CN108753754B

CN108753754B - 糖基化作为植酸酶的稳定剂

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Publication number: CN108753754B
Application number: CN201810617794.4A
Authority: CN
Inventors: M·S·格伯特; S-K·李; M·奥尔蒂斯-马尔多纳多; M·华德
Original assignee: Danisco US Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 2012-02-07
Filing date: 2013-02-01
Publication date: 2022-11-04
Anticipated expiration: 2033-02-01
Also published as: WO2013119470A1; US20150030717A1; EP2812429A1; PL2812429T3; CN108753754A; AU2013217568B2; CN104487571A; CA2862430A1; DK2812429T3; CA2862430C; US9894917B2; JP2015515259A; ES2825057T3; EP2812429B1; AU2013217568A1

Abstract

本教导内容提供具有增加的稳定性的经修饰的酶，优选植酸酶，所述增加的稳定性假设是由增加的糖基化引起。可修饰所述酶以在氨基酸序列中引入或增加氨基酸序列中的糖基化位点数目，或者可通过使用特定的宿主产生方法增加糖基化，或采用这两种方法。本教导内容的酶具有增加的在升高的温度下处理后的稳定性，所述在升高的温度下处理后的稳定性可通过在处理如加热之后的失活可逆性或回收率百分比来测量。本教导内容的酶可应用于例如食品、饲料和饲料制丸。

Description

糖基化作为植酸酶的稳定剂

本申请为2013年2月1日提交的发明名称为“糖基化作为植酸酶的稳定剂”的PCT申请PCT/US2013/024415的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段日期为2014年8月7日，申请号201380008462.1。

优先权

本申请要求2012年2月7日提交的系列号为61/595,941的美国临时专利申请的优先权，特此将该专利以引用的方式并入本文。

技术领域

本教导内容涉及经修饰的植酸酶的领域。更具体地讲，本教导内容涉及通过突变植酸酶自身和/或由于涉及去糖基化缺陷型宿主细胞的植酸酶产生方法而进行的植酸酶糖基化。在一些实施例中，所涉及的植酸酶是真菌植酸酶或细菌植酸酶，并且可来自布丘氏菌属(Buttiauxella)。

背景技术

植酸盐是磷在谷类和豆类中的主要储存形式。然而，单胃动物如猪、家禽和鱼不能代谢或吸收植酸盐(或植酸)并因而其被排泄，从而在高密度家畜生产的区域导致潜在的磷污染。此外，植酸还通过螯合金属剂如钙、铜和锌而在单胃动物中充当抗营养剂。

为了给这些动物的生长和健康提供足够的磷酸盐，将无机磷酸盐添加至它们的饮食。这种添加可能是昂贵的并且进一步增加潜在的污染问题。

通过植酸酶的作用，植酸盐通常被水解而产生低级磷酸肌醇和无机磷酸盐。植酸酶可用作动物饲料的添加剂，其中它们可改善无机磷对动物的可利用率以及降低对环境的磷酸盐污染(Wodzinski RJ,Ullah AH.Adv Appl Microbiol.(《应用微生物进展》)42,263-302(1996))。

文献中已描述了许多真菌来源的植酸酶(Wyss M.等人，Appl.Environ.Microbiol.(《应用和环境微生物学》)65(2),367-373(1999)；Berka R.M.等人，Appl.Environ.Microbiol.(《应用和环境微生物学》)64(ll),4423-4427(1998)；LassenS.等人，Appl.Environ.Microbiol.(《应用和环境微生物学》)67(lo),4701-4707(2001))和细菌来源的植酸酶(Greiner R.等人，Arch.Biochem.Biophys.(《生物化学与生物物理学集刊》)303(I),107-113(1 93)；Kerovuo等人，Appl.Environ.Microbiol.(《应用和环境微生物学》)64(6),2079-2085(1998)；Kim H.W.等人，Biotechnol.Lett.(《生物技术通讯》)25,1231-1234(2003)；Greiner R.等人，Arch.Biochem.Biophys.(《生物化学与生物物理学集刊》)341(2),201-206(1997)；YoonS.J.等人，Enzyme and microbial technol.(《酶和微生物技术》)18,449-454(1996)；Zinin N.V.等人，FEMS Microbiol.Lett.(《FEMS微生物通讯》)236,283-290(2004))。具体地讲，BP11(WO2006/043178)、BP17(WO2008/097619)和BP111(WO2009/129489)由于它们的稳定性，尤其是它们的热稳定性是适用于食品和动物饲料中的已知变体植酸酶。这些植酸酶是布丘氏菌属P1-29(以登录号NCIMB 4124保藏)的野生型植酸酶的变体。植酸酶已知可经历可逆的热失活(Wyss,Appl.Envir.Microbiol.(《应用和环境微生物学》)(1998)64:4446)。

动物饲料可能会在高温下制备、生产和加工。特别是它们可能由丸粒(pellet)或颗粒(granule)如WO99/32595和WO2007/044968中描述的那些形成。动物饲料的制备因而要求饲料和饲料成分在高温下是热稳定的。因此如果饲料酶(尤其是植酸酶)在暴露于高温或升高的温度后保留高水平的酶活性，则是有利的。

可以在氨基酸水平上修饰酶以引入糖基化位点，这可促进酶的糖基化。例如，N连接聚糖附连于分泌性蛋白表面上的基序NXS/T内的天冬酰胺残基(Weerapana和Imperiali(2006)Glycobiology(《糖生物学》)16:91R-101R)。已知酶的糖基化可提供增加的热稳定性(Koseki等人，(2006)Biosci.Biotechnol.Biochem.(《生物科学生物技术和生物化学》)70:2476-2480)。已知增加的糖基化可增加一些植酸酶在低pH下的蛋白酶稳定性(WO01/90333)以及热稳定性(WO2006/028684)。然而，这些参考文献没有公开布丘氏菌属起源的植酸酶，或没有公布进一步增加的糖基化可在酶处于固体状态时改善饲料制丸(pelleting)期间对蒸气处理的耐受性。

本教导内容提供具有增加的失活可逆性的改善的糖基化的植酸酶。在一些实施例中，该植酸酶可用于食品或饲料。在一些实施例中，该植酸酶经历制丸工艺以包括在食品或饲料中。

发明内容

在一些实施例中，本教导内容提供包含SEQ ID NO:1的植酸酶多肽和与之具有至少75％、85％、90％、95％、98％、99％或99.9％同一性的变体，所述植酸酶和变体具有增加的糖基化和增加的稳定性。

在一些实施例中，本教导内容提供包含SEQ ID NO:1的植酸酶多肽和与之具有至少75％、85％、90％、95％、98％、99％或99.9％同一性的变体，其中所述植酸酶多肽在去糖基化缺陷型宿主中产生。

在一些实施例中，本教导内容提供包含SEQ ID NO:1的植酸酶多肽和与之具有至少75％、85％、90％、95％、98％、99％或99.9％同一性的变体，所述植酸酶多肽和变体包含至少一个额外的糖基化位点，其中所述至少一个额外的糖基化位点通过引入氨基酸改变以产生N连接糖基化位点基序Asn-Xaa-Ser/Thr来实现，其中Xaa可以是任何氨基酸。

在一些实施例中，本教导内容提供在去糖基化缺陷型宿主中产生的植酸酶多肽。

在一些实施例中，本教导内容提供与SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11任一者具有至少75％、85％、90％、95％、98％、99％或99.9％同一性的植酸酶多肽。

在一些实施例中，本教导内容提供增加制丸的植酸酶多肽的稳定性的方法，包括：使植酸酶多肽糖基化；用所述植酸酶多肽形成颗粒；将所述颗粒在至少85℃、至少90℃或至少95℃的温度下制丸，以形成制丸的植酸酶多肽；从而与缺少所述糖基化的对照制丸的植酸酶多肽相比，增加了制丸的植酸酶多肽的稳定性。

在一些实施例中，本教导内容提供制备具有高植酸酶活性的食品或饲料的方法。

在一些实施例中，本教导内容提供饲养动物的方法，包括施用包含植酸酶多肽的饲料组合物。

在一些实施例中，本教导内容提供通过本文的方法制备的植酸酶多肽。

在一些实施例中，本教导内容提供编码植酸酶多肽的核酸。

在一些实施例中，本教导内容提供包含核酸序列的载体或宿主细胞。

附图说明

本教导内容将参照如下附图进行描述：

图1提供了质粒pTrex3g/BP-17的图谱。

图2提供了变体植酸酶的分子量比较。

图3提供了对从里氏木霉(T.reesei)产生的BP17样品和从内切-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因缺失的里氏木霉产生的BP17样品的分析。

图4提供了失活可逆性研究，显示了在pH 4.0下于95℃保持10分钟的不同宿主中表达的BP17的保留活性百分比。

图5提供了在95℃下处理10分钟后，随时间变化的BP-17(从里氏木霉产生)和BP-17(从内切-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因缺失的里氏木霉产生)的保留活性百分比。

图6提供了在将表3的颗粒制剂在90℃和95℃下制丸后所获得的恢复活性(recovered activity)的图。

序列

SEQ ID NO:1＝BP17，与野生型(SEQ ID NO:4)相比包含12个氨基酸置换的变体植酸酶，缺少信号序列(SEQ ID NO:12)。

SEQ ID NO:2＝BP11，与野生型(SEQ ID NO:4)相比包含11个氨基酸置换的变体植酸酶，缺少信号序列(SEQ ID NO:12)。

SEQ ID NO:3＝BP111，与野生型(SEQ ID NO:4)相比包含21个氨基酸置换的变体植酸酶，缺少信号序列(SEQ ID NO:12)。

SEQ ID NO:4＝由以登录号NCIMB 41248保藏的布丘氏菌属菌株P 1-29编码的野生型植酸酶，缺少信号序列(SEQ ID NO:12)。

SEQ ID NO:5＝具有额外的氨基酸置换E121T的BP17。

SEQ ID NO:6＝具有额外的氨基酸置换P394N的BP17。

SEQ ID NO:7＝具有额外的氨基酸置换D386N的BP17。

SEQ ID NO:8＝具有额外的氨基酸置换K202N和N204T的BP17。

SEQ ID NO:9＝具有额外的氨基酸置换Q151N和P153S的BP17。

SEQ ID NO:10＝具有额外的氨基酸置换P373T的BP17。

SEQ ID NO:11＝具有额外的氨基酸置换Q76N的BP17。

SEQ ID NO:12＝野生型(SEQ ID NO:4)的信号序列。

SEQ ID NO:13＝在5'端含有Spe1位点以及在3'端含有Asc1位点的布丘氏菌植酸酶的BP-17变体的DNA序列。

SEQ ID NO:14-17＝引物。

SEQ ID NO:18＝实例1中的PCR产物序列，在cbh1启动子与信号序列/BP-17编码序列之间。

SEQ ID NO:19＝实例1中的PCR产物序列，在BP-17编码序列的3'端与cbh1终止区之间。

SEQ ID NO:20-29＝引物。

SEQ ID NO:30-47＝引物。

具体实施方式

除非另外指明，否则本教导内容的实施将采用分子生物学的常规技术(包括重组技术)、微生物学的常规技术、细胞生物学的常规技术、生物化学的常规技术和动物饲料制丸的常规技术，这些常规技术在本领域技术内。这类技术在例如以下的文献中充分解释：Molecular Cloning:A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)，第二版(Sambrook等人，1989)；Oligonucleotide Synthesis(《寡核苷酸合成》)(M.J.Gait编辑，1984；Current Protocols in Molecular Biology(《现代分子生物学实验技术》)(F.M.Ausubel等人编辑，1994)；PCR:The Polymerase Chain Reaction(《PCR：聚合酶链反应》)(Mullis等人编辑，1994)；Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(《基因转移和表达：实验室手册》)(Kriegler,1990)，以及Fairfield,D.1994.第10章，Pelleting CostCenter.载于：Feed Manufacturing Technology IV(饲料制造技术IV).(McEllhiney编辑)，弗吉尼亚州阿灵顿县的美国饲料行业协会(American Feed Industry Association,Arlington,Va.)，第110-139页。

除非本文另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本教导内容所属领域普通技术人员技术通常所理解的相同的含义。Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(《微生物学和分子生物学词典》)，第二版，纽约约翰威立国际出版公司(John Wiley and Sons,New York)(1994)，以及Hale和Markham,The Harper Collins Dictionary of Biology(《哈珀柯林斯生物学词典》)，纽约哈珀永久出版社(HarperPerennial,NY)(1991)为技术人员提供了许多本发明所用术语的通用词典。与本文所述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料均可用于本教导内容的实践或测试。

本文提供的数字范围包括限定该范围的数字。

除非另外指明，否则分别地，核酸从左至右以5'至3'取向写出；氨基酸序列从左至右以氨基至羧基取向写出。

定义

如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”是同义词，并且可互换使用。在此类氨基酸序列表现出活性的情况下，它们可被称为“酶”。使用常规的氨基酸残基的单字母或三字母代码，其中氨基酸序列以标准的氨基端至羧基端取向(即，N→C)提供。

