KR100790918B1 - 에스케리챠 콜리 피타아제의 부위-지향성 돌연변이유발 - Google Patents

에스케리챠 콜리 피타아제의 부위-지향성 돌연변이유발 Download PDF

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Abstract

본 발명은 개선된 효소 특성을 갖는 분리된 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제에 관한 것이다. 상기 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제 조성물은 동물 사료 조성물에 특히 유용하다.

Description

에스케리챠 콜리 피타아제의 부위-지향성 돌연변이유발{SITE-DIRECTED MUTAGENESIS OF ESCHERICHIA COLI PHYTASE}
본 출원은 1999. 11. 18.자로 출원된 미국 가출원 제60/166,179호의 이익을 청구한다.
발명의 분야
본 발명은 에스케리챠 콜리(Escherichia coli) 포스파타아제/피타아제의 부위-지향성 돌연변이유발에 관한 것이다.
발명의 배경
모노에스테르 포스파타아제의 특정 그룹인 피타아제는 곡물 식품 또는 사료에 있어서 포스페이트("P")의 주 축적 형태인 피테이트(미오-이노시톨 헥소포스페이트)로부터 포스페이트의 방출을 개시시키기 위하여 필요하다. 문헌[Reddy, N.R. 등, "Phytates in Legumes and Cereals", Advances in Food Research, 28:1 (1982)]을 참조하라. 인간 뿐만 아니라, 돼지 및 가금과 같은 단순 위장(simple-stomached) 동물은 그들의 위장관에 적은 피타아제 활성을 가지기 때문에, 섭취된 피테이트 P의 거의 모두는 소화되지 않는다. 이는, 그러한 동물들의 규정식에 있어서 비싸고 재생할 수 없는 영양소인 무기 P의 보충에 대한 필요를 낳는다. 더욱 바람직하지 않게, 그러한 동물들의 배설물(manure)을 통하여 배출된 이용되지 않은 피타아제-P는 P의 환경 오염을 초래한다. 문헌[Cromwell, G.L. 등, "P-A Key Essential Nutrient, Yet a Possible Major Pollutant -- Its Central Role in Animal Nutrition", Biotechnology In the Feed Industry; Proceedings Alltech 7th Annual Symposium, p. 133 (1991)]을 참조하라. 또한, 피테이트는 아연과 같은 필수적 미량 성분과 킬레이트를 형성하며, 피테이트의 제거 없이 주로 식물성 식품을 섭취하는 어린이들에게서 발육 지연 및 지능 발달 지연과 같은 영양 결핍을 초래한다.
아스페르길루스 니거(Aspergillus niger) NRRL3135로부터 두 개의 피타아제, phyA 및 phyB를 클로닝하고 시퀀싱하였다. 문헌[Ehrlich, K.C. 등, "Identification and Cloning of a Second Phytase Gene (phys) from Aspergillus niger (ficuum)", Biochem. Biophys. Res. Commun., 195:53-57 (1993); Piddington, C.S. 등, "The Cloning and Sequencing of the Genes Encoding Phytase (phy) and pH 2.5-optimum Acid Phosphatase (aph) from Aspergillus niger var. awamori", Gene, 133:56-62 (1993)]을 참조하라. 최근에, 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus) 및 마이셀리오프토라 테르모필라 (Myceliophthora thermophila)[Mitchell 등, "The Phytase Subfamily of Histidine Acid Phosphatase: Isolation of Genes for Two Novel Phytases From the Fungi Aspergillus terreus and Myceliophthora thermophila", Microbiology 143:245-52, (1997)], 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus) [Pasamontes 등, "Gene Cloning, Purification, and Characterization of a Heat-Stable Phytase from the Fungus Aspergillus fumigatus" Appl. Environ. Microbiol., 63:1696-700 (1997)], 에머리셀라 니둘란스(Emericella nidulans) 및 탈라로마이세스 테르모필루스(Talaromyces thermophilus)[Pasamontes 등, "Cloning of the Phytase from Emericella nidulans and the Thermophilic Fungus Talaromyces thermophilus", Biochim. Biophys. Acta., 1353:217-23 (1997)] 및 옥수수[Maugenest 등, "Cloning and Characterization of a cDNA Encoding a Maize Seedling Phytase", Biochem. J. 322:511-17 (1997)]로부터 신규한 피타아제 유전자를 분리하였다.
엔테로박터(Enterobacter) sp. 4 [Yoon 등, "Isolation and Identification of Phytase-Producing Bacterium, Enterobacter sp. 4, and Enzymatic Properties of Phytase Enzyme.", Enzyme and Microbial Technology 18:449-54 (1996)], 클레브시엘라 테르리겐나(Klebsiella terrigena)[Greiner 등, "Purification and Characterization of a Phytase from Klebsiella terrigena", Arch. Biochem. Biophys. 341:201-06 (1997)], 및 바실루스(Bacillus) sp. DS11 [Kim 등, "Purification and Properties of a Thermostable Phytase from Bacillus sp. DS11", Enzyme and Microbial Technology 22:2-7 (1998)]로부터 다양한 유형의 피타아제 효소를 분리 및/또는 정제하였다. 이들 효소의 성질이 연구되었다. 또한, 아스페르길루스 피큠(Aspergillus ficuum)에서 유래한 phyA의 결정 구조가 보고되었다[Kostrewa 등, "Crystal Structure of Phytase from Aspergillus ficuum at 2.5 A Resolution", Nature Structure Biology 4:185-90 (1997)].
하팅그스벨트(Hartingsveldt) 등은 phyA 유전자를 A. 니거(niger) 내로 도입하여, 야생형과 비교할 때 피타아제 활성을 10 배 증가시켰다["Cloning, Characterization and Overexpression of the Phytase-Encoding Gene (phyA) of Aspergillus Niger", Gene 127:87-94 (1993)]. 돼지 및 가금을 위한 규정식에 있어서 이들 보충적 미생물 피타아제 공급원은 피테이트-P 및 아연의 이용 개선에 효과적인 것으로 밝혀졌다[Simons 등, "Improvement of Phosphorus Availability By Microbial Phytase in Broilers and Pigs", Br. J. Nutr., 64:525 (1990); Lei, X. G. 등, "Supplementing Corn-Soybean Meal Diets With Microbial Phytase Linearly Improves Phytate P Utilization by Weaning Pigs", J. Anim. Sci., 71:3359 (1993); Lei, X.G. 등, "Supplementing Corn-Soybean Meal Diets With Microbial Phytase Maximizes Phytate P Utilization by Weaning Pigs", J. Anim. Sci., 71:3368 (1993); Cromwell, G.L. 등, "P- A Key Essential Nutrient, Yet a Possible Major Pollutant -- Its Central Role in Animal Nutrition", Biotechnology In the Feed Industry; Proceedings Alltech 7th Annual Symposium, p. 133 (1991)]. 그러나, 한정된 시판 피타아제의 공급 비용 및 사료 펠릿화 과정에서 가열할 때의 그 불안정성은 동물 산업에 있어서의 그 실질적인 사용을 배제한다[Jongbloed, A.W. 등, "Effect of Pelleting Mixed Feeds on Phytase Activity and Apparent Absorbability of Phosphorus and Calcium in Pigs", Animal Feed Science and Technology, 28;233-42 (1990)]. 또한, A. 니거로부터 생산한 피타아제는 아마도 인간 식품 제조를 위한 가장 안정한 공급원이 아닐 것이다.
따라서, 식품 및 사료 산업 분야의 용도를 위하여 피타아제 생산을 개선시킬 필요가 있다.
발명의 요약
본 발명은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형 에스케리챠 콜리 산 포스파타아제/피타아제에 다수의 아미노산 치환을 도입시킴으로써 생산한 분리된 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제에 관한 것이다. 상기 아미노산 치환들은 서열 번호 1의 200, 207 및 211 위치에 도입된다. 또한, 본 발명은 200 및 210 위치에 있는 Cys 아미노산 잔기 사이의 디설파이드 결합 형성을 파괴하는 1 이상의 아미노산 치환에 의하여, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형 산 포스파타아제/피타아제와 상이하게 된, 분리된 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제에 관한 것이다. 본 발명의 상기 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제는 동물 사료 조성물에 유용하다.
또한, 본 발명은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형 에스케리챠 콜리 산 포스파타아제/피타아제의 효소 특성(enzymatic properties)을 개선시키는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 서열 번호 1의 200, 207 및 211 위치에 아미노산 치환을 도입시킴으로써 야생형 산 포스파타아제/피타아제의 아미노산 서열을 변경시키는 단계를 포함한다. 상기 방법의 다른 실시 태양은 200 및 210 위치에 있는 Cys 아미노산 잔기들 사이의 디설파이드 결합 형성을 파괴하는 1 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 서열 번호 1의 야생형 산 포스파타아제/피타아제의 아미노 산 서열을 변경시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 실시 양태는 본 발명의 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제를 암호하는 분리된 DNA 분자에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 상기 DNA 분자를 함유하는 숙주 세포 및 재조합 DNA 발현 시스템을 공개한다. 이러한 구성은 본 발명의 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제를 재조합 방식으로 생산하는데 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 다양한 공급원의 유기체로부터의 돌연변이 산 포스파타아제 /피타아제의 유도를 설계하여 열안정성 및 촉매 효율 등의 효소 특성을 향상시킨 돌연변이체를 생산하는데 광범위하게 적용할 수 있는 기본적 분자 방법을 제공한다. 이러한 방법은 야생형 효소의 유전자를 동정하고 분리하는 단계, 및 그 효소의 기능 및/또는 안정성을 향상시키기 위한 부위-지향성 돌연변이유발의 대상으로 그러한 유전자를 사용하는 단계를 포함한다. 본 발명의 한 실시 양태는 야생형 효소에 N-글리코실화 부위를 첨가하기 위하여, 및/또는 상기 효소의 물리 화학적 성질을 변경시키기 위하여(예를 들어, 그 효소의 실효 양전하를 증가시키기 위하여) 그 야생형 유전자에 표적화된 돌연변이를 만드는데 있어서, 부위-지향성 돌연변이유발 방법을 이용하는 것이다. 또한, 최종 단백질 생성물에서 발견되는 특정 디설파이드 결합을 제거하여 열안정성 및 촉매 기능성을 향상시키기 위하여, 상기 야생형 유전자에 표적화된 돌연변이를 만들 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 야생형 에스케리챠 콜리 산 포스파타아제/피타아제의 부위-지향성 돌연변이유발에 의하여 생성된 분리된 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제에 관한 것이다. 하나의 실시 태양에 따르면, 야생형 에스케리챠 콜리 산 포스파타아제 /피타아제에 다수의 표적화된 아미노산 치환을 도입함으로써 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제를 생산한다. 다른 실시 태양에 있어서, 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제의 Cys 아미노산 잔기들 사이의 디설파이드 결합 형성을 파괴하기 위하여 야생형 산 포스파타아제/피타아제 내로 1 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써, 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제를 생산한다. 야생형 산 포스파타아제/피타아제는 하기 서열 번호 1에 상응하는 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112002015236395-pct00001
Figure 112002015236395-pct00002
서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 상기 야생형 산 포스파타아제/피타아제는 하기 서열 번호 2의 뉴클레오티드 서열의 염기 187-1486의 코딩 서열에 의하여 암호된다:
Figure 112002015236395-pct00003
Figure 112002015236395-pct00004
상기 산 포스파타아제/피타아제는 E. coli.로부터 유도한다.
