MXPA04006389A

MXPA04006389A - Fitasa termotolerante para comida de animales.

Info

Publication number: MXPA04006389A
Application number: MXPA04006389A
Authority: MX
Inventors: Betts Scott
Original assignee: Syngenta Participations Ag
Priority date: 2001-12-28
Filing date: 2002-12-30
Publication date: 2005-07-13
Also published as: US20030170293A1; US7081563B2; AU2002364919A1; TW200305430A; CA2471859A1; EP1474165A4; US7169595B2; BR0215406A; CN1622825A; US20060228400A1; EP1474165A1; AR037988A1; US20060137038A1; US7141717B2; US7317138B2; WO2003057248A1; ZA200405088B; US20070092555A1

Abstract

La invencion proporciona un polinucleotido de fitasa sintetico que se optimiza para expresion en plantas y que se codifica en una fitasa termotolerante, asi como tambien enzima de fitasa termotolerante aislada. Tambien se proporciona productos alimenticios o comida que comprenden una fitasa termotolerante, y plantas transgenicas que expresan la fitasa termotolerante. Ademas se proporcionan metodos para gacer utilizar fitasas termotolerantes, por ejemplo, un metodo para utilizar una fitasa termotolerante en procesamiento de alimentos y comidas.

Description

WO 03/057248 A 1 ' ? ????,?^ Eurasian patent (A , AZ, B Y KG. Z, MD, RU, TJ, T ), — befare ihc expiration of íhc lime limil for amending Ihe Eur pcan palcnl (AT BE. BG, CH, CY. CZ, DE, DK, BE, clai s and lo be rep blished in Ihc ereni of reccipi of ES, Fl, FR, GB, GR, 1E, IT, LU, MC, NL, PT, SE, SI, SK, a endmems TR). OAPI palenl (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GQ, GW, L, MR, NE, SN, TD, TG). For two-lelter codes and olher abbrevialions. refer to Ihe "Guid- Published: rnce 'oies on Codes and Abbrevialions" appcaring al Ihe begin- iniernalional searcli repon ning of each regular issue oflhe PCT Gazclle.

FITASA TERMOTOLERANTE PARA COMIDA DE ANIMALES SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama la prioridad de la Solicitud No. 60/344 ,476, presentada el 28 de Diciembre del 2001 , la cual se incorpora para referencia en la presente .

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en general al campo de la biología molecular y, más específicamente , a métodos para hacer y utilizar una fitasa termotolerante.