术语“核酸”涵盖DNA、RNA、异源双链体和能够编码多肽的合成分子。核酸可为单链或双链的，而且可为化学修饰物。术语“核酸”与“多核苷酸”可互换使用。由于遗传密码具有简并性，故可以使用不止一个密码子来编码特定氨基酸，并且本发明组合物和方法涵盖编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。除非另作说明，否则核酸序列是以5'至3'取向给出。

所谓“同源物”，应当意指对象氨基酸序列和对象核苷酸序列具有指定程度的同一性的实体。同源序列被认为包括与对象序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％同一性的氨基酸序列，该同一性使用常规的序列比对工具Clustal V采用默认参数测量。通常，同源物将包括与对象氨基酸序列相同的活性位点残基，但可包括任何数目的保守氨基酸置换。示例性的保守氨基酸置换在如下保守氨基酸置换表中列出。

保守氨基酸置换

如本文所用，术语“植酸酶”意指能够催化磷酸酯(包括植酸盐/植酸)的水解并释放无机磷酸根的蛋白质或多肽。示例性的植酸酶在本教导内容整篇中论述和引用，包括大肠杆菌植酸酶(美国专利6,110,719)，和从多种来源中的任一种获得的那些，所述多种来源包括：子囊菌纲(Ascomycetes)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、黑曲霉(Aspergillusniger)、嗜热真菌属(Thermomyces)、腐质霉属(Humicola)、担子菌纲(Basidiomycetes)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和西方许旺酵母(Schwannniomyces occidentalis)。除了植酸盐外，一些植酸酶还能水解中间程度磷酸化的磷酸肌醇中的至少一些。在一个实施例中，本教导内容中制备的或修饰的活性酶是6-植酸酶。6-植酸酶也称为“4-植酸酶”或“植酸6-磷酸酶”。另外的植酸酶包括组氨酸酸性植酸酶(HAP)，其为包含存在于原核生物中的酶成员(如来自大肠杆菌的appA植酸酶)和真核生物中的酶成员(来自曲霉属(Aspergillus)物种的phyA和phyAB)、来自酵母和植物的HAP植酸酶的一组酶。HAP植酸酶在它们的DNA序列中共同具有处于N末端的活性位点基序RHGXRXP和处于C末端的HD基序。

本植酸酶可以是“前体”、“未成熟的”或“全长的”，在该情形中它们包括信号序列，或可以是“成熟的”，在该情形中它们缺少信号序列。多肽的成熟形式通常是最有用的。除非另有说明，否则本文所用的氨基酸残基位置编号是指各植酸酶多肽的成熟形式。本淀粉酶多肽还可以被截短以移除N末端或C末端，只要所得的多肽保留植酸酶活性。

关于多肽的术语“野生型”、“亲本”或“参考”是指不在一个或多个氨基酸位置处包括人为制造的置换、插入或缺失的天然存在的多肽。类似地，关于多核苷酸的术语“野生型”、“亲本”或“参考”是指不包括人为制造的核苷改变的天然存在的多核苷酸。然而，应注意，编码野生型多肽、亲本多肽或参考多肽的多核苷酸不局限于天然存在的多核苷酸，而涵盖编码野生型多肽、亲本多肽或参考多肽的任何多核苷酸。

关于多肽的术语“变体”是指不同于特定野生型多肽、亲本多肽或参考多肽的多肽，因为其在一个或多个氨基酸位置处包括人为制造的置换、插入或缺失。类似地，关于多核苷酸的术语“变体”是指核苷酸序列不同于指定的野生型多核苷酸、亲本多核苷酸或参考多核苷酸的多核苷酸。野生型、亲本或参考多肽或多核苷酸的身份从上下文来看将是显而易见的。

关于对象细胞、核酸、蛋白质或载体而使用时，术语“重组”表明对象已通过引入异源核酸或蛋白质、或者变更天然的核酸或蛋白质而得到修饰，或者细胞衍生自已经过此类修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达未在天然(非重组)形式的细胞中存在的基因，或者以不同于自然界中存在的水平或条件表达天然基因。

如本文所用，关于细胞使用的术语“转化”、“稳定转化”和“转基因”意指含有整合进其基因组中或作为经多代保留下来的附加体而携带的非天然(如，异源)核酸序列的细胞。

在将核酸序列插入细胞的情况下，术语“引入”意指本领域已知的“转染”、“转化”或“转导”。

“宿主菌株”或“宿主细胞”是表达载体、噬菌体、病毒或其他DNA构建体(包括编码目标多肽(如植酸酶)的多核苷酸)已引入其中的生物体。示例性的宿主菌株是木霉属物种(Trichoderma sp.)。术语“宿主细胞”包括由细胞产生的原生质体。

关于多核苷酸或蛋白质的术语“异源”是指并非天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。

关于多核苷酸或蛋白质的术语“内源”是指天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。

如本文所用，术语“表达”是指基于核酸序列生成多肽的过程。该过程包括转录和翻译二者。

“选择标记”或“可选标记”是指这样的基因，其能够在宿主中表达以有利于选择携带该基因的宿主细胞。可选标记的例子包括(但不限于)抗微生物物质(如潮霉素、博来霉素或氯霉素)和/或赋予宿主细胞代谢益处(如营养益处)的基因。

“载体”是指设计用来将核酸引入一种或多种细胞类型中的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、盒(cassette)等等。

“表达载体”是指包含编码目标多肽的DNA序列的DNA构建体，所述编码序列有效连接至能够实现该DNA在合适宿主中表达的合适控制序列。这种控制序列可包括实现转录的启动子、任选的控制转录的操纵子序列、编码mRNA上的合适核糖体结合位点的序列、增强子和控制转录和翻译终止的序列。

术语“有效连接”意指指定组分处于一种允许它们以预期的方式起作用的关系(包括但不限于并置)。例如，如果编码序列的表达处于调节序列的控制之下则该调节序列与该编码序列有效连接。

“信号序列”是连接至蛋白质的N-端部分的氨基酸的序列，其促进蛋白质分泌至细胞外。细胞外蛋白质的成熟形式没有信号序列，其在分泌过程期间被切除。

“丝状真菌”是指真菌亚门(Eumycotina)和卵菌亚门(Oomycota)的所有丝状形式(参见Alexopoulos,C.J.(1962),Introductory Mycology(《真菌学概论》)，纽约威立出版社(Wiley,New York))。这些真菌表征为细胞壁由几丁质、纤维素和其他复合多糖构成的营养菌丝体。本教导内容的丝状真菌在形态学上、在生理上以及在遗传上有别于酵母。丝状真菌的营养生长是通过菌丝伸长来进行，并且碳分解代谢是专性好氧的。在本教导内容中，丝状真菌亲本细胞可以是木霉属的物种如里氏木霉(此前被分类为长梗木霉(T.Iongibrachiatum)，现在也称为红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))、绿色木霉(Trichoderma viride)、康氏木霉(Trichoderma koningii)或哈茨木霉(Trichodermaharzianum)的细胞。另外的丝状真菌包括曲霉属、镰孢菌属(Fusarium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、青霉属(Penicillium)、腐质霉属(Humicola)、链孢霉属(Neurospora)、毁丝霉属(Myceliophthora)或它们的有性形式如翘孢霉属(Emericella)、肉座菌属(Hypocrea)。

术语“分离的”和“分开的”是指从在自然界中天然与之相关联的至少一种其他材料或组分移出的化合物、蛋白质(多肽)、细胞、核酸、氨基酸或其他指定材料或组分。

如本文所用，术语“纯化的”是指处于相对纯的状态的物质(如，分离的多肽或多核苷酸)，所述相对纯的状态如纯度至少约90％、纯度至少约95％、纯度至少约98％或纯度甚至至少约99％。

如本文所用，术语“修饰”和“变更”可互换使用并且意指改变或变动。在修饰或变更多肽的背景下，这些术语可意指直接改变氨基酸序列或通过改变编码核酸来改变氨基酸序列，或指改变多肽的结构如通过使该酶糖基化。

本文所用的术语“糖基化”是指聚糖连接至分子，例如连接至蛋白质。糖基化可以是酶促反应。所形成的连接可以通过共价键。短语“高度糖基化”是指在全部或几乎全部的可用糖基化位点(例如N-连接糖基化位点)处糖基化的分子如酶。

本文所用的术语“聚糖”是指多糖或低聚糖，或糖缀合物如糖蛋白类的碳水化合物部分。聚糖可以是单糖残基的均聚物或杂聚物。它们可以是直链分子或支链分子。

如本文所用，“表观熔解温度”可通过在多个温度下将酶温育一定的时间来测量。然后在酶的适当测定温度下测量保留的活性。将结果绘图。引起50％残余活性损失的温育温度计算为表观熔解温度。

“饲料”和“食品”分别意指旨在用于或适合于分别由非人动物和人吃、摄取、消化的任何天然的或人工的饮食、膳食等或这类膳食的组分。

如本文所用，术语“食品”在广义上使用-并且涵盖用于人的食品和食物产品以及用于非人动物的食品(即饲料)。

术语“饲料”用于指在动物饲养中喂养给动物的产品。术语“饲料”和“动物饲料”可互换使用。在一个优选的实施例中，食品或饲料是供非反刍动物和反刍动物消费。反刍动物的例子包括乳牛、绵羊、山羊和马。非反刍动物的例子包括单胃动物如猪、家禽(如鸡和火鸡)、鱼(如鲑鱼)、狗、猫和人。

食品或饲料可以是溶液的形式或可以为固体-这取决于用途和/或施加的模式和/或施用模式。在一些实施例中，本文提及的酶可以用作食品或饲料物质或用于食品或饲料物质的制备或生产。

如本文所用，术语“食品或饲料成分”包括制剂，该制剂被或可被添加至食品或饲料并且包括可在广泛产品中以低水平使用的制剂。食品成分可以是溶液的形式或可以为固体-这取决于用途和/或施加的模式和/或施用模式。本文描述的酶可以用作食品或饲料成分或可用于制备或生产。该酶可以是食品补充剂或可以添加至食品补充剂。用于单胃动物的饲料组合物通常包括包含含有植酸盐的植物产品的组合物。这类组合物包括基于玉米粉、大豆粉、菜籽粉、棉籽粉、玉蜀黍、小麦、大麦和高粱的饲料。本文所述的酶可以是(或可添加至)食品或饲料物质和组合物。

用于单胃动物的饲料组合物通常包括包含含有植酸盐的植物产品的组合物。这类组合物包括基于玉米粉、大豆粉、菜籽粉、棉籽粉、玉蜀黍、小麦、大麦和高粱的饲料。本文所述的酶可以是(或可添加至)食品或饲料物质和组合物。

本教导内容还提供了制备食品或饲料成分或补充剂的方法，该方法包括将通过本说明书的工艺制备的酶、或本说明书的经修饰的酶或包含根据本说明书的酶的组合物与另一食品成分一起混合或添加。制备饲料或食品成分的方法是本发明的另一个实施例。这类方法可涉及制丸。为了制备食品或饲料成分，可以固体、诸如预混物之类的制剂或液体的形式添加本说明书的酶。

如本文所用，术语“制丸”和“丸粒”是指为固体、圆形、球形和圆柱形片剂的丸粒(尤其是饲料丸粒和固体、挤出的动物饲料)的制备或使用。已知的饲料制丸制造工艺的一个例子包括：将食品或饲料成分在室温下混合在一起约1至约5分钟，将该混合物转移至储料仓，将该混合物输送至蒸气调理器，任选将蒸气调理过的混合物转移至膨化器，将该混合物转移至制丸磨(pellet mill)或挤出机，最后将该丸粒转移进丸粒冷却器中。Fairfield,D.1994。第10章，Pelleting Cost Center。载于：Feed Manufacturing Technology IV(饲料制造技术IV).(McEllhiney编辑)弗吉尼亚州阿灵顿县的美国饲料行业协会(AmericanFeed Industry Association,Arlington,Va.)，第110-139页。

术语“丸粒”是指已经经受热处理，如蒸气处理，并挤出通过机器的动物饲料组合物(通常源于谷粒)。丸粒可掺入颗粒形式的酶。术语“颗粒”用于由酶和其他化学品如盐和糖构成的粒子，并且可使用多种技术(包括形成多层型颗粒的流化床制粒方法)中的任一种形成。

“NCIMB”是位于苏格兰亚伯丁郡(Aberdeen,Scotland)的生物体保藏所名称，名称为英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心(National Collection of Industrial,food,and Marine Bacteria)。

单数名词包括复数指代，除非上下文清楚表明并非如此。

如本文所用，“内切氨基葡萄糖苷酶”(或内切糖苷酶、内切氨基葡萄糖苷酶、内切N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、ENG酶)是从其他蛋白质如植酸酶移除N连接糖基化的分泌性酶(Stals等人，(2010)FEMS Microbiol.Lett.(《FEMS微生物通讯》)303:9-17)。如本文所用，“ETD”指示酶在内切-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因缺失的宿主中产生。

如本文所用，术语“稳定性”是指其中植酸酶的酶活性或其他功能特性有利地得以维持或改善的多种效果中的任一者。植酸酶可通过显示出改善的“恢复活性”、“热稳定性”和/或“失活可逆性”中的任一者而展现稳定性。