본 발명의 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제를 생산하는데 있어서, 서열 번호 1의 200, 207 및 211 위치에 아미노산 치환을 도입한다. 하기와 같이, 서열 번호 1의 산 포스파타아제/피타아제에 아미노산 치환을 도입하는 것이 특히 바람직하다: 200 위치에는 Cys 아미노산 잔기 대신에 Asn 아미노산 잔기를 도입; 207 위치에는 Asp 아미노산 잔기 대신에 Asn 아미노산 잔기를 도입; 그리고 211 위치에는 Ser 아미노산 잔기 대신에 Asn 아미노산 잔기를 도입. 결국, 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제는 하기와 같은 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는다(아미노산 치환에는 하선을 그었고, 진하게 나타내었다):
Figure 112002015236395-pct00005
Figure 112002015236395-pct00006
서열 번호 3의 상기 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제는 탈글리코실화 후에 분자량이 45 내지 48 kDa 이며, 특이적 피타아제 활성이 63 U/mg 이다. 서열 번호 3의 아미노산 21-432의 아미노산 서열은 성숙 단백질을 나타낸다.
본 발명의 다른 실시 양태는 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제에서 디설파이드 결합 형성을 파괴하기 위하여 서열 번호 1의 아미노산 서열 내에 1 이상의 아미노산 치환을 삽입함으로써, 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제를 생산하는 것을 포함한다. 특히, 서열 번호 1의 200 및/또는 210 위치에 있는 Cys 아미노산 잔기를 표적 치환함으로써 이들 잔기 사이의 디설파이드 결합을 제거할 수 있다.
서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 상기 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제는 하기 서열 번호 4의 뉴클레오티드 서열의 염기 187-1486의 코딩 서열에 의하여 암호된다(200, 207 및 211 아미노산 위치에 치환된 Asn 잔기에 대한 코돈은 하선을 그었고, 진하게 나타내었다):
Figure 112002015236395-pct00007
Figure 112002015236395-pct00008
본 발명의 한 실시 태양은 당업계에 주지된 재조합 DNA 기술을 이용하여 발현 벡터 시스템 내로 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제 유전자를 삽입하는 것을 포함한다. 이를 통하여 숙주 세포내에서 상기 유전자를 발현시킬 수 있으며, 동물 사료와 같은 조성물에 사용하기 위한 산 포스파타아제/피타아제의 생산 및 정제가 가능하게 된다.
돌연변이 산 포스파타아제/피타아제 유전자의 DNA는 DNA 하이브리드화 기술을 이용하여 분리 및/또는 동정할 수 있다. 본 발명의 핵산(DNA 또는 RNA) 프로브는 엄격한 조건하에서 상보성 핵산으로 하이브리드화될 것이다. 덜 엄격한 조건을 선택할 수도 있다. 일반적으로, 엄격한 조건은 규정 이온 강도 및 pH에서 특이적 서열에 대한 열융점(Tm) 이하인 약 50 ℃로 선택한다. 상기 Tm은 표적 서열의 50 %가 완전하게 매치된 프로브에 하이브리드화되는 온도(규정 이온 강도 및 pH 하에서)이다. 상기 Tm은 용액 조건 및 상기 프로브의 염기 조성에 따라 달라지며, DNA:RNA 하이브리드화의 경우, 하기 방정식을 이용하여 계산할 수 있다:
Tm = 79.8 ℃ + (18.5 x Log[Na+])
+ (58.4 ℃ x %[G+C])
- (820/ 듀플렉스 중의 #bp)
- (0.5 x % 포름아미드)
문헌[Promega Protocols and Applications Guide, 2판, Promega Corp., Madison, WI (1991)]을 참조하라. 상기 문헌은 본 명세서에 참고 인용된다. 또한, 예를 들어, 단백질-함유 용액을 이용한 멤브레인의 차단, 하이브리드화 완충액에의 이종성 RNA, DNA 및 SDS의 첨가, 및 RNase로의 처리와 같은 다수의 공지된 기술 중 임의의 하나를 이용하여, 비특이적 결합을 조절할 수 있다.
일반적으로, 핵산 하이브리드화 분석 또는 유전자 증폭 검출 과정에 대한 적당한 엄격한 조건은 전술한 문헌에 언급된 바와 같거나, 기타 문헌[Southern, "Detection of Specific Sequences Among DNA Fragments Separated by Gel Electrophoresis", J. Mol. Biol., 98:503-17 (1975), 이 문헌은 본 명세서에 참고 인용됨]에서 확인된 바와 같다. 예를 들어, 42 ℃에서, 5X SSPE 및 50 % 포름아미드를 사용하여 하이브리드화시키고, 50 ℃에서 0.5X SSPE로 세척하는 하이브리드화 조건을 이용하며, 20 이상의 염기, 바람직하게 25 이상의 염기 또는 더욱 바람직하게 30 이상의 염기를 함유하는 핵산 프로브를 사용할 수 있다. 예를 들어, 나트륨 농도를 증가시킨 적당하게 선택된 세척 매질(예, 1X SSPE, 2X SSPE, 5X SSPE 등)을 사용하여 55 ℃에서 또는 더욱 바람직하게 60 ℃에서 세척함으로써 엄격성을 증가 시킬 수 있다. 교차-하이브리드화의 문제가 남아있다면, 예를 들어, 65 ℃, 70 ℃, 75 ℃ 또는 80 ℃에서 세척함으로써 더욱 높은 온도를 선택할 수도 있다. 하이브리드화 조건을 조절함으로써, 디폴트 셋팅의 TBLASTN 프로그램[Altschul, S.F. 등, "Basic Local Alignment Search Tool", J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990), 이 문헌은 본 명세서에 참고 인용됨]에 의한 측정시, 소정 정도의 상동성(즉, 80 % 이상, 85 % 이상, 90 % 이상 또는 95 % 이상)을 갖는 서열을 동정할 수 있다.
본 발명의 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제를 검출하는 바람직한 방법으로는 문헌[Barany, "Genetic Disease Detection and DNA Amplification Using Cloned Thermostable Ligase", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(1):189-193 (1991), 이 문헌은 본 명세서에 참고 인용됨]에 기재되어 있는 바와 같은 리가아제 사슬 반응(LCR) 및 리가아제 검출 반응(LDR)과 같은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 DNA 분자는, 정확한 해독틀 및 적당한 배향으로 발현 시스템 내에 그 DNA 분자를 도입함으로써 임의의 원핵 또는 진핵 발현 시스템 내에서 발현시킬 수 있다. 다양한 숙주-벡터 시스템을 이용하여 상기 단백질-암호 서열을 발현시킬 수 있다. 바람직한 벡터로는 바이러스 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 올리고뉴클레오티드 등이 있다. 우선, 상기 벡터 시스템은 사용되는 숙주 세포와 상용성이 있어야만 한다. 숙주-벡터 시스템으로는 하기의 것들이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다: 박테리오파아지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA로 형질전환시킨 박테리아; 이스트 벡터를 함유하는 이스트와 같은 미생물; 바이러스(예, 백시니 아 바이러스, 아데노바이러스 등)로 감염시킨 포유동물 세포 시스템; 바이러스(예, 바큘로바이러스)로 감염시킨 곤충 세포 시스템; 및 박테리아로 감염시킨 식물 세포. 상기 벡터들의 발현 성분은 그들의 강도 및 특이성에 따라 달라진다. 사용되는 숙주-벡터 시스템에 따라, 다수의 적당한 전사 및 번역 성분 중 하나를 사용할 수 있다. 예를 들어, 전사 인핸서 성분으로 본 발명에 따른 DNA 분자를 프레임 내 스플라이싱한다.
본 발명의 DNA 분자를 발현시키기 위한 바람직한 숙주로는 이스트 또는 사상균 종을 비롯한 진균류 세포가 포함되며, 본 발명에 따른 숙주 세포로서 사용할 수 있다. 바람직한 이스트 숙주 세포로는 사카로마이세스 세레비시아에 (Saccharomyces cerevisiae)의 상이한 균주가 있다. 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 토룰라스포라(Torulaspora) 및 스키조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces)와 같은 기타 이스트를 사용할 수도 있다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 단백질을 과발현시키는데 사용하는 이스트 균주는 사카로마이세스 세레비시아에이다. 바람직한 사상균 숙주 세포로는 아스페르길루스 및 뉴로스포라 (Neurospora)가 있다. 아스페르길루스의 더욱 바람직한 균주는 아스페르길루스 니거이다.
본 발명의 다른 바람직한 실시 태양에 있어서, 이스트 균주는 메틸로트로프 이스트 균주(methylotrophic yeast strain)이다. 메틸로트로프 이스트는 알콜 옥시다아제 발현을 위한 유전자를 함유하며, 세포 기능을 유지시키기 위하여 필요한 에너지 공급원의 생산을 위한 탄소원으로서 메탄올을 이용할 수 있는 이스트 속의 것이다. 전형적인 메틸로트로프 이스트로는 피키아(Pichia), 한세뉼라 (Hansenula), 토룰롭시스(Torulopsis), 칸디다(Candida) 및 카르윈스키아 (Karwinskia) 속의 일원이 있다. 이들 이스트 속은 하나의 탄소원으로서 메탄올을 사용할 수 있다. 더욱 바람직한 실시 태양에 있어서, 메틸로트로프 이스트 균주는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)이다.
