CN104125778B - 用植酸改善植酸酶的稳定性以及包含植酸酶和植酸的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供改善的方法和包含植酸酶和植酸的组合物。在一些实施例中，改善的植酸酶稳定性得以实现并且在诸如改善的动物饲料组合物之类的领域中采用。所述植酸酶和植酸功能邻近，优选在多层型颗粒或包含这种多层型颗粒的丸粒中。

Description

用植酸改善植酸酶的稳定性以及包含植酸酶和植酸的组合物

优先权

本申请要求2012年2月7日提交的系列号为61/595,923的美国临时专利申请的优先权，特此将该专利以引用的方式并入本文。

技术领域

本教导内容还涉及用植酸稳定植酸酶的方法。本教导内容还涉及包含植酸酶和植酸的组合物、颗粒(granule)、丸粒(pellet)和酶溶液。另外，本教导内容涉及制备包含植酸酶和植酸的组合物的方法；改善植酸酶的稳定性(包括热稳定性)的方法；改善植酸酶的恢复活性(recovered activity)的方法；以及制备热处理食品或动物饲料丸粒的方法。本教导内容还涉及使用本教导内容的组合物、颗粒、丸粒、丸粒改善组合物和酶溶液来制备热处理食品或动物饲料丸粒的方法。

背景技术

活性剂如酶在食品和动物饲料中的使用是普遍的。酶已知可改善食品或动物饲料的消化率、减少食品和动物饲料中的抗营养因子和改善动物生产率。

当与干饲料混合物比较时，饲料丸粒具有受本行业欢迎的性质，如改善的饲料品质、降低的病原体、制造期间较低的粉尘水平、良好的处理性和更均匀的成分配量。

在通过例如热处理、高压、剪切应力和化学处理(如pH、表面活性剂和溶剂)进行的工业食品和饲料加工(如制丸(pelleting))期间可发生酶失活。如果在加工后，例如在蒸气处理和制丸后冷却时，酶再活化，则该失活是至少部分可逆的；如果在加工后，例如在蒸气处理和制丸后冷却时催化活性不恢复，则该失活是不可逆的。酶的不可逆失活和活性降低通常是诸如制丸之类的工艺中不期望的。

优选的工业制丸工艺在称为调理的处理中利用蒸气喷射，其在制丸步骤之前添加水分并提高温度，这迫使蒸气加热的饲料成分或经调理的糊料穿过模具。制丸工艺温度可为约70℃至95℃或更高。

由于制丸工艺中所用的蒸气、温度、压力或化学品，酶的活性或效能在加工和随后的储存过程中通常显著降低。该问题通过这样的事实来说明：饲料酶通常以稳定化的液体产品提供给本行业，在制丸工艺后将该液体产品喷涂在饲料丸粒上以避免酶失活。当在制丸后施加酶(例如通过将酶喷涂于丸粒上)时难以实现均匀的配量，并且在制丸后添加酶的设备费用高。或者，可在制丸之前将液体酶制剂或干混合酶制剂添加至混合器。在某些情况下，可能要添加比原本所需的酶水平高的酶水平来补偿制丸过程中的损失。

在食品和饲料行业中，对在经受蒸气处理制丸工艺的制剂中充当组分而无可测量的酶活性损失的稳定、耐用的酶颗粒剂存在需要。

避免工业过程中不可逆地使酶失活或减少酶活性的问题的方法包括鉴别新的酶来源(如在极端嗜热微生物中鉴别已知的酶)或鉴别使已知酶稳定化的手段。

Klibanov,1983,(Stabilization of Enzymes against Thermal Inactivation,Advances in Applied Microbiology(《应用微生物学进展》)，第29卷，第1-28页)公开说，存在三种使酶稳定的基本手段：(1)固定化，(2)化学修饰和(3)增添添加剂。然而，Klibanov(1983)还公开说，这些方法中的任一种均可导致稳定化或脱稳定化，或根本没有效果。

Pace和Grath(J Biol Chem(《生物化学杂志》)255:3862,1980)声称，酶在其底物、辅酶或与其特异性结合的任何小分子的存在下导致稳定性增加，因为与天然状态结合可改变去折叠平衡而降低酶去折叠状态的浓度。

EP0969089公开说，氨基酸置换可影响植酸酶的稳定性，一些置换具有稳定化效果而另一些则具有失稳效果，并且一些氨基酸置换根本没有效果。

植酸(或当处于盐形式时的植酸盐)存在于许多植物组织尤其是麸皮、种子和谷类中。单胃动物如猪、家禽、鱼和人对植酸磷的消化差，因为它们在肠中缺少或具有低水平的消化酶植酸酶。

EP0619369和US5554399公开了包含植酸酶和酸性磷酸酶的组合物以及该酶组合物在食品、制丸的饲料和草料中的用途。

WO2004071218公开了增加食品中的矿物质的量。WO2004071218公开了包含活性植酸酶、植酸盐和必需的阳离子的制备物。WO2004071218公开说，可将该制备物添加至供人消费的任何食品或饮用品或添加至诸如咖喱粉之类的调味品。

EP0420428公开了通过使用植酸、植酸盐或者植酸或植酸盐的异构体或水解产物(包括肌醇)与脱磷酸化酶组合的混合物来治疗类风湿性关节炎的方法。植酸或植酸盐可吸附于用于施用的固体载体上。对于口服，该组合物还包含脱磷酸化酶如植酸酶。

US4952396公开了通过施用选自植酸、植酸盐、植酸或植酸盐的异构体或水解产物(包括肌醇)的化合物或任何这些化合物的组合的混合物来抑制肿瘤生长的方法。植酸或植酸盐可吸附于用于施用的固体载体上。对于口服，该组合物还包含脱磷酸化酶如植酸酶。

US5112814公开了通过施用选自植酸、植酸盐、植酸或植酸盐的异构体或水解产物(包括肌醇)的化合物或者任何这些化合物的组合的混合物来治疗帕金森氏病的方法。植酸或植酸盐可吸附于用于施用的固体载体上。对于口服，可将该组合物与水解磷酸基团的酶如植酸酶一起使用。

US4758430公开了通过施用选自植酸、植酸盐、植酸或植酸盐的异构体或水解产物的化合物或者任何这些化合物的组合的混合物来治疗阿尔茨海默病的方法。植酸或植酸盐可吸附于用于施用的固体载体上。对于口服，该组合物还包含脱磷酸化酶如植酸酶。

EP0969089公开了使包含植酸酶和一种或多种稳定剂的酶制剂稳定的方法，所述稳定剂选自：C5糖；分子量为600至4000Da的聚乙二醇；丙二酸、戊二酸和琥珀酸的二钠盐；羧甲基纤维素；和海藻酸盐。作为备选，EP0969089公开说，植酸酶可通过与戊二醛交联或通过用高碘酸钠氧化以及与己二酸二肼反应来稳定化。

WO9316175公开了通过添加尿素和/或多元醇如山梨醇和甘油来稳定化并施加至制丸的饲料物质的液体植酸酶制剂。WO9316175的稳定化液体制剂更耐受酶活性的热失活并且可储存更长时间周期，植酸酶活性保持性更好。

Singh和Satyanarayana(Bioresource Technology(《生物资源技术》),2009；100:2046-2051)公开了从嗜热霉菌嗜热侧孢霉(Sporotrichum thermophile)纯化和表征组氨酸酸性磷酸酶(HAP)植酸酶。Singh和Satyanarayana(2009)通过在60℃和80℃、pH 3.0、5.0和7.0缓冲液下温育该植酸酶测定了该酶的热稳定性。Singh和Satyanarayana(2009)测定了80℃下稳定剂甘油、海藻糖、山梨醇和植酸对酶活性的影响。

本教导内容寻求克服这些问题中的一些问题。例如，本教导内容可解决与食品和动物饲料工业过程对植酸酶的影响相关的问题。

为了便于参考，我们在一个或多个标题下描述了本教导内容的要素。注意，在所述标题每一者下的教导内容也适用于其他标题下的教导内容。例如，关于本教导内容的使用的所述实施例和方面的每一者同样是关于本教导内容的方法或本教导内容的组合物。同样地，关于本教导内容的方法或使用的所述实施例和方面的每一者同样是关于本教导内容的组合物的实施例或方面。

发明内容

在一些实施例中，本教导内容提供了增加组合物中植酸酶的稳定性的方法，该方法包括将至少10毫重量摩尔浓度(millimolal)的植酸引入至所述组合物，其中所述植酸酶和所述植酸功能邻近。

在一些实施例中，本教导内容提供了包含植酸和植酸酶的颗粒组合物，其中所述植酸酶和所述植酸功能邻近。

在一些实施例中，本教导内容提供了改善在将固体状态的植酸酶与至少一种食品或动物饲料成分混合并以蒸气处理将所得的混合物制丸后所述植酸酶的恢复活性的方法，该方法包括：将浓度为至少10毫重量摩尔浓度的植酸提供给该植酸酶；将所述植酸酶与至少一种食品或动物饲料成分混合；以及以蒸气处理将所得的混合物制丸，其中与未通过至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶相比，所述植酸酶的恢复活性高至少15％、至少17％、至少19％、至少20％、至少23％、至少25％、至少27％或至少30％。

在一些实施例中，本教导内容提供了包含颗粒的丸粒组合物，其中所述颗粒包含功能邻近的植酸和植酸酶，其中植酸的浓度为至少10毫重量摩尔浓度。

在一些实施例中，本教导内容提供了制备热处理食品或动物饲料丸粒的方法，包括如下步骤：将根据权利要求17-30和32-36中的任一项所述的组合物与至少一种食品或动物饲料成分混合；以及利用蒸气将所得的混合物制丸。

在一些实施例中，本教导内容提供了制造饲料组合物的方法，包括如下步骤：将饲料组分与包括芯和涂层的颗粒混合，其中该芯包含功能邻近的植酸酶和植酸；蒸气处理所述组合物，并将所述组合物制丸。

附图说明

本教导内容将参考如下附图进行描述：

图1示出了相对于制丸之前糊料的植酸酶活性的在90℃或95℃下制丸后获得的恢复植酸酶活性。

图2示出了含有和不含有15mM植酸的0.5mg/ml植酸酶的DSC Tm差示扫描量热法图。

图3示出了含有和不含有15mM肌醇的0.5mg/ml植酸酶的DSC Tm差示扫描量热法图。

图4示出了DSC Tm对植酸浓度的图。(0.5mg/ml植酸酶。)

图5示出了DSC Tm对植酸浓度的图，将BP17 EDT与Ronozyme P-(CT)(来自帝斯曼公司(DSM)的一种市售的植酸酶)进行了比较。

序列

SEQ ID NO:1＝BP17，布丘氏菌属物种(Buttiauxella sp.)的变体植酸酶，与缺少信号序列(SEQ ID NO:12)的野生型(SEQ ID NO:4)相比包含12个氨基酸置换。

SEQ ID NO:2＝BP11，布丘氏菌属物种的变体植酸酶，与缺少信号序列(SEQ IDNO:12)的野生型(SEQ ID NO:4)相比包含11个氨基酸置换。

SEQ ID NO:3＝BP111，布丘氏菌属物种的变体植酸酶，与缺少信号序列(SEQ IDNO:12)的野生型(SEQ ID NO:4)相比包含21个氨基酸置换。

SEQ ID NO:4＝缺少信号序列(SEQ ID NO:12)的由以登录号NCIMB41248保藏的布丘氏菌属菌株P 1-29编码的野生型植酸酶。

SEQ ID NO:5＝具有额外的氨基酸置换E121T的BP17。

SEQ ID NO:6＝具有额外的氨基酸置换P394N的BP17。

SEQ ID NO:7＝具有额外的氨基酸置换D386N的BP17。

SEQ ID NO:8＝具有额外的氨基酸置换K202N和N204T的BP17。

SEQ ID NO:9＝具有额外的氨基酸置换Q151N和P153S的BP17。

SEQ ID NO:10＝具有额外的氨基酸置换P373T的BP17。

SEQ ID NO:11＝具有额外的氨基酸置换Q76N的BP17。

SEQ ID NO:12＝野生型(SEQ ID NO:4)的信号序列。

具体实施方式

除非另外指明，否则本教导内容的实施将采用分子生物学的常规技术(包括重组技术)、微生物学的常规技术、细胞生物学的常规技术、生物化学的常规技术和动物饲料制丸的常规技术，这些常规技术在本领域技术内。这类技术在例如以下的文献中充分解释：Molecular Cloning:ALaboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)，第二版(Sambrook等人，1989)；Oligonucleotide Synthesis(《寡核苷酸合成》)(M.J.Gait编辑，1984；Current Protocols in Molecular Biology(《现代分子生物学实验技术》)(F.M.Ausubel等人编辑，1994)；PCR:The Polymerase Chain Reaction(《PCR：聚合酶链反应》)(Mullis等人编辑，1994)；GeneTransfer and Expression:A Laboratory Manual(《基因转移和表达：实验室手册》)(Kriegler,1990)，以及Fairfield,D.1994.第10章，Pelleting Cost Center.载于：Feed Manufacturing Technology IV(饲料制造技术IV).(McEllhiney编辑)，弗吉尼亚州阿灵顿县的美国饲料行业协会(American Feed Industry Association,Arlington,Va.)，第110-139页。