如本文所用，术语“恢复活性”是指(i)处理(涉及以下应激源中的一者或多者：加热、增加的压力、增加的pH、降低的pH、储存、干燥、暴露于表面活性剂、暴露于溶剂和机械应力)后植酸酶的活性与(ii)处理前植酸酶的活性之比。恢复活性可表示为百分比。

恢复活性百分比计算如下：

在制丸实验的语境中，“处理之前的活性”可通过测量未经历处理的糊料中存在的植酸酶活性来估计，测量未经过处理的植酸酶的方式与的确经历过处理的植酸酶相同。例如，以与经处理的糊料中的植酸酶相似的时间和相似的条件操纵和保存未处理的糊料中的植酸酶，以控制指定的处理本身之外的可能的相互作用或其他影响。

如本文所用，术语“失活可逆性”是一种稳定性，其是指暴露于升高的温度，例如高于70℃、高于80℃、高于90℃或高于95℃的酶恢复一定的活性以及显示至少部分地逆转热介导的失活的能力。在移除升高的温度后发生活性恢复。在实例5中更详细地论述了失活可逆性测定法。

如本文所用，结合植酸酶使用的术语“对照植酸酶”是指类型与已添加稳定剂(如通过在去糖基化缺陷型宿主中表达而进行的糖基化)的植酸酶分子相同的植酸酶分子(如BP17植酸酶)，不同的是缺少稳定剂。例如，在一份样品中BP17通过在去糖基化缺陷型宿主中表达来稳定，而在对比的对照植酸酶样品中，唯一的差别是植酸酶BP 17不在去糖基化缺陷型宿主中表达，这种植酸酶为“对照植酸酶”。

如本文所用，“植酸酶活性单位”是每分钟能够释放1μmol磷酸根的酶量。植酸酶活性根据AOAC(分析化学家协会(Association of Analytical Chemists))官方方法2000.12测定，该方法是如如下文献中所述：“Determination of phytase activity in feed by acolorimetric enzymatic method:collaborative interlaboratory study”Engelen AJ,van der Heeft F C,Randsdorp P H,Somers W A,Schaefer J,van der Vat B J.JAOAC Int.(《美国官方分析化学家协会杂志》)2001年五月-六月；84(3):629-33。简而言之，在220mM醋酸钠三水合物、68.4mM脱水氯化钙、0.01％Tween 20,pH 5.5中提取经研磨的样品。然后测定上清液。该测定法测量37℃、pH 5.5下60分钟无机磷酸根从水稻植酸酶的释放。用酸性钼酸盐/钒酸盐试剂终止该测定法，并通过钼钒酸磷的黄色络合物的强度定量磷酸根。

提供如下假想实验来进一步示例和解释本教导内容的术语。这里，表中的单位为了方便而描述为在制丸前以100任意单位的植酸酶活性开始。首先，看最上一行的数据，对于给定的对照植酸酶组合物如天然表达的BP17，在制丸处理后“恢复活性百分比”为50％。其次，看最底下一行数据，对于给定的植酸酶组合物如内切T缺失表达的BP17，在制丸处理后植酸酶的“恢复活性百分比”为80％。再次，看最右边一列，与不在内切T缺失表达宿主中表达的“对照植酸酶”相比，内切T缺失表达的BP17植酸酶的植酸酶活性高60％(80-50＝30；30/50＝.6＝60％)。在一些实施例中，这些改善可伴随热稳定性(例如通过Tm所测量的热稳定性)的改善。在一些实施例中，这些改善可伴随失活可逆性的改善。

	制丸前	制丸后
			对照BP17-天然	100	50
稳定化的BP17-EDT	100	50

示例性的实施例

在一些实施例中，本教导内容涉及由于增加的糖基化而具有增加的稳定性的酶(例如植酸酶)的制备。在一些实施例中，本教导内容涉及酶(例如植酸酶)的修饰或变更以引入或增加糖基化位点的数目。在一些实施例中，这涉及向多肽中引入已知可被识别为N连接糖基化位点的氨基酸基序。

在又一个实施例中，本教导内容还涉及通过制备方法增加酶的糖基化。在一些实施例中，所用的制备方法是在丝状真菌宿主例如木霉属物种真菌如里氏木霉中表达。

本教导内容还涉及酶如植酸酶在变更的宿主中表达，其中所述变更使多种基因中的一种的功能缺失，并且在一些实施例中使内切氨基葡萄糖苷酶基因的功能缺失。

本教导内容还涉及包含本教导内容的经修饰的酶的食品和/或饲料的制备。在一些实施例中，所述食品或饲料是丸粒的形式。

本教导内容还提供制备食品或饲料成分或补充剂的方法，该方法包括将通过本教导内容的工艺制备的植酸酶或包含根据本教导内容的植酸酶的组合物与另一食品成分混合或一起添加。制备食品或食品成分的方法也是本教导内容的另一个实施例。这类方法可涉及制丸。为了制备食品或饲料成分，可以固体、诸如预混物之类的制剂或液体的形式添加本教导内容的酶。固体形式通常在混合步骤之前或期间添加；而液体形式通常在制丸步骤之后添加。

本教导内容的一些实施例是由于糖基化而具有改善的制丸性能的植酸酶。特别是，本教导内容涉及在制丸后保留它们的活性并因而增加动物饲料中的有效磷的水平的热稳定性植酸酶。在一些实施例中，稳定性由失活可逆性引起。在一些实施例中，稳定性由处理如加热后改善的恢复活性引起。

在一个实施例中，待制备或修饰的活性酶是BP17。BP17是布丘氏菌属物种植酸酶的酶变体。用作全部氨基酸的位置位置编号的参照的BP17的序列(不包括信号肽)如下：

SEQ ID NO:1

NDTPASGYQVEKVVILSRHGVRAPTKMTQTMRDVTPNTWPEWPVKLGYITPRGEHLISLMGGFYRQKFQQQGILSQGSCPTPNSI

YVWTDVAQRTLKTGEAFLAGLAPQCGLTIHHQQNLEKADPLFHPVKAGICSMDKTQVQQAVEKEAQTPIDNLNQHYIPSLALMNT

TLNFSKSPWCQKHSADKSCDLGLSMPSKLSIKDNGNEVSLDGAIGLSSTLAEIFLLEYAQGMPQAAWGNIHSEQEWALLLKLHNV

YFDLMERTPYIARHKGTPLLQAISNALNPNATESKLPDISPDNKILFIAGHDTNIANIAGMLNMRWTLPGQPDNTPPGGALVFER

LADKSGKQYVSVSMVYQTLEQLRSQTPLSLNQPAGSVQLKIPGCNDQTAEGYCPLSTFTRVVSQSVEPGCQLQ

在另一个实施例中，待制备或修饰的活性酶是BP11。BP11是布丘氏菌属物种植酸酶的酶变体。BP11的序列(不包括信号肽)如下：

SEQ ID NO:2

YVWTDVDQRTLKTGEAFLAGLAPQCGLTIHHQQNLEKADPLFHPVKAGICSMDKTQVQQAVEKEAQTPIDNLNQHYIPSLALMNT

LADKSGKQYVSVSMVYQTLEQLRSQTPLSLNQPAGSVQLKIPGCNDQTAEGYCPLSTFTRVVSQSVEPGCQLQ

在另一个实施例中，待制备或修饰的活性酶是BP111。BP111是布丘氏菌属物种植酸酶的酶变体。BP111的序列(不包括信号肽)如下：

SEQ ID NO:3

NDTPASGYQVEKVVILSRHGVRAPTKMTQTMRDVTPYTWPEWPVKLGYITPRGEHLISLMGGFYRQKFQQQGILPRGSCPTPNSI

YVWTDVAQRTLKTGEAFLAGLAPQCGLTIHHQQNLEKADPLFHPVKAGICSMDKTQVQQAVEKEAQTPIDNLNQRYIPELALMNT

ILNFSKSPWCQKHSADKPCDLALSMPSKLSIKDNGNEVSLDGAIGLSSTLAEIFLLEYAQGMPQVAWGNIHSEQEWALLLKLHNV

LADKSGKQYVSVSMVYQTLEQLRSQTPLSLNQPPGSVQLKIPGCNDQTAEGYCPLSTFTRVVSQSVEPGCQLQ

所有这些植酸酶均是野生型序列，如衍生自以登录号NCIMB 41248保藏的布丘氏菌属物种菌株P 1-29的序列(具有如下的序列)的变体：

SEQ ID NO:4

YVWADVDQRTLKTGEAFLAGLAPQCGLTIHHQQNLEKADPLFHPVKAGTCSMDKTQVQQAVEKEAQTPIDNLNQHYIPFLALMNT

TLNFSTSAWCQKHSADKSCDLGLSMPSKLSIKDNGNKVALDGAIGLSSTLAEIFLLEYAQGMPQAAWGNIHSEQEWASLLKLHNV

QFDLMARTPYIARHNGTPLLQAISNALNPNATESKLPDISPDNKILFIAGHDTNIANIAGMLNMRWTLPGQPDNTPPGGALVFER

LADKSGKQYVSVSMVYQTLEQLRSQTPLSLNQPAGSVQLKIPGCNDQTAEGYCPLSTFTRVVSQSVEPGCQLQ

上文详细描述的植酸酶是缺少信号序列的成熟蛋白质。衍生自以登录号NCIMB41248保藏的布丘氏菌属物种菌株P 1-29的适当信号序列如下：

SEQ ID NO:12

MTISAFNRKKLTLHPGLFVALSAIFSLGSTAYA

在又一实施例中，本教导内容涉及变更或修饰植酸酶以引入已知可被识别为N连接糖基化位点的基序。在一些实施例中，该基序为Asn-Xaa-Ser/Thr，其中Asn是天冬酰胺(N)，Xaa可以是任何氨基酸，Ser是丝氨酸(S)，Thr是苏氨酸(T)。Ser和Thr是等价的备选。这些变更可以使用诸如定点诱变之类的技术进行。这种变更可涉及将基序Asn-Xaa-Ser/Thr的一个或两个或全部三个氨基酸引入进多肽中。

根据NetNGlyc 1.0预测算法(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)的分析，植酸酶BP17氨基酸序列(SEQ ID NO:1)含有三个潜在的N连接糖基化位点。预计会被糖基化的天冬酰胺残基是成熟植酸酶BP17序列SEQID NO:1的残基N169、N173和N285。

在一个实施例中本教导内容涉及高度糖基化的植酸酶(例如高度糖基化的BP17)或其同源物、变体或衍生物的制备和使用。在一些实施例中，所制备和/或使用的酶与BP17具有超过75％，例如超过80％，例如超过90％以及又如，超过95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的同一性。

本教导内容的一些实施例涉及为BP17引入另外的糖基化位点。具体而言，可给BP17引入如下置换中的一者或多者或全部(参照缺少信号序列的SEQ ID NO:1的位置位置编号)以便引入糖基化位点：E121T、P394N、D386N、K202N和N204T、Q151N和P153S、P373T以及Q76N。

特别是，本教导内容的序列可在相同序列中包含K202N和N204T。在本教导内容的又一个实施例中，本教导内容的序列可在相同序列中包含Q151N和P153S。在本教导内容的又一个实施例中，本教导内容的序列可包含D386N。

如下可构成本教导内容的序列(在每种情况中相对于BP17的氨基酸改变以粗体和下划线示出)，其中已经给BP17(SEQ ID NO:1)引入了氨基酸置换来增加糖基化位点的数目：

SEQ ID NO:5(E121T)

NDTPASGYQVEKVVILSRHGVRAPTKMTQTMRDVTPNTWPEWPVKLGYITPRGEHLISLMGGFYRQKFQQQGILSQGSCPTPNSIYVWTDVAQRTLKTGEAFLAGLAPQCGLTIHHQQNLTKADPLFHPVKAGICSMDKTQVQQAVEKEAQTPIDNLNQHYIPSLALMNTTLNFSKSPWCQKHSADKSCDLGLSMPSKLSIKDNGNEVSLDGAIGLSSTLAEIFLLEYAQGMPQAAWGNIHSEQEWALLLKLHNVYFDLMERTPYIARHKGTPLLQAISNALNPNATESKLPDISPDNKILFIAGHDTNIANIAGMLNMRWTLPGQPDNTPPGGALVFERLADKSGKQYVSVSMVYQTLEQLRSQTPLSLNQPAGSVQLKIPGCNDQTAEGYCPLSTFTRVVSQSVEPGCQLQ

SEQ ID NO:6(P394N)

NDTPASGYQVEKVVILSRHGVRAPTKMTQTMRDVTPNTWPEWPVKLGYITPRGEHLISLMGGFYRQKFQQQGILSQGSCPTPNSIYVWTDVAQRTLKTGEAFLAGLAPQCGLTIHHQQNLEKADPLFHPVKAGICSMDKTQVQQAVEKEAQTPIDNLNQHYIPSLALMNTTLNFSKSPWCQKHSADKSCDLGLSMPSKLSIKDNGNEVSLDGAIGLSSTLAEIFLLEYAQGMPQAAWGNIHSEQEWALLLKLHNVYFDLMERTPYIARHKGTPLLQAISNALNPNATESKLPDISPDNKILFIAGHDTNIANIAGMLNMRWTLPGQPDNTPPGGALVFERLADKSGKQYVSVSMVYQTLEQLRSQTPLSLNQPAGSVQLKIPGCNDQTAEGYCNLSTFTRVVSQSVEPGCQLQ