몇 가지 방법으로 정제된 단백질을 수득할 수 있다. 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드는 바람직하게 통상의 기술에 의하여 정제된 형태로 생산한다(바람직하게 약 80 % 이상의 순도, 더욱 바람직하게 90 % 이상의 순도). 통상, 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드는 재조합 숙주 세포의 성장 배지 내로 분비시킨다. 대안적으로, 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드를 생산하나, 성장 배지 내로 분비시키지 않을 수 있다. 그러한 경우에 있어서, 단백질 분리를 위하여, 재조합 플라스미드를 보유하는 숙주 세포를 증식시키고, 초음파 처리, 열처리 또는 화학 처리를 통하여 세포용해시킨 후, 호모지네이트를 원심분리하여 세포 데브리를 제거한다. 그 다음, 상청액을 연속 암모늄 설페이트 침전시킨다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 단백질을 함유하는 분획을 적당한 크기의 덱스트란 또는 폴리아크릴아미드 컬럼 내에서 겔 여과시켜 단백질을 분리한다. 필요한 경우에, HPLC로 단백질 분획을 추가로 정제할 수 있다.
또한, 본 발명은 피타아제 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드를 암호하는 이종성 유전자를 갖는 이스트 균주를 제공한다. 상기 이종성 유전자는 이스트 내에서 피타아제를 발현시킬 수 있는 프로모터에 기능적으로 결합되어야 한다.
본 발명의 또 다른 실시 양태는 이스트 내에서 피타아제를 발현시키기 위한 벡터이다. 상기 벡터는 피타아제 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드를 암호하는 비-이스트 유기체에서 유래한 유전자를 보유한다. 상기 피타아제 유전자는, 이스트의 게놈 내로 인테그레이트되거나 자발적으로 복제되는 임의의 벡터 내로 클로닝할 수 있다. 자발적 복제 플라스미드, 예를 들어, YEp 플라스미드의 카피수는 고 카피수일 수 있으나, 그들의 유사분열 안정성은 불충분할 수 있다[Bitter 등, "Expression and Secretion Vectors for Yeast", Meth. Enzymol. 153:516-44(1987), 이 문헌은 본 명세서에 참고 인용됨]. 그들은 E. coli에서의 복제에 역할을 하는 E. coli 서열 및 자발적 복제를 초래하는 2뮤-플라스미드를 함유할 수 있다. 상기 벡터는 바람직하게 이스트 형질전환체의 선택을 위한 유전자 마커 및 E. coli에서의 선택을 위한 항생제 내성 유전자를 함유한다. ARS 및 CEN 서열을 함유하는 에피솜성 벡터는 세포 당 단일 카피로 발생하며, 그들은 YEp 벡터에 비하여 더욱 안정하다. 이스트 게놈 내의 단일 또는 다중 카피로서 DNA 단편을 인테그레이트시키는 경우에, 인테그레이티브 벡터를 사용한다. 이러한 경우에, 재조합 DNA는 안정하며, 선택이 필요하지 않다. 문헌들[Struhl 등, "High-Frequency Transformation of Yeast: Autonomous Replication of Hybrid DNA Molecules", Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 76:1035-39 (1979); Powels 등, Cloning Vectors, I-IV, et seq. Elsevier, (1985); 및 Sakai 등, "Enhanced Secretion of Human Nerve Growth Factor from Saccharomyces Cerevisiae Using an Advanced δ-Integration System", Biotechnology 9:1382-85 (1991)]을 참조하라. 이들 문헌은 본 명세서에 참고 인용된다. 일부 벡터는 선택된 숙주 세포에서 기능하는 복제 개시점을 갖는다. 적당한 복제 개시점은 2 μ, ARS 1 및 25 μM를 포함한다. 상기 벡터는 선택 마커, 및 프로모터 서열 및 융합 유전자 서열의 삽입을 위한 엔도뉴클레아제 제한 부위를 갖는다. 상기 벡터는 제한 부위의 제거 또는 추가, 또는 기타 불필요한 뉴클레오티드의 제거를 통하여 개질시킬 수 있다.
피타아제 유전자는 임의의 프로모터의 제어하에 둘 수 있다[Stetler 등, "Secretion of Active, Full- and Half-Length Human Secretory Leukocyte Protease Inhibitor by Saccharomyces cerevisiae", Biotechnology 7:55-60, (1989), 이는 본 명세서에 참고 인용됨]. 구성형 또는 조절형 이스트 프로모터를 선택할 수 있다. 그 중에서 이스트 벡터를 위한 적당한 프로모터 서열로는 메탈로티오네인, 3-포스포글리세레이트 키나아제[Hitzeman 등, J. Biol. Chem. 255:2073 (1980), 이 문헌은 본 명세서에 참고 인용됨) 또는 기타 글리콜라이트 효소[Hess 등, J. Adv. Enzyme Reg. 7:149 (1968); 및 Holland 등, Biochem. 17:4900, (1978), 이 문헌은 본 명세서에 참고 인용됨], 예를 들어, 에놀라아제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나아제, 헥소키나아제, 피루베이트 디카르복실라아제, 포스포프룩토키나아제, 글루코스-6-포스페이트 아이소머라아제, 3-포스포글리세레이트 뮤타아제, 피루베이트 키나아제, 트리오세포스페이트 아이소머라아제, 포스포글루코스 아이소머라아제 및 글루코키나아제 등이 있다. 이스트 발현에서 사용하기 위한 기타 적당한 벡터 및 프로모터들은 EP A-73,657(Hitzeman, 본 명세서에 참고 인용됨)에 추가로 기재되어 있다. 기타 대안은 문헌[Russell 등, J. Biol. Chem. 258:2674 (1982) 및 Beier 등, Nature 300:724 (1982), 이 문헌들은 본 명세서에 참고 인용됨]에 기재되어 있는 글루코스-억제성 ADH2 프로모터이다.
구성형 또는 조절형 이스트 프로모터를 선택할 수 있다. 예를 들어, 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 유전자, 글리콜라이트 효소를 암호하는 기타 유전자, 및 알파-인자 유전자의 강력한 프로모터가 구성형이다. 구성형 프로모터를 사용하는 경우에, 세포 성장 중에 그 생성물이 합성된다. ADH2 프로모터는 에탄올 및 글루코스로 조절하고, GAL-1-10 및 GAL7 프로모터는 갈락토스 및 글루코스로 조절하며, PH05 프로모터는 포스페이트로 조절하고, 메탈로티오닌 프로모터는 구리로 조절한다. HSP150 프로모터가 속하는 열 쇼크 프로모터는 온도로 조절한다. 하이브리드 프로모터를 사용할 수도 있다. 소정 목적 생성물의 연속적 발현이 숙주 세포에게 유해한 경우에, 조절형 프로모터를 사용한다. 이스트 프로모터 대신에, T7 프로모터와 같은 강력한 원핵 프로모터를 사용할 수 있으나, 이 경우에 각각의 폴리머라아제를 암호하는 유전자로 상기 이스트 균주를 형질전환시켜야 한다. 전사 종결을 위하여, HSP 150 터미네이터 또는 기타 기능성 터미네이터를 사용한다. 이제, 프로모터 및 터미네이터를 조절 성분이라 부른다. 본 발명은 어떠한 특정 벡터, 프로모터 또는 터미네이터에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 벡터는 선택 마커를 보유할 수 있다. 선택 마커는 종종 트립토판 또는 히스티딘 결핍 돌연변이체와 같은 주지된 특성의 대사 결핍이 있는 이스트 균주를 보충할 수 있는 유전자 또는 항생제 내성 유전자이다. 바람직한 선택 마커로는 URA3, LEU2, HIS3, TRP1, HIS4, ARG4 또는 항생제 내성 유전자가 있다.
또한, 상기 벡터는 박테리아 세포 내에서 복제될 수 있는 복제 개시점을 가질 수 있다. 박테리아 균주 내에서의 벡터의 조작이 더욱 효율적이다. 바람직한 박테리아 복제 개시점은 ColE1, Ori 또는 OriT이다.
피타아제 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드는 세포에 의해 성장 배지 내로 분비되는 것이 바람직하다. 이는 생성물의 고농도 발현 및 용이한 분리를 가능하게 한다. 피타아제 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드는 세포에서 유리된 단백질을 검출할 수 있는 신호 서열에 커플링된다. 상기 신호 서열은 그 단백질에서 개열된 것이 바람직하다.
이스트로부터 또는 피타아제 유전자로부터 또는 다른 공급원으로부터 유래된 리더(leader) 서열을 사용하여 발현된 피타아제 효소를 배지로 분비하는 것을 도울 수 있다. 본 발명은 임의의 특정 형태 리더 서열 또는 신호 펩티드로 제한되지 않는다.
적당한 리더 서열은 이스트 알파 인자 리더 서열을 포함하는데, 상기 리더 서열은 피타아제의 분비를 지시하는 데 사용될 수 있다. 상기 알파 인자 리더 서열은 종종 프로모터 서열과 구조 유전자 서열 사이에 삽입된다(Kurjan et al., Cell 30:933.(1982); Bitter et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:5330,(1984);미국 특허 제4,546,082호; 및 유럽 공개 특허 출원 제324,274호, 이들은 본 명세서에 참고 인용됨). 다른 적당한 리더 서열은 에스.세레비시아에 MF 알파 1(알파 인자)이고 이것은 64개 아미노산의 "리더" 또는 프로펩티드가 후속되는 19개 아미노산 신호 또는 프레펩티드(prepeptide) 를 포함하고, (LysArg(Asp/Glu,Ala)2-3 알파인자)4가 후속되는 3개의 N-결합된 글리코실화 부위를 포함하는 165개 아미노산의 프레프로(prepro) 형태로서 합성된다(Kurjan et al., Cell 30:933-43(1982), 본 명세서에 참고 인용됨). 프레프로 MF 알파 1의 신호-리더 부분은 에스.세리비시아에에서 이종 단백질의 합성 및 분비를 달성하는 데 광범위하게 사용되어 왔다. 이스트에 이종성인 신호/리더 펩티드의 용도는 미국 특허 제4,546,082호; 유럽 특허 출원 제116,201호, 123,294호, 123,544호, 163,529호 및 123,289호; 독일 특허 출원 제3614/83호에 공지되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참고 인용된다. 유럽 특허 출원 제123,289호(본 명세서에 참고 인용됨)는 에스.세레비시아에 a-인자 전구체의 사용을 개시하고 있는 한편, WO84/01153호(본 명세서에 참고 인용됨)는 사카로마이세스 세레비시아에 인버타아제(invertase) 신호 펩티드의 사용을 개시하고 있으며, 독일 특허 출원 DK 3614/83호(본 명세서에 참고 인용됨)는 외부 단백질의 분비를 위한 사카로마이세스 세레비시아에 PH05 신호 펩티드의 사용을 개시하고 있다.