除非本文另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本教导内容所属领域普通技术人员技术通常所理解的相同的含义。Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(《微生物学和分子生物学词典》)，第二版，纽约约翰威立国际出版公司(John Wiley and Sons,New York)(1994)，以及Hale和Markham,The Harper Collins Dictionary of Biology(《哈珀柯林斯生物学词典》)，纽约哈珀永久出版社(Harper Perennial,NY)(1991)为技术人员提供了许多本发明所用术语的通用词典。与本文所述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料均可用于本教导内容的实践或测试。

本文提供的数字范围包括限定该范围的数字。

除非另外指明，否则分别地，核酸从左至右以5'至3'取向写出；氨基酸序列从左至右以氨基至羧基取向写出。

定义

如本文所用，术语“植酸”是指肌醇六磷酸(IP6)，但是由于IP6通常不以纯的形式存在，所以该术语还涵盖作为IP6的分解代谢产物的磷酸肌醇，包括肌醇五磷酸(IP5)、肌醇四磷酸(IP4)、肌醇三磷酸(IP3)、肌醇二磷酸(IP2)和肌醇一磷酸(IP1)、它们的盐以及它们的混合物。术语“植酸”不指肌醇，肌醇为植酸的完全水解产物(IP0)。因而，术语“植酸”涵盖分解代谢产物、水解产物、盐和类似物(如酯和盐)。如本文所用，术语IP6、IP5、IP4、IP3、IP2、IP1及它们的盐是指该特定肌醇磷酸(盐)的任何异构体。

而处于盐形式的IP6、IP5、IP4、IP3、IP2和IP1通常称为“植酸盐”，如本文所用，术语“植酸”还包括这类植酸盐。植酸盐的抗衡离子通常是钠(如植酸钠)。然而抗衡离子可以是例如钙、镁、铁或锌。

因而，本文所用的术语“植酸”包括对植酸的酸形式和盐形式的指代。在某些实施例中，植酸为酸形式或酸形式的组合。在某些实施例中，植酸为盐形式或盐形式的组合。在某些实施例中，植酸是酸形式(或酸形式的组合)和盐形式(或盐形式的组合)的组合。

如本文所用，术语“毫重量摩尔浓度”是用于液体和固体二者。

用于溶液(液体)的术语“毫重量摩尔浓度”在本文中是如科学文献中定义使用–即溶液的重量摩尔浓度被定义为组分(其在这里为植酸)的摩尔量除以单位为千克的溶剂质量(其在这里为溶液中除了植酸之外的任何东西)。因而，1,000毫重量摩尔浓度等同于1重量摩尔浓度。

在本文中用于固体的“毫重量摩尔浓度”定义为植酸的量(单位为毫摩尔)除以固体(如颗粒的酶层)的溶剂的质量，其中溶剂定义为非植酸固体(如在包含植酸酶和植酸的颗粒酶层中的非植酸固体)。

“饲料”和“食品”分别意指旨在用于或适合于分别由非人动物和人吃、摄取、消化的任何天然的或人工的饮食、膳食等或这类膳食的组分。

如本文所用，术语“食品”在广义上使用-并且涵盖用于人的食品和食物产品以及用于非人动物的食品(即饲料)。

术语“饲料”用于指在动物饲养中喂养给动物的产品。术语“饲料”和“动物饲料”可互换使用。在一个优选的实施例中，食品或饲料是供非反刍动物和反刍动物消费。反刍动物的例子包括乳牛、绵羊、山羊和马。非反刍动物的例子包括单胃动物如猪、家禽(如鸡和火鸡)、鱼(如鲑鱼)、狗、猫和人。

食品或饲料可以是溶液的形式或可以为固体-这取决于用途和/或施加的模式和/或施用模式。在一些实施例中，本文提及的酶可以用作食品或饲料物质或用于食品或饲料物质的制备或生产。

如本文所用，术语“食品或饲料成分”包括制剂，该制剂被或可被添加至食品或食物并且包括可在广泛产品中以低水平使用的制剂。食品成分可以是溶液的形式或可以为固体-这取决于用途和/或施加的模式和/或施用模式。本文描述的酶可以用作食品或饲料成分或可用于制备或生产。该酶可以是食品补充剂或可以添加至食品补充剂。

用于单胃动物的饲料组合物通常包括包含含有植酸盐的植物产品的组合物。这类组合物包括基于玉米粉、大豆粉、菜籽粉、棉籽粉、玉蜀黍、小麦、大麦和高粱的饲料。本文所述的酶可以是(或可添加至)食品或饲料物质和组合物。

本教导内容还提供了制备食品或饲料成分或补充剂的方法，该方法包括将通过本说明书的工艺制备的酶、或本说明书的经修饰的酶或包含根据本说明书的酶的组合物与另一食品成分一起混合或添加。制备饲料或食品成分的方法是本发明的另一个实施例。这类方法可涉及制丸。为了制备食品或饲料成分，可以固体、诸如预混物之类的制剂或液体的形式添加本说明书的酶。

如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”是同义词，并且可互换使用。在此类氨基酸序列表现出活性的情况下，它们可被称为“酶”。使用常规的氨基酸残基的单字母或三字母代码，其中氨基酸序列以标准的氨基端至羧基端取向(即，N→C)提供。

术语“核酸”涵盖DNA、RNA、异源双链体和能够编码多肽的合成分子。核酸可为单链或双链的，而且可为化学修饰物。术语“核酸”与“多核苷酸”可互换使用。由于遗传密码具有简并性，故可以使用不止一个密码子来编码特定氨基酸，并且本发明组合物和方法涵盖编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。除非另作说明，否则核酸序列是以5'至3'取向给出。

所谓“同源物”，应当意指对象氨基酸序列和对象核苷酸序列具有指定程度的同一性的实体。同源序列被认为包括与对象序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％同一性的氨基酸序列，该同一性使用常规的序列比对工具Clustal V采用默认参数测量。通常，同源物将包括与对象氨基酸序列相同的活性位点残基，但可包括任何数目的保守氨基酸置换。示例性的保守氨基酸置换在如下保守氨基酸置换表中列出。

保守氨基酸置换

如本文所用，术语“植酸酶”意指能够催化磷酸酯(包括植酸盐/植酸)的水解并释放无机磷酸根的蛋白质或多肽。示例性的植酸酶在本教导内容整篇中论述和引用，包括大肠杆菌植酸酶(美国专利6,110,719)，和从多种来源中的任一种获得的那些，所述多种来源包括：子囊菌纲(Ascomycetes)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、黑曲霉(Aspergillusniger)、嗜热真菌属(Thermomyces)、腐质霉属(Humicola)、担子菌纲(Basidiomycetes)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和西方许旺酵母(Schwannniomyces occidentalis)。除了植酸盐外，一些植酸酶还能水解中间程度磷酸化的磷酸肌醇中的至少一些。在一个实施例中，本教导内容中制备的或修饰的活性酶是6-植酸酶。6-植酸酶也称为“4-植酸酶”或“植酸6-磷酸酶”。另外的植酸酶包括组氨酸酸性植酸酶(HAP)，其为包含存在于原核生物中的酶成员(如来自大肠杆菌的appA植酸酶)和真核生物的酶成员(来自曲霉属(Aspergillus)物种的phyA和phyAB)、来自酵母和植物的HAP植酸酶的一组酶。HAP植酸酶在它们的DNA序列中共同具有处于N末端的活性位点基序RHGXRXP和处于C末端的HD基序。

本植酸酶可以是“前体”、“未成熟的”或“全长的”，在该情形中它们包括信号序列，或可以是“成熟的”，在该情形中它们缺少信号序列。多肽的成熟形式通常是最有用的。除非另有说明，否则本文所用的氨基酸残基编号方式是指各植酸酶多肽的成熟形式。本淀粉酶多肽还可以被截短以移除N末端或C末端，只要所得的多肽保留植酸酶活性。

关于多肽的术语“野生型”、“亲本”或“参考”是指不在一个或多个氨基酸位置处包括人为制造的置换、插入或缺失的天然存在的多肽。类似地，关于多核苷酸的术语“野生型”、“亲本”或“参考”是指不包括人为制造的核苷改变的天然存在的多核苷酸。然而，应注意，编码野生型多肽、亲本多肽或参考多肽的多核苷酸不局限于天然存在的多核苷酸，而涵盖编码野生型多肽、亲本多肽或参考多肽的任何多核苷酸。

关于多肽的术语“变体”是指不同于特定野生型多肽、亲本多肽或参考多肽的多肽，因为其在一个或多个氨基酸位置处包括人为制造的置换、插入或缺失。类似地，关于多核苷酸的术语“变体”是指核苷酸序列不同于指定的野生型多核苷酸、亲本多核苷酸或参考多核苷酸的多核苷酸。野生型、亲本或参考多肽或多核苷酸的身份从上下文来看将是显而易见的。

“载体”是指设计用来将核酸引入一种或多种细胞类型中的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、盒(cassette)等等。

“表达载体”是指包含编码目标多肽的DNA序列的DNA构建体，所述编码序列有效连接至能够实现该DNA在合适宿主中表达的合适控制序列。这种控制序列可包括实现转录的启动子、任选的控制转录的操纵子序列、编码mRNA上的合适核糖体结合位点的序列、增强子和控制转录和翻译终止的序列。

如本文所用，术语“表达”是指基于核酸序列生成多肽的过程。该过程包括转录和翻译二者。

“启动子”是指涉及结合RNA聚合酶以起始基因转录的调节序列。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。可以使用的诱导型启动子的非限制性例子是里氏木霉(Trichoderma reesei)cbh1，其为诱导型启动子。

术语“有效连接”意指指定组分处于一种允许它们以预期的方式起作用的关系(包括但不限于并置)。例如，如果编码序列的表达处于调节序列的控制之下则该调节序列与该编码序列有效连接。

“宿主菌株”或“宿主细胞”是表达载体、噬菌体、病毒或其他DNA构建体(包括编码目标多肽(如植酸酶)的多核苷酸)已引入其中的生物体。示例性的宿主菌株是木霉属物种(Trichoderma sp.)。术语“宿主细胞”包括由细胞产生的原生质体。

关于对象细胞、核酸、蛋白质或载体而使用时，术语“重组”表明对象已通过引入异源核酸或蛋白质、或者变更天然的核酸或蛋白质而得到修饰，或者细胞衍生自已经过此类修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达未在天然(非重组)形式的细胞中存在的基因，或者以不同于自然界中存在的水平或条件表达天然基因。

“信号序列”(也称为“前序列”、“信号肽”、“前导序列”、“前导肽”)是指结合至蛋白质的N端部分、帮助该蛋白质的成熟形式从细胞分泌的氨基酸序列(如SEQ ID NO:12)。信号序列使多肽靶向至分泌途径并且一旦多肽转运进内质网膜中就被从新生多肽切除。胞外蛋白的成熟形式(如SEQ ID NO:1)缺少信号序列，该信号序列在分泌过程中被切除。

“选择标记”或“可选标记”是指这样的基因，其能够在宿主中表达以有利于选择携带该基因的宿主细胞。可选标记的例子包括(但不限于)抗微生物剂(如潮霉素、博来霉素或氯霉素)和/或赋予宿主细胞代谢益处(如营养益处)的基因。术语“衍生自”涵盖术语“源自”、“获自”、“可获自”、“分离自”以及“产自”。

“丝状真菌”是指真菌亚门(Eumycotina)和卵菌亚门(Oomycota)的所有丝状形式(参见Alexopoulos,C.J.(1962),Introductory Mycology(《真菌学概论》)，纽约威立出版社(Wiley,New York))。这些真菌表征为细胞壁由几丁质、纤维素和其他复合多糖构成的营养菌丝体。本教导内容的丝状真菌在形态学上、在生理上以及在遗传上有别于酵母。丝状真菌的营养生长是通过菌丝伸长来进行，并且碳分解代谢是专性好氧的。在本教导内容中，丝状真菌亲本细胞可以是木霉属的物种如里氏木霉(此前被分类为长梗木霉(T.Iongibrachiatum)，现在也称为红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))、绿色木霉(Trichoderma viride)、康氏木霉(Trichoderma koningii)或哈茨木霉(Trichodermaharzianum)的细胞。另外的丝状真菌包括曲霉属、镰孢菌属(Fusarium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、青霉属(Penicillium)、腐质霉属(Humicola)、链孢霉属(Neurospora)、毁丝霉属(Myceliophthora)或它们的有性形式如翘孢霉属(Emericella)、肉座菌属(Hypocrea)。