SEQ ID NO:7(D386N)

NDTPASGYQVEKVVILSRHGVRAPTKMTQTMRDVTPNTWPEWPVKLGYITPRGEHLISLMGGFYRQKFQQQGILSQGSCPTPNSIYVWTDVAQRTLKTGEAFLAGLAPQCGLTIHHQQNLEKADPLFHPVKAGICSMDKTQVQQAVEKEAQTPIDNLNQHYIPSLALMNTTLNFSKSPWCQKHSADKSCDLGLSMPSKLSIKDNGNEVSLDGAIGLSSTLAEIFLLEYAQGMPQAAWGNIHSEQEWALLLKLHNVYFDLMERTPYIARHKGTPLLQAISNALNPNATESKLPDISPDNKILFIAGHDTNIANIAGMLNMRWTLPGQPDNTPPGGALVFERLADKSGKQYVSVSMVYQTLEQLRSQTPLSLNQPAGSVQLKIPGCNNQTAEGYCPLSTFTRVVSQSVEPGCQLQ

SEQ ID NO:8(K202N和N204T)

NDTPASGYQVEKVVILSRHGVRAPTKMTQTMRDVTPNTWPEWPVKLGYITPRGEHLISLMGGFYRQKFQQQGILSQGSCPTPNSIYVWTDVAQRTLKTGEAFLAGLAPQCGLTIHHQQNLEKADPLFHPVKAGICSMDKTQVQQAVEKEAQTPIDNLNQHYIPSLALMNTTLNFSKSPWCQKHSADKSCDLGLSMPSKLSINDTGNEVSLDGAIGLSSTLAEIFLLEYAQGMPQAAWGNIHSEQEWALLLKLHNVYFDLMERTPYIARHKGTPLLQAISNALNPNATESKLPDISPDNKILFIAGHDTNIANIAGMLNMRWTLPGQPDNTPPGGALVFERLADKSGKQYVSVSMVYQTLEQLRSQTPLSLNQPAGSVQLKIPGCNDQTAEGYCPLSTFTRVVSQSVEPGCQLQ

SEQ ID NO:9(Q151N和P153S)

NDTPASGYQVEKVVILSRHGVRAPTKMTQTMRDVTPNTWPEWPVKLGYITPRGEHLISLMGGFYRQKFQQQGILSQGSCPTPNSIYVWTDVAQRTLKTGEAFLAGLAPQCGLTIHHQQNLEKADPLFHPVKAGICSMDKTQVQQAVEKEANTSIDNLNQHYIPSLALMNTTLNFSKSPWCQKHSADKSCDLGLSMPSKLSIKDNGNEVSLDGAIGLSSTLAEIFLLEYAQGMPQAAWGNIHSEQEWALLLKLHNVYFDLMERTPYIARHKGTPLLQAISNALNPNATESKLPDISPDNKILFIAGHDTNIANIAGMLNMRWTLPGQPDNTPPGGALVFERLADKSGKQYVSVSMVYQTLEQLRSQTPLSLNQPAGSVQLKIPGCNDQTAEGYCPLSTFTRVVSQSVEPGCQLQ

SEQ ID NO:10(P373T)

NDTPASGYQVEKVVILSRHGVRAPTKMTQTMRDVTPNTWPEWPVKLGYITPRGEHLISLMGGFYRQKFQQQGILSQGSCPTPNSIYVWTDVAQRTLKTGEAFLAGLAPQCGLTIHHQQNLEKADPLFHPVKAGICSMDKTQVQQAVEKEAQTPIDNLNQHYIPSLALMNTTLNFSKSPWCQKHSADKSCDLGLSMPSKLSIKDNGNEVSLDGAIGLSSTLAEIFLLEYAQGMPQAAWGNIHSEQEWALLLKLHNVYFDLMERTPYIARHKGTPLLQAISNALNPNATESKLPDISPDNKILFIAGHDTNIANIAGMLNMRWTLPGQPDNTPPGGALVFERLADKSGKQYVSVSMVYQTLEQLRSQTPLSLNQTAGSVQLKIPGCNDQTAEGYCPLSTFTRVVSQSVEPGCQLQ

SEQ ID NO:11(Q76N)

NDTPASGYQVEKVVILSRHGVRAPTKMTQTMRDVTPNTWPEWPVKLGYITPRGEHLISLMGGFYRQKFQQQGILSNGSCPTPNSIYVWTDVAQRTLKTGEAFLAGLAPQCGLTIHHQQNLEKADPLFHPVKAGICSMDKTQVQQAVEKEAQTPIDNLNQHYIPSLALMNTTLNFSKSPWCQKHSADKSCDLGLSMPSKLSIKDNGNEVSLDGAIGLSSTLAEIFLLEYAQGMPQAAWGNIHSEQEWALLLKLHNVYFDLMERTPYIARHKGTPLLQAISNALNPNATESKLPDISPDNKILFIAGHDTNIANIAGMLNMRWTLPGQPDNTPPGGALVFERLADKSGKQYVSVSMVYQTLEQLRSQTPLSLNQPAGSVQLKIPGCNDQTAEGYCPLSTFTRVVSQSVEPGCQLQ

与酶来源的野生型酶或酶亲本相比，酶的糖基化程度可增加经修饰的酶热失活的可逆性。

本教导内容的一些实施例提供具有增加的失活可逆性的植酸酶。在一些实施例中，这类酶是糖基化的BP17。在一些实施例中，本教导内容提供具有增加的失活可逆性的包含SEQ ID NO:5、6、7、8、9、10和11的酶或其同源物、变体或衍生物。在一些实施例中，与对照植酸酶相比这类酶具有超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、140％、160％、180％或200％的增加的失活可逆性。

本教导内容还提供编码和能够编码SEQ ID NO:5、6、7、8、9、10和11的多肽或其同源物、变体或衍生物的核酸。

本教导内容可还涉及SEQ ID NO:1-11任一者的酶或通过在该亲本蛋白质的氨基酸序列中置换、缺失或添加一个或数个氨基酸，如2、3、4、5、6、7、8、9个氨基酸或更多个氨基酸，如10个或超过10个氨基酸而衍生自该(亲本)酶且具有该亲本蛋白质的活性的多肽。在一些实施例中，这类酶与SEQ ID NO:1-11具有超过75％，例如超过80％，例如超过90％以及又如，超过95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施例中使该酶糖基化，在一些实施例中这种酶具有增加的处理如加热后的失活可逆性和/或增加的处理如加热后的恢复活性。

本教导内容的又一个方面提供了制备酶，例如其中增加了糖基化或酶被高度糖基化的酶的方法。该酶涉及变更酶的氨基酸序列，或变更编码该酶的核酸，以增加糖基化位点的数目。在一些实施例中，该变更涉及增加N连接糖基化位点的数目。在一些实施例中，这涉及将基序Asn-Xaa-Ser/Thr引入给酶或将编码该位点的序列引入给核酸。在一些实施例中，将一个或两个或三个或更多个糖基化位点引入给酶。

在一些实施例中，本教导内容的酶用于食品或饲料中、用于食品或饲料的制备中和/或用于食品或饲料添加剂或它们的制备中。在一些实施例中，该酶可形成具有其他食品或饲料成分的组合物，或可添加至食品或饲料成分的组合物。在一些实施例中，与用于食品或饲料制备的相当的酶或类似的酶相比，所述酶具有更高的处理如加热后的失活可逆性，和/或改善的处理如加热后的恢复活性。

在历史上植酸酶如BP17(SEQ ID NO:1)被添加至动物饲料来增加磷的有效性从而增加产品的营养价值。饲料的加工，例如在加热和高压下加工，可使植酸酶变性而降低其活性。本教导内容提供更加热稳定的植酸酶，其因而增加饲料中存在的植酸酶活性的加工后水平。在一些实施例中，饲料加工涉及丸粒形成。在另外的实施例中，包含所述植酸酶的丸粒具有增加的加工后的植酸酶活性水平。

制备方法

在另外的实施例中，本教导内容还涉及通过制备方法来增加酶的糖基化。在一些实施例中，所用的制备方法是在丝状真菌宿主中表达，例如在木霉属物种真菌中特别是例如在里氏木霉中表达。

本教导内容还涉及在变更的宿主中表达酶，其中变更已缺失了多种基因中的一种的功能，在一些实施例中已缺失了内切氨基葡萄糖苷酶基因的功能。

在一个实施例中，本教导内容提供植酸酶(在一些实施例中，该植酸酶是BP17，其可被修饰或可未被修饰)在木霉属物种真菌，例如在里氏木霉中的表达和产生，其中内源性内切氨基葡萄糖苷酶基因已缺失。

在一些实施例中，本教导内容涉及具有增加的糖基化的酶(如植酸酶)的制备。在另外的实施例中，增加的糖基化通过使用内切氨基葡萄糖苷酶基因缺失的宿主来支持。在一些实施例中，与使用不同方法，尤其是利用不同宿主物种和/或其中内切氨基葡萄糖苷酶基因未缺失的宿主的方法制备的酶相比，所制备的酶具有增加的失活可逆性。在一些实施例中，与使用不同方法，尤其是利用不同宿主物种和/或其中内切氨基葡萄糖苷酶基因未缺失的宿主的方法制备的酶相比，所制备的酶具有增加的稳定性。

蛋白质如酶若在内源内切氨基葡萄糖苷酶缺失的宿主中产生则糖基化程度较高。根据本教导内容的一些实施例，可通过移除、破坏、干扰或可防止或减少内切氨基葡萄糖苷酶在宿主中表达和产生的任何方法来缺失内切氨基葡萄糖苷酶基因。

在一些实施例中，本教导内容涉及植酸酶在内切氨基葡萄糖苷酶缺失的宿主中表达和产生。在另外的实施例中，植酸酶是BP17或其同源物、变体或衍生物，所述同源物、变体或衍生物例如与BP17(SEQ ID NO:1)或SEQ ID NO:2-11的任一者具有超过75％，例如超过80％，例如超过90％以及又如超过95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施例中，宿主是丝状真菌宿主，例如木霉属物种真菌以及又如里氏木霉。在一些实施例中，与通过其他制备方法制备的植酸酶或未糖基化或未高度糖基化的植酸酶相比，所述植酸酶具有增加的失活可逆性。

在一些实施例中，通过本教导内容的方法制备的酶用于食品或饲料中、用于食品或饲料的制备中和/或用于食品或饲料添加剂或它们的制备中。在一些实施例中，本教导内容的酶可形成具有其他食品或饲料成分的组合物，或可添加至食品或饲料成分的组合物。在一些另外的实施例中，本教导内容的酶具有比食品或饲料制备中所用的其他酶高的失活可逆性。

在一些实施例中，本教导内容的制备方法提供具有增加的失活可逆性的植酸酶，其因而可增加饲料中存在的加工后的植酸酶活性水平。在一些实施例中，饲料加工涉及丸粒形成。在另外的实施例中，包含本教导内容的植酸酶的丸粒具有增加的加工后的植酸酶活性水平。在另外的实施例中，本教导内容的植酸酶更好地能够幸免于制丸工艺并更好地保留加工后的植酸酶活性水平。

颗粒和多层型颗粒

芯、颗粒和多层型颗粒可通过多种制造技术制备，这些技术包括：旋转雾化、湿法制粒、干法制粒、喷雾干燥、圆盘制粒、挤出、锅包衣、滚圆、转鼓制粒、流化床凝聚、高速剪切制粒、流化床喷雾、结晶、沉淀、乳液胶凝、旋转圆盘雾化和其他浇注方法，以及造粒工艺。这些工艺是本领域已知的并在如下专利中描述：美国专利No.4689297和美国专利No.5324649(流化床工艺)；EP656058B1和美国专利No.454332(挤出工艺)；美国专利No.6248706(高速剪切制粒)；以及EP804532B1和美国专利No.6534466(利用流化床制芯和混合器包衣的联合工艺)。

芯是多层型颗粒的内核或是颗粒。用于芯的材料可适用于食品和/或动物饲料中。US20100124586、WO9932595和US5324649详细描述了适用于芯的材料。

在一个实施例中，芯包含一种或多种水溶性或水分散性试剂。合适的水溶性试剂包括但不限于无机盐(如硫酸钠、氯化钠、硫酸镁、硫酸锌和硫酸铵)、柠檬酸、糖(如蔗糖、乳糖、葡萄糖、颗粒状蔗糖、麦芽糖糊精和果糖)、增塑剂(如多元醇、尿素、邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二甲酯)、纤维材料(如纤维素和纤维素衍生物如羟基-丙基-甲基纤维素、羧基-甲基纤维素和羟基-乙基纤维素)、植酸以及它们的组合。合适的分散性试剂包括但不限于：粘土、彩糖球(nonpareils)(糖和淀粉的组合；如淀粉-蔗糖彩糖球-ASNP)、滑石粉、硅酸盐、羧甲基纤维素、淀粉以及它们的组合。