사카로마이세스 세레비시아에(MF 알파 1 또는 MF 알파 2)에서 유래하는 알파 인자 신호-리더는 이스트에서 발현된 이종 단백질의 분비 공정에서 사용될 수도 있다(미국 특허 제4,546,082호; 유럽 특허 출원 제16,201호, 123,294호, 123,544호 및 163,529호, 본 명세서에 참고 인용됨). 소정 단백질에 대한 유전자의 5' 말단에 에스.세레비시아에 MF 알파 1 신호/리더 서열을 암호하는 DNA 서열을 융합함에 의한 소정 단백질의 분비 및 처리를 개시하였다. 이스트에서 발현된 이종성 단백질의 분비를 제공하기 위한 마우스 타액 아밀라아제 신호 펩티드(또는 이들의 돌연변이 체)의 용도는 PCT 공개 번호 WO89/02463 및 WO90/10075호에 개시되어 있으며 이것은 본 명세서에 참고 인용되어 있다.
미국 특허 제5,726,038호는 이스트 아스파르트 프로테아제 3의 신호 펩티드의 용도에 대하여 개시하고 있으며, 이것은 이스트에서 발현된 단백질의 분비를 개선시킬 수 있다. 이스트 숙주로부터 재조합 폴리펩티드의 분비를 촉진하는 데 적절한 다른 리더 서열은 당업자에게 공지되어 있다. 리더 서열은 1 이상의 제한 부위를 가지기 위해 3' 말단 가까이에서 변형될 수 있다. 이것은 리더 서열과 구조 유전자의 융합을 촉진할 것이다.
이스트 형질전환 프로토콜은 당업자에게 공지되어 있다. 상기 프로토콜의 하나는 문헌[Hinnen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:1929(1978)]에 기재되어 있으며, 이는 본 명세서에 참고 인용되어 있다. Hinnen et al.의 프로토콜은 선택 배지에서 Trp 형질전환용으로 선택하며, 상기 선택 배지는 0.67 %의 이스트 질소 염기, 0.5 %의 카사미노산, 2% 의 글루코오스, 10 ㎍/㎖의 아데닌 및 20 ㎍/㎖의 우라실로 구성된다.
유전자는 안정한 발현 벡터, 인공 염색체에서 유지되거나 또는 이스트 숙주 세포 염색체로의 인테그레이트에 의해 유지될 수 있다. 염색체로의 인테그레이트는 이스트 염색체로 재조합할 벡터로 피타아제 유전자를 클로닝함으로써 수행될 수 있다. 적절한 벡터는 이스트 염색체에서의 뉴클레오티드 서열에 동종인 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 피타아제 유전자는 재조합 부위들 (예, 전위 인자들:transposable element) 사이에 위치할 수 있으며, 이는 재조합 부위는 유전 자를 염색체로 이동시킬 수 있다.
본 발명의 다른 실시 양태는 야생형 산 포스파타아제/피타아제의 효소 특성을 개선시키는 것에 관한 것이다. 이는 야생형 산 포스파타아제/피타아제의 아미노산 서열을 전술한 200, 207 및 211 위치에서 변경시킴으로써 달성된다. 예를 들어, 이들 변형은 산 포스파타아제/피타아제가 개선된 열안정성을 갖도록 한다. 대안적으로, 개선된 효소 특성은 pH 약 3.5 내지 약 5.5 사이의 범위에서 피타아제 활성을 갖는다.
이스트계에서 생산된 피타아제 효소가 옥수수 및 대두로부터 피타아제-P를 현재 시판되고 있는 피타아제 만큼 효과적으로 방출시키는 경우, 보다 열안정적인 것 같다. 이스트에서의 이러한 피타아제의 과발현계를 사용하여 식품 및 사료 산업에 사용되는 열안정적인 피타아제를 제공할 수 있다.
본 발명의 개선된 산 포스파타아제/피타아제는 동물 사료에 사용되어 가금, 돼지, 전-반추위 송아지, 동물원의 동물들 및 애완동물(예컨대, 고양이 및 강아지)와 같은 단순 위장 동물의 포스페이트 소화를 개선시킨다. 본 발명은 다량의 무기포스페이트로 동물 사료를 보충할 필요성을 감소시킬 것이며, 이에 의하여 동물 사료가 보다 저렴해지고 재생할 수 없는 형태의 포스페이트가 덜 농축될 것이다. 본 발명은 단순 위장 동물로 하여금 포스페이트의 흡수를 강화시기키 때문에, 이들 동물의 대소변은 사용되지 않은 피타아제-포스페이트를 덜 포함하게 되어 포스페이트 공해의 양을 줄일 것이다.
본 발명의 동물 사료 조성물을 제조하는 데 있어서, 돌연변이 산 포스파타아 제/피타아제는 식물 원료 성분과 합해져서 펠렛 또는 분말 형태로 가공한다. 식물 원료 성분은 동물 사료에 통상 사용되는 다수의 식물 및/또는 식물 부산물의 다양한 조합물을 포함하며, 옥수수, 대두, 밀, 쌀, 목화씨, 평지, 수수 및 감자와 같은 식물을 포함한다. 또한, 동물 사료 조성물은 다양한 비타민, 미네랄, 동물 단백질 및 항생제로 강화될 수 있다. 동물 사료 조성물의 한 실시 태양은 적당한 농도의 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제, 에너지원(들)(예컨대 옥수수, 밀), 단백질원(들)(예컨대, 대두, 쌀, 목화씨 밀, 평지 밀, 수수 밀) 및 비타민/미네랄 보충물의 혼합물을 포함한다. 구체적으로, 일정량의 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제는 300-1,000 유닛/kg(사료) 이다. 종래의 동물 사료 조성물의 한 예는 50-70 %의 옥수수, 20-30%의 대두, 약 1 %의 비타민 및 미네랄 보충물 및 적정량의 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제를 사용하여 특히 아연 및 철과 같은 상기 미네랄의 섭취를 증가시킴으로서 인간 영양을 강화시킬 수 있다. 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제를 인간 규정식에 첨가함으로서 영양 부족으로부터 발생하는 다양한 문제, 예를 들어 어린이의 발육 지연 및 지능 발달 지연과 같은 문제를 치료하거나 예방할 수 있다.
본 발명은 다양한 유기체 공급원으로부터 유래되는 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제를 설계하는 데 널리 적용될 수 있는 기본 분자법을 제공하여 보다 큰 열안정성 및 촉매 유효성과 같은 개선된 효소 특성을 갖춘 돌연변이체를 제공한다. 이 방법은 야생형 효소 유전자를 동정하고 분리하는 단계를 포함하며 이러한 유전 자를 부위 지향성 돌연변이유발의 대상으로 사용하여 효소의 기능 및/또는 안정성을 개선시킨다. 본 발명의 한 실시 양태는 부위 지향성 돌연변이유발을 이용하여 야생형의 유전자에 대해 표적화된 돌연변이를 이루어 N-글리코실화 부위를 야생형 효소에 추가하거나/추가하고 효소의 물리화학적 특성을 변경시킨다(예를 들어, 효소의 실효 양전하량의 증가). 또한, 표적화된 돌연변이를 야생형 유전자에 도입하여 최종 단백질 생성물에서 발견되는 임의의 디설파이드 결합을 제거하고 열안정성 및 촉매적 기능을 개선시킨다.
도 1은 E. coli 산 포스파타아제/피타아제(appA)의 유도 아미노산 서열(서열 번호 1) 및 뉴클레오티드 서열(서열 번호 2)을 나타낸다. 프라이머는 하선을 그었고, 화살표로 나타내었다. GH 루프 영역(202-211)은 진하게 나타내며, C200(G 헬릭스 내) 및 C210(GH 루프 내)은 α-도메인의 독특한 디설파이드 결합을 형성한다. 치환되는 아미노산(A131, V134N, C200, D207 및 S211)은 하선을 그었고, 진하게 나타내었다.
도 2는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 발현된 정제 재조합 단백질의 SDS-겔 전기영동(15%) 분석을 나타낸다. 레인 당 단백질 30 ㎍을 로딩하였다. 레인 M, 예비염색 마커(바이오래드, kDa)(포스포릴라아제 b, 103; 소 혈청 알부민, 76; 난알부민, 49; 탄소 언하이드라아제, 33.2; 대두 트립신 저해제, 28); 레인 1, 엔도 H f (엔도글리코시다아제 H f ); 레인 2, r-AppA(피키아 파스토리스 에서 appA에 의 하여 생성된 재조합 단백질); 레인 3, r-AppA + 엔도 H f ; 레인 4, 돌연변이체 U; 레인 5, 돌연변이체 U + 엔도 H f ; 레인 6, 돌연변이체 R; 레인 7, 돌연변이체 R + 엔도 H f ; 레인 8, 돌연변이체 Y; 레인 9, 돌연변이체 Y + 엔도 H f .