术语“培养”是指在液体或固体培养基中在适于生长的条件下培养一群微生物细胞。

关于多核苷酸或蛋白质的术语“异源”是指并非天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。

关于多核苷酸或蛋白质的术语“内源”是指天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。

如本文所用，关于细胞使用的术语“转化”、“稳定转化”和“转基因”意指含有整合进其基因组中或作为经多代保留下来的附加体而携带的非天然(如，异源)核酸序列的细胞。

在将核酸序列插入细胞的情况下，术语“引入”意指本领域已知的“转染”、“转化”或“转导”。

术语“分离的”和“分开的”是指从在自然界中天然与之相关联的至少一种其他材料或组分移出的化合物、蛋白质(多肽)、细胞、核酸、氨基酸或其他指定材料或组分。

如本文所用，术语“纯化的”是指处于相对纯的状态的物质(如，分离的多肽或多核苷酸)，所述相对纯的状态如纯度至少约90％、纯度至少约95％、纯度至少约98％或纯度甚至至少约99％。

如本文所用，术语“修饰”和“变更”可互换使用并且意指改变或变动。在修饰或变更多肽的背景下，这些术语可意指直接改变氨基酸序列或通过改变编码核酸来改变氨基酸序列，或指改变多肽的结构如通过使该酶糖基化。

本文所用的术语“糖基化”是指聚糖连接至分子，例如连接至蛋白质。糖基化可以是酶促反应。所形成的连接可以通过共价键。短语“高度糖基化”是指在全部或几乎全部的可用糖基化位点(例如N-连接糖基化位点)处糖基化的分子如酶。

本文所用的术语“聚糖”是指多糖或低聚糖，或糖缀合物如糖蛋白类的碳水化合物部分。聚糖可以是单糖残基的均聚物或杂聚物。它们可以是直链分子或支链分子。

如本文所用，术语“固体支持物”是指植酸酶和植酸喷涂于其上的惰性固体材料。可任选地，其他材料(如酶、水溶性试剂、可分散试剂和适于颗粒剂的其他组分)也可以喷涂于固体支持物上。固体支持物的例子包括但不限于硫酸钠、硫酸镁、颗粒状蔗糖、淀粉-蔗糖彩糖球(non-pareils)(ASNP)和麦芽糖糊精。

如本文所用，术语“颗粒”是指可具有或可不具有涂层的芯。

如本文所用，术语“多层型颗粒”是指包含芯和至少一个涂层的组合物。

本文所用的术语“芯”可与术语“种”是可互换的。

本文所用的术语“涂层”和“层”是可互换的。涂层通常封装芯以形成实质上连续的层从而芯表面具有很少或不具有未涂覆的面积。颗粒和/或多层型颗粒中所用的材料(如本文详细描述的试剂、组分和酶)适合用于食品和/或动物饲料中。该材料可以是食品级或饲料级。

本文所用的术语“外涂层”是指多层型颗粒的离芯最远的涂层(即施加的最后的涂层)。

如本文所用，术语“功能邻近”意指植酸与植酸酶的邻近是使得植酸能够稳定植酸酶的这样一种邻近。例如，植酸与植酸酶二者均在颗粒的相同层中。例如，植酸与植酸酶二者均在芯中和/或植酸与植酸酶二者均在相同的涂层中。又如，植酸与植酸酶在颗粒的相邻涂层中。再如，植酸酶在芯中而植酸在邻近的涂层中。

如本文所用，术语“酶涂层”是指包含至少一种酶的酶层。在一些实施例中，酶层包含至少两种酶。在一些实施例中，酶层包含至少三种酶。

“NCIMB”是位于苏格兰亚伯丁郡(Aberdeen,Scotland)的生物体保藏所名称，名称为英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心(National Collection of Industrial,food,and Marine Bacteria)。

如本文所用，术语“丸粒”和“制丸”是指固体、圆形、球形和圆柱形片剂或丸粒和形成这类固体形状的工艺，尤其是饲料丸粒和固体、挤出的动物饲料。已知的食品和动物饲料制丸制造工艺通常包括：将食品或饲料成分在室温下混合在一起约1至约5分钟，将所得的混合物转移至储料仓，将该混合物输送至蒸气调理器，任选将蒸气调理过的混合物转移至膨化器，将该混合物转移至制丸磨(pellet mill)或挤出机，最后将该丸粒转移进丸粒冷却器中。Fairfield,D.1994.第10章，Pelleting Cost Center.载于：Feed ManufacturingTechnology IV(饲料制造技术IV).(McEllhiney编辑)弗吉尼亚州阿灵顿县的美国饲料行业协会(American Feed Industry Association,Arlington,Va.)，第110-139页。

如本文所用，术语“热处理食品或动物饲料丸粒”是指经受热处理(如蒸气调理)的未经制丸的混合物，所述热处理通常在至少90℃下至少30秒(例如在90℃下30秒和/或在95℃下30秒)。可然后将该混合物挤出以形成动物饲料丸粒。

如本文所用，术语“稳定性”是指其中植酸酶的酶活性或其他功能特性有利地得以维持或改善的多种效果中的任一者。植酸酶可通过显示出改善的“恢复活性”、“热稳定性”和/或“失活可逆性”中的任一者而展现稳定性。

如本文所用，术语“恢复活性”是指(i)处理后植酸酶的活性与(ii)处理前植酸酶的活性之比，所述处理涉及以下应激源中的一者或多者：加热、增加的压力、增加的pH、降低的pH、储存、干燥、暴露于表面活性剂、暴露于溶剂和机械应力。恢复活性可表示为百分比。

恢复活性百分比计算如下：

在制丸实验的语境中，“处理之前的活性”可通过测量未经历处理的糊料中存在的植酸酶活性来估计，测量未经过处理的植酸酶的方式与的确经历过处理的植酸酶相同。例如，以与经处理的糊料中的植酸酶相似的时间和相似的条件操纵和保存未处理的糊料中的植酸酶，以控制指定的处理本身之外的可能的相互作用或其他影响。

如本文所用，结合植酸酶使用的术语“对照植酸酶”是指类型与已添加稳定剂(如存在植酸)的植酸酶分子相同的植酸酶分子(如BP17植酸酶)，不同的是缺少稳定剂。例如，在一份样品中植酸酶BP17用植酸稳定，而在对比的对照植酸酶样品中，唯一的差别是植酸酶BP17尚未用植酸稳定，这种植酸酶为“对照植酸酶”。

如本文所用，“植酸酶活性单位”是每分钟能够释放1μmol磷酸根的酶量。植酸酶活性根据AOAC(分析化学家协会(Association of Analytical Chemists))官方方法2000.12测定，该方法是如如下文献中所述：“Determination of phytase activity in feed by acolorimetric enzymatic method:collaborative interlaboratory study”Engelen AJ,van der Heeft F C,Randsdorp P H,Somers W A,Schaefer J,van der Vat B J.JAOAC Int.(《美国官方分析化学家协会杂志》)2001年五月-六月；84(3):629-33。简而言之，在220mM醋酸钠三水合物、68.4mM脱水氯化钙、0.01％Tween 20,pH 5.5中提取经研磨的样品。然后测定上清液。该测定法测量37℃、pH 5.5下60分钟无机磷酸根从水稻植酸酶的释放。用酸性钼酸盐/钒酸盐试剂终止该测定法，并通过钼钒酸磷的黄色络合物的强度定量磷酸根。

如本文所用，酶的熔解温度(Tm)可通过本领域已知的技术测量。一种合适的技术是差示扫描量热法(DSC)。测定熔解温度的其他合适技术包括光散射实验、圆二向色性实验和酶学实验。DSC是一种热分析技术。其用于测量将样品的温度维持在一定范围内的任一温度所需的能量量。当测试的温度增加时，样品最终达到其熔解温度。熔解温度Tm观察为DSC图中的吸热峰。如本文所用，术语“DSC Tm”是指通过DSC以扫描速率90℃/min和5.5的溶液pH测量的酶的熔解温度。

提供如下假想实验来进一步示例和解释本教导内容的术语。这里，表中的单位为了方便而描述为在制丸前以100任意单位的植酸酶活性开始。首先，看最上一行的数据，对于给定的植酸酶组合物如缺少植酸的BP17，在制丸处理后“恢复活性百分比”为50％。其次，看最底下一行数据，对于给定的植酸酶组合物如具有植酸的BP17，在制丸处理后植酸酶的“恢复活性百分比”为80％。再次，看最右边一列，与“对照植酸酶”即未通过植酸稳定的植酸酶相比，具有植酸的BP植酸酶的植酸酶活性高60％(80-50＝30；30/50＝.6＝60％)。在一些实施例中，这些改善可伴随热稳定性(例如通过DSC Tm所测量的Tm)的改善。在一些实施例中，这些改善可伴随失活可逆性(即，丧失的活性在一段时间后恢复的能力)的改善。

示例性的实施例

本教导内容提供了令人惊讶的观察结果：在用摩尔过量的其底物或其潜在的底物类似物预先温育后植酸酶的热稳定化导致干燥形式或液体形式的该酶稳定。更具体地讲，本教导内容提供：植酸酶的稳定性可以改善，包括植酸与该植酸酶功能邻近。另外，本教导内容提供：过量的植酸可改善植酸酶在食品和动物饲料加工过程中的稳定性并且可导致具有改善的植酸酶活性的热处理食品和动物饲料丸粒。

植酸

在一些实施例中，植酸包含未水解的磷酸肌醇IP6。通常，植酸的商业来源不是纯的IP6。在一些实施例中，植酸是部分水解的磷酸肌醇(如IP6、IP5、IP4、IP3、IP2和IP1)的混合物。因而，可用类型的植酸是植酸分解代谢产物、水解产物、盐和类似物(如酯和盐)。肌醇(植酸的完全水解产物–IP0)可以存在于供在本教导内容中使用的植酸来源中，但我们发现在一些条件下肌醇本身不使植酸稳定。因而，根据本教导内容，磷酸肌醇可用于使食品或饲料组合物中的植酸酶稳定。

供在本教导内容中使用的植酸可通过化学方法合成。除此以外或作为另一种选择，供在本教导内容中使用的植酸可存在于食品、动物饲料或它们的成分中或衍生自食品、动物饲料或它们的成分。植酸存在于坚果外壳、种子和谷物中。植酸的来源包括但不限于亚麻籽、芝麻籽、杏仁、巴西果、椰子、花生、核桃、玉蜀黍(玉米)、燕麦、燕麦粉、水稻、小麦、豆类、鹰嘴豆、大豆、豆腐和土豆。通常，植酸通过提取进水中而获自谷物(如玉米、小麦或水稻)。

在制丸之前与植酸酶(如以多层型颗粒的形式)混合的用于稳定植酸酶的植酸是除了可能固有地存在于食品或动物饲料的成分中的植酸的量之外的。换句话讲，用于稳定植酸酶的植酸是外源植酸酶；存在于食品或动物饲料的成分中的植酸是内源植酸。因此，计算得到的大于10毫重量摩尔浓度的由本教导内容提供的植酸，以及其他声明的由本教导内容提供的用于稳定植酸酶的毫重量摩尔浓度水平，不包括痕量的内源植酸。可将任何手段用于将植酸提供给植酸酶。例如，可将包含植酸的液体与包含植酸酶的液体混合。又如，植酸酶和植酸处于颗粒，例如多层型颗粒中。

在一个实施例中，植酸是在溶液中。在另一个实施例中，植酸是固体状态。在又一个实施例中，植酸喷雾干燥于固体支持物上。

植酸酶

如本文所用，术语“植酸酶”意指能够催化磷酸酯(包括植酸盐和植酸)的水解并释放无机磷酸根的蛋白质或多肽。除了植酸盐外，一些植酸酶还能水解中间程度磷酸化的磷酸肌醇中的至少一些。

术语“植酸酶”可以是一种植酸酶或植酸酶的组合，除非语境明确另外指明。

将植酸酶如源自布丘氏菌属物种的6-植酸酶BP17添加至食品和动物饲料以增加磷的有效性因而增加产品的营养价值。食品或动物饲料的加工，例如在加热和高压下加工，可使植酸酶变性而降低其活性。