在一个实施例中，芯包含硫酸钠。在另一个实施例中，芯由硫酸钠组成。在一些实施例中，芯可包括植酸酶和/或植酸。在一些实施例中，芯不包含植酸酶。

在一些实施例中，芯涂覆有至少一个涂层。在一个实施例中，芯涂覆有至少两个涂层。在另一个实施例中，芯涂覆有至少三个涂层。在又一个实施例中，芯涂覆有至少四个涂层。

用于涂层中的材料可适用于食品和/或动物饲料。US20100124586、WO9932595和US5324649详细描述了适用于涂层的材料。

在一些实施例中，传统上通过运行以及通过将一层喷涂于下一层的上面来采用流化床制粒工艺，其中仅简单用水冲洗生产线和喷嘴以达成清洁目的，不终止喷涂。在一些实施例中，可通过在每次中间的喷涂结束后让颗粒干燥(在不喷涂的情况下流化)额外的时间周期(如5分钟)(例如在70℃下)来制备颗粒，最终的喷涂后可进行任选的额外干燥(例如70℃下20分钟)。

在一些实施例中，中间的喷涂结束后的额外时间周期是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20或25分钟。在一些实施例中，中间的喷涂结束后的额外时间周期是2-8、3-7或4-6分钟。在一些实施例中，中间的喷涂结束后的额外时间周期的温度是至少50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃。在一些实施例中，中间步骤结束后的额外时间周期的温度是60℃-80℃或65℃-75℃。在一些实施例中，在中间的喷涂结束后干燥步骤在65-75℃下进行4-6分钟。

在一些实施例中，最终的喷涂后的任选干燥可以是至少5、10、15、20、25或30分钟。在一些实施例中，最终的喷涂后的任选干燥可以是5-30或10-25分钟。在一些实施例中，最终的喷涂后的任选干燥的温度是至少50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃。在一些实施例中，最终的喷涂后的任选干燥的温度是至少60℃-80℃或65℃-75℃。在一些实施例中，最终的喷涂后的任选干燥是在65℃-75℃下15-25分钟。

在一个实施例中，涂层包含如下材料中的一种或多种：无机盐(如硫酸钠、氯化钠、硫酸镁、硫酸锌和硫酸铵)、柠檬酸、糖(如蔗糖、乳糖、葡萄糖和果糖)、增塑剂(如多元醇、尿素、邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二甲酯)、纤维材料(如纤维素和纤维素衍生物如羟基-丙基-甲基纤维素、羧基-甲基纤维素和羟基-乙基纤维素)、粘土、彩糖球(糖和淀粉的组合)、硅酸盐、羧甲基纤维素、植酸、淀粉(如玉米淀粉)、脂肪、油(如油菜籽油和石蜡油)、脂质、乙烯基聚合物、乙烯基共聚物、聚乙烯醇(PVA)、增塑剂(如多元醇、尿素、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二甲酯和水)、抗凝聚剂(如滑石粉、粘土、无定形二氧化硅和二氧化钛)、消泡剂(如Foamblast

和Erol

)和滑石粉。US20100124586、WO9932595和US5324649详细描述了适用于涂层的组分。

在一个实施例中，涂层包含糖，如蔗糖。

在一个实施例中，涂层包含聚合物如聚乙烯醇(PVA)。

适于掺入进多层型颗粒的涂层中的PVA包括具有低至高的粘度的部分水解、完全水解的和中等水解的PVA。

在另一个实施例中，涂层包含无机盐，如硫酸钠。

在一个实施例中，至少一个涂层是酶涂层。在一些实施例中，芯涂覆有至少两个酶层。在另一个实施例中，芯涂覆有至少三个酶层。

在一些实施例中，本教导内容的颗粒包含酶涂层。在一些实施例中，酶层包含至少一种酶。在一些实施例中，酶层包含至少两种酶。在一些实施例中，酶层包含至少三种酶。在一些实施例中，酶选自植酸酶、木聚糖酶、磷酸酶、淀粉酶、酯酶、氧化还原酶、脂酶、转移酶、纤维素酶、半纤维素酶、β-葡聚糖酶、氧化酶(如己糖氧化酶和麦芽糖氧化还原酶)、蛋白酶以及它们的混合物。一般来讲，至少一个酶涂层包含至少一种植酸酶和植酸。

在一个实施例中，酶涂层包含至少一种植酸酶和至少一种另外的酶，所述另外的酶选自植酸酶、木聚糖酶、磷酸酶、淀粉酶、酯酶、氧化还原酶、脂酶、转移酶、纤维素酶、半纤维素酶、β-葡聚糖酶、氧化酶(如己糖氧化酶个麦芽糖氧化还原酶)和蛋白酶。

上述酶列表仅仅是例子，无意于排除其他情况。任何酶均可用于本文所述的颗粒中，包括细菌来源、真菌来源、酵母来源、植物来源、昆虫来源和动物来源的野生型酶、重组酶和变体酶，以及酸性酶、中性酶或碱性酶。

在一些实施例中，酶涂层可另外包含一种或多种另外的选自如下的材料：植酸、糖(如蔗糖)、淀粉(如玉米淀粉)、脂肪、油(如油菜籽油和石蜡油)、脂质、烯类聚合物、乙烯基共聚物、聚乙烯醇(PVA)、增塑剂(如多元醇、尿素、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二甲酯和水)、抗凝聚剂(如滑石粉、粘土、无定形二氧化硅和二氧化钛)、消泡剂(如可得自法国莱斯坎Ouvrie PMC公司(Ouvrie PMC,Lesquin,France)的Foamblast

和Erol

)和滑石粉。US20100124586、WO9932595和US5324649详细描述了适用于颗粒的组分。Foamblast

可得自Emerald Foam Control,LLC公司。Foamblast

是用食品级成分制备的去沫剂。

在一个实施例中，酶涂层包含植酸和至少一种植酸酶。换句话讲，将植酸酶和植酸掺入进多层型颗粒的同一层中。

在一个实施例中，多层型颗粒包括包含植酸酶的酶涂层和与该酶层功能邻近的包含植酸的涂层。

在一个实施例中，涂层包含植酸，其中所述涂层与包含植酸酶的芯和/或包含植酸酶的酶涂层功能邻近。

在一个实施例中，多层型颗粒的外涂层包含如下材料中的一者或多者：聚合物(如乙烯基聚合物、聚乙烯醇和乙烯基共聚物)、树胶、蜡、脂肪、油、脂质、卵磷脂、颜料、润滑剂、彩糖球、无机盐(如硫酸钠、氯化钠、硫酸镁、硫酸锌和硫酸铵)、滑石粉和增塑剂(如糖、糖醇和聚乙二醇)。

在一个实施例中，多层型颗粒的外涂层包含无机盐(如硫酸钠)、聚乙烯醇(PVA)、滑石粉或它们的组合。在一个实施例中，外涂层包含聚乙烯醇(PVA)和/或滑石粉。

在一个实施例中，外涂层防止或减少水、水分或蒸汽迁移进酶层的速率或程度。

本文所述的多层型颗粒可通过多种技术来制备，所述多种技术包括：流化床喷雾、锅包衣和通过在起始芯材料(种子)的顶部添加连续层来构建多层型颗粒的其他技术。参见例如US 5324649和US20100124586。在一个实施例中，多层型颗粒用流化床喷雾工艺制备。

在一个实施例中，多层型颗粒包含如下或由如下组成：包含硫酸钠的芯；包含植酸酶、蔗糖、淀粉、植酸和菜籽油或由植酸酶、蔗糖、淀粉、植酸和菜籽油组成的第一涂层；包含硫酸钠或由硫酸钠组成的第二涂层；和包含滑石粉和PVA或由滑石粉和PVA组成的第三涂层。将第一涂层施加至芯，然后将第二涂层施加至第一涂层，然后将第三涂层施加至第二涂层。

在另一个实施例中，多层型颗粒包含如下或由如下组成：包含硫酸钠的芯；包含植酸酶、蔗糖、淀粉、植酸和消泡剂(如Foamblast

)或由它们组成的第一涂层；包含硫酸钠或由硫酸钠组成的第二涂层；和包含滑石粉和PVA或由滑石粉和PVA组成的第三涂层。将第一涂层施加至芯，然后将第二涂层施加至第一涂层，然后将第三涂层施加至第二涂层。

实施例的组合

在又一个实施例中，可组合本教导内容的各方面。换句话讲，可在变更的宿主(例如其中已经缺失内切氨基葡萄糖苷酶基因的宿主)中产生已经通过变更氨基酸序列进行修饰来增加糖基化位点的数目的本教导内容的植酸酶。这可使该酶的糖基化程度最大化。在一些实施例中，宿主是木霉属物种真菌，例如里氏木霉。

在一些实施例中，在变更的宿主中表达的酶是植酸酶，例如BP17(SEQ ID NO:1)或野生型植酸酶如SEQ ID NO:4，或者SEQ ID NO:2、3、5-11中任一者的经修饰的植酸酶或它们的同源物、变体或衍生物，所述同源物、变体或衍生物例如与BP17(SEQ ID NO:1)或SEQID NO:2-11任一者具有超过75％，例如超过80％，例如超过90％，以及又如超过95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

特别是，本教导内容的酶和/或通过本教导内容的方法制备的酶代表性的酶特性改善可导致食品或饲料加工条件下的酶稳定性、导致胃通过期间的酶稳定性以及导致人或动物胃和/或肠道中的酶活性和稳定性，从而使改善的变体尤其适合用作饲料补充剂。因而，这类改善包括增加的在暴露于升高的温度，在一些实施例中，在高于65℃、高于75℃、高于85℃的温度下以及在另外的实施例中在高于95℃的温度下后所引起的失活可逆性和/或恢复活性。另外，影响的其他参数可包括对抗蛋白水解消化(例如消化道的蛋白酶如胃蛋白酶)的稳定性增加、在低pH下的催化活性(例如低于pH 5.5下的催化活性)的增加以及从植酸盐(以及在一些例子中还有磷酸肌醇)释放磷酸根基团的总体效率。

在本教导内容的另一个实施例中，提供制备食品或动物饲料的方法。动物饲料通常在饲料磨机中制备，在磨机中首先将原料研磨成合适的粒度，然后与适当的添加剂混合。可将本教导内容的酶或通过本教导内容的方法制备的酶添加至饲料成分。然后制备作为糊料或丸粒的饲料；后者通常涉及将温度升高至目标水平并随后使饲料通过模具以产生特定尺寸的丸粒的方法。随后，可添加液体添加剂如脂肪和酶。在运送之前让丸粒冷却。动物饲料的制备还可涉及包括挤出在内的额外步骤。

另一个实施例本教导内容提供制备包含植酸酶变体的动物饲料的方法，所述方法包括如下连续的步骤：i)进行上述制备植酸酶变体的方法中的一种或多种，以及ii)将所制备的植酸酶变体添加至动物饲料。在一些实施例中，饲料组合物包含浓度为10-10000U/kg饲料、200-2000U/kg饲料或500-1000U/kg饲料的植酸酶。

实例

如下实例旨在示例本教导内容的一些实施例。

实例1布丘氏菌植酸酶BP-17在里氏木霉宿主细胞中的表达

植酸酶BP-17表达载体的构建。

将由GeneArt AG(德国雷根斯堡(Regensburg,Germany))合成的DNA用作模板(SEQID NO:13)通过聚合酶链反应(PCR)扩增布丘氏菌植酸酶的BP-17变体(US2009098249A1)的开放阅读框。