도 3은 기질로서 소듐 피테이트를 사용한 정제된 r-AppA(●) 및 돌연변이체 (U, ■; Y, ▲; R, ◆)의 37 ℃에서의 pH 의존성 효소 활성을 나타낸다. 상기 각 돌연변이체 및 r-AppA에 대한 최대 활성은 100 %로 정의하였다. 완충액: pH 1.5-3.5, 0.2 M 글리신-HCl; pH 4.5-7.5, 0.2 M 소듐 시트레이트; pH 8.5-11, 0.2 M 트리스-HCl. 별표는 r-AppA 및 기타 돌연변이체 사이의 유이적 차이(P＜0.05)를 나타낸다. 결과는 세 번의 실험으로부터 얻은 평균 ±SE로 나타낸다.
도 4는 지시된 온도에서 15 분 동안 노출된 후의 정제된 r-AppA(●) 및 돌연변이체(U, ■; Y, ▲; R, ◆)의 잔류 효소 활성을 나타낸다. 상기 정제된 효소는 0.2 M 글리신-HCl, pH 2.5에서 15 분 동안 항온처리하였다. 가열 말기에, 얼음 위에서 상기 반응 혼합물을 30 분 동안 냉각시켰다. 각 재조합 효소에 대한 소듐 피테이트를 사용한 초기 활성은 100 %로 정의하였다. 별표는 r-AppA 및 기타 돌연변이체 사이의 유이적 차이(P＜0.05)를 나타낸다. 결과는 세 번의 실험으로부터 얻은 평균 ±SE로 나타낸다.
실시예 1: 돌연변이유발 설계에 대한 서열 분석
AppA 효소의 글리코실화를 개선시키기 위한 돌연변이유발의 설계 기준은 1) 잠재적인 글리코실화 부위는 25 % 이상의 용매 접근성을 가져야 하고 2) 상기 부위는 단일 잔기 변경에 의해 쉽게 가공되어 N-결합된 글리코실화 모티브를 생성하여야 한다(Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr, 이때 X는 프로린이 아님). 처음에, AppA 효소에 대한 결정 구조 없이, 래트 산 포스파타아제의 결정 구조(35 % 서열 동정)(Schneider,G.et.al., EMBO J.12:2600-15(1993), 본 명세서에 참고 인용됨)을 사용하여 다음과 같이 접근성을 계산하였다. 우선, AppA 효소 및 래트 산 포스파타아제를 다중 서열 정렬 프로그램 PIMA을 이용하여 수개의 밀접하게 관련된 포스파타아제/피타아제로 정렬시켰다(Smith,R.et al.,Protein Engineering 5:35-41(1992), 본 명세서에 참고 인용됨). 상기 정렬된 서열은 다음의 것을 포함한다: 인간 전립선 산 포스파타아제 전구체(GeneBank 기탁번호 P15309); 카에노르합디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans) 히스티딘 산 포스파타아제(GeneBank 기탁번호 Z68011); 아스페르길러스 퓨미가투스(Aspergillus fumigatus) 피타아제 (GeneBank 기탁번호 U59804); 피키아 안구스타(Pichia angusta) 피억제성 산 포스파타아제 (GeneBank 기탁번호 AF0511611); 래트 산 포스파타아제 (GeneBank 기탁번호 576257); 및 E.Coli appA(GeneBank 기탁번호 M58708). 다음으로, 래트 포스파타아제의 모든 아미노산의 용매 접근성 표면을 프로그램 DSSP를 이용하여 측정하고(단백질의 2차 구조 정의)(Kabsch,W.et al.,Biopolymers 22:2577-637(1983), 본 명세서에 참고 인용됨), 전술한 바와 같이 상응하는 아미노산의 총 표면적을 나누어 이들 값을 접근성 백분율로 전환하였다(Eisenberg,D.et al.,Chemica Scripta 29A,217-221(1989), 본 명세서에 참고 인용됨). 용매 25 % 이상의 잔기만이 접근가 능한 것으로 생각된다. 래트 산 포스파타아제 및 AppA 효소의 전체 구조가 보존된다는 예상하에 전술한 서열 정렬에 기초하여 Appa 효소내 상응하는 아미노산에 상응하여 값들이 부여되었다. 마지막으로, 예상 용매 접근가능한 잔기를 시험하여 어떤 것이 N-글리코실화 부위로 점 돌연변이에 의해 용이하게 전환될 수 있을 것인지를 판단하였다. 31 개의 잠재적인 부위들 중에서 5개 부위가 소정 기준에 가장 적합한 것으로 선택되었다. 추가적인 돌연변이 유발 C200N은 다른 AppA 돌연변이유발 연구를 위해 설계된 프라이머 P2를 사용하여 도입되었다. 실시된 정렬로부터, 돌연변이유발 C200N은 틈 영역에 존재하고 C200은 단백질의 α-도메인에서 C200이 헬릭스 G 및 GH 루프(G 및 H 헬릭스 간의 비유기적 구조)사이의 독특한 디설파이드 결합을 형성하는 경우 C210(C178/C188로 표지, Lim et al., Nat.Struct.Biol.7:108-13(2000), 본 명세서에 참고 인용됨)과 관련되어 있다(Lim et al., Nat.Struct.Biol.7:108-13(2000), 본 명세서에 참고 인용됨). 따라서, 6 PCR 프라이머가 설계되었다:appA 야생형 서열을 증폭하기 위한 E2 및 K2(Dassa,J.et al.,J.Bacteriol. 172:5497-500(1990), 본 명세서에 참고 인용됨) 및 4개의 돌연변이체를 개발하기 위한 기타의 것들(표1 및 도1). 모든 프라이머는 Cornell University Oligonucleotide Synthesis Facility(Ithaca,NY)에 의해 합성되었다.
Figure 112002015236395-pct00009
실시예 2: PCR에 의한 돌연변이체의 작제
E.Coli appA 돌연변이체는 종래의 연구로부터 적용된 메가프라이머 부위-지향성 돌연변이유발법을 사용하여 작제되었다(Seraphin,B. et al.,Nucl.Acids Res.24:3276-77(1996); Smith et al., BioTechniques 22:438-39(1997), 본 명세서에 참고 인용됨). appA 영역의 원상태 암호를 증폭시키기 위하여, E.Coli 균주 BL21로부터 분리된 pAPPA1 플라스미드내에 삽입된 appA의 DNA 200 ng(Dassa,J.et al.,J.Bacteriol. 172:5497-500(1990), 본 명세서에 참고 인용됨), 각각의 프라이머 E2 및 K2 50 pmol, AmpliTaq DNA 폴리머라아제 5U(Perkin Elmer, Norwalk, CT), 10 mM Tris-HCl pH 8.3, 50 mM KCl, 12.5 mM MgCl2, 및 200 mM 각각의 dNTPs(Promega Corp., Madison, WI)을 포함하는 최종 부피 50 ㎕에 PCR을 세팅하였다. 상기 반응은 GeneAmp PCR 시스템 2400(Perkin Elmer)을 사용하여 실시되었고, 94 ℃(3분)에서 1회의 사이클, [94 ℃(0.5 분), 54 ℃(1분) 및 72 ℃(1.5분)]의 30회의 사이클 및 72 ℃(10분)에서 1회의 사이클을 포함한다. 돌연변이체의 메가프라이머(megaprimer)를 별도의 PCR 라운드에서 생산하였다(표2).
E.coli appA 돌연변이체 명칭 및 구조
작제물1 크기bp 글리코실화 수
돌연변이체 R E2A1P3K2 1350 7
U E2P2P3K2 1350 5
Y E2A1P2P3K2 1350 7
야생형 r-AppA E2K2 1350 3
1 프라이머 명칭은 표1 참조.

4 ㎕의 원상태 appA PCR 반응 혼합물 및 표1에 기재된 각각의 변형된 프라이머를 이용하여, 제1 돌연변이성 PCR 반응물(100 ㎕)을 전술한 바와 같이 수행하였다. 모든 메가프라이머 PCR 생성물은1.5 % 저온 용융 아가로스(Gibco BGL, Grand Island,NY) 겔 전기영동에서 분석하였다. 예상 단편을 절제하고 GENECLEAN II 키트(Bio101, Vista,CA)로 용리하였다. 4 ㎕의 appA PCR 생성물 및 그 크기에 따라 다양한 농도의 정제된 메가프라이머(50 ng 내지 4 ㎍)를 사용하여, 최종 돌연변이성 PCR 반응물(100 ㎕)을 전술한 바와 같이 세팅하였다. 5개의 열 사이클을 94 ℃에서 1분 동안 그리고 70 ℃에서 2분 동안 세팅하였다. 70 ℃에서 1 μM의 전방 프라이머 및 2 U 의 AmpliTaq DNA 폴리머라아제를 첨가하고 반응물과 부드럽게 혼합 한 후 94 ℃ 에서 1분 동안, 56 ℃에서 1분 동안, 70 ℃에서 1.5분 동안 25회 열 사이클링을 지속하였다.
실시예 3: 서브클로닝 및 발현
E.Coli 균주 TOP10F'(Invitrogen,San Diego,CA)을 최초 숙주로서 사용하였다. PCR 단편을 정제하고 사용설명서에 따라 pGEMP-Easy 벡터(Promega)로 클로닝하였다. 분리된 플라스미드 DNA의 EcoRI 소화를 이용하여 양성 형질전환체를 스크리닝하였다. 생성된 삽입체를 EcoRI 부위에서 pPICZαA(Kit Easy-Select, Invitrogen)으로 클로닝하고 25 ㎍/㎖ Zeocin을 포함하는 LB(Luria-Bertani) 배지상에서 도포된 TOP10F' 세포로 형질전환하였다. 정확한 배향으로 소정 삽입체를 갖춘 콜로니를 플라스미드 DNA의 SalI 또는 BstXI 제한 소화를 이용하여 선택하였다. 피.파스토리스 균주 X33(Mut + His +)을 단백질 발현(Invitrogen)에 대한 숙주로서 사용하여 YPD(이스트 추출물 펩톤 덱스트로스 배지) 액체 배지에서 전기영동하기 전에 성장시켰다. 플라스미드 DNA 2 ㎍을 제한 효소 BglII 또는 PmeI을 사용하여 선형화(linearize)하고 사용설명서(invitrogen)에 따라 X33으로 형질전환하였다. 선택된 형질전환체를 24 시간 동안 글리세롤(GMGY) 최소 배양 배지에서 항온 배양하고 0.5 % 메탄올 배지(GMMY)를 사용하여 단백질 발현을 유도하였다.