用于本教导内容的植酸酶可以是适合用于食品或动物饲料中的任何植酸酶。

在一个实施例中，在本说明书中制备或修饰的活性酶是植酸酶，更具体地讲是6-植酸酶。

6-植酸酶也称为“4-植酸酶”或“植酸6-磷酸酶”。另外的植酸酶包括组氨酸酸性植酸酶(HAP)，其为包含存在于原核生物中的酶成员(如来自大肠杆菌的appA植酸酶)和真核生物的酶成员(来自曲霉属物种的phyA和phyB)、来自酵母和植物的HAP植酸酶的一组酶。HAP植酸酶在它们的DNA序列中共同具有处于N末端的活性位点基序RHGXRXP和处于C末端的HD基序。这提供了水解磷酸单酯的两步式机理。来自黑曲霉的phyA和phyB以及来自大肠杆菌的appA是已经得到最完全表征的代表。

在一个实施例中，植酸酶是6-植酸酶、大肠杆菌植酸酶、曲霉植酸酶或Ronozyme植酸酶(帝斯曼公司)。

在高度优选的实施例中，待制备或修饰的活性酶是BP17。BP17是布丘氏菌属物种植酸酶的酶变体。BP17的序列(不包括信号肽)以SEQ ID No.1示出，其用作全部氨基酸位置编号方式的参照。

在另一个实施例中，待制备或修饰的活性酶是BP11。BP11是布丘氏菌属物种植酸酶的酶变体。BP11的序列(不包括信号肽)以SEQ ID No.2示出。

在另一个实施例中，待制备或修饰的活性酶是BP111。BP111是布丘氏菌属物种植酸酶的酶变体。BP111的序列(不包括信号肽)以SEQ ID No.3示出。

所有这些植酸酶均是野生型序列，如衍生自以登录号NCIMB 41248保藏的布丘氏菌属菌株P 1-29的序列(具有以SEQ ID No.4示出的序列)的变体。

上文详细描述的植酸酶是缺少信号序列的成熟蛋白质。衍生自以登录号NCIMB41248保藏的布丘氏菌属菌株P 1-29的适当信号序列以SEQ ID No.12示出。

在一个实施例中，植酸酶是在木霉宿主细胞中产生。在一些实施例中，植酸酶是在包含内切-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因缺失的木霉宿主细胞中产生。内切-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因编码酶内切-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，其从其他蛋白质如植酸酶移除N连接糖基化。在一些实施例中，植酸酶是在包含内切-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因缺失的木霉宿主细胞中产生的植酸酶BP17。示例性的菌株例如在WO 09/114380中教导，参见例如实例5。

添加至食品或动物饲料的植酸酶单位的量将取决于食品或饲料本身的组成。含有较低量的有效磷的食品和饲料通常将需要较高量的植酸酶活性。所需的植酸酶量可由技术人员确定。

在一个实施例中，掺入食品或动物饲料中的植酸酶量可在每克食品或动物饲料0.1至20个单位的植酸酶活性之间。通常，植酸酶的量是每吨(1,000kg)食品或动物饲料约50克(12,000U/g植酸酶颗粒)；这等价于每克食品或动物饲料0.6个单位的植酸酶。

在一个实施例中，植酸酶是在溶液中。

在另一个实施例中，植酸酶是固体状态。在又一个实施例中，植酸酶喷雾干燥于固体支持物上。在另一个实施例中，将植酸酶掺入颗粒如多层型颗粒中。在一些实施例中，植酸酶在食品或动物饲料中。

植酸酶和植酸

在一个实施例中，植酸酶和/或植酸在溶液中。

在一个备选的实施例中，植酸酶和/或植酸处于固体状态(如处于颗粒，例如多层型颗粒中)。

在一些实施例中，植酸酶和/或植酸喷雾干燥于固体支持物上。固体支持物的例子包括但不限于硫酸钠、硫酸镁、颗粒状蔗糖、淀粉-蔗糖彩糖球(ASNP)和麦芽糖糊精。

在一个实施例中，将植酸酶和植酸掺入多层型颗粒中。在一些实施例中，将植酸酶和植酸掺入多层型颗粒的同一层中。

在本教导内容的一个实施例中，每摩尔植酸酶有至少3摩尔植酸。

稳定化的植酸酶

与尚未通过使用植酸来稳定的对照植酸酶的稳定性相比，液体状态和/或固体状态的植酸酶的稳定性可得到改善。

在一个实施例中，通过至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定植酸酶。在一些实施例中，通过至少20、至少50、至少100毫重量摩尔浓度或至少150毫重量摩尔浓度的植酸来稳定植酸酶。

在另一个实施例中，通过10毫重量摩尔浓度至150毫重量摩尔浓度范围内的植酸来稳定植酸酶。在其它实施例中，通过10毫重量摩尔浓度至100毫重量摩尔浓度范围内的植酸来稳定植酸酶。在一些实施例中，通过20毫重量摩尔浓度至150毫重量摩尔浓度范围内的植酸来稳定植酸酶。在其它实施例中，通过20毫重量摩尔浓度至100毫重量摩尔浓度范围内的植酸来稳定植酸酶。在一些实施例中，通过50毫重量摩尔浓度至150毫重量摩尔浓度范围内的植酸来稳定植酸酶。在其它实施例中，通过50毫重量摩尔浓度至100毫重量摩尔浓度范围内的植酸来稳定植酸酶。在一些实施例中，通过100毫重量摩尔浓度至150毫重量摩尔浓度范围内的植酸来稳定植酸酶。

在一些实施例中，以植酸的重量与植酸存在于其中的整个颗粒(包括不含植酸的层(如果存在的话))的重量之比表示，植酸以少于5％、2％、1％、.5％、.1％、.05％、.01％、.005％、.001％重量/重量存在。

在其他实施例中，功能邻近的植酸与植酸酶的摩尔比为1:1、2:1、3:1、5:1、10:1、20:1、25:1或50:1。

在一个实施例中，处理(如加热、增加的压力、增加的pH、降低的pH、储存、干燥、暴露于表面活性剂、暴露于溶剂和/或机械应力)之后，稳定化的植酸酶具有的植酸酶活性比尚未通过使用植酸来稳定的对照植酸酶的植酸酶活性高至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％或至少60％。在一个实施例中，处理(如加热、增加的压力、增加的pH、降低的pH、储存、干燥、暴露于表面活性剂、暴露于溶剂和/或机械应力)之后，稳定化的植酸酶具有的植酸酶活性比尚未通过植酸来稳定的对照植酸酶的植酸酶活性高10％-60％。

在一个实施例中，处理(加热、增加的压力、增加的pH、降低的pH、储存、暴露于表面活性剂、暴露于溶剂和/或机械应力)后稳定化的植酸酶的酶活性是处理前稳定化的植酸酶的酶活性的至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。

在一个实施例中，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的植酸酶活性得以恢复。

在一个实施例中，在食品或动物饲料制丸期间以固体状态至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的植酸酶活性得以恢复。

在一个实施例中，处理(加热、增加的压力、增加的pH、降低的pH、储存、暴露于表面活性剂、暴露于溶剂和/或机械应力)后至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的植酸酶活性得以恢复。例如，处理后至少80％植酸酶活性得以恢复。

在一个实施例中，在食品或动物饲料制丸后至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的植酸酶活性得以恢复。例如，在食品或动物饲料制丸后至少80％的植酸酶活性得以恢复。

在一些实施例中，在食品或饲料制丸后以固体状态至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的植酸酶活性得以恢复。例如，在食品或动物饲料制丸后以固体状态至少80％的植酸酶活性得以恢复。

在一个实施例中，与未通过植酸稳定的对照植酸酶相比，通过植酸稳定的植酸酶的恢复活性提高至少15％、至少17％、至少19％、至少20％、至少23％、至少25％、至少27％、至少30％、至少32％、至少35％、至少40％、至少42％或至少45％。例如，与未通过植酸稳定的对照植酸酶相比，通过植酸稳定的植酸酶的恢复活性增加至少23％。

在一个实施例中，在相同条件下与未通过至少10毫重量摩尔浓度植酸稳定的对照植酸酶相比，固体状态(如多层型颗粒)的通过植酸稳定的植酸酶的恢复活性提高至少15％、至少17％、至少19％、至少20％、至少23％、至少25％、至少27％、至少30％、至少32％、至少35％、至少40％、至少42％或至少45％。例如，在相同条件下与未通过至少10毫重量摩尔浓度植酸稳定的对照植酸酶相比，固体状态(如多层型颗粒)的通过植酸稳定的植酸酶的恢复活性提高至少32％。

在一个实施例中，与未通过10毫重量摩尔浓度至150毫重量摩尔浓度范围内的植酸稳定的对照植酸酶相比，固体状态(如多层型颗粒)的通过植酸稳定的植酸酶的恢复活性提高至少至少15％、至少17％、至少19％、至少20％、至少23％、至少25％、至少27％、至少30％、至少32％、至少35％、至少40％、至少42％或至少45％。

在一个实施例中，相同条件下与未通过浓度为至少10毫重量摩尔浓度的植酸稳定的对照植酸酶的恢复活性相比，在将稳定化的植酸酶与至少一种食品或动物饲料成分混合并以例如加热(如蒸气)、增加的压力、增加的pH、降低的pH、储存、暴露于表面活性剂、暴露于溶剂和/或机械应力处理所得的混合物后，所述稳定化的植酸酶的恢复活性提高至少15％、至少17％、至少19％、至少20％、至少23％、至少25％、至少27％、至少30％、至少32％、至少35％、至少40％、至少42％或至少45％。例如，相同条件下与未通过浓度为至少10毫重量摩尔浓度的植酸稳定的对照植酸酶的恢复活性相比，在将稳定化的植酸酶与至少一种食品或动物饲料成分混合并以例如加热(如蒸气)、增加的压力、增加的pH、降低的pH、储存、暴露于表面活性剂、暴露于溶剂和/或机械应力处理所得的混合物后所述稳定化的植酸酶的恢复活性提高至少32％。

在另一个实施例中，相同条件下与未通过浓度范围为10毫重量摩尔浓度至150毫重量摩尔浓度的植酸稳定的对照植酸酶的恢复活性相比，在将稳定化的植酸酶与至少一种食品或动物饲料成分混合并以例如加热(如蒸气)、增加的压力、增加的pH、降低的pH、储存、暴露于表面活性剂、暴露于溶剂和/或机械应力处理所得的混合物后，所述稳定化的植酸酶的恢复活性提高至少15％、至少17％、至少19％、至少20％、至少23％、至少25％、至少27％、至少30％、至少32％、至少35％、至少40％或至少42％、至少45％。

在一个实施例中，将至少10毫重量摩尔浓度的植酸用于稳定经受或已经经受如下处理中的一者或多者的食品或饲料丸粒中的植酸酶：加热、增加的压力、增加的pH、降低的pH、储存、暴露于表面活性剂、暴露于溶剂和机械应力

熔解温度(Tm)

一种测定酶热稳定性的方式是测定酶的熔解温度(Tm)。

酶的熔解温度(Tm)可通过本领域已知的技术测量。一种合适的技术是差示扫描量热法。测定熔解温度的其他合适技术包括光散射实验、圆二向色性实验和酶学实验。

在一个实施例中，与对照植酸酶相比，植酸酶(通过至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定)的Tm(如DSC Tm)增加至少1℃、至少1.3℃、至少1.4℃、至少1.5℃、至少2℃、至少4℃、至少6℃、至少7℃、至少7.5℃、至少7.6℃或至少8℃。

在一个实施例中，与未通过至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶相比，通过至少15毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的植酸酶的Tm(如DSC Tm)增加至少1℃、至少1.3℃或至少1.4℃。例如，与未通过至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶相比，通过至少15毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的植酸酶的Tm(如DSC Tm)增加至少1.4℃。

在一个实施例中，与未通过至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶相比，通过至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的植酸酶的Tm(如DSC Tm)增加至少4℃、至少6℃、至少7℃、至少7.5℃、至少7.6℃或至少8℃。例如，与未通过至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶相比，通过至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的植酸酶的Tm(如DSC Tm)增加至少7.6℃。

在一个实施例中，与未通过10毫重量摩尔浓度至150毫重量摩尔浓度范围内的植酸来稳定的对照植酸酶相比，植酸酶(通过10毫重量摩尔浓度至150毫重量摩尔浓度范围内的植酸稳定)的T_m(如DSC Tm)增加至少1℃、至少1.3℃、至少1.4℃、至少1.5℃、至少2℃、至少4℃、至少6℃、至少7℃、至少7.5℃、至少7.6℃或至少8℃。