ACTAGTGTCGCCGTGGAGAAGCGCAACGACACCCCCGCCAGCGGCTACCAGGTCGAGAAGGTCGTCATCCTCAGCCGCCACGGCGTCCGCGCCCCTACCAAGATGACCCAGACCATGCGCGACGTCACCCCCAACACCTGGCCCGAGTGGCCCGTCAAGCTCGGCTACATCACCCCTCGCGGCGAGCACCTCATCAGCCTCATGGGCGGCTTCTACCGCCAGAAGTTCCAGCAGCAGGGCATCCTCAGCCAGGGCTCGTGCCCCACCCCCAACAGCATCTACGTCTGGACCGACGTCGCCCAGCGCACCCTCAAGACCGGCGAGGCCTTCCTCGCCGGCCTCGCCCCCCAGTGCGGCCTCACCATCCACCACCAGCAGAACCTCGAGAAGGCCGACCCCCTCTTCCACCCCGTCAAGGCCGGCATCTGCAGCATGGACAAGACCCAGGTCCAGCAGGCCGTCGAGAAGGAGGCCCAGACCCCCATCGACAACCTCAACCAGCACTACATCCCCAGCCTCGCCCTCATGAACACCACCCTCAACTTCAGCAAGAGCCCCTGGTGCCAGAAGCACAGCGCCGACAAGAGCTGCGACCTCGGCCTCAGCATGCCCAGCAAGCTCAGCATCAAGGACAACGGCAACGAGGTCTCCCTCGACGGCGCTATCGGCCTCAGCTCCACCCTCGCCGAGATCTTCCTCCTCGAGTACGCCCAGGGCATGCCTCAGGCCGCCTGGGGCAACATCCACAGCGAGCAGGAGTGGGCCCTCCTCCTCAAGCTCCACAACGTCTACTTCGACCTCATGGAGCGCACCCCCTACATCGCCCGCCACAAGGGCACCCCCCTCCTCCAGGCCATCAGCAACGCCCTCAACCCCAACGCCACCGAGAGCAAGCTCCCCGACATCAGCCCCGACAACAAGATCCTCTTCATCGCCGGCCACGACACCAACATCGCCAACATCGCCGGCATGCTCAACATGCGCTGGACCCTCCCCGGCCAGCCCGACAACACCCCCCCTGGCGGCGCTCTCGTCTTTGAGCGCCTCGCCGACAAGTCCGGCAAGCAGTACGTCAGCGTCAGCATGGTCTACCAGACCCTCGAGCAGCTCCGCAGCCAGACCCCCCTCAGCCTCAACCAGCCTGCCGGCAGCGTCCAGCTCAAGATCCCCGGCTGCAACGACCAGACCGCCGAGGGCTACTGCCCCCTCAGCACCTTCACCCGCGTCGTCAGCCAGAGCGTCGAGCCCGGCTGCCAGCTCCAGTAAGGCGCGCC(SEQ ID NO:13)。

所使用PCR仪是Peltier Thermal Cycler PTC-200(MJ Research公司)。该PCR中所用的DNA聚合酶是Herculase(Stratagene公司)。用于扩增植酸酶开放阅读框的引物为引物TSK680(正向引物)5'-CACCATGCAGACCTTCGGTGCTTTTCTCGTTTCCTTCCTCGCCGCCAGCGGCCTGGCCGCGGCCAACGACACCCCCGCCAGC-3'(SEQ ID NO:14)和引物SK6 5'-CCTTACTGGAGCTGGCAG-3'(SEQ ID NO:15)。

正向引物在5'端含有额外的克隆进pENTRY/D-TOPO载体(英杰公司(Invitrogen))所需的四个氨基酸(序列–CACC)和编码引导植酸酶BP-17分泌的天然里氏木霉信号序列的序列。

用于扩增布丘氏菌植酸酶开放阅读框的PCR条件如下：步骤1：94℃1分钟。步骤2：94℃30秒。步骤3：58℃30秒。步骤4：72℃5分钟。重复步骤2-4 30个循环。步骤5：4℃储存。使用Qiaquick凝胶纯化试剂盒(Qiaquick Gel Purification Kit)(凯杰公司(Qiagen))纯化PCR产物。最初将纯化的PCR产物克隆进pENTRY/D TOPO载体(英杰公司)中，并转化进TOP 10化学感受态大肠杆菌细胞(英杰公司)中。使用LR克隆酶II(英杰公司)根据制造商的说明书将具有正确的植酸酶开放阅读框序列的pENTR/D-TOPO载体与pTrex3g载体重组以产生pTrex3g/BP-17(参见图1)。

将质粒pTrex3g/BP-17用作制备PCR的模板，该PCR使用引物SK7455'-GAGTTGTGAAGTCGGTAATCC(SEQ ID NO:16)和SK746 5'-CTGGAAACGCAACCCTGAAG(SEQ ID NO:17)，并用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化大约5.8kb的DNA片段(植酸酶BP-17表达盒)。

更具体地讲，该PCR产物含有如下DNA片段：

1.里氏木霉cbh1启动子区。该启动子序列始于cbh1起始密码子上游大约1500bp的位置，终于cbh1起始密码子上游16bp。

2.序列atcacaagtttgtacaaaaaagcaggctccgcggccgcccccttcacc(SEQ ID NO:18)是在cbh1启动子与信号序列/BP-17编码序列之间。该序列以粗体示出的部分是25bp的λ噬菌体attB1重组位点(attB1)。

3.合成的编码成熟布丘氏菌植酸酶变体的编码区(1242bp)，直接融合至信号序列(60bp)的末端。

4.序列ggaagggtgggcgcgccgacccagctttcttgtacaaagtggtgatcgcgcc(SEQ ID NO:19)介于BP-17编码序列的3'端与cbh1终止区之间。该序列以粗体示出的部分是25bp的λ噬菌体attB重组位点(attB2)。

5.天然的里氏木霉cbh1终止区(356bp)紧接在植酸酶的编码区之后。

6.构巢曲霉(Aspergillus nidulans)基因组DNA的2.75kb片段，包括amdS(乙酰胺酶)基因的启动子、编码区和终止子。该片段始于天然存在的SspI位点，紧邻天然存在的XbaI位点之前结束。

用植酸酶BP-17表达盒转化里氏木霉菌株

WO05/001036中描述了四基因缺失的里氏木霉菌株(Δcbh1,Δcbh2,Δegl1,Δegl2)。使用

等人(

M.,Nevalainen,H.,Ratto,M.,Salminen,E.和Knowles,J.1987.A versatile transformation system for the cellulolytic filamentousfungus Trichoderma reesei.Gene(《基因》)61:155-164)描述的转化方法用植酸酶BP-17表达盒转化该菌株。

在含有乙酰胺作为唯一氮源的选择培养基(山梨醇218g/l；乙酰胺0.6g/l；氯化铯1.68g/l；葡萄糖20g/l；磷酸二氢钾15g/l；硫酸镁七水合物0.6g/l；脱水氯化钙0.6g/l；硫酸亚铁(II)5mg/l；硫酸锌1.4mg/l；氯化钴(II)1mg/l；硫酸锰(II)1.6mg/l；琼脂20g/l；pH4.25)上选择转化株。约1周后出现转化菌落。将单独的转化株转移至新鲜的乙酰胺选择板上并让其生长2-4天。

将在选择培养基上显示稳定生长的分离株用于接种250ml摇瓶中的50ml的乳糖确定成分培养基((NH₄)₂SO₄ 5g/l；PIPPS缓冲液33g/l；Bacto酪蛋白氨基酸9g/l；KH₂PO₄ 4.5g/l；CaCl₂*2H₂O 1.32g/l；MgSO₄*7H₂O 1g/l；Mazu DF204 5ml/l；400X痕量元素2.5ml/l；pH5.5；乳糖(独立灭菌)16g/l。400X痕量元素溶液：柠檬酸(无水)175g/l；FeSO₄*7H₂O 200g/l；ZnSO₄*7H₂O 16g/l；CuSO₄*5H₂O 3.2g/l；MnSO₄*4H₂O 1.4g/l；H₃BO₃ 0.8g/l)。将摇瓶在28℃下摇动4-5天。

通过过滤分离培养基并在十二烷基硫酸钠的存在下通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析。根据氨基酸序列观察到具有大概的植酸酶BP-17的预计迁移率的新蛋白质带。鉴定了产生高的量的植酸酶的转化株。将使用WO2004/035070中描述的方法由该转化株在14L生物反应器中产生的植酸酶用于后续的研究。

实例2布丘氏菌植酸酶BP-17在内切氨基葡萄糖苷酶基因缺失的里氏木霉宿主细胞中的表达

构建里氏木霉内切氨基葡萄糖苷酶基因的破坏盒。

里氏木霉内切氨基葡萄糖苷酶基因编码从糖蛋白切除N连接聚糖的分泌性酶。使用WO 2006/050584中提供的信息，其在里氏木霉的基因组序列中得以鉴定(http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html)。通过PCR使用引物SK915(5'-CTGATATCCTGGCATGGTGAATCTCCGTG-3')(SEQ ID NO:20)和SK916(5'-CATGGCGCGCCGAGGCAGATAGGCGGACGAAG-3')(SEQ ID NO:21)扩增其5'旁侧区(1.9Kb)。通过PCR使用引物SK917(5'-CATGGCGCGCCGTGTAAGTGCGTGGCTGCAG-3')(SEQ ID NO:22)和SK918(5'-CTGATATCGATCGAGTCGAACTGTCGCTTC-3')(SEQ ID NO:23)扩增其3'旁侧区(1.7Kb)。在所有PCR反应中将PfuII Ultra(Stratagene)用作聚合酶。

使用QIAquick PCR纯化试剂盒(凯杰公司)遵循手册中列出的规程纯化PCR反应的产物。用限制性内切核酸酶AscI消化这两个扩增的DNA片段，然后用QIAquick试剂盒纯化消化的DNA。将两个DNA片段混合并用作融合PCR反应的模板，该PCR反应使用引物SK915和SK918。使用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(英杰公司)将该反应的产物(3.6kbDNA片段)克隆进pCR-Blunt II TOPO载体中。通过限制分析确认所得的质粒的结构(pCR-BluntII-TOPO(5'-3'旁侧区))。

使用PCR引物SK949(5'-GTTTCGCATGGCGCGCCTGAGACAATGG-3')(SEQ ID NO:24)和SK946(5'-CACAGGCGCGCCGATCGCCATCCCGTCGCGTC-3')(SEQ ID NO:25)以及使用pTrex-葡糖淀粉酶载体(WO 2008/039370，实例2)作为模板，扩增赋予氯嘧磺隆抗性的里氏木霉乙酰乳酸合成酶(ALS)基因的突变体形式(WO 2008/039370)。将该PCR反应的产物用QIAuick试剂盒纯化，用AscI消化，再次纯化并与用相同酶消化并类似纯化的pCR-BluntII-TOPO(5'-3'旁侧区)连接。通过限制分析确定插入物在所得的质粒pCR-BluntII-TOPO(5'旁侧区-ALS标记-3'旁侧区)中的取向。

使用相同的技术以及引物MC40(5'-CTATGACATGCCCTGAGGCGATGCTGGCCAGGTACGAGCTG-3')(SEQ ID NO:26)和MC41(5'-CAGCCTCGCGGTCACAGTGAGAGGAACGGGGTGAAGTCGTATAAG-3')(SEQ ID NO:27)，扩增额外的里氏木霉染色体序列片段(称为“3'-重复”)。

该序列在里氏木霉上位于pCR-BluntII-TOPO(5'-3'旁侧区)内含有的3'-旁侧区的更下游。使用In-Fusion Dry-Down PCR克隆试剂盒(Clontech公司)将该PCR的0.46kb产物(3'-重复)克隆进pCR-BluntII-TOPO(5'旁侧区-ALS标记-3'旁侧区)中的ALS基因的上游。用Pas I和BstEII消化pCR-BluntII-TOPO(5'旁侧区-ALS标记-3'旁侧区)来用作载体以克隆进3'重复中。将所得的构建体pCR-BluntII-TOPO(5'旁侧区-ALS标记-3'重复-3'旁侧区)用作PCR的模板，该PCR使用引物SK1008(CTAGCGATCGCGTGTGCACATAGGTGAGTTCTCC)(SEQID NO:28)和SK1009:(CTAGCGATCGCGCAGACTGGCATGCCTCAATCAC)(SEQ ID NO:29)。

使用来自英杰公司的对应试剂盒将7.5kb DNA产物克隆进pCR-BluntII-TOPO载体中。用AsiSI消化所得的质粒并通过制备型琼脂糖凝胶电泳纯化7.5kb DNA片段(内切氨基葡萄糖苷酶缺失盒)。

破坏里氏木霉中的内切氨基葡萄糖苷酶基因。

等人(

M.,Nevalainen,H.,Ratto,M.,Salminen,E.和Knowles,J.1987.A versatile transformation system for the cellulolytic filamentousfungus Trichoderma reesei.Gene(《基因》)61:155-164)描述的转化方法，用以SEQ IDNO:30列出的缺失盒转化该菌株。在含有200ppm氯嘧磺隆的改良Vogel’s培养基(WO 2008/039370)上选择转化株。在液体培养基中培养转化株并通过SDS凝胶电泳分析培养物上清液。

鉴定了两个克隆(#11和#74)，其在凝胶上的大多数蛋白质条带的迁移率中展现出向上偏移。从这两个菌株以及亲本四基因缺失里氏木霉菌株分离染色体DNA。使用引物对MC42加MC 48(5'-CTCGCCATCTGACAACCTACAAATC-3'(SEQ ID NO:30)和5'-CTAGTACCCTGAGTTGTCTCGCCTCC-3')(SEQ ID NO:31))以及MC 45加MC 50(5'-CCTCTACCATAACAGGATCCATCTG-3'(SEQ ID NO:32)和5'-CGTGAGCTGATGAAGGAGAGAACAAAGG-3'(SEQ ID NO:33))对这些DNA制备物进行PCR分析。

使用分离自克隆#74的DNA获得了具有预计大小(2.9和2.3kb)的产物。让该克隆经受连续两轮的纯化(通过分离单个胞子的子代)。从纯化的转化株#74分离DNA。重复PCR分析，从而确认内切氨基葡萄糖苷酶基因的成功缺失。