실시예 4: 효소 정제 및 생화학적 특성
배지 상청액 중의 발현된 r-AppA 및 돌연변이체 효소들을 전술한 바와 같이 2단계 황산염 침전(25 % 및 75%)에 가하였다(Rodriguez,E.et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.257:117-23(1999),본 명세서에 참고 인용됨). 제1 라운드의 현탁액을 4 ℃에서 25,000 x g 로 20 분 동안 원심분리하였다. 제2 라운드의 펠렛을 10 ㎖에 현탁시키고 25 mM Tris-HCl, pH7에 대해 밤새 투석하였다. 투석 후, 단백질 추출물을 DEAE(디에틸아미노에틸)-세파로스 컬럼(Sigma, St.Louis,MO)에 부가하고 25mM Tris-HCl, pH7로 평형화하였다. 결합(bound) 단백질을 25mM Tris-HCl, pH7 중의 1M NaCl로 용리하였다. 최고 활성을 나타내는 이들 3개의 단편들을 풀로 하여 다음 분석을 위해 25mM Tris-HCl, pH7.5에 대해 투석하였다. 기질로서 나트륨 피테이트를 이용하여 피타아제 활성을 측정하였다(Rodriguez,E.et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.257:117-23(1999); Piddington,C.S.et al.,Gene 133:55-62(1993), 본 명세서에 참고 인용됨). 효소를 0.25 M 글리신-HCl, pH 2.5에 희석하고 11 mM 나트륨 피테이트(Sigma)를 포함하는 동부피의 기질 용액을 첨가하였다. 샘플을 15 분 동안 37 ℃에서 항온배양 한 후, 동부피의 15 % 트리클로로아세트산을 첨가함으로써 반응을 종결하였다. 0.2 ㎖ 샘플을 1.8 ㎖의 H2O, 및 0.6 M H2SO4, 2% 아스코르브산 및 0.5 % 암모늄 몰리브데이트를 함유하는 용액 2 ㎖ 와 혼합한 후, 유리 무기 인을 820 nm에서 측정하고 20 분 동안 50 ℃에서 항온배양하였다. 1 피타아제 유닛을 37 ℃ 에서 분 당 나트륨 피테이트로부터 무기 인 1μmol을 방출하는 활성량으로 정의하였다. 효소 운동학에서 사용되는 나트륨 피테이트의 최종 농도는 0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2.5, 10 및 25 mM 이었다. 산 포스파타아제 활성을 최종 농도 25 mM에서 pNPP(Sigma)를 사용하여 분석하였다(Smith,R.et al.,Protein Engineering 5:35-41(1992), 본 명세서에 참고 인용됨). 효소(40 nmol) 50 ㎕에, 250 mM 글리신-HCl, pH 2.5 850 ㎕를 첨가하였다. 37 ℃에서 5분 간 항온배양한 후, pNPP 100㎕를 첨가하였다. 샘플 0.1 ㎖을 1 M NaOH 0.9 ㎖와 혼합하고 10분간 항온배양한 후 방출된 p-니트로페놀을 405 nm 에서 측정하였다. 효소 운동학에서 사용되는 pNPP의 최종 농도는 0.1, 0.2, 0.75, 1, 2.5, 10, 및 25 mM 이었다. 산 피타아제/피타아제 활성 1유닛을 분 당 p-니트로페놀 1μmol 형성을 촉매하는 효소의 양으로 정의하였다. 열안정성 분석 전에, 효소(2 mg/㎖)을 0.2 M 글리신-HCl, pH 2.5에서 1:400 으로 희석하였다. 희석된 샘플을 25, 55, 80 및 90 ℃에서 15분 동안 항온배양하였다. 샘플을 얼음에서 30분 동안 냉각한 후, 남은 피타아제 활성을 전술한 바와 같이 측정하였다. 정제된 효소의 탈글리코실화는 0.5 IU 엔도글리코시다아제 Hf(엔도 Hf)가 있는 총 단백질 100 ㎍을 사용설명서에 따라 4시간 동안 37 ℃에서 항온배양함으로써 수행하였다(New England Biolas, Beverly,MA). 나트륨 도데실 황산염-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE), 15 % (w/v)겔을 전술한 바와 같이 실시하였다(Laemmli, U.K.,Nature 227:680-85(1970), 본 명세서에 참고 인용됨). Lowry 법(Lowry,O.H.et al., J.Biol.Chem.193:265-75(1951), 본 명세서에 참고 인용됨)을 사용하여 단백질 농도를 측정하였다.
SAS를 이용하여 데이터를 분석하였다(release 6.04, SAS institute, Cary,NC,USA).
실시예 5: 피타아제 발현 및 글리코실화에 대한 부위 지향성 돌연변이유발 의 효과
각각의 이스트 형질전환체로부터 유래된 게놈 DNA를 E2 및 K2 프라이머를 이용하여 PCR(폴리머라아제 연쇄 반응)에 의해 소정 돌연변이된 appA를 증폭시키기 위하여 추출하였다. 모든 소정 돌연변이는 서열화에 의해 확인되었다. 각각의 돌연변이체에 대하여, 24 콜로니를 유도 후 다양한 시점에서 피타아제 활성에 대해 분석하였다. 모든 3개의 돌연변이, 돌연변이 R, 돌연변이 U, 및 돌연변이 Y는 r-AppA와 함께 발현되고 분비되어 메탄올 유도 96시간 후 최고점에 도달된 세포내 피타아제 활성의 시간에 따른 축적을 나타낸다. 배지 상청액에서의 최고 활성은 각각 35, 175, 57 및 117 U/㎖ 였다(표3). 발현 벡터 pPICZαA로 형질전환된 이스트 X33을 대조군으로 사용하고 SDS-PAGE 에서 임의의 활성 또는 피타아제 단백질을 부여하지 않았다. 정제된 단백질에서, 돌연변이체 U는 최고의 비 피타아제 활성(specific phytase activity), 63 U/mg을 가지며 이후 돌연변이체 Y, r-AppA 및 돌연변이체 R은 각각 51, 41 및 32 U/mg 단백질이었다. 정제 후에 수집한 단백질 수율은 돌연변이체 U 및 Y, r-AppA 및 돌연변이체 R에 대해서 각각 654, 324, 688 및 425 mg/L 였다(표3).
r-AppA 및 3개 돌연변이체의 피타아제 수율 및 비활성(specific activity)
단백질 피타아제 활성1 단백질 수율2 비활성3
-엔도 Hf +엔도 Hf
r-AppA 117±15 688±44 41±3 37±4
R 35±4 425±26 32±2 29±2
U 175±19 654±39 63±4* 65±5*
Y 57±8 324±18 51±5 46±6
1: 배양 96 시간 후 GMMY 배지에서의 피타아제 활성(U/㎖) 2: 단백질 수율(배양물 리터 당 정제된 단백질 mg) 3: 비 피타아제 활성(정제된 단백질의 mg 당 유닛) *: r-AppA 대조군에 대한 현저한 차이(p<0.05)를 나타낸다. 결과는 3개 실험들의 대표적인 것이다.

SDS-PAGE에서, r-AppA의 밴드 크기는 50-56 kDa인 반면, 돌연변이체 R은 68-70 kDa이고, 돌연변이체 Y는 86-90 kDa이었다(도2). 이것은 r-AppA에서 14 % 내지 돌연변이체 R에서 48 % 및 돌연변이체 Y에서 89 %까지의 글리코실화 수준의 향상을 가져왔다. 돌연변이체 U에서의 글리코실화 수준은 r-AppA와 동등한 것으로 나타났다. 이들 모든 재조합 효소는 엔도 Hf 에 의한 탈글리코실화 후, 유사한 분자량, 45 kDa 내지 48 kDa을 나타냈다. 탈글리코실화는 모든 돌연변이체 또는 r-AppA에 대한 비활성에 심각하게 영향을 미치지는 않는다(표3). 그러나, 이들 정제된 단백질을 β-머캅토에탄올 및 엔도 Hf로 처리하는 것은 피타아제 활성의 완전한 손실을 유발했다.
실시예 6: 피타아제 pH 및 최적 온도 및 열안정성에 대한 부위-지향성 돌연변이유발의 효과
돌연변이체 R, U 및 Y가 r-AppA와 동일한 최적 pH(2.5)를 공유함에도 불구하 고, pH 3.5, 4.5 및 5.5에서 돌연변이체 U는 r-AppA 보다 더 활성(p<0.05)인 반면 돌연변이체 Y는 덜 활성(p<0.05)이다(도3). 최적 온도는 돌연변이체 U에서 65 ℃이고, 다른 2개의 돌연변이체 및 r-AppA에서 55 ℃였다. 0.2 M 글리신-HCl, pH 2.5에서, 돌연변이체 U는 15분 동안 80 ℃ 및 90 ℃에서 가열된 후 r-AppA보다 높은 (p<0.05)잔류 피타아제 활성을 나타냈다.
실시예 7: 효소 운동학에 대한 부위 지향성 돌연변이유발의 효과
돌연변이체 U에서 r-AppA(p<0.05)에 대해, pNPP(p-니트로페닐 포스페이트)의 K m 값은 1/2로 감소되었고 나트륨 피테이트의 값은 70 %로 감소하였다(표4). 결과적으로, 돌연변이체 U는 pNPP의 겉보기 촉매 효율 k cat /K m 의 1.9배 증가를 나타냈고, r-AppA 보다 나트륨 피테이트에서 5.2배 증가를 나타냈다. 돌연변이체 Y의 k cat /K m 값이 나트륨 피테이트의 r-AppA 값과는 현저하게 달랐지만, 실질적인 강화는 상대적으로 작았다. 반대로, 돌연변이체 R 은 양 기질에 대해 r-AppA보다 현저하게 낮은 촉매 효능을 나타냈다.
r-AppA 및 3개 돌연변이체1의 촉매성
효소 기질
pNPP Na-피타아제
K m (mM) k cat (분-1) k cat /K m (분-1M-1) K m (mM) k cat (분-1) k cat /K m (분-1M-1)
r-AppA 3.66±0.44 752±7.9 (2.0±0.18) x105 1.95±0.25 2148±33 (1.11±0.13)x106
R 7.87±0.84* 390±5.9* (0.5±0.07)x105* 3.07±0.26* 1657±23* (0.54±0.09)x106*
U 1.86±35* 1073±13* (5.8±0.37)x105* 0.58±0.08* 4003±56* (6.90±0.70)x106*
Y 3.18±0.39 787±6.7 (2.5±0.17)x105 2.03±0.19 3431±41* (1.69±0.21)x106*
1 반응 속도 측정을 본원에서 전술한 바와 같이 3회 수행하였다.K m 값을 Lineweaver-Burk plot 법을 이용하여 계산하였다. 모든 반응들을 0.25 M 글리신-HCl, pH2.5에서 측정하였다. * r-AppA 대조군에 대해 현저한 차이(p<0.05)를 나타낸다. 결과는 5개의 독립적인 실험의 대표적인 것이다.

상기 결과는 추가적인 N-글리코실화 부위 및/또는 아미노산 변화가 부위 지향성 돌연변이유발에 의해 AppA 효소에 추가될 수 있다는 것을 나타낸다. 원상태 appA 유전자에 의해 생산된 r-AppA와 비교하였을 때, 돌연변이체 효소 R 및 Y는 명확하게 강화된 글리코실화를 나타냈으며 탈글리코실화 전 및 후의 분자량의 차이에 의해 알 수 있다. 따라서, 이들 2개 돌연변이체에서의 처리된 N-글리코실화 부위는 실제로 피.파스토리스에 의해 인지되며 정확하게 가공되었다. 돌연변이체 R 및 Y에서의 다중의 돌연변이 때문에, 이들 결과는 특정 처리 부위에서의 글리코실화 수준을 분석할 수 없으나, 돌연변이체와 r-AppA 사이의 비교에 의해 유용한 정보를 유도할 수 있다. 첫째로, 두개의 돌연변이체 R 및 Y는 r-AppA에 관해 4개의 추가적인 N-글리코실화 부위를 가졌음에도, 돌연변이체 Y는 R에 비해 40 % 많은 N-글리코실화를 나타냈다(89% 대 48 %). 돌연변이체 Y에서 C200N 치환이 이들 2개 변이체에서 유일하게 상이한 것이고 돌연변이가 추가적인 예상 N-글리코실화 부위를 추가하지 않았기 때문에, C200N 자체의 변경은 임의 부위에서 N-글리코실화를 증강시킬 수도 있을 것이다. 둘째로, 돌연변이체 U가 추가적으로 2개의 N-글리코실화 부위(Asn 207 및 Asn 211)를 가졌지만, 외관상 분자량은 r-AppA와 동일하였으며, 이는 돌연변이체 U에서의 2개의 처리된 글리코실화가 휴지상태임을 암시하였다. 이것은 상기 신호 서열의 존재가 글리코실화에 필요하지만, 반드시 글리코실화를 진행하지는 않는다는 것을 나타낸다(Meldgaard,M.et al.,Microbiol.140:159-66(1994), 본 명세서에 참고 인용됨). 돌연변이체 U의 경우 돌연변이된 잔기가 구조를 기초로 하는 서열 정렬 만큼 용매 접근성이 있지는 않다는 것을 믿을 수 있다. AppA 효소의 최근 공개된 결정 구조는 이러한 물음에 대한 대답을 줄 수 있을 것이다(Lim et al., Nat.Struct.Biol.7:108-13(2000); Jia,Z.et al., Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.54:647-49(1998), 본 명세서에 참고 인용됨). 최근 돌연변이체 R은 돌연변이체 U에 비해 글리코실화가 현저하게 증가되었다. 이러한 차이는 돌연변이체 R에서의 A131N 및 V134N에서의 2개의 추가된 N-글리코실화 부위에 의해 발생될 수 있다. 상기 결과로부터, 다음의 관찰이 이루어질 수 있다:1)A131N 및 V134N의 치환은 AppA 효소의 글리코실화를 증가시킨다; 2) D207N 및 S211N의 치환은 휴지되었다; 3) C200N 치환은 돌연변이체 Y의 경우 다른 부위에서 글리코실화를 증강시키지만 돌연변이체 U는 그렇지 않다.
통상, 단백질의 추가적인 글리코실화는 폴딩을 촉진하고 안정성을 증가시킨다(Haraguchi,M.et al.,Biochem.J.312:273-80(1995); Imperiali,B.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.92:97-112(1995), 본 명세서에 참고 인용됨). 예상과는 달리, 글리코실화가의 정도가 증가되었음에도, 돌연변이체 R 및 Y는 증강된 열안정성을 나타내지 않았다. 놀랍게도, 돌연변이체 U는 r-AppA와 동일한 수준의 글리코실화를 가졌음에도 보다 큰 열안정성을 나타냈다. C200N의 수행이 다른 부위에서 N-글리코실화가 일어났다는 것을 의미하지는 않지만, 특정 부위에서 보다 많은 글리코실화가 실현가능하다. 겉보기에는, 글리코실화보다는 돌연변이 그 자체가 이러한 효과에 기여했다. 최근의 연구에서는 아스페르길루스 니거 또는 이스트 한세뉼라 폴리모르파에서 발현된 6가지의 상이한 피타아제의 생산을 설명하였다(Wyss,M.et al.,Appl.Environ.Microbiol.65:359-66(1999), 본 명세서에 참고 인용됨). 이러한 결과는 글리코실화 수준이 선택된 숙주에 의존하지만 열안정성, 비활성 또는 단백질 재폴딩에 현저한 효과를 미치지는 않았다는 것을 나타낸다(Wyss,M.et al.,Appl.Environ.Microbiol.65:359-66(1999), 본 명세서에 참고 인용됨).
운동학 데이터는 3개의 모든 돌연변이체 및 r-AppA가 pNPP보다 나트륨 피테이트에서 낮은 K m 및 높은 k cat /K m 를 가진다는 것을 나타냈다. 명백하게는, 이들 재조합 효소가 후자보다는 전자에 대해 높은 외관상 효율을 가지는데, 이는 AppA 효소가 산 포스파타아제에 비해 더욱 피타아제임을 나타낸다(Lim et al., Nat.Struct.Biol.7:108-13(2000); (Rodriguez,E.et al.,Biochem.Biophys.Res. Commun.257:117-23(1999),본 명세서에 참고 인용됨). 돌연변이체 U는 r-AppA에 비해 두개의 기질 모두에서 외관상 효율이 크게 증가했음을 나타냈다. k cat /K m 의 증가는 거의 K m 에서의 큰 감소에 기인하는 것 같다(pNPP에 대해 1.86 대 3.66 이고 나트륨 피테이트에 대해 0.58 대 1.95 mM 이다). 이것은 돌연변이체 U가 r-AppA에 보다 매우 낮은 농도에서 포화된다는 것을 의미한다. 또한, 이러한 두 형태의 피타아제 사이에 두 기질에 대한 k cat 가 현저하게 차이가 났다. 래트 산 포스파타아제의 구조에 기초하여(Schneider,G.et.al., EMBO J.12:2600-15(1993), 본 명세서에 참고 인용됨), 이들 돌연변이가 효소 활성 부위 또는 산 포스파타아제 다이머 형성에 관련될 수 없다. 이들 돌연변이는 다른 단백질에 대해 전술한 것과 같이, 효소의 형태적 가요성에 단독으로 또는 함께 영향을 주는 것 같다(Kern,G.et al.,Protein Sci.2:1862-68(1993),본 명세서에 참고 인용됨). E.Coli 피타아제의 최근 밝혀진 결정 구조에 근거하면(Lim et al., Nat.Struct.Biol.7:108-13(2000); Jia,Z.et al., Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.54:647-49(1998), 본 명세서에 참고 인용됨), 이들 돌연변이는 기질 결합 포켓에 직접 관련되지는 않았다. 그러나, Lim et al,에 의해(Lim et al., Nat.Struct.Biol.7:108-13(2000), 본 명세서에 참고 인용됨) C178 및 C188로 표지된 C200 및 C210은 단백질의 α-도메인에서 헬릭스 G 와 GH 루프 사이의 디설파이드 결합에 관련된다(Lim et al., Nat.Struct.Biol.7:108-13(2000).54:647-49(1998), 본 명세서에 참고 인용됨). 돌연변이 C200N으로, α-도 메인으로의 독특한 디설파이드 결합은 GH 루프에 더이상 존재하지 않는다. 이러한 변화는 중앙 동공 또는 효소의 "기질 결합 부위"을 향해 α-도메인이 보다 우수한 가요성을 갖게할 수 있다(Lim et al., Nat.Struct.Biol.7:108-13(2000), 본 명세서에 참고 인용됨). 이러한 내부 가요성은 돌연변이체 U(및 작은 정도로 돌연변이 Y)가 나트륨 피테이트 가수분해에 대해 촉매 효능의 개선을 나타냈다는 사실로 뒷받침될 수 있다. 돌연변이체 U에 대해 글리코실화가 증강되지 않았기 때문에, 처리된 글리코실화 부위 N207 및 N211(Lim et al,에 의해 D185 및 S189로 표지(Lim et al., Nat.Struct.Biol.7:108-13(2000), 본 명세서에 참고 인용됨)은 노출된 표면으로부터 가리워질 수 있다. 따라서 돌연변이체 U의 열안정성개선은 돌연변이체 Y 또는 돌연변이체 R에 존재하지 않는 소수성 상호작용의 수의 증가에 의해 설명될 수 있다.
모든 3개의 돌연변이 및 r-AppA에서 피타아제의 비활성이 탈글리코실화에 의해 현저하게 영향을 받지 않는다는 것은 알아둘 가치가 있다. 그러나, 글리코프로테인 호르몬에 나타난 것과 같은 탈글리코실화(Terashima,M.et al.,Eur.JBiochem.226:249-54(1994),본 명세서에 참고 인용됨) 또는 에스. 세레비시아에에서 발현되는 슈와니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis) α-아밀라아제(Han,Y.et al.,Appl.Environ.Microbiol.65:1915-18(1999), 본 명세서에 참고 인용됨)는 기질 결합 및(또는) 그 이용 속도를 조절하는 가능한 형태 변화와 관련될 수 있다. 모든 돌연변이체 및 원상태 대조군을 β-머캅토에탄올 및 탈글리코실화 처리에 의해 완전히 불활성화시킬 수 있다. 이는 4 개의 디설파이드 결합이 이들 재조합 피타아제의 촉매적 기능을 유지하는 데에 있어서 함께 중요 역할을 수행한다는 것을 암시한다(Ullah,A.H.,J.et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.227:311-17(1996),본 명세서에 참고 인용됨).