组合物

在一个实施例中，组合物为液体如液体饲料。

在一个备选的实施例中，组合物为固体，如颗粒或粉末。

在一个实施例中，组合物为颗粒，如多层型颗粒。

在另一个实施例中，组合物为食品或动物饲料如食品或动物饲料丸粒。例如，组合物为已经经历如下处理中的一者或多者的食品或动物饲料丸粒：加热、增加的压力、增加的pH、降低的pH、储存、暴露于表面活性剂、暴露于溶剂和机械应力例如，组合物为已经在至少90℃的温度下加热30秒(如95℃下30秒)的热处理食品或动物饲料丸粒。

在又一个实施例中，组合物为食品或动物饲料成分如糊料。

在一个实施例中，组合物为丸粒改善组合物。在一个实施例中，丸粒改善组合物为液体如液体饲料。在另一个实施例中，丸粒改善组合物为固体。在一个实施例中，丸粒改善组合物包含颗粒(如多层型颗粒)，所述颗粒包含植酸和任选的植酸，如至少10毫重量摩尔浓度的植酸。在另一个实施例中，丸粒改善组合物包含颗粒(如多层型颗粒)或由颗粒(如多层型颗粒)组成，所述颗粒包含植酸酶和植酸或至少10毫重量摩尔浓度的植酸。在又一个实施例中，丸粒改善组合物还包含至少一种食品或动物饲料成分。丸粒改善组合物在食品或动物饲料制丸后恢复的植酸酶活性为例如至少65％。又如，与其中对照植酸酶未通过浓度为至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照组合物相比，丸粒改善组合物中的植酸酶的DSC Tm提高至少1℃。又如，相同条件下与未通过浓度为至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶的恢复活性相比，在将丸粒改善组合物与至少一种食品或动物饲料成分混合并通过在90℃下蒸气处理30秒和/或在95℃下蒸气处理30秒将所得的混合物制丸后，所述丸粒改善组合物中的植酸酶的恢复活性提高至少15％。

在一个实施例中，组合物包含由所述植酸酶水解所述植酸而得到的低级磷酸肌醇，包括肌醇六磷酸、肌醇五磷酸、肌醇四磷酸、肌醇三磷酸、肌醇二磷酸、肌醇一磷酸以及它们的混合物。

颗粒和多层型颗粒

芯、颗粒和多层型颗粒可通过多种制造技术制备，这些技术包括：旋转雾化、湿法制粒、干法制粒、喷雾干燥、圆盘制粒、挤出、锅包衣、滚圆、转鼓制粒、流化床凝聚、高速剪切制粒、流化床喷涂、结晶、沉淀、乳液胶凝、旋转圆盘雾化和其他浇注方法，以及造粒工艺。这些工艺是本领域已知的并在如下专利中描述：美国专利No.4689297和美国专利No.5324649(流化床工艺)；EP656058B1和美国专利No.454332(挤出工艺)；美国专利No.6248706(高速剪切制粒)；以及EP804532B1和美国专利No.6534466(利用流化床制芯和混合器包衣的联合工艺)。

芯是多层型颗粒的内核或是颗粒。用于芯的材料可适用于食品和/或动物饲料中。US20100124586、WO9932595和US5324649详细描述了适用于芯的材料。

在一个实施例中，芯包含一种或多种水溶性或水分散性试剂。合适的水溶性试剂包括但不限于无机盐(如硫酸钠、氯化钠、硫酸镁、硫酸锌和硫酸铵)、柠檬酸、糖(如蔗糖、乳糖、葡萄糖、颗粒状蔗糖、麦芽糖糊精和果糖)、增塑剂(如多元醇、尿素、邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二甲酯)、纤维材料(如纤维素和纤维素衍生物如羟基-丙基-甲基纤维素、羧基-甲基纤维素和羟基-乙基纤维素)、植酸以及它们的组合。合适的分散性试剂包括但不限于：粘土、彩糖球(糖和淀粉的组合；如淀粉-蔗糖彩糖球-ASNP)、滑石粉、硅酸盐、羧甲基纤维素、淀粉以及它们的组合。

在一个实施例中，芯包含硫酸钠。在另一个实施例中，芯由硫酸钠组成。在一些实施例中，芯可包含植酸酶和/或植酸。在一些实施例中，芯不包含植酸酶。

在一些实施例中，芯涂覆有至少一个涂层。在一个实施例中，芯涂覆有至少两个涂层。在另一个实施例中，芯涂覆有至少三个涂层。在又一个实施例中，芯涂覆有至少四个涂层。

用于涂层中的材料可适用于食品和/或动物饲料。US20100124586、WO9932595和US5324649详细描述了适用于涂层的材料。

在一些实施例中，传统上通过运行以及通过将一层连续喷涂于下一层的上面来采用流化床制粒工艺，其中仅简单用水冲洗生产线和喷嘴以达成清洁目的，不终止喷涂。在一些实施例中，可通过在每次中间的喷涂结束后让颗粒干燥(在不喷涂的情况下流化)额外的时间周期(如5分钟)(例如在70℃下)来制备颗粒，最终的喷涂后可进行任选的额外干燥(例如70℃下20分钟)。

在一些实施例中，中间的喷涂结束后的额外时间周期是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20或25分钟。在一些实施例中，中间的喷涂结束后的额外时间周期是2-8、3-7或4-6分钟。在一些实施例中，中间的喷涂结束后的额外时间周期的温度是至少50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃。在一些实施例中，中间步骤结束后的额外时间周期的温度是60℃-80℃或65℃-75℃。在一些实施例中，在中间的喷涂结束后干燥步骤在65-75℃下进行4-6分钟。

在一些实施例中，最终的喷涂后的任选干燥可以是至少5、10、15、20、25或30分钟。在一些实施例中，最终的喷涂后的任选干燥可以是5-30或10-25分钟。在一些实施例中，最终的喷涂后的任选干燥的温度可以是至少50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃。在一些实施例中，最终的喷涂后的任选干燥的温度可以是60℃-80℃或65℃-75℃。在一些实施例中，最终的喷涂后的任选干燥是在65℃-75℃下15-25分钟。

在一个实施例中，涂层包含如下材料中的一种或多种：无机盐(如硫酸钠、氯化钠、硫酸镁、硫酸锌和硫酸铵)、柠檬酸、糖(如蔗糖、乳糖、葡萄糖和果糖)、增塑剂(如多元醇、尿素、邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二甲酯)、纤维材料(如纤维素和纤维素衍生物如羟基-丙基-甲基纤维素、羧基-甲基纤维素和羟基-乙基纤维素)、粘土、彩糖球(糖和淀粉的组合)、硅酸盐、羧甲基纤维素、植酸、淀粉(如玉米淀粉)、脂肪、油(如油菜籽油和石蜡油)、脂质、乙烯基聚合物、乙烯基共聚物、聚乙烯醇(PVA)、增塑剂(如多元醇、尿素、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二甲酯和水)、抗凝聚剂(如滑石粉、粘土、无定形二氧化硅和二氧化钛)、消泡剂(如Foamblast

和Erol

)和滑石粉。US20100124586、WO9932595和US5324649详细描述了适用于涂层的组分。

在一个实施例中，涂层包含糖，如蔗糖。

在一个实施例中，涂层包含聚合物如聚乙烯醇(PVA)。

适于掺入进多层型颗粒的涂层中的PVA包括具有低至高的粘度的部分水解、完全水解的和中等水解的PVA。

在另一个实施例中，涂层包含无机盐，如硫酸钠。

在一个实施例中，至少一个涂层是酶涂层。在一些实施例中，芯涂覆有至少两个酶层。在另一个实施例中，芯涂覆有至少三个酶层。

在一些实施例中，本教导内容的颗粒包括酶涂层。在一些实施例中，酶层包含至少一种酶。在一些实施例中，酶层包含至少两种酶。在一些实施例中，酶层包含至少三种酶。在一些实施例中，酶选自植酸酶、木聚糖酶、磷酸酶、淀粉酶、酯酶、氧化还原酶、脂酶、转移酶、纤维素酶、半纤维素酶、β-葡聚糖酶、氧化酶(如己糖氧化酶和麦芽糖氧化还原酶)、蛋白酶以及它们的混合物。一般来讲，至少一个酶涂层包含至少一种植酸酶和植酸。

在一个实施例中，酶涂层包含至少一种植酸酶和至少一种另外的酶，所述另外的酶选自植酸酶、木聚糖酶、磷酸酶、淀粉酶、酯酶、氧化还原酶、脂酶、转移酶、纤维素酶、半纤维素酶、β-葡聚糖酶、氧化酶(如己糖氧化酶个麦芽糖氧化还原酶)和蛋白酶。

上述酶列表仅仅是例子，无意于排除其他情况。任何酶均可用于本文所述的颗粒中，包括细菌来源、真菌来源、酵母来源、植物来源、昆虫来源和动物来源的野生型酶、重组酶和变体酶，以及酸性酶、中性酶或碱性酶。

在一些实施例中，酶涂层可另外包含一种或多种另外的选自如下的材料：植酸、糖(如蔗糖)、淀粉(如玉米淀粉)、脂肪、油(如油菜籽油和石蜡油)、脂质、烯类聚合物、乙烯基共聚物、聚乙烯醇(PVA)、增塑剂(如多元醇、尿素、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二甲酯和水)、抗凝聚剂(如滑石粉、粘土、无定形二氧化硅和二氧化钛)、消泡剂(如可得自法国莱斯坎Ouvrie PMC公司(Ouvrie PMC,Lesquin,France)的Foamblast

和Erol

)和滑石粉。US20100124586、WO9932595和US5324649详细描述了适用于颗粒的组分。Foamblast

可得自EmeraldFoam Control,LLC公司。Foamblast

是用食品级成分制备的去沫剂。

在一个实施例中，酶涂层包含植酸和至少一种植酸酶。换句话讲，将植酸酶和植酸掺入进多层型颗粒的同一层中。

在一个实施例中，多层型颗粒包括包含植酸酶的酶涂层和与该酶层功能邻近的包含植酸的涂层。

在一个实施例中，涂层包含植酸，其中所述涂层与包含植酸酶的芯和/或包含植酸酶的酶涂层功能邻近。

在一个实施例中，多层型颗粒的外涂层包含如下材料中的一者或多者：聚合物(如乙烯基聚合物、聚乙烯醇和乙烯基共聚物)、树胶、蜡、脂肪、油、脂质、卵磷脂、颜料、润滑剂、彩糖球、无机盐(如硫酸钠、氯化钠、硫酸镁、硫酸锌和硫酸铵)、滑石粉和增塑剂(如糖、糖醇和聚乙二醇)。

在一个实施例中，多层型颗粒的外涂层包含无机盐(如硫酸钠)、聚乙烯醇(PVA)、滑石粉或它们的组合。在一个实施例中，外涂层包含聚乙烯醇(PVA)和/或滑石粉。

在一个实施例中，外涂层防止或减少水、水分或蒸汽迁移进酶层的速率或程度。

本文所述的多层型颗粒可通过多种技术来制备，所述多种技术包括：流化床喷涂、锅包衣和通过在起始芯材料(种子)的顶部添加连续层来构建多层型颗粒的其他技术。参见例如US 5324649和US20100124586。在一个实施例中，多层型颗粒用流化床喷涂工艺制备。

在一个实施例中，多层型颗粒包括如下或由如下组成：包含硫酸钠的芯；包含植酸酶、蔗糖、淀粉、植酸和菜籽油或由植酸酶、蔗糖、淀粉、植酸和菜籽油组成的第一涂层；包含硫酸钠或由硫酸钠组成的第二涂层；和包含滑石粉和PVA或由滑石粉和PVA组成的第三涂层。将第一涂层施加至芯，然后将第二涂层施加至第一涂层，然后将第三涂层施加至第二涂层。

在另一个实施例中，多层型颗粒包括如下或由如下组成：包含硫酸钠的芯；包含植酸酶、蔗糖、淀粉、植酸和消泡剂(如Foamblast

)或由它们组成的第一涂层；包含硫酸钠或由硫酸钠组成的第二涂层；和包含滑石粉和PVA或由滑石粉和PVA组成的第三涂层。将第一涂层施加至芯，然后将第二涂层施加至第一涂层，然后将第三涂层施加至第二涂层。

丸粒和制丸

丸粒可包含根据多种已知的制丸方法中的任一种制备的如本文所述的颗粒和/或多层型颗粒，所述制丸方法的例子在下文进一步描述。

在一个实施例中，丸粒包含植酸、植酸酶和至少一种食品或饲料成分，其中植酸的浓度为至少10毫重量摩尔浓度。在一个实施例中，丸粒包含至少一种食品或饲料成分和含有植酸和植酸酶的颗粒，其中颗粒中植酸的浓度为至少10毫重量摩尔浓度。