ANTECEDE NTES DE LA INVENCIÓN Las fitasas (fosfohidrolasa de hexaquisfosfato de mio-inositol: EC 3.1 .3.8) son enzimas q ue hidrolizan el fitato (hexaquisfosfato de mio-inositol) en mio-inositol y fosfato inorgánico. Se sabe que las enzimas son valiosos aditivos alimenticios. Al final del siglo veinte, las ventas anuales de fitasa como un aditivo alimenticio animal se estimaron en $ 1 00 millones y continúan en ascenso. Las dietas de aves de corral y cerdos se basan actualmente en cereales, legu mbres y productos de semillas oleaginosas. Aproximadamente dos tercios del fósforo (P) presente en estos forrajes aparece como fitatos, las sales de ácido fítico (hexaqu isfosfato de mio-inositol, lnsP6) (Jongbloed ef al. , 1993). El fósforo de fitato en plantas es una sal mezclada de calcio-magnesio-potasio de ácido fítico q ue se 1 . 2 -presenta como quelato y su solubilidad es muy baja (Pallauf y Rimbach, 1997). El fósforo en esta forma es escasamente digerible/disponible para animales monogástricos tales como humanos, puercos y aves de corral. Para la utilización de fósforo fitato y minerales y elementos residuales enlazados en complejos de ácido fitico, es necesaria la hidrólisis de los grupos de fosfato unidos de tipo éster de ácido fitico por fitasa (Rimbach ef al. , 1994). Las fitasas pertenecen a un grupo especial de fosfatases que son capaces de hidrolizar el fitato en una serie de ésteres de fosfato inferiores de mio-inositol y fosfato. Se conocen dos tipos de fitasas: 3-fitasa y 6-fitasa, que indican el ataque inicial del enlace de éster de fosfato susceptible. Aunque los animales monogástricos carecen de suficiente fitasa para utilizar eficazmente el fósforo de fitato, muchos hongos, bacterias y levaduras producen fitasa que puede utilizarse para complementar raciones animales. Los efectos benéficos de las fitasas complementarias en la capacidad de digestión del fósforo y el desempeño animal se han documentado bien (Mroz et al. , 1994; Kornegay et al. ; Rao et al. , 1999; Ravindran et al. , 1 999). Sin embargo, la mayoría de estos estudios se ha llevado a cabo en una base ad hoc con información con frecuencia solo superficial de las enzimas proporcionadas como estrategias de comercialización por los fabricantes. La eficacia de cualquier preparación de enzima depende no solamente del tipo, la velocidad de inclusión y el nivel de actividad presente, sino también de la habilidad de la enzima para mantener su actividad en las diferentes condiciones encontradas a través del tracto gastrointestinal y las condiciones utilizadas para el pre- tratamiento de un alimento o formulación alimenticia. Aunque numerosas fitasas se encuentran disponibles para utilizarse como un complemento, muchas de las enzimas tienen ciertas desventajas. Por ejemplo, muchas de las fitasas actualmente dispon ibles pierden actividad durante los procesos de conformación en gránulos de los alimentos debido al tratamiento térmico. Adicionalmente, muchas de las fitasas actualmente utilizadas no son adecuadas en dietas que contienen bajos niveles de fosfato de calcio complementario . Además, en muchos casos, existe un alto costo de prod ucción asociado con las enzimas microbialmente expresadas. Por lo tanto, lo que se necesita es una fitasa con propiedades, mejoradas para alimentos animales y procesamiento de alimentos así como también un procedimiento económico para producir la fitasa . Un método para producir una fitasa más económica sería utilizar técnicas de ADN recombinante para producir plantas transgénicas u órganos de plantas capaces de expresar la fitasa que podría entonces agregarse como tal al alimento para animales o alimento para humanos para consu mo directo. Alternativamente, la fitasa podría extraerse y, si se desea , purificarse para aplicación deseada .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De acuerdo con lo anterior, la invención proporciona métodos para la preparación y uso de una molécula de ácido nucleico (polinucléotido) que codifica una fitasa termotolerante, es decir, una fitasa termotolerante que retiene al menos el 40% de la actividad después de 30 · _ 4 -minutos a aproximadamente 60°C, y la cual tiene una actividad específica elevada, es decir, al menos aproximadamente 200 U/mg a 37°C y a pH ácido, por ejemplo, pH 4.5. En una modalidad, la invención proporciona un método para preparar una fitasa termotolerante. El método comprende la expresión en una célula huésped vegetal de una cinta de expresión que comprende un promotor operablemente enlazado a una molécula de ácido nucleico que codifica una fitasa termotolerante que retiene al menos 40% de la actividad después de 30 minutos a 60°C y tiene una actividad específica de más de 200 U/mg a pH 4.5 y 37°C. En una modalidad preferida, el método comprende además aislar la fitasa termotolerante. La célula huésped, vegetal puede ser monocotiledónea, tal como una célula de trigo o maíz o dicotiledónea, tal como una célula de semilla de soya. En una modalidad preferida, la célula vegetal que se emplea para preparar la fitasa termotolerante recombinante produce una forma glicosilada de la fitasa termotolerante recombinante. La invención también proporciona una secuencia polinucleótida que codifica la fitasa termotolerante en donde la secuencia polinucleótida se optimiza para expresión en una célula vegetal, principalmente una