결론적으로, G 헬릭스 및 GH 루프가 돌연변이체 U에서 디설파이드 결합 C200/C210을 포함하지 않으면, α-도메인이 약간 더 가요성이 될 수 있어서, 효소의 촉매 효능 및 열안정성을 긍정적으로 조절한다. E.Coli 피타아제 결정 구조가 가까운 장래에 알려질 것이므로(Lim et al., Nat.Struct.Biol.7:108-13(2000), 본 명세서에 참고 인용됨), 보다 구체적인 돌연변이유발 연구가 이루어져 효소의 특성을 개선할 수 있는 형태 변화를 해명해야 할 것이다.
바람직한 실시 태양이 본원에서 상세히 설명되었으나, 본 발명의 범위내에서 변형, 추가, 치환 등이 이루어질 수 있음은 당업자에게 명백할 것이며 후술하는 특허청구범위에서 설명된 발명의 범위내에 속하는 것으로 간주된다.
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Claims (52)

  1. 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형 에스케리챠 콜리(Escherichia coli) 산 포스파타아제/피타아제에 200, 207 및 211 위치에의 치환을 포함하는 다수의 아미노산 치환을 도입함으로써 생산한, 분리된 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제로서, 200 위치에서의 아미노산 치환은 Cys 아미노산 잔기 대신에 Asn 아미노산 잔기를 도입한 것이고, 207 위치에서의 아미노산 치환은 Asp 아미노산 잔기 대신에 Asn 아미노산 잔기를 도입한 것이며, 211 위치에서의 아미노산 치환은 Ser 아미노산 잔기 대신에 Asn 아미노산 잔기를 도입한 것인, 분리된 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 분리된 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제가 순수 형태인 것인, 분리된 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제.
  4. 제1항에 있어서, 상기 분리된 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제가 재조합체인 것인, 분리된 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제.
  5. 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형 에스케리챠 콜리 산 포스파타아제/피타아제의 효소 특성을 개선시키는 방법으로서,
    서열 번호 1의 200, 207 및 211 위치에 아미노산 치환을 도입함으로써 상기 야생형 산 포스파타아제/피타아제의 아미노산 서열을 변경시키는 단계를 포함하고,
    200 위치에서의 아미노산 치환은 Cys 아미노산 잔기 대신에 Asn 아미노산 잔기를 도입한 것이고, 207 위치에서의 아미노산 치환은 Asp 아미노산 잔기 대신에 Asn 아미노산 잔기를 도입한 것이며, 211 위치에서의 아미노산 치환은 Ser 아미노산 잔기 대신에 Asn 아미노산 잔기를 도입한 것인 방법.
  6. 삭제
  7. 제5항에 있어서, 상기 개선된 효소 특성이 향상된 열안정성인 것인 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 개선된 효소 특성이 pH 3.5 내지 pH 5.5의 pH 범위에서의 더욱 우수한 피타아제 활성인 것인 방법.
  9. 제1항에 따른 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제를 암호하는 분리된 DNA 분자.
  10. 제9항에 있어서, 상기 야생형 산 포스파타아제/피타아제가 에스케리챠 콜리로부터 분리된 것인, 분리된 DNA 분자.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제9항에 따른 DNA 분자를 포함하는 재조합 DNA 발현 시스템.
  14. 제13항에 있어서, 상기 DNA 분자는 이종성 발현 벡터 내에 있는 것인, 재조 합 DNA 발현 시스템.
  15. 제13항에 있어서, 상기 DNA 분자는 정확한 해독틀 및 정확한 배향으로 발현 시스템 내에 삽입된 것인, 재조합 DNA 발현 시스템.
  16. 제9항에 따른 이종성 DNA 분자를 포함하는 숙주 세포.
  17. 삭제
  18. 제16항에 있어서, 상기 이종성 DNA 분자가 재조합 DNA 발현 시스템 내에 있는 것인 숙주 세포.
  19. 제16항에 있어서, 상기 숙주 세포가 이스트 세포인 것인 숙주 세포.
  20. 제19항에 있어서, 상기 이스트 세포가 사카로마이세스(Saccharomyces), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 토룰라스포라(Torulaspora) 및 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces)로 구성된 군으로부터 선택되는 균주의 세포인 것인 숙주 세포.
  21. 제19항에 있어서, 상기 이스트 세포가 메틸로트로프 이스트 균주 (methylotrophic yeast strain)인 것인 숙주 세포.
  22. 제21항에 있어서, 상기 메틸로트로프 이스트 균주가 피키아(Pichia), 한세뉼라(Hansenula), 토룰룹시스(Torulupsis), 칸디다(Candida) 및 카르윈스키아 (Karwinskia)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 숙주 세포.
  23. 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제를 재조합 방식으로 생산하는 방법으로서,
    상기 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제의 발현에 적당한 조건 하에서, 제9항에 따른 1종 이상의 이종성 DNA 분자로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계, 및
    상기 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제를 분리하는 단계를 포함하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 숙주 세포가 이스트 세포인 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 이스트 세포가 사카로마이세스, 클루이베로마이세스, 토룰라스포라 및 스키조사카로마이세스로 구성된 군으로부터 선택되는 균주의 세포인 것인 방법.
  26. 제24항에 있어서, 상기 이스트 세포가 메틸로트로프 이스트 균주인 것인 방 법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 메틸로트로프 이스트 균주가 피키아, 한세뉼라, 토룰룹시스, 칸디다 및 카르윈스키아로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  28. 제1항에 따른 분리된 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제를 포함하는 동물 사료 조성물.
  29. 동물 사료를 생산하는 방법으로서,
    동물 사료 조성물을 생산하기에 효과적인 조건 하에서, 동물 사료 내에 제1항에 따른 분리된 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제를 도입하는 단계를 포함하는 방법.
  30. 서열 번호 1의 아미노산 서열의 200 및 210 위치 중 1 이상에서 시스테인 아미노산 잔기를 시스테인이 아닌 아미노산 잔기로 치환하는 것을 포함하는 1 이상의 아미노산 치환에 의하여, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형 에스케리챠 콜리 산 포스파타아제/피타아제와 구별되는, 분리된 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제로서, 상기 1 이상의 아미노산 치환은 시스테인 아미노산 잔기들 사이의 디설파이드 결합 형성을 파괴하는 것인 분리된 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제.
  31. 제30항에 있어서, 상기 분리된 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제가 순수 형태인 것인, 분리된 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제.
  32. 제30항에 있어서, 상기 분리된 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제가 재조합체인 것인, 분리된 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제.
  33. 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형 에스케리챠 콜리 산 포스파타아제/피타아제의 효소 특성을 개선시키는 방법으로서,
    200 및 210 위치에 있는 Cys 아미노산 잔기들 사이의 디설파이드 결합 형성을 파괴하는 1 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 상기 야생형 산 포스파타아제/피타아제의 아미노산 서열을 변경시키는 단계를 포함하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 개선된 효소 특성이 향상된 열안정성인 것인 방법.
  35. 제33항에 있어서, 상기 개선된 효소 특성이 pH 3.5 내지 pH 5.5의 pH 범위에서의 더욱 우수한 피타아제 활성인 것인 방법.
  36. 제30항에 따른 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제를 암호하는 분리된 DNA 분자.
  37. 제36항에 따른 DNA 분자를 포함하는 재조합 DNA 발현 시스템.
  38. 제37항에 있어서, 상기 DNA 분자는 이종성 발현 벡터 내에 있는 것인, 재조합 DNA 발현 시스템.
  39. 제37항에 있어서, 상기 DNA 분자는 정확한 해독틀 및 정확한 배향으로 발현 시스템 내에 삽입된 것인, 재조합 DNA 발현 시스템.
  40. 제36항에 따른 이종성 DNA 분자를 포함하는 숙주 세포.
  41. 제40항에 있어서, 상기 이종성 DNA 분자가 재조합 DNA 발현 시스템 내에 있는 것인 숙주 세포.
  42. 제40항에 있어서, 상기 숙주 세포가 이스트 세포인 것인 숙주 세포.
  43. 제42항에 있어서, 상기 이스트 세포가 사카로마이세스, 클루이베로마이세스, 토룰라스포라 및 스키조사카로마이세스로 구성된 군으로부터 선택되는 균주의 세포인 것인 숙주 세포.
  44. 제42항에 있어서, 상기 이스트 세포가 메틸로트로프 이스트 균주인 것인 숙주 세포.
  45. 제44항에 있어서, 상기 메틸로트로프 이스트 균주가 피키아, 한세뉼라, 토룰룹시스, 칸디다 및 카르윈스키아로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 숙주 세포.
  46. 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제를 재조합 방식으로 생산하는 방법으로서,
    상기 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제의 발현에 적당한 조건 하에서, 제36항에 따른 1종 이상의 이종성 DNA 분자로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계, 및
    상기 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제를 분리하는 단계를 포함하는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 숙주 세포가 이스트 세포인 것인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 이스트 세포가 사카로마이세스, 클루이베로마이세스, 토룰라스포라 및 스키조사카로마이세스로 구성된 군으로부터 선택되는 균주의 세포인 것인 방법.
  49. 제47항에 있어서, 상기 이스트 세포가 메틸로트로프 이스트 균주인 것인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 메틸로트로프 이스트 균주가 피키아, 한세뉼라, 토룰룹시스, 칸디다 및 카르윈스키아로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  51. 제30항에 따른 분리된 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제를 포함하는 동물 사료 조성물.
  52. 동물 사료를 생산하는 방법으로서,
    동물 사료 조성물을 생산하기에 효과적인 조건 하에서, 동물 사료 내에 제30항에 따른 분리된 돌연변이 산 포스파타아제/피타아제를 도입하는 단계를 포함하는 방법.
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