本教导内容的丸粒可通过其中饲料混合物的温度升高至高水平以杀死细菌的方法制备。通常在制丸之前通过蒸汽处理升高温度，其为称作调理的工艺。随后，可将经调理的饲料混合物通过模具以制备特定尺寸的丸粒。可通过将本文所述的颗粒和/或多层型颗粒与本文所述的食品或动物饲料混合来制备饲料混合物。

一般来讲，蒸汽调理器在约85℃至约95℃下处理该混合物约20秒至约90秒，最多至数分钟。蒸汽的量可根据水分的量以及食品或动物饲料混合物的初始温度而变动。在制丸工艺中已报道了约4％至约6％的添加蒸汽，将该量选择为在制丸之前在糊料中产生少于约18％的水分，或者在旨在用于挤出的糊料中产生最多至约28％的水分。

可在约100℃至约140℃的温度范围下进行任选的膨化工艺约4至约10秒。制造工艺的丸粒研磨部分通常在约85℃至约95℃的温度下操作约3秒至5秒。

在制丸之前，未经制丸的混合物(所谓的用于丸粒的预混物或前体、基础混合物、糊料和稀释剂)通常含有维生素和痕量矿物质。基础混合物通常含有食品和动物饲料成分如磷酸二钙、石灰石、盐和维生素以及矿物质预混物，但不含有谷物和蛋白质成分。稀释剂包括但不限于谷物(例如小麦粗粉和米糠)和粘土，如层状硅酸盐(硅酸镁海泡石、膨润土、高岭土、蒙脱石、锂蒙脱石、滑石粉、贝得石、绿坡缕石和硅镁石)。粘土还充当用于食品和动物饲料预混物的载体和流化剂，或稀释剂。糊料通常包含完全的动物膳食。例如，糊料包含玉米、大豆粉、豆油、盐、DL甲硫氨酸、石灰石、磷酸二钙和维生素以及矿物质或由它们组成。举个例子，糊料由61.10％玉米、31.43％大豆粉48、4％豆油、0.40％盐、0.20％DL甲硫氨酸、1.16％石灰石、1.46％磷酸二钙和0.25％维生素和矿物质组成。

在一个实施例中，通过将至少一种食品或饲料成分(如糊料)与溶液中的植酸酶和植酸混合、蒸气调理所得的混合物然后将该混合物制丸来制备食品或动物饲料。

在一个实施例中，通过将至少一种食品或动物饲料成分(如糊料)与固体状态(如诸如多层型颗粒之类的颗粒中)的植酸酶和植酸混合、蒸气调理所得的混合物然后将该混合物制丸而制备食品或动物饲料。

例如，可将玉米粉和大豆粉(如60％的玉米粉和40％的大豆粉)的未经制丸的混合物与包含植酸酶和植酸的多层型颗粒混合，然后在90℃下经受蒸气调理30秒。然后将该混合物挤出以形成动物饲料丸粒。

在一些实施例中，本教导内容的组合物可存在于热处理食品或动物饲料丸粒中。可使这种热处理食品或动物饲料丸粒在至少90℃的温度下经受热处理至少30秒(如90℃下30秒和/或95℃下30秒)。可然后将该混合物挤出以形成动物饲料丸粒。

食品和动物饲料

在一个实施例中，食品或动物饲料是液体如液体饲料。在另一个实施例中，食品或动物饲料是固体。如本文所用，术语动物包括所有动物，动物的例子包括非反刍动物和反刍动物(如乳牛、绵羊、山羊和马)。非反刍动物的例子包括单胃动物如猪、家禽(如鸡和火鸡)、鱼(如鲑鱼)、狗、猫和人。在一个实施例中，动物饲料是用于鸡的饲料(鸡饲料)。在一个实施例中，动物饲料是用于猪的饲料(猪)。

食品或动物饲料可包含植物蛋白。植物蛋白可源自豆类、油料种子、坚果和谷类。植物蛋白来源的例子包括来自豆科(Fabaceae,Leguminosae)、禾本科(Poaceae)、十字花科(Cruciferaceae)和藜科(Chenopodiaceae)的植物。

合适的植物蛋白来源是大豆、大豆粉、谷类(如玉蜀黍(玉米)、小麦、燕麦、大麦、黑麦和高粱)、谷粉(如玉米粉、小麦粉、燕麦粉、大麦粉、黑麦粉、高粱粉和低芥酸菜子粉)、麸皮(如麦麸和燕麦麸)、油料种子(如油菜籽和向日葵籽)、油料种子粉(如油菜籽粉)、棉籽粉、卷心菜、甜菜和糖用甜菜。这些植物蛋白是食品成分和动物饲料成分的例子。

食品或动物饲料可包含动物蛋白。合适的动物蛋白包括鱼粉和乳清。食品或动物饲料可包含添加剂。合适的添加剂包括酶抑制剂、维生素、痕量矿物质、常量矿物质、染色剂、芳香化合物、抗微生物肽(如明串珠菌素(Leucocin)A、Thanatin和Tritrpticin)和酶。

食品或动物饲料或它们的成分可以是液体。食品或动物饲料或它们的成分可以是固体。例子包括玉米、小麦或大豆粉。

酶修饰实施例

本教导内容为植酸酶提供多种修饰，例如通过糖基化。具体地讲，本说明书涉及植酸酶的糖基化。在一些实施例中，本说明书涉及酶的修饰或变更以引入或增加糖基化位点的数目。可对多肽或编码核酸进行该修饰。在一些实施例中，修饰的酶是植酸酶，在一些实施例中该酶是植酸酶BP17。根据NetNGlyc 1.0预测算法(http://www.cbs.dtu.dk/ services/NetNGlyc/)的分析，植酸酶BP17氨基酸序列(SEQ ID NO:1)含有三个潜在的N连接糖基化位点。预测会被糖基化的天冬酰胺残基是成熟植酸酶BP17序列(缺少信号序列)的残基N169、N173和N285，如下面SEQ ID NO:1中粗体和下划线所指明的。

SEQ ID NO:1

NDTPASGYQVEKVVILSRHGVRAPTKMTQTMRDVTPNTWPEWPVKLGYITPRGEHLISLMGGFYRQKFQQQGILSQGSCPTPNSIYVWTDVAQRTLKTGEAFLAGLAPQCGLTIHHQQNLEKADPLFHPVKAGICSMDKTQVQQAVEKEAQTPIDNLNQHYIPSLALMNTTLNFSKSPWCQKHSADKSCDLGLSMPSKLSIKDNGNEVSLDGAIGLSSTLAEIFLLEYAQGMPQAAWGNIHSEQEWALLLKLHNVYFDLMERTPYIARHKGTPLLQAISNALNPNATESKLPDISPDNKILFIAGHDTNIANIAGMLNMRWTLPGQPDNTPPGGALVFERLADKSGKQYVSVSMVYQTLEQLRSQTPLSLNQPAGSVQLKIPGCNDQTAEGYCPLSTFTRVVSQSVEPGCQLQ

本说明书的一个实施例涉及高度糖基化的植酸酶(例如高度糖基化的BP17)或其同源物、变体或衍生物的制备和使用。在一些实施例中，所制备和/或使用的酶与BP17具有超过75％，例如超过80％，例如超过90％以及又如，超过95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

本说明书的一些实施例涉及为BP17引入进一步的糖基化位点。具体而言，可给BP17引入如下置换中的一者或多者或全部(参照缺少信号序列的SEQ ID NO:1的位置编号方式)以便引入糖基化位点：E121T、P394N、D386N、K202N、N204T、Q151N和P153S、P373T以及Q76N。

具体地讲，本说明书的序列可在相同序列中包含K202N和N204T。在本说明书的另外的实施例中，本说明书的序列可在相同序列中包含Q151N和P153S。

SEQ ID No:5至11给出了可用于本教导内容中的变体序列(在每种情况中相对于BP17的氨基酸改变以粗体和下划线示出)，其中已给BP17(SEQ ID NO:1)引入了氨基酸置换来增加糖基化位点的数目。

酶的糖基化程度可增加经修饰的酶的稳定性。因而本说明书的一些实施例提供更热稳定的酶，例如比野生型酶或使用不同方法制备的酶更热稳定的酶。

本说明书还提供编码和能够编码SEQ ID NO 1的多肽以及其同源物、变体或衍生物的核酸。

本说明书可还涉及SEQ ID NO 1的酶或通过在亲本蛋白质的氨基酸序列中置换、缺失或添加一个或数个氨基酸，如2、3、4、5、6、7、8、9个氨基酸或更多个氨基酸，如10个或超过10个氨基酸而衍生自亲本酶且具有亲本蛋白质的活性的多肽。在一些实施例中，该酶被糖基化，在一些实施例中这种酶具有增加的稳定性。

本说明书的另外的方面提供了制备本说明书的酶、例如其中糖基化增加或酶被高度糖基化的酶的方法。该酶涉及变更酶的氨基酸序列，或变更编码该酶的核酸，以增加糖基化位点的数目。在一些实施例中，该变更涉及增加N连接糖基化位点的数目。在一些实施例中，这涉及将基序Asn-Xaa-Ser/Thr引入给该酶或将编码该位点的序列引入给核酸。在一些实施例中，将一个或两个或三个或更多个糖基化位点引入给酶。

在一些实施例中，本说明书的方法在植酸酶例如BP17(SEQ ID NO:1)上进行。在一些实施例中，本说明书的方法引入如下氨基酸突变中的一者或多者以增加植酸酶中的糖基化位点数目(参考SEQ ID NO:1的位置编号方式)：E121T、P394N、D386N、K202N、N204T、Q151N、P153S、P373T和Q76N)。

制备方法

在另外的实施例中，本说明书还涉及通过制备方法来增加酶的糖基化。在一些实施例中，所用的制备方法是在丝状真菌宿主中表达，例如在木霉属物种真菌中特别是例如在里氏木霉中表达。

本说明书还涉及在变更的宿主中表达酶，其中变更已缺失了多种基因中的一种的功能，在一些实施例中已缺失了内源性内切氨基葡萄糖苷酶基因的功能。

在一个具体的实施例中，本说明书涉及酶例如植酸酶，并且在一些实施例中是植酸酶BP17(其可被修饰或可未被修饰)在木霉属物种真菌，例如在里氏木霉中的表达和产生，其中内源性内切氨基葡萄糖苷酶基因已缺失。

在一些实施例中，本说明书涉及具有增加的糖基化的酶(如植酸酶)的制备和/或使用。在另外的实施例中，增加的糖基化通过使用内切T基因缺失的宿主来支持。在一些实施例中，与使用不同方法，特别是利用不同宿主物种和/或其中内源性内切氨基葡萄糖苷酶基因未缺失的宿主的方法制备的酶相比，所制备的酶具有增加的稳定性。

内源性内切氨基葡萄糖苷酶是从其他蛋白质如植酸酶移除N连接糖基化的分泌酶。蛋白质如酶若在内切T缺失的宿主中产生则糖基化程度较高。根据本说明书，内切T基因可通过移除、破坏、干扰或可防止或减少内切T在宿主中表达和产生的任何方法来缺失。示例性的菌株例如在WO09/114380中教导，参见例如实例5。

在一些实施例中，本说明书涉及植酸酶在内切T缺失的宿主中表达和产生。在另外的实施例中，植酸酶是BP17或其同源物、变体或衍生物，所述同源物、变体或衍生物例如与BP17(SEQ ID NO:1)具有超过75％，例如超过80％，例如超过90％以及又如超过95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施例中，宿主是丝状真菌宿主，例如木霉属物种真菌以及又如里氏木霉。在一些实施例中，与通过其他制备方法制备的植酸酶或未糖基化或未高度糖基化的植酸酶相比，所述植酸酶具有增加的稳定性，例如热稳定性增加。糖基化程度可通过质谱测定。

在一些实施例中，本说明书的制备方法提供更热稳定的植酸酶，其因而可增加饲料中存在的植酸酶活性的加工后水平。在一些实施例中，饲料加工涉及丸粒形成。在另外的实施例中，包含本说明书的植酸酶的丸粒具有增加的加工后的植酸酶活性水平。在另外的实施例中，本说明书的植酸酶更好地能够幸免于制丸工艺并更好地保持加工后的植酸酶活性水平。

实施例的组合

在又一个实施例中，可组合本说明书的各方面。换句话讲，已通过变更氨基酸序列进行修饰来增加糖基化位点数目的本说明书的酶可在经变更的宿主(例如其中内切T基因已缺失的宿主)中产生。这使该酶的糖基化程度最大化。在一些实施例中，宿主是木霉属物种真菌，例如里氏木霉。