célula de maíz. Se prefiere que el polinucleótido que codifica la fitasa termotolerante (el primer polinucleótido) se enlace de manera operable a por lo menos una secuencia reguladora, tal como un promotor, un mejorador, un intrón, una secuencia terminadora, o cualquier combinación de los mismos, y, opcionalmente, a un segundo polinucleótido que codifica u na secuencia de señal, la cual dirige la enzima codificada por el primer polinucleótido hacia un lugar celular en particular, por ejemplo, una ubicación extracelular. Los promotores pueden ser promotores constitutivos, tales como un promotor de ubiquitina o promotores inducibles (condicionales). Los promotores pueden ser específicos de tejido. En una modalidad preferida, el promotor es u n promotor específico de endoesperma tal como un promotor de glutelina-2 ?-ze ína y prferentemente el promotor de glutelina-2 ?-zeína 27-KD de maíz, o un promotor de pirofosforilasa AD-glucosa de maíz. El promotor puede ser un promotor específico de embrión tal como promotor de globu lina de maíz 1 u oleosina de maíz 1 8 KD. Los promotores ejemplificativos incluyen, pero no se limitan a, SEQ I D NO:8 y SEQ ID NO: 9. Preferentemente, la fitasa termotolerante tiene al menos 40% de actividad a aproximadamente 60°C por 30 minutos , más preferentemente al menos 40% de actividad a aproximadamente 65°C durante 30 min utos, incluso más preferentemente al menos 35% de actividad a 70°C durante 30 minutos , y la cual tiene una actividad específica de al menos 400 U/mg, más preferentemente al menos 600 U/mg e incluso más preferentemente al menos 800 U/mg , a 37°C y a pH ácido , por ejemplo, menos de pH 5.0 y más preferentemente menos de pH 4.0 y mayor de un pH 1 .5. Una fitasa termotolerante ejemplar de la invención se proporciona en la SEQ I D NO: 1 . También se proporcionan por la invención vectores que comprenden la cinta de expresión o polinucleótido de la invención y células de planta y células de planta transformadas que comprenden el polinucleótido, la cinta de expresión o vector de la invención. Un vector de la invención puede codificar más de un polipéptido, incluyendo más de una fitasa termotolerante o puede codificar un polipéptido de fusión que comprende la fitasa termotolerante de la invención , y u na célula vegetal puede comprender uno o más vectores de la invención . Las células transformadas de la invención son útiles en la preparación de la fitasa termotolerante de la invención . De acuerdo con lo anterior, la invención proporciona fitasa termotolerante aislada de las células microbianas transformadas de la invención , así como también una enzima sintéticamente preparada . Un polipéptido de fusión preparado por los métodos de la invención preferentemente comprende una secuencia de señal. La secuencia de señal , operativamente enlazada al gen de fitasa, tiene como objetiva la fitasa para un amiloplasto, retículo endoplásmico, apoplasto, o granu lo de almidón de la célula. Las secuencias de señal ejemplificativas incluyen , pero no se limitan a , la secuencia de terminal N de ceroso, la secuencia de termina N de ?-zeína, un dominio de unión de almidón tal como un dominio encapsulante de almidón ceroso. En una modalidad preferida, el polipéptido de fusión preparado y empleado en los métodos de la invención comprende la secuencia de señal S EKDEL operativamente enlazada al término C de la fitasa termotolerante. La fitasa termotolerante proporcionada por la invención tiene una vida media de más de 25 minutos a u n pH mayor a 2.0 y menor a 4.0. Se proporcionan además por la invención métodos para la formulación de fitasas termotolerantes, formulaciones de fitasa o mezclas de enzima formuladas. La fitasa termotolerante recombinantes o formu laciones de la misma pueden agregarse como un complemento a los alimentos o alimentos animales o a componentes de alimentos y alimentos antes , durante o después del procesamiento de alimento o alimentos. Preferentemente, la fitasa termotolerante recombinante de la invención se agrega a una mezcla de componentes alimenticios antes y/o durante el acondicionamiento térmico (por ejemplo, vapor) en una trituradora de gránulos. Por lo tanto, la invención incluye métodos para la elaboración y uso de una fitasa termotolerante. Además, ya que una fitasa de la invención es capaz de sobrevivir a la etapa de acondicionamiento térmico encontrada en una trituradora de gránulos comercial durante la formu lación de alimentos, la invención proporciona un método para la elaboración de alimento animal, por ejemplo, gránulos de alimento granular duro que comprenden la fitasa termotolerante. Para elaborar el alimento, la fitasa formulada puede mezclarse con componentes alimenticios, acondicionarse con vapor la mezcla en una trituradora de gránulos de tal manera que se retenga al menos 50% de la actividad enzimática térmicamente pre-tratada y extruirse el alimento a través de una boquilla de gránulos. La fitasa puede utilizarse así como un complemento en alimentos animales por sí sola, además de vitaminas, minerales, otras enzimas alimenticias, co-productos agrícolas (por ejemplo, productos de calidad media de trigo o harina de gluten de maíz) , o en una combinación con los mismos. La enzima también puede agregarse a dietas de mezcla de granos molidos y hervidos, es decir, d ietas que no han pasado a través de un granulador.