用植酸酶BP-17表达盒转化内切氨基葡萄糖苷酶缺失的里氏木霉菌株

将刚采集的内切氨基葡萄糖苷酶缺失的里氏木霉菌株悬浮于冰冷的1.2M山梨醇中，用相同溶液洗涤两次并用植酸酶BP-17表达盒进行电穿孔。电穿孔参数如下：电压：-16kV/cm；电容：-25μF；电阻：-50Ω。电穿孔后，将孢子涂布接种于含有乙酰胺作为唯一氮源的选择培养基(乙酰胺0.6g/l；氯化铯1.68g/l；葡萄糖20g/l；磷酸二氢钾15g/l；硫酸镁七水合物0.6g/l；脱水氯化钙0.6g/l；硫酸亚铁(II)5mg/l；硫酸锌1.4mg/l；氯化钴(II)1mg/l；硫酸锰(II)1.6mg/l；琼脂20g/l；pH 4.25)上。约1周后出现转化菌落。将单独的转化株转移至新鲜的乙酰胺选择板上并让其生长2-4天。

将表现出在选择培养基上稳定生长的分离株用于接种在孔底部配备有微过滤器的微量滴定板(Millipore MultiScreen-GV^TM)孔中的0.17ml乳糖成分确定培养基((NH₄)₂SO₄ 5g/l；PIPPS缓冲液33g/l；Bacto酪蛋白氨基酸9g/l；KH₂PO₄ 4.5g/l；CaCl₂*2H₂O1.32g/l；MgSO₄*7H₂O 1g/l；Mazu DF204 5ml/l；400X痕量元素2.5ml/l；pH 5.5；乳糖(独立灭菌)16g/l。400X痕量元素溶液：柠檬酸(无水)175g/l；FeSO₄*7H₂O 200g/l；ZnSO₄*7H₂O16g/l；CuSO₄*5H₂O 3.2g/l；MnSO₄*4H₂O 1.4g/l；H₃BO₃ 0.8g/l)。将板在纯氧气氛中于25-28C下温育4-5天。

通过过滤分离培养基并在十二烷基硫酸钠的存在下通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析。观察到一个新的蛋白质条带，该条带具有的蛋白质的预计迁移率高于通过BP-17的氨基酸序列预计的迁移率。将该较高的观察分子量假定是由于糖基化。鉴定了产生高的量的植酸酶的转化株。将使用WO2004/035070中描述的方法由该转化株在14L生物反应器中产生的植酸酶用于后续的研究。

实例3-植酸酶BP17的糖基化突变体的产生

根据NetNGlyc 1.0预测算法(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)的分析，植酸酶BP-17氨基酸序列含有三个潜在的N连接糖基化位点。这些糖基化位点是SEQID NO:1的成熟植酸酶BP-17序列的残基N169、N173和N285(参照SEQ ID NO:1的位置位置编号)。

使用定点诱变方法将突变引入植酸酶BP-17编码区的DNA中。将含有信号序列和植酸酶BP-17开放阅读框的质粒pENTRY/D TOPO(如实例1中所述)用作PCR的模板，该PCR使用设计用于在BP-17DNA序列中引入改变的引物。所述突变旨在在BP-17分子的表面上引入新的糖基化位点。每个BP-17变体因而在氨基酸序列中具有改变，所述改变可引入已知可被识别为N连接糖基化位点的新Asn-Xaa-Ser/Thr基序。产生了BP-17的7种不同的变体。下面的表列出了氨基酸改变和用于定点诱变的寡核苷酸。氨基酸位置编号是基于成熟BP-17序列(SEQ ID NO:1)。

用于定点诱变的PCR条件如下。PCR混合物含有37ul H₂O、5ul 10X PfuUltra II反应缓冲液、2ul 10mM dNTP混合物、1ul(9ng)pENTR/D TOPO BP-17、2ul的10uM寡核苷酸1、2ul的10uM寡核苷酸2、1ul(2.5个单位)PfuUltra II Fusion HS DNA聚合酶(Stratagene公司)。PCR条件为：95℃下30秒；然后是18个循环的：95℃下30秒、55℃下1分钟、68℃下8分钟。在PCR后添加1ul的DpnI限制性内切核酸酶并在37C下温育1小时。使用Qiagen PCR纯化柱根据制造商的用法说明书纯化PCR产物。最后，用该PCR产物转化大肠杆菌细胞(One ShotTOP10化学感受态大肠杆菌，英杰公司)。

定点诱变后，将具有不同BP-17变体的pENTR/D TOPO的单独克隆进行DNA序列分析以确认预计的突变已实现。使用LR克隆酶II(英杰公司)根据制造商的说明书使具有验证过的植酸酶BP-17变体开放阅读框序列的每个pENTR/D-TOPO载体与pTrex3g载体重组以产生pTrex3g/BP-17E121T、pTrex3g/BP-17P394N、pTrex3g/BP-17D386N、pTrex3g/BP-17K202NN204T、pTrex3g/BP-17Q151N P153S、pTrex3g/BP-17P373T和pTrex3g/BP-17Q76N。

七种不同的成熟BP-17变体的氨基酸序列公开为SEQ ID NO:5(E121T)、SEQ IDNO:6(P394N)、SEQ ID NO:7(D386N)、SEQ ID NO:8(K202N和N204T)、SEQ ID NO:9(Q151N和P153S)、SEQ ID NO:10(P373T)和SEQ ID NO:11(Q76N)。在每种情形中，相对于BP-17的氨基酸改变在括号中示出，参照SEQ ID NO:1的位置位置编号。

使用来自伯乐公司(Bio-Rad)(加利福尼亚州的赫尔克里(Hercules,CA))的Biolistic PDS-1000/He粒子递送系统(Biolistic PDS-1000/He Particle DeliverySystem)，将所得的不同BP-17变体表达载体插入进里氏木霉的内切氨基葡萄糖苷酶缺失的菌株(ETD菌株)中。所用的转化规程是如Foreman(WO 2005/001036)所描述的。用于分离转化株的选择培养基含有作为唯一氮源的乙酰胺(乙酰胺0.6g/l；氯化铯1.68g/l；葡萄糖20g/l；磷酸二氢钾15g/l；硫酸镁七水合物0.6g/l；脱水氯化钙0.6g/l；硫酸亚铁(II)5mg/l；硫酸锌1.4mg/l；氯化钴(II)1mg/l；硫酸锰(II)1.6mg/l；琼脂20g；pH 4.25)。在约5天后出现转化的菌落。将单独的转化株转移至新鲜的乙酰胺选择板上并让其生长2-4天。

将表现出在选择培养基上稳定生长的分离株用于接种在孔底部配备有微过滤器的微量滴定板(Millipore MultiScreen-GV^TM)孔中的0.17ml乳糖成分确定培养基((NH₄)₂SO₄ 5g/l；PIPPS缓冲液33g/l；Bacto酪蛋白氨基酸9g/l；KH₂PO₄ 4.5g/l；CaCl₂*2H₂O1.32g/l；MgSO₄*7H₂O 1g/l；Mazu DF204 5ml/l；400X痕量元素2.5ml/l；pH 5.5；乳糖(独立灭菌)16g/l。400X痕量元素溶液：柠檬酸(无水)175g/l；FeSO₄*7H₂O 200g/l；ZnSO₄*7H₂O16g/l；CuSO₄*5H₂O 3.2g/l；MnSO₄*4H₂O 1.4g/l；H₃BO₃ 0.8g/l)。将板在纯氧气氛中于25C-28C下温育4-5天。通过过滤分离培养基并在十二烷基硫酸钠的存在下通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析。观察到一个新的蛋白质条带，该条带具有的蛋白质的预计迁移率高于通过BP-17的氨基酸序列预计的迁移率。将该较高的观察分子量假定是由于糖基化。

选择产生高的量的植酸酶的具有每个不同BP-17变体的一个转化株。通过SDS-PAGE将来自这些BP-17变体转化株每一者的上清液与含有ETD菌株中产生的植酸酶BP17-ETD的上清液比较(图2)。通过SDS-PAGE上植酸酶条带的迁移率判断，不同的BP-17变体相对于BP17-ETD全部具有增加的聚糖含量，但增加程度不同。选取了BP-17变体中的两种(D386N以及K202N N204T)，它们相对于BP17-ETD在SDS-PAGE上显示出表观分子量的最大增加。将使用WO2004/035070中描述的方法由这两种转化株在14L生物反应器中产生的植酸酶用于后续的研究。

还进行定点诱变反应以产生编码BP-17变体的DNA，该变体具有两个额外的N连接糖基化位点。使用上述条件将具有BP-17变体D386N的质粒pENTR/D TOPO在定点诱变反应中用作模板，该反应使用引物对E121T和E121T-r，或K202NN204T和K202NN204T-r，或BP17R76N和BP17R76N-r。以这种方式，合成了BP-17变体D386N E121T、D386N K202N N204T和D386NQ76N并插入进表达载体pTrex3g中。

使用上述条件将具有BP-17变体Q76N的质粒pENTR/D TOPO在定点诱变反应中用作模板，该反应使用引物对K202NN204T和K202NN204T-r。以这种方式合成了BP-17变体Q76NK202N N204T并插入进表达载体pTrex3g中。

如上所述使用Biolistic PDS-1000/He粒子递送系统将所得的不同BP-17变体表达载体插入进里氏木霉的ETD菌株中。鉴别了在液体培养中产生BP-17变体D386N E121T、D386N K202N N204T、D386N Q76N和Q76N K202N N204T的里氏木霉转化株。与BP-17相比这些变体每一者均具有两个额外的N连接糖基化位点。

使用类似的技术，可以产生与BP-17相比具有三个或更多额外的N连接糖基化位点的BP-17变体。

实例4–通过质谱测定的糖基化程度

进行质谱研究以进一步表征与内切氨基葡萄糖苷酶基因缺失的里氏木霉中产生的BP-17(BP17-ETD)相比较里氏木霉中产生的植酸酶BP-17(BP-17-天然)(SEQ ID NO:1)上存在的糖基化。另外，表征了二者均在菌株ETD菌株中产生的植酸酶BP-17变体D386N(SEQID NO:7)和K202N N204T(SEQ ID NO:8)。

蛋白质N连接去糖基化(内切-H)反应

在50mM醋酸钠，pH 5.5中使用内切糖苷酶H(内切-H，内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶H)以酶促方式进行所有BP-17样品的N-去糖基化。以1/100(w/w)的蛋白质比例将2.0mg/mL的内切-H添加至植酸酶溶液。在37℃下进行去糖基化反应2-3小时。根据供应商建议的标准规程(www.millipore.com)在MALDI-TOF/MS分析之前使反应过的蛋白质样品经受

(Micro C4反相柱)(马萨诸塞州贝德福得市的密理博公司(Millipore,Bedford,MA))净化步骤。内切H消化可移除除了单个N-乙酰基葡糖胺(203Da)之外的N连接聚糖链，该单个N-乙酰基葡糖胺保持连接于蛋白质在糖基化位点处的天冬酰胺残基。

完整蛋白质分子量测定的MALDI-TOF/MS分析

通过使用干滴(dried droplet)方法将等体积(1μL)的样品与芥子酸(Sinapinicacid)基质(在50％乙腈、0.1％甲酸中饱和)共结晶来制备脱盐蛋白质样品供MALDI-TOF/MS分析。使用Voyager DE-STR MALDI-TOF质谱仪(美国加利福尼亚州福斯特城的应用生物系统公司(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA))获得蛋白质质谱。20000-80000m/z范围的MS仪器设定为：线性操作模式，延迟引出模式(delayed extraction mode)，正极性，25kV加速电压，93％栅极电压，以及750纳秒引出延迟时间。将300次激光发射/谱和BSA用作外部校准物。

使用MALDI-TOF/MS分析，对内切H消化之前和之后BP17-天然、BP17-ETD以及ETD菌株中产生的BP-17变体之间进行了比较。在每份样品中存在一组植酸酶蛋白质，其由于糖基化的异质性而存在质量变动。然而，对于每份样品可以鉴别主要的物质，从而有可能指示样品之间N连接聚糖总质量的差异。在内切氨基葡萄糖苷酶基因缺失和不缺失的里氏木霉中产生的植酸酶(BP-17)均糖基化，但糖基化程度不同(表1)。主要的BP17-ETD分子显示与BP17-天然相比质量有大约900Da的增加(47,254Da相比于48,127Da)，假设是由于增加的所连接的N连接聚糖的质量。对于在内切氨基葡萄糖苷酶缺失的菌株中产生的BP-17变体，糖基化的程度更高，酶的总质量为大约50,000Da。

用于精确的蛋白质(BP-17)分子量测定的LC/MS(二苯基柱)分析

所有质谱数据均用与LCQ Advantage MS系统联用的Surveyor^TMLC系统(加利福尼亚州圣荷西市的ThermoFinnigan公司(ThermoFinnigan,SanJose,CA))获取。将Vydac二苯基柱(2.1×150mm)用于所有的BP-17样品，使用40分钟内从0％至70％溶剂B的HPLC梯度，使用200μL/分钟的流量。溶剂A：水中的0.1％TFA，溶剂B：乙腈中的0.08％TFA。数据处理使用Xcalibur软件程序(加利福尼亚州圣荷西市的ThermoFinnigan公司)和用于蛋白质完整质量去卷积的MagTran程序进行。

将LC/MS用于获得植酸酶蛋白质在内切H消化以移除糖基化后的更精确质量。通过内切-H处理，BP17-天然样品和BP17-ETD样品二者均显示出两种植酸酶物质，摩尔质量为等价于连接有2个和3个N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)的BP-17氨基酸序列(理论分子量为45410.8)的45815Da和46020Da。这支持这样的假设：最开始一些植酸酶分子具有连接于表面上的两个位置的N连接聚糖，而一些分子具有连接于表面上的三个位置的N连接聚糖。

内切H消化后，两种BP-17变体(D386N和K202N N204T)显示出等价于连接有3个或4个N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)的BP-17氨基酸序列的摩尔质量。如上面所看到的那样，在内切H处理后，BP-17显示出等价于连接有2个和3个GlcNAc残基的BP-17氨基酸序列的摩尔质量。因而，确认相比于BP17-天然和BP17-ETD这两种变体BP-17分子各有一个额外的N连接聚糖连接于表面。

表1汇总了使用MALDI-TOF/MS和LC/MS技术测定的每份样品中存在的各种物质的分布和鉴定的分子量。

表1：使用和不使用内切-H处理的各种BP-17和BP-17_ETD样品的MS分析。

*来自三份独立样品的测量结果的平均值

实例5–酶学

将如下程序用于纯化植酸酶BP17-天然和植酸酶BP17-ETD。将浓缩的发酵上清液(50ml)施加至用25mM醋酸钠，pH 5.0缓冲液平衡的600mL脱盐色谱柱(通用电气医疗公司(GE Healthcare)PN 17-0034-02，G-25粗介质)上。用超纯水将脱盐的样品(150mL)稀释10倍至1500mL并上样至90ml阳离子-交换色谱柱(通用电气医疗公司PN 17-1087-01，SP琼脂糖HP)上。在用25mM醋酸钠，pH 5.0缓冲液洗涤后，使用基础缓冲液至25mM醋酸钠，pH 5.0缓冲液中的200mM氯化钠的梯度洗脱植酸酶。植酸酶在150-175mM的氯化钠浓度下洗脱。汇集各植酸酶级分，浓缩并用50mM醋酸钠，pH 5.5缓冲液进行缓冲液更换(使用上述脱盐柱)，测定浓度和纯度。使用该程序发现植酸酶样品纯度>95％。

如下使用酶学测定法在96孔微量滴定板(MTP)中测定植酸酶活性。

除非另有说明，否则所有样品均在含有0.25M NaOAc(pH 5.5)、1.3mM CaCl2和0.01％Tween 20的醋酸钠(NaOAc)缓冲液中稀释至0.153mg/mL。其中注意，利用2M NaCl和重新平衡的pH将电导率平衡在12mS/cm。通过酶学pNPP(对硝基苯基磷酸酯，西格玛化工公司(Sigma Chemical))测定法在96孔MTP板中测定植酸酶样品的活性。在NaOAc缓冲液(pH5.5)中使pNPP为60mM。如果需要的话，将样品以2500rpm离心2分钟以移除任何沉淀物。将15uL的植酸酶样品添加至96孔MTP，然后添加181uL的60mM pNPP(在30℃下平衡)。在430nm的吸光度下使用预先设定为30℃的分光光度计(斯派克公司(Spectromax))动态读取MTP板。

失活可逆性测定法。

将100μL 0.153mg/mL植酸酶样品添加至PCR管。然后使用PCR热循环仪在最高至95℃的多个温育温度下对样品进行热处理。十分钟后收集样品并冷却，保持在冰上直至测定时。在已收集所有样品后，在30℃下通过pNPP测定法评估剩余的活性。

在使用植酸酶BP-17的稳定性研究中，观察到在高于大约70℃的温度下一些植酸酶样品的剩余活性随着增加温度而出乎意料地改善(图3)。这种在更加升高的温度(尤其是参见90℃和95℃)下处理后的改善活性对于BP17-ETD植酸酶比对BP17-天然更明显。内切氨基葡萄糖苷酶基因的缺失导致植酸酶BP17-ETD的活性实质性改善。这支持这样的假设：失活可逆性可与糖基化程度相关，并且糖基化可与表达宿主有关。

表观熔解温度(Tm_app)

从稳定性研究计算了pH 4.0和pH 5.5下BP17-天然和BP17-ETD的表观熔解温度(Tm_app)值(pH 4.0研究在图3中示出)并在表2中示出。表达宿主不显著地影响Tm_app，如通过这样的观察结果所示的：BP17-天然或ETD菌株中产生的BP17-ETD具有相同的Tm_app。

表2：pH 4.0和pH 5.5下BP17的表观熔解温度(Tm_app)值.(95℃下的剩余活性百分比在括号中。)

植酸酶失活可逆性的速率

为了表征植酸酶活性改变的时序，进行了稳定性研究并测量了样品随从加热移走后的时间而变化的剩余活性。

图4示出了在95℃下处理10分钟后，并移至室温以在静置于室温下5小时内的多个指明时间点测量的BP17-天然和BP17-ETD随时间变化的剩余活性百分比。这些值是相对于未加热的对照样品而计算的百分比。

在室温下BP17-天然没有显示任何活性增加。然而，在加热处理后BP17-ETD显示出增加的活性，达到未处理样品的活性的19％，较于紧邻热处理后的初始时间点增加8.5％。

当在4℃下保持时在24小时或48小时后样品没有获得进一步的活性(数据未示出)。

实例6-流化床制粒和制丸试验

将植酸酶掺入进颗粒中，这是通常理解为提供对抗后续蒸气处理的一定保护的工艺。然后将这些酶颗粒与动物饲料混合并通过带有蒸气处理的动物饲料制丸机。期望植酸酶在该制丸工艺后保留活性。

为了测定在制丸工艺过程中的植酸酶稳定性，使用美国专利No.5,324,649中描述的流化床喷雾工艺将硫酸钠种子(也称为芯)装进流化床腔室中。通过将蔗糖和玉米淀粉溶解或分散进超滤过的植酸酶浓缩物(UFC)中来制备“1号喷雾剂”。将额外的水添加至该混合物以将总固形物浓度保持为约40％。需要恒定的搅拌来保持玉米淀粉和石蜡油或消泡剂良好分散于酶UFC中。

使用顶喷工艺将1号喷雾剂施加至已装至流化床制粒机的硫酸钠芯。将温度、喷涂率、雾化气压以及其他参数全部进行调节以获得良好收率的1号喷雾剂涂覆于芯上而不使粒子团聚。

后续的喷雾剂(2号喷雾剂、3号喷雾剂等)通过将该喷雾剂溶液的全部组分溶解和/或分散进水中以形成含有大约18至40％固形物的溶液来制备。含有水不能溶解的油、消泡剂或玉米淀粉的喷雾剂需要连续搅拌来保持这些材料良好分散。

在最终的喷雾后收获颗粒并使用植酸酶测定法测定植酸酶活性。

然后将该多层型颗粒与60％玉米粉和40％大豆粉的混合物(即糊料)以60克颗粒对120千克玉米-大豆粉的比率合并使得在制丸前混合物中的最终植酸酶活性大约为5个单位/克。

然后在动物饲料制粒机中将该混合物制丸。将颗粒和玉米-大豆粉在卧式螺带混合机中共混大约15分钟。制丸磨为配备有17.3cm内径模具的单辊型Simon Heesen，丸粒孔直径为3mm。冲模速度为500rpm，由7.5kW马达驱动。通常的进料速率为每小时300kg。调理器中的温度保持在+/-0.1摄氏度，该温度是在调理器的饲料出口处测量。该调理器具有级联型混合机系统。使用两种调理温度：90℃和95℃。蒸气入口压力为2atm，调理器中的温度通过手动调节三个阀来控制，这三个阀控制蒸气递送。在调理器中的驻留时间为大约30秒。当达到目标温度时，该系统运行大约5至10分钟，然后进行采样。采样持续1-1.5分钟的周期，对应于5-7.5kg制丸后的饲料，立刻将样品置于冷却盒中，该冷却盒具有穿孔的底部，空气流量为每小时1500立方米。冷却15分钟后，用分样器将样品缩减两次，取1kg用于实验室测试。

在制丸和冷却后，然后将丸粒磨碎并测定植酸酶活性。将玉米-大豆粉与植酸酶颗粒的未制丸混合物称为“糊料”对照，并也测定植酸酶活性。在90℃或95℃下制丸的酶颗粒中的恢复活性与糊料对照活性之比为恢复活性百分比。

实验室规模制粒和制丸

表3汇总了在制丸试验中制备和测试的颗粒制剂。将大约720克的硫化钠种子装至涂布机，制备各种喷雾剂溶液并如上所述喷雾以制备颗粒。完成批次的颗粒的质量为大约2,000克。

表3

表4

结果

将表3中的制剂在90℃和95℃下制丸后获得的恢复活性在图5中绘出。这里，可以看出，BP17-ETD植酸酶导致90℃和95℃二者下的增加的恢复活性。另一方面，BP17-天然植酸酶显示出制丸后活性实质降低。(表3制剂中淀粉水平或酶固形物的小差异将对这些制剂的制丸性能具有十分小的影响。)

将表4中的制剂在90℃和95℃下制丸后获得的恢复活性在图6中绘出。这里，可以看出由于在BP17蛋白上产生额外的糖基化位点而产生的额外糖基化的效果同样是90℃和95℃下的增加的恢复活性。(表4制剂中酶固形物水平的小差异将对这些制剂的制丸性能具有十分小的影响。)

尽管出于清晰理解的目的已通过举例说明和实例的方式对上述组合物和方法进行了相当详细的描述，但是对于本领域的技术人员而言，可以进行某些更改和修改将是显而易见的。因而，本说明书不应该理解为限制本教导内容的范围，本教导内容的范围由随附的权利要求书界定。

特此将本文所引用的全部出版物、专利以及专利申请全文以引用方式并入以用于所有目的，所引入的程度就如同将每个单独的专利公开、专利或专利申请具体且独立地指出以引用方式这样并入。

Claims

1.重组宿主细胞，其包含核酸序列，所述核酸序列编码细菌植酸酶多肽，所述细菌植酸酶多肽与SEQ ID NO:1相比包含至少一个额外的糖基化位点，其中所述至少一个额外的糖基化位点通过引入氨基酸改变以产生N连接糖基化位点基序Asn-Xaa-Ser/Thr来实现，其中Xaa可以是任何氨基酸，并且所述的宿主细胞是去糖基化缺陷型真菌宿主细胞，且其中所述植酸酶多肽具有SEQ ID NO:7或8的氨基酸序列。

2.一种生产细菌植酸酶多肽的方法，该方法包括培养权利要求1的重组宿主细胞以产生所述植酸酶多肽。

3.根据权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述植酸酶多肽具有一种或多种的以下性质：

(a)与缺少增加的糖基化的对照植酸酶相比暴露于升高的温度后的增加的失活可逆性，其中所述升高的温度是至少90℃或至少95℃；

(b)与缺少增加的糖基化的对照植酸酶相比暴露于至少90℃或至少95℃的升高的温度后的增加的恢复活性；以及

(c)与在至少90℃或至少95℃的升高的温度下暴露之前的植酸酶相比，暴露于所述升高的温度后的恢复活性。

4.根据权利要求3所述的重组宿主细胞，其中所述失活可逆性比缺少增加的糖基化的对照植酸酶高至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。

5.根据权利要求3所述的重组宿主细胞，其中与缺少增加的糖基化的对照植酸酶相比所述增加的恢复活性是至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％或350％。

6.根据权利要求3所述的重组宿主细胞，其中与在所述升高的温度下暴露之前的所述植酸酶相比，所述恢复活性是至少40％、50％、60％、70％、80％、85％或90％。

7.根据权利要求2所述的方法，其中所述植酸酶多肽具有一种或多种的以下性质：

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述失活可逆性比缺少增加的糖基化的对照植酸酶高至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。

9.根据权利要求7所述的方法，其中与缺少增加的糖基化的对照植酸酶相比所述增加的恢复活性是至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％或350％。

10.根据权利要求7所述的方法，其中与在所述升高的温度下暴露之前的所述植酸酶相比，所述恢复活性是至少40％、50％、60％、70％、80％、85％或90％。

11.根据权利要求2所述的方法，其中所述宿主细胞是丝状真菌细胞。

12.根据权利要求2所述的方法，其中所述宿主细胞是曲霉属物种(Aspergillus spp)、镰孢菌属物种(Fusarium spp)、毁丝霉属物种(Myceliophthora spp)或木霉属物种(Trichoderma spp)。

13.根据权利要求2所述的方法，其中所述宿主细胞是黑曲霉(A.niger)、米曲霉(A.oryzae)、构巢曲霉(A.nidulans)、塔宾曲霉(A.tubingensis)或泡盛曲霉(A.awamori)。

14.根据权利要求2所述的方法，其中所述宿主细胞是里氏木霉(T.reesei)。