在一些实施例中，在变更的宿主中表达的酶是植酸酶，例如BP17(SEQ ID NO:1)或Ronozyme P-(CT)，或它们的同源物、变体或衍生物，所述同源物、变体或衍生物例如分别与BP17(SEQ ID NO:1)或市售的Ronozyme P-(CT)具有超过75％，例如超过80％，例如超过90％以及又如超过95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

在一些实施例中，不管以何种方式制备的或具有无论什么序列的植酸酶与植酸功能邻近，其中植酸酶和植酸处于任何本文所述的组合物中。

实例

如下实例旨在示例本教导内容的一些实施例。实例1和实例2中所用的植酸酶是在EDT-里氏木霉宿主中产生的具有SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的植酸酶BP17。实例3中所用的植酸酶可从帝斯曼公司商购获得的植酸酶Ronozyme P-(CT)。恢复活性百分比、植酸酶活性以及DSC的计算如定义中所述来进行。

实例1-流化床制粒和制丸试验

将植酸(西格玛公司(Sigma))掺入包含植酸酶的多层型颗粒中以评估是否可实现保护植酸酶免受后续的蒸气处理的影响。然后将这些含植酸酶的颗粒与动物饲料混合并通过带有蒸气处理的动物饲料制丸机。

流化床制粒

可使用美国专利No.5324649中描述的流化床喷雾工艺制备酶颗粒。这里，使用了Vector FL-1流化床喷雾-涂布机。以12,000个单位/克(以总干颗粒重量计)添加植酸酶。以总颗粒重量的0.10％至0.40％或在酶层中15至60mM浓度添加植酸。将硫酸钠种子(也称为芯)装进流化床腔室中。通过将蔗糖、玉米淀粉、植酸以及石蜡油或者油菜籽油或消泡剂Foamblast

溶解或分散进经过超滤的植酸酶浓缩物(UFC)中来制备“1号喷雾剂”溶液。将额外的水添加至该混合物以将总固形物浓度保持为约40％。需要恒定的搅拌来保持玉米淀粉和石蜡油或者油菜籽油或消泡剂良好分散于酶UFC中。

使用顶喷工艺将1号喷雾剂施加至已装至流化床制粒机的硫酸钠芯。以6.3g/分钟的初始喷涂速率(在30分钟内斜升至11g/分钟的最终喷涂速率)施加1号喷雾剂。将雾化气压保持在35至40psi之间并将床温度保持在43至45℃之间。

后续的喷雾剂(2号喷雾剂、3号喷雾剂等)通过将该喷雾剂溶液的全部组分溶解和/或分散进水中以形成含有大约18至40％固形物的溶液来制备。含有水不能溶解的油、消泡剂或玉米淀粉的喷雾剂需要连续搅拌来保持这些材料良好分散。2号喷雾剂以23.9g/分钟的恒定喷涂速率施加。将雾化气压保持在34至36psi之间并将床温度保持在45至47℃之间。以7.2g/分钟的初始喷涂速率(在15分钟内斜升至9.2g/分钟的最终喷涂速率)施加3号喷雾剂。雾化气压为40psi并且床温度保持在49℃至50℃之间。

在最终的喷涂后收获多层型颗粒并用上述植酸酶测定法测定植酸酶活性。

制丸

然后将该多层型颗粒与60％玉米粉和40％大豆粉的混合物(即糊料)以60克颗粒对120千克玉米-大豆粉的比率合并使得在制丸前混合物中的最终植酸酶活性大约为5个单位/克。

然后在动物饲料制粒机中将该混合物制丸。将颗粒和玉米-大豆粉在卧式螺带混合机中共混大约15分钟。制丸磨为配备有17.3cm内径模具的单辊型Simon Heesen，丸粒孔直径为3mm。冲模速度为500rpm，由7.5kW马达驱动。通常的进料速率为每小时300kg。调理器中的温度保持在+/-0.1摄氏度，该温度是在调理器的饲料出口处测量。该调理器具有级联型混合机系统。使用两种调理温度：90℃和95℃。蒸气入口压力为2atm，调理器中的温度通过手动调节三个阀来控制，这三个阀控制蒸气递送。在调理器中的驻留时间为大约30秒。当达到目标温度时，该系统运行大约5至10分钟，然后进行采样。采样持续1-1.5分钟的周期，对应于5-7.5kg制丸后的饲料，立刻将样品置于冷却盒中，该冷却盒具有穿孔的底部，空气流量为每小时1500立方米。冷却15分钟后，用分样器将样品缩减两次，取1kg用于实验室测试。

在制丸和冷却后，然后将丸粒磨碎并测定植酸酶活性。将玉米-大豆粉与植酸酶颗粒的未制丸混合物称为“糊料”对照，并也测定植酸酶活性。在90℃或95℃下制丸的酶颗粒中的恢复活性与糊料对照活性之比称为恢复活性百分比，如定义中描述的。

化学计量学

下面表1.1中的计算中，对于加载有0.1％w/w植酸的颗粒可以看出，酶层中的植酸水平是10.19毫摩尔/千克酶层固体或10.19毫重量摩尔浓度。当已将0.1％w/w至1.0％w/w(10.19–101.9毫重量摩尔浓度)的植酸用于颗粒中时如表3中所示观察到制丸性能的改善。

因而，在0.10％w/w植酸下酶层中植酸的浓度为10.19mM，在0.20％w/w植酸下酶层中植酸的浓度为20.38mM，在0.4％w/w植酸下酶层中植酸的浓度为40.76mM，在0.19％w/w下酶层中植酸的浓度为19.361mM，在0.37％w/w下酶层中植酸的浓度为37.703mM，在1％w/w下酶层中植酸的浓度为101.9mM。植酸获自西格玛公司，通过HPLC测定，最初含有大于70％的IP6，余量为IP5、IP4、IP3、IP2和IP1。(在该表1.1中，L10263是下面表1.2中描述的L-10-263；SP1指1号喷雾剂；SP2指2号喷雾剂；SP3指3号喷雾剂。每种“喷雾剂”是含有指定组分固形物的含水溶液或悬浮液，其在流化床涂布机内被喷涂于芯上)。

表1.1

颗粒制剂

表1.2汇总了在制丸试验中制备和测试的颗粒制剂。

表1.2

图1示出了在将这些表1.2制剂制丸后获得的恢复活性。制丸在90℃和95℃下进行。从表1中可以看出，与在酶层中没有任何植酸的情况下制备的对照颗粒(即对照植酸酶)相比，当0.1至0.4％的植酸存在于颗粒的酶层中时，在90℃下观察到19至27％的恢复活性改善，在95℃下观察到17至42％的恢复活性改善。V-10-153和V-11-144是不含植酸的对照样品。所有的其他样品(L-10-263、V-10-264、L-10-231、L-10-265和L-11-095)含有0.10％至0.40％之间的植酸并且在90℃下观察到19至27％的恢复活性改善，在95℃下观察到17至42％的恢复活性改善。(改善的波动看起来不与这些样品中所用的植酸水平相关，可能是由0.10％水平下存在可能的过量)。

表1.3示出在喷涂于颗粒上之前植酸与植酸酶UFC的温育时间对90℃和95℃下制丸后的植酸酶活性的影响。注意，制剂L-11-087、V-11-090、V-11-088和L-11-088全部具有相同的组成，该组成与表1.2中所示的L-11-095相同。这些制剂之间的唯一差异是在喷涂于颗粒上之前让它们温育的时间。可以看出，对于30分钟至6小时之间的温育时间，制丸后的植酸酶活性没有变化。24小时的温育时间后，在90℃和95℃下均观察到制丸后的植酸酶活性显著降低，但该时间范围非常长，在商业环境中制备这些酶颗粒时将通常不会遇到。

表1.3–使用不同温育时间在90℃和95℃下制丸后的植酸酶活性

<u>制剂</u>	<u>温育时间(小时)</u>	<u>90℃恢复活性</u>	<u>标准偏差</u>	<u>95℃恢复活性</u>	<u>标准偏差</u>
						L-11-087	0.5	116％	18％	95％	1％
V-11-090	3	96％	14％	63％	1％
						V-11-088	6	95％	5％	95％	1％
L-11-088	24	87％	1％	51％	5％

实例2-BP17植酸酶的差示扫描量热测定

在MicroCal VP-DSC上进行DSC，使用每小时90℃的扫描速率，BP17植酸酶的浓度为在pH 5.50.25M醋酸钠缓冲液中0.5mg/ml(0.01mM)，该缓冲液含有20mM氯化钙。在添加至醋酸盐缓冲液和植酸酶之前用氢氧化钠将所有植酸样品的pH调节至5.5以确保所有样品均处于相同的pH 5.5下。对于所有样品，在DSC的参比皿中运行醋酸盐缓冲液。

图2示出了添加有或未添加15mM植酸底物的0.5mg/ml(0.01mM)BP17植酸酶的DSC图。对每份样品指示了熔点(Tm)，可以看出，添加15mM植酸将Tm从72.4℃增加至73.8℃(增加1.4℃)，从而指示植酸酶天然状态的稳定化。

图3示出了与没有肌醇的情况下的单独植酸酶相比，15mM肌醇(植酸与植酸酶反应的完全水解产物)的DSC图。可以看出，肌醇没有增加植酸酶的Tm。这支持这样的假设：稳定实体不是植酸的植酸酶水解的完全水解产物，而是部分水解的植酸如肌醇六磷酸、肌醇五磷酸、肌醇四磷酸、肌醇三磷酸、肌醇二磷酸和肌醇一磷酸。(轻微的曲线高度波动可能与经历熔融转变的酶总量相关。这可由于样品制备过程中的实验误差而变化。)

使用基于HPLC的分析方法分析了根据表1.2制备的颗粒样品的磷酸肌醇残余物(IP6、IP5、IP4等)的分布。该HPLC方法是基于离子交换，使用Dionex HPLC系统上的CarboPac 100柱。运行了水和1N HCl的梯度，用显色试剂(0.1％Fe(NO3)3,9H2O)对洗脱材料进行柱后衍生化，从而形成可用290nm的UV检测的InsP-Fe复合物。该方法仅能够定量IP6至IP2，IP1和IP0与溶剂峰一起洗脱。如下面表2.1中所示，在样品任一者中不可能检测出任何植酸盐(IP6)。对于0.1％植酸和0.5mg/ml植酸酶颗粒样品，存在小量的IP3。所述液体样品没有产生远离“溶剂前沿”之外的任何峰。对浓度最大的样品该峰相当大，这暗示完全降解为IP1、IP0和无机磷酸根。

表2.1显示在颗粒中，植酸已水解为IP3、IP2、IP1和IP0，并且不存在IP6。这支持这样的假设：稳定实体是IP3、IP2、IP1(根据DSC数据排除了IP0；IP0不太可能是稳定实体，因为如图3中所示当使用DSC用植酸酶测试IP0(肌醇)时，未观察到Tm增加)。

酶层含有12,000U/g植酸酶。表中的单位是HPLC峰面积。短划线(-)指示值未测定。

<u>样品</u>	<u>IP6</u>	<u>IP5</u>	<u>IP4</u>	<u>IP3</u>	<u>IP2</u>	<u>IP1</u>	<u>IP0</u>
								L-11-087	0	0	0	0.0241	0.0004	-	-
L-11-087	0	0	0	0.0315	0	-	-
								L-11-087	0	0	0	0.0359	0	-	-
L-11-087	0	0	0	0.0343	0	-	-
								L-11-088	0	0	0	0.0288	0	-	-
L-11-088	0	0	0	0.0209	0	-	-
								100mg/ml植酸和0.5mg/ml植酸酶	0	0	0	0	0	-	-
100mg/ml植酸和0.5mg/ml植酸酶	0	0	0	0	0	-	-

图4示出了在0至150mM浓度的植酸的存在下测定的植酸酶的DSCTm的图。可以看出，150mM植酸下植酸酶的Tm从72.4℃增加至80℃，从而显示较未添加植酸的植酸酶Tm增加7.6℃。这可指示来自植酸的十分强的稳定效果。当植酸高于150mM时不可能测定植酸酶的Tm，因为在该浓度下植酸干扰对植酸酶的DSC测量。

实例3-Ronozyme P-CT的差示扫描量热测定

为了探究植酸对其他植酸酶的稳定化的普遍性，使用从帝斯曼公司的颗粒状Rononzyme P-(CT)产品提取的植酸酶进行DSC实验。

通过以10克颗粒固体/100克缓冲液的浓度将颗粒溶解于pH 5.5醋酸钠缓冲液中来从该颗粒提取植酸酶1小时。然后将该材料滤过0.20微米过滤器，然后使用pH 5.5醋酸钠缓冲液和10K分子量筛截