Debido a que las enzimas de fitasa comerciales actualmente disponibles no son termotolerantes, con frecuencia se aplican después de la formación de gránulos, generalmente a través de rocío de una solución de enzima sobre alimentos granulados. Algunos de los problemas asociados con los métodos de rocío son que solamente un bajo porcentaje de los gránulos se contacta con la enzima, la enzima solamente se presenta en la superficie de los gránulos cubiertos y las trituradoras de alimentos necesitan invertir en y operar compleja maquinaria de rocío. En contraste, la fitasa termotolerante de la invención, la cual tiene una actividad específica 8 veces mayor que otras enzimas comercialmente disponibles, puede agregarse antes de la formación de gránulos, facilitando así la producción de un alimento con una distribución mejorada de la enzima. Además, los alimentos que comprenden la fitasa termotolerante de la invención pueden tener una mayor vida útil en depósito que los alimentos rociados con fitasa, ya que el proceso de rocío introduce humedad que puede apoyar el desarrollo de hongos y bacterias durante el almacenamiento. Además, la mayor actividad específica de la fitasa termotolerante de la invención permite que los fabricantes de alimentos utilicen niveles de fosfato significativamente inferiores en los alimentos. Por ejemplo, se recomienda actualmente que la dieta se complemente con las fitasas comerciales disponibles que utilizan un nivel basal de 0.45% de fosfato inorgánico. La fitasa termotolerante de la invención puede utilizarse con un complemento de fosfato inferior, por ejemplo, de aproximadamente 0.225% en dietas para aves de corral. La invención proporciona así un método para la preparación de alimentos animales, que comprende la proporción de una mezcla que comprende uno o más de los componentes alimenticios y una preparación que comprende la fitasa termotolerante de la invención y el tratamiento de la mezcla bajo condiciones adecuadas de temperatura y humedad a fin de hid rolizar ácido fítico que se presenta en la mezcla. También se proporcionan alimentos animales preparados mediante tal método . Se proporciona además un método para la preparación de una fitasa termotolerante que contiene una composición para formu lación alimenticia, que comprende la combinación de una solución líquida que comprende la fitasa termotolerante de la invención y harina de grano molido, por ejemplo, harina de grano molido de soya, a fin de producir una mezcla; y la liofilización de la mezcla para producir u na composición liofilizada . En una modalidad adicional , el método comprende además combinar la composición liofilizada con otros componentes alimenticios para producir una mezcla adicional . Las composiciones liofilizadas preparadas de acuerdo a estos métodos también se proporcionan por la invención . La invención proporciona además un método en el cual una mezcla que comprende componentes alimenticios an imales y una prepa ración que comprende la fitasa termotolerante de la invención se trata con calor, preferentemente a una temperatura mayor a 50°C, a fin de producir una mezcla alimenticia anima l termo-tratada. También se proporcionan los alimentos animales termo-tratados preparados por el método . La preparación de fitasa puede ser una preparación líquida o sólida y preferentemente comprende menos de aproximadamente 1 % de fosfato inorgánico. Preferentemente, la preparación de fitasa es material de planta transgénica. El material de planta transgénica es preferentemente grado de maíz, grano agrietado, harina de maíz, o un extracto de enzima preparado del maíz. En una modalidad, una solución líquida que comprende la fitasa termotolerante de la invención se combina con harina de granos molidos de soya a fin de producir una mezcla y la mezcla se liofiliza entonces. La mezcla, la cual comprende preferentemente menos de 0.45% de fosfato inorgánico, también puede comprender al menos una vitamina, mineral, una enzima diferente a una fitasa termotolerante, un ácido orgánico, un producto probiótico, un aceite esencial, o un co-producto del procesamiento de granos. Los alimentos termo-tratados pueden procesarse aún más, por ejemplo, mediante extrusión de los alimentos termo-tratados a través de una trituradora de gránulos a fin de producir alimentos animales granulados, que también se comprenden por la invención. También se proporciona una composición alimenticia animal que comprende la fitasa termotolerante preparada por los métodos de la invención. En particular, la invención proporciona una composición alimenticia animal que comprende la fitasa termotolernte, preparada de acuerdo a los métodos de la invención, tal fitasa tiene una actividad específica mayor a 400 U/mg a pH 4.5 y 37°C, y preferentemente mayor a 600 U/mg a pH 4.5 y 37°C, y más preferentemente mayor a 800 U/mg a pH 45 y 37°C. En una modalidad preferida, la composición alimenticia animal comprende una fitasa termotolerante que tiene una vida media mayor a 25 minutos a un pH mayor a 2.0 y menor a 4.0. También se proporciona un aditivo alimenticio de enzima o un aditivo alimenticio que comprende una fitasa termotolerante preparada de acuerdo a los métodos de la invención. En modalidades preferías, los aditivos alimenticios o alimento comprenden una fitasa termotolerante que tiene una actividad específica mayor a 400 U/mg a pH 4.5 y 37°C, y preferentemente mayor a 600 U/mg a pH 4.5 y 37°C, y más preferentemente mayor a 800 U/mg a pH 45 y 37°C. En modalidades preferidas, los aditivos alimenticios y alimentos animales comprenden una fitasa termotolerante que tiene una vida media mayor a 25 minutos a un pH mayor a 2.0 y menor a 4.0. También se proporciona un método para disminuir/reducir el índice de conversión de alimentos e incrementar la ganancia de peso de un animal, que comprende la alimentación de un animal con alimentos que comprenden la fitasa termotolerante. En una modalidad preferida, el método comprende alimentar a un animal con un alimento que comprende fosfatasa inorgánica por debajo de 0.45% y la fitasa termoestable de la invención en una cantidad efectiva para mejorar el índice de conversión de alimentos o la ganancia de peso en el animal. En modalidades adicionales, se prefiere que la fitasa termoestable tenga una vida media de aproximadamente 30 minutos en el tracto digestivo del animal. Se proporciona además un método para reducir los requisitos dietéticos de fósforo, por ejemplo, fósforo inorgánico, en un animal. El método comprende la alimentación de un animal con alimentos que comprenden la fitasa termotolerante de la invención en una cantidad eficaz - 12 -para incrementar la biodisponibilidad del fósforo, preferentemente la biodisponibilidad del fósforo inorgánico, en los alimentos para el animal. También se proporciona un método para mejorar la utilización del fósforo presente en alimentos para un animal, cuyo método comprende la alimentación del animal con un alimento que comprende la fitasa termotolerante de la invención en una cantidad eficaz para incrementar la biodisponibilidad del fósforo en los alimentos para el animal. En modalidades adicionales de estos métodos, la fitasa tiene una vida media de aproximadamente 30 minutos en el tracto digestivo del animal. Además, la invención proporciona un método para disminuir los niveles de fosfato en el excremento de un animal, que comprende la alimentación del animal con un alimento que comprende la fitasa termotolerante de la invención en una cantidad efectiva para disminuir los niveles de fosfato en el excremento del animal. En u na modalidad preferida, la invención proporciona un método para reducir los niveles de fosfato en el extremento de un anima l que comprende alimentar al animal un alimento que comprende menos de 0.45% de fósforo inorgánico y la fitasa termotolerante de la invención en una cantidad eficaz para disminuir los niveles de fosfato en el excremento del animal . En modalidades adicionales de estos métodos, la fitasa tiene una vida media de aproximadamente 30 minutos en el tracto digestivo del animal . La invención también proporciona un método para mejorar el valor nutritivo de alimentos animales o de alimento para hu mano. El método comprende la ad ición de la fitasa termotolerante de la invención durante la preparación de alimentos animales o de alimento para humano. ' - 1 3 - También se proporciona un método para la preparación de un alimento humano, que comprende la proporción de una mezcla de un componente alimenticio y una preparación que comprende la fitasa termotolerante de la invención ; y el tratamiento de la mezcla bajo condiciones adecuadