloxacilina) Tratamiento Contra Enfermedades Bacterianas Causadas Por Bacterias Gram + y Gram -

Ampicilina y su inyección Biolox de combinación (Ampicilina y Cloxacilina)

Tratamiento Contra Enfermedades Bacterianas Causadas Por Bacterias Gram + y Gram -.

Nitrofurazona + Urea Bolo Nefrea

Tratamiento De Infecciones Genitales

Trimetoprim + Sulfametoxazol Bolo Trizol

Tratamiento De Infecciones Del Tracto Respiratorio, Infecciones Del Tracto Gastrointestinal, Infecciones Urinogenitales.

Metronidazol y Furazolidona Bolo Metofur

Tratamiento De Enfermedades Bacterianas Y Protozoarias.

Ftalilsulfatiazol, Pectina y Caolín Pectolina Bolo Suspensión

Tratamiento De Diarrea Bacteriana Y No Específica, Disentería Bacilar Y Diarrea Neonatal En Terneros.

Antihelmínticos

Pomada Germex Ectoparasiticida (Hexacloruro de Gamma Benceno, Hemisulfato de Proflavina y Cetrimida) Ectoparasiticida y Antiséptico

Endoparasiticidas > Albendazol y su Combinación Alben (Albendazol) Suspensión (Albendazol 2,5%) Suspensión Plus (Albendazol 5%) Bolo Forte (Albendazol 1,5 g) Comprimido (Albendazol 600 mg) Polvo (Albendazol 5%, 15%)

Prevención Y Tratamiento De Infestaciones De Ascaridiosis, Tenia y Trematodo

Alpraz (Albendazol y Praziquantel) Comprimido

Prevención Y Tratamiento De Infestaciones De Ascaridiosis, Tenia y Trematodo En Caninos y Felinos.

Oxiclozanida y su Combinación Clozan (Oxiclozanida) Bolo, Suspensión

Prevención Y Tratamiento De Infestaciones De Trematodo

Tetzán (Oxiclozanida y Tetramisol Hcl) Bolo, Suspensión

Prevención Y Tratamiento De Infestaciones De Ascaridiosis y Trematodo

Fluzan (Oxiclozanida y Levamisol Hcl) Bolo, Suspensión

Prevención Y Tratamiento De Infestaciones De Ascaridiosis y Aumento De La Inmunidad

Levamisol Inyección Nemasol Polvo Wormnil

Prevención Y Tratamiento De Infestaciones De Ascaridiosis y Aumento De La Inmunidad.

Fenbendazol Fenzol Comprimido (Fenbendazol 150 mg) Bolo (Fenbendazol 1,5 g) Polvo (Fenbendazol 2,5% p/p)

Prevención Y Tratamiento De Infestaciones De Ascaridiosis y Tenia

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Clase de tratamiento

Agente químico Descripción

Tónicos

Complejo de Vitamina B, Aminoácidos y Extracto hepático Inyección Heptogen Tratamiento de Anorexia, Hepatitis, Debilidad, Convulsiones Neurálgicas Escualidez y Crecimiento Atrofiado.

Levulinato Cálcico Con Vit.B12 y Vit.D3 Inyección Hylactin

Prevención y tratamiento de hipocalcemia, terapia de apoyo en estados de enfermedad (especialmente hipotermia) y tratamiento de fases tempranas de raquitismo.

Suplementos de pienso animal

Minerales Esenciales, Selenio y Vitamina E Bolo Gynolactin Tratamiento de Anestro Causado Por Infertilidad y Reproducción Repetida En Animales Lecheros y Caballos.

Minerales Esenciales, Vitamina E, y Yodo Polvo Hylactin

Infertilidad, Lactación Inapropiada, Inmunidad Disminuida, Crecimiento Atrofiado y Debilidad.

Electrolitos Esenciales Con Vitamina C Polvo Electra -C

Diarrea, Deshidratación, Previo y después del Transporte, Temperaturas Extremas (Altas o Bajas) y otros Estados de estrés.

Pyrenox Plus (Diclofenaco Sódico + Paracetamol) Bolo, Inyección.

Tratamiento de Mastitis, Pirexia, Dolor e Inflamación Post Quirúrgica, Prolapso DelÚtero, Cojera y Artritis.

Tabla 2. Formulaciones Terapéuticas

Producto

Descripción

Acutrim® (fenilpropanolamina)

Comprimidos supresores del apetito una vez al día.

The Baxter® Infusor

Para suministro intravenoso controlado de anticoagulantes, antibióticos, agentes quimioterapéuticos, y otros fármacos ampliamente usados.

Catapres-TTS® (sistema terapéutico transdérmico de clonidina)

Sistema transdérmico para el tratamiento de hipertensión una vez a la semana.

Covera HS3 (clorhidrato de verapamilo)

Comprimidos de liberación prolongada de aparición prolongada para el tratamiento de hipertensión y angina de pecho una vez al día (COER-24).

DynaCirc CR® (isradipina)

Comprimidos de liberación prolongada para el tratamiento de hipertensión una vez al día.

Efidac 24® (maleato de clorfeniramina)

Comprimidos de liberación prolongada para el alivio de síntomas alérgicos una vez al día.

Estraderm® (sistema transdérmico de estradiol)

Sistema transdérmico para tratar ciertos síntomas postmenopáusicos y prevenir la osteoporosis dos veces a la semana

Glucotrol XL® (glipizida)

Comprimidos de liberación prolongada usados como auxiliar para la dieta para el control de hiperglucemia en pacientes con diabetes mellitus no insulinodependientes una vez al día.

IVOMEC SR® Bolo (ivermectina)

Sistema de suministro de Ruminal para el control estacional de parásitos principales internos y externos en ganado vacuno.

Minipress XL® (prazosina)

Comprimidos de liberación prolongada para el tratamiento de hipertensión una vez al día.

NicoDerm® CQ™ (sistema transdérmico de nicotina)

Sistema transdérmico usado como auxiliar para el abandono del tabaco para el alivio de los síntomas de abstinencia de nicotina una vez al día.

Procardia XL® (nifedipina)

Comprimidos de liberación prolongada para el tratamiento de angina e hipertensión una vez al día.

Sudafed® 24 Horas (pseudoefedrina)

Descongestivo nasal para el alivio de catarros, sinusitis, fiebre del heno y otras alergias respiratorias una vez al día.

Transderm-Nitro® (sistema transdérmico de nitroglicerina)

Sistema transdérmico para la prevención de angina de pecho debido a arteriopatía coronaria una vez al día.

Transderm Scop® (sistema transdérmico de escopolamina)

Sistema transdérmico para la prevención de náuseas y vómitos asociados con mareo por movimiento.

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Producto

Descripción

Volmax (albuterol)

Comprimidos de liberación prolongada para el alivio de broncoespasmo en pacientes con enfermedad respiratoria obstructiva reversible.

Actisite®

(clorhidrato de tetraciclina) Fibra periodontal usada como auxiliar para el raspado y pulido para la reducción de la profundidad de las cavidades y el sangrado en la exploración en pacientes con periodontitis adulta.

ALZET®

Bombas osmóticas para investigación en laboratorio.

Amphotec® (complejo de sulfato de colesterilo y anfotericina B para inyección)

AMPHOTEC® es un tratamiento fungicida para aspergilosis invasiva en pacientes donde la alteración renal o la toxicidad inaceptable impide el uso de anfotericina B en dosis eficaces y en pacientes con aspergilosis invasiva donde ha fallado terapia previa con anfotericina B.

BiCitra® (citrato sódico y ácido cítrico)

Agente alcalinizante usado en aquellas afecciones donde es deseable un mantenimiento a largo plazo de orina alcalina.

Ditropan® (clorhidrato de oxibutinina)

Para el alivio de síntomas de inestabilidad de vejiga asociados con vejiga neurogénica no inhibida o neurogénica refleja (es decir, urgencia, frecuencia, filtrado urinario, incontinencia apremiante, disuria).

Ditropan® XL (clorhidrato de oxibutinina)

Es un comprimido de liberación controlada indicado para el tratamiento de vejiga hiperactiva con síntomas de incontinencia urinaria apremiante, urgencia y frecuencia una vez al día.

DOXIL® (inyección liposómica de doxorrubicina HCl)

Duragesic® (sistema transdérmico de fentanilo) CII

Sistema transdérmico de 72 horas para el tratamiento de dolor crónico en pacientes que requieren analgesia continua con opio por dolor que no puede tratarse por medios más leves tales como combinaciones de acetaminofeno-opioides, analgésicos no esteroideos, o PRN dosificados con opioides de corta acción.

Elmiron® (polisulfato sódico de pentosano)

Indicado para el alivio del dolor de vejiga o malestar asociado con cistitis intersticial.

ENACT AirWatch™

Un sistema de control y tratamiento del asma.

Ethyl® (amifostina)

Indicado para reducir la toxicidad renal cumulativa asociada con administración repetida de cisplatino en pacientes con cáncer avanzado de ovario o cáncer pulmonar no microcítico. Indicado para reducir la incidencia de xerostomía moderada a grave en pacientes que experimentan tratamiento de radiación post-operatorio para cáncer de cabeza y cuello, donde el punto de acceso de la radiación incluye una parte sustancial de las glándulas parótidas.

Mycelex® Trociscos (clotrimazol)

Para el tratamiento local de candidiasis orofaríngea. También indicado profilácticamente para reducir la incidencia de candidiasis orofaríngea en pacientes inmuno-comprometidos por afecciones que incluyen quimioterapia, radioterapia, o terapia con esteroides utilizada en el tratamiento de leucemia, tumores sólidos, o trasplante renal.

Neutra-Phos® (fosfato de potasio y sodio)

Un suplemento dietético/nutricional

PolyCitra® -K Solución Oral y PolyCitra® -K Cristales (citrato potásico y ácido cítrico)

Agente alcalinizante útil en aquellas afecciones donde es deseable un mantenimiento a largo plazo de una orina alcalina, tal como en pacientes con ácido úrico y cálculos de cistina del tracto urinario, especialmente cuando la administración de sales de sodio es indeseable o está contraindicada.

PolyCitra® -K Jarabe y LC (tricitratos)

Agente alcalinizante útil en aquellas afecciones donde es deseable un mantenimiento a largo plazo de una orina alcalina, tal como en pacientes con ácido úrico y cálculos de cistina del tracto urinario.

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Variante

imagen89 Mutación Variante imagen90 Mutación Variante imagen91 Mutación Variante Mutación

8

L 192 F 41 S 102 A 74 S 102 Y 107 H 263 P

9

Q 377 R 42 I 174 F 75 S 218 I 108 A 274 V

10

V 422 M 43 G 171 S 76 A 232 P 109 A 274 L

11

L 157 P 44 N 148 M 77 W 265 L 110 A 274 F

12

I 107 H 45 Q 137 V 78 N 266 P 111 S 389 V

13

I 108 R 46 P 145 L 79 L 167 S 112 G 395 T

14

Q 309 P 47 I 108 Y 80 L 216 T 113 G 395 Q

15

I 108 A 48 E 113 P 81 P 217 L 114 G 395 L

16

I 108 S 49 F 147 Y 82 L 244 S 115 G 395 I

17

I 107 P 50 S 173 H 83 P 269 L 116 G 395 E

18

C 155 Y 51 T 163 P 84 T 48 F 117 S 389 H

19

I 108 Q 52 N 148 R 85 T 48 W 118 I 427 G

20

A 236 T 53 S 173 V 86 T 48 M 119 I 427 S

21

S 208 P 54 A 248 L 87 T 48 H 120 A 429 P

22

A 109 V 55 A 248 T 88 T 48 K 121 P 343 E

23

G 171 M 56 Q 247 H 89 T 48 Y 122 P 343 V

24

S 173 G 57 A 236 H 90 T 48 V 123 P 343 R

25

V 162 L 58 L 269 I 91 M 51 A 124 P 343 L

26

D 139 Y 59 S 197 G 92 M 51 L 125 P 343 V

27

L 146 R 60 L 235 I 93 T 48 I 126 N 348 K

28

Q 137 Y 61 S 211 H 94 M 51 G 127 P 343 I

29

Q 137 L 62 T 282 H 95 T 48 L 128 N 348 W

30

L 146 T 63 Q 246 W 96 L 50 W 129 P 343 N

31

K 151 P 64 G 257 R 97 G 67 A 130 L 379 V

32

N 148 K 65 L 269 T 98 Y 79 W 131 Q 381 S

33

K 151 H 66 G 257 A 99 Y 79 N 132 L 379 S

Tabla 5. Nombres de las variantes y mutaciones de los resultados descubiertos a partir de la exploración de GSSM que presentan mejoras de la degradación en FGS.

5 Un número significativo de las variantes de GSSM cumplieron los requisitos de FGS (degradación rápida < 10% después de la supervivencia en FGS de 10 min), pero se quedan cortos en las propiedades de termotolerancia (supervivencia < 75% después de un tratamiento térmico de 30 min a 65°C). Los mutantes de degradación lenta y media cumplieron los requisitos de termotolerancia, pero no los requisitos de FGS. A partir de la exploración de GSSM, únicamente la Variante 56 (Q247H) cumplió tanto con el FGS como con las propiedades de termotolerancia.

10

Clasificación

Mutación TT a 65C % FGS % Valor de adecuación Clasificación Mutación TT a 65C % FGS % Valor de adecuación

1

Q247H 76 3 0,73 29 G257A 36 3 0,32

2

I427T 99 37 0,62 30 H263P 60 29 0,32

3

Q246W 76 23 0,53 31 Y79S 67 36 0,31

4

L157P 46 2 0,44 32 Y79N 68 38 0,30

5

Q377R 47 3 0,44 33 T48F 50 21 0,29

6

T48M 66 24 0,42 34 L296T 62 34 0,29

98

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imagen97

Nombre del oligo

Secuencia del oligo -5' -3' imagen98

imagen99

imagen100 imagen101

L157P-D164_R

imagen102 SEC ID No: 6

Q247H_R

GAGATATTTCTCCTGCAACATGCACAGGGAATGCCGGAGCC SEC ID No: 7

Q275H_R

TGCTAAGTTTGCATAACGCGCATTTTGATTTGCTACAACGCAC SEC ID No: 8

Q275V_R

TGCTAAGTTTGCATAACGCGGTGTTTGATTTGCTACAACGCAC SEC ID No: 9

I427T_R

AATCGTGAATGAAGCACGCACACCGGCGTGCAGTTTGAGAT SEC ID No: 10

Tabla 10. Oligos utilizados en la Biblioteca A

Nombre del oligo

Secuencia del oligo -5' -3' imagen103

T48M_F

imagen104 SEC ID No: 11

Y79H_F

imagen105 SEC ID No: 12

L157P_F

imagen106 SEC ID No: 13

G179R_F

imagen107 SEC ID No: 14

C226D_F

imagen108 SEC ID No: 15

Q246W_R

imagen109 SEC ID No: 16

Q246W+Q247H_R

imagen110 SEC ID No: 17

Q247H_R

imagen111 SEC ID No: 18

Q275V_R

imagen112 SEC ID No: 19

T349Y_R

imagen113 SEC ID No: 20

105

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Claims (1)

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