管更换缓冲液5次。在

自动化化学分析仪上用Lowry型测定法测量总蛋白质浓度。

在图5中，可以看到在存在植酸时的稳定化(Tm增加)类型与此前用BP17时观察到的相似。

较高的Tm可能是因为该植酸酶的酶序列与前面实例的BP17不同。植酸对Tm的影响类似于BP17植酸酶并且斜率看起来相似。

尽管上述教导内容已通过举例说明和实例的方式较详细地进行了描述以为了清楚地理解，但对本领域技术人员显而易见的是，可以实践某些改变和修饰而不脱离本教导内容的精神和范畴。因而，本说明书不应该理解为限制本教导内容的范围，本教导内容的范围由随附的权利要求书界定。

特此将本文所引用的全部出版物、专利以及专利申请全文以引用方式并入以用于所有目的，所引入的程度就如同将每个单独的出版物、专利或专利申请具体且独立地指出以引用方式这样并入。以引用的方式并入该文本的文献不应当理解为承认该文献是本申请的“现有技术”。

序列表

SEQ ID NO:1

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SEQ ID NO:2

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SEQ ID NO:3

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SEQ ID NO:4

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SEQ ID NO:5(E121T)

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SEQ ID NO:6(P394N)

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SEQ ID NO:7(D386N)

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SEQ ID NO:8(K202N和N204T)

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SEQ ID NO:9(Q151N和P153S)

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SEQ ID NO:10(P373T)

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SEQ ID NO:11(Q76N)

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SEQ ID NO:12

MTISAFNRKKLTLHPGLFVALSAIFSLGSTAYA

Claims (63)

1.一种增加含植酸酶的颗粒中的植酸酶的稳定性的方法，所述方法包括将至少10毫重量摩尔浓度的植酸引入至所述含植酸酶的颗粒中得到颗粒组合物，其中所述植酸酶和所述植酸功能邻近，其中所述植酸酶和植酸处于固体状态，

其中所述颗粒组合物还包含硫酸钠芯，其中所述植酸和植酸酶被包含在围绕所述硫酸钠芯的层中，其中植酸和植酸酶层包含(a)淀粉、(b)蔗糖、和(c)油菜籽油或石蜡油或消泡剂，所述颗粒组合物还包括包含硫酸钠的第一外涂层和包含PVA和滑石粉的第二外涂层。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述颗粒组合物是多层型颗粒。

3.根据权利要求1所述的方法，其中将所述植酸酶和植酸掺入进多层型颗粒的相同层中。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，颗粒组合物与至少一种动物饲料或食品成分混合以制成混合物，其中所述混合物在蒸气处理制丸后产生动物饲料或食品丸粒，其中在所述丸粒中植酸酶的恢复活性百分数为至少65％。

5.根据权利要求1所述的方法，其中,与未通过浓度为至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶相比，所述植酸酶的通过差示扫描量热法测量的熔解温度，即DSC Tm，增加至少1℃。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，与未通过浓度为至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶相比，所述植酸酶的DSC Tm增加至少2℃。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，在将所述颗粒组合物与至少一种食品或动物饲料成分混合得到混合物，所述混合物以蒸气处理制丸后，所述植酸酶活性比未通过浓度为至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶的植酸酶活性高至少15％。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，植酸为10毫重量摩尔浓度至150毫重量摩尔浓度，其中在将所述颗粒组合物与至少一种食品或动物饲料成分混合得到混合物，所述混合物以蒸气处理制丸后，所述植酸酶活性，比未通过植酸来稳定的对照植酸酶的植酸酶活性，高至少15％。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述植酸酶是植酸酶BP17。

10.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述植酸酶是Ronozyme P-(CT)。

11.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述植酸酶是在包含内切-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因缺失的木霉属(Trichoderma)宿主细胞中产生的植酸酶BP17。

12.一种包含至少10毫重量摩尔浓度的植酸和植酸酶的颗粒组合物，其中所述植酸酶和所述植酸功能邻近，

其中所述颗粒组合物还包含硫酸钠芯，其中所述植酸和植酸酶被包含在围绕所述硫酸钠芯的层中，其中植酸和植酸酶层包含(a)淀粉、(b)蔗糖、和(c)油菜籽油或石蜡油或消泡剂，所述颗粒组合物还包括包含硫酸钠的第一外涂层和包含PVA和滑石粉的第二外涂层。

13.根据权利要求12所述的颗粒组合物，其中所述植酸是至少20毫重量摩尔浓度，其中所述植酸酶以不超过500毫重量摩尔浓度存在。

14.根据权利要求12的颗粒组合物，其中所述植酸是10-100毫重量摩尔浓度。

15.根据权利要求12所述的颗粒组合物，其中与缺少植酸的对照植酸酶相比所述植酸酶是稳定的。

16.根据权利要求12所述的颗粒组合物，其中所述植酸酶和植酸喷雾干燥于固体支持物上。

17.根据权利要求12所述的颗粒组合物，其中所述植酸酶和植酸掺入于多层型颗粒中。

18.根据权利要求17所述的颗粒组合物，其中所述植酸酶和植酸掺入于所述多层型颗粒的相同层中。

19.根据权利要求15所述的颗粒组合物，其中与未通过浓度为至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶相比，所述植酸酶的DSC Tm增加至少1℃。

20.根据权利要求15所述的颗粒组合物，其中与未通过浓度范围为至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶相比，所述植酸酶的DSC Tm增加至少2℃。

21.根据权利要求12所述的颗粒组合物，其中，在将所述颗粒组合物与至少一种食品或动物饲料成分混合得到混合物，将所述混合物以蒸气处理制丸后，所述植酸酶的恢复活性，比未通过植酸稳定的对照植酸酶，高至少15％。

22.根据权利要求12-21中任一项所述的颗粒组合物，其中所述植酸被所述植酸酶水解而产生部分水解的磷酸肌醇，所述磷酸肌醇选自肌醇六磷酸、肌醇五磷酸、肌醇四磷酸、肌醇三磷酸、肌醇二磷酸、肌醇一磷酸以及它们的混合物。

23.根据权利要求12-21中任一项所述的颗粒组合物，其中所述植酸酶是植酸酶BP17或Ronozyme P-(CT)。

24.根据权利要求12-21中任一项所述的颗粒组合物，其中所述植酸酶是在包含内切-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因缺失的木霉属宿主细胞中产生的植酸酶BP17。

25.一种包含根据权利要求12-24中任一项所述的颗粒组合物的丸粒组合物。

26.一种制备热处理食品或动物饲料丸粒的方法，所述方法包括如下步骤：

将根据权利要求12-24中任一项所述的颗粒组合物与至少一种食品或动物饲料成分混合；以及

以蒸气将所得的混合物制丸。

27.根据权利要求5所述的方法，其中，与未通过浓度为至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶相比，所述植酸酶的通过差示扫描量热法测量的熔解温度，即DSC Tm，增加至少1.3℃。

28.根据权利要求5所述的方法，其中，与未通过浓度为至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶相比，所述植酸酶的通过差示扫描量热法测量的熔解温度，即DSC Tm，增加至少1.4℃。

29.根据权利要求5所述的方法，其中，与未通过浓度为至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶相比，所述植酸酶的通过差示扫描量热法测量的熔解温度，即DSC Tm，增加至少1.5℃。

30.根据权利要求6所述的方法，其中，与未通过浓度为至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶相比，所述植酸酶的DSC Tm增加至少4℃。

31.根据权利要求6所述的方法，其中，与未通过浓度为至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶相比，所述植酸酶的DSC Tm增加至少6℃。

32.根据权利要求6所述的方法，其中，与未通过浓度为至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶相比，所述植酸酶的DSC Tm增加至少7℃。

33.根据权利要求6所述的方法，其中，与未通过浓度为至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶相比，所述植酸酶的DSC Tm增加至少7.5℃。

34.根据权利要求6所述的方法，其中，与未通过浓度为至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶相比，所述植酸酶的DSC Tm增加至少7.6℃。

35.根据权利要求6所述的方法，其中，与未通过浓度为至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶相比，所述植酸酶的DSC Tm增加至少8℃。

36.根据权利要求7或8所述的方法，其中，在将所述颗粒组合物与至少一种食品或动物饲料成分混合得到混合物，所述混合物以蒸气处理制丸后，所述植酸酶活性比未通过浓度为至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶的植酸酶活性高至少17％。

37.根据权利要求7或8所述的方法，其中，在将所述颗粒组合物与至少一种食品或动物饲料成分混合得到混合物，所述混合物以蒸气处理制丸后，所述植酸酶活性比未通过浓度为至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶的植酸酶活性高至少19％。

38.根据权利要求7或8所述的方法，其中，在将所述颗粒组合物与至少一种食品或动物饲料成分混合得到混合物，所述混合物以蒸气处理制丸后，所述植酸酶活性比未通过浓度为至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶的植酸酶活性高至少20％。

39.根据权利要求7或8所述的方法，其中，在将所述颗粒组合物与至少一种食品或动物饲料成分混合得到混合物，所述混合物以蒸气处理制丸后，所述植酸酶活性比未通过浓度为至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶的植酸酶活性高至少23％。

40.根据权利要求7或8所述的方法，其中，在将所述颗粒组合物与至少一种食品或动物饲料成分混合得到混合物，所述混合物以蒸气处理制丸后，所述植酸酶活性比未通过浓度为至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶的植酸酶活性高至少25％。

41.根据权利要求7或8所述的方法，其中，在将所述颗粒组合物与至少一种食品或动物饲料成分混合得到混合物，所述混合物以蒸气处理制丸后，所述植酸酶活性比未通过浓度为至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶的植酸酶活性高至少27％。

42.根据权利要求7或8所述的方法，其中，在将所述颗粒组合物与至少一种食品或动物饲料成分混合得到混合物，所述混合物以蒸气处理制丸后，所述植酸酶活性比未通过浓度为至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶的植酸酶活性高至少30％。

43.根据权利要求13所述的颗粒组合物，其中所述植酸是至少30毫重量摩尔浓度。

44.根据权利要求13所述的颗粒组合物，其中所述植酸是至少50毫重量摩尔浓度。

45.根据权利要求13所述的颗粒组合物，其中所述植酸是至少80毫重量摩尔浓度。

46.根据权利要求13所述的颗粒组合物，其中所述植酸是至少100毫重量摩尔浓度。

47.根据权利要求13所述的颗粒组合物，其中所述植酸酶以不超过400毫重量摩尔浓度存在。

48.根据权利要求13所述的颗粒组合物，其中所述植酸酶以不超过300毫重量摩尔浓度存在。

49.根据权利要求13所述的颗粒组合物，其中所述植酸酶以不超过200毫重量摩尔浓度存在。

50.根据权利要求13所述的颗粒组合物，其中所述植酸酶以不超过150毫重量摩尔浓度存在。

51.根据权利要求13所述的颗粒组合物，其中所述植酸酶以不超过100毫重量摩尔浓度存在。

52.根据权利要求19所述的颗粒组合物，其中与未通过浓度为至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶相比，所述植酸酶的DSC Tm增加至少1.3℃。

53.根据权利要求19所述的颗粒组合物，其中与未通过浓度为至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶相比，所述植酸酶的DSC Tm增加至少1.4℃。

54.根据权利要求19所述的颗粒组合物，其中与未通过浓度为至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶相比，所述植酸酶的DSC Tm增加至少1.5℃。

55.根据权利要求20所述的颗粒组合物，其中与未通过浓度范围为至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶相比，所述植酸酶的DSC Tm增加至少4℃。

56.根据权利要求20所述的颗粒组合物，其中与未通过浓度范围为至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶相比，所述植酸酶的DSC Tm增加至少6℃。

57.根据权利要求20所述的颗粒组合物，其中与未通过浓度范围为至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶相比，所述植酸酶的DSC Tm增加至少7℃。

58.根据权利要求20所述的颗粒组合物，其中与未通过浓度范围为至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶相比，所述植酸酶的DSC Tm增加至少7.5℃。

59.根据权利要求20所述的颗粒组合物，其中与未通过浓度范围为至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶相比，所述植酸酶的DSC Tm增加至少7.6℃。

60.根据权利要求20所述的颗粒组合物，其中与未通过浓度范围为至少10毫重量摩尔浓度的植酸来稳定的对照植酸酶相比，所述植酸酶的DSC Tm增加至少8℃。

61.根据权利要求14所述的颗粒组合物，其中所述植酸是20-90毫重量摩尔浓度。

62.根据权利要求14所述的颗粒组合物，其中所述植酸是30-80毫重量摩尔浓度。

63.根据权利要求14所述的颗粒组合物，其中所述植酸是40-70毫重量摩尔浓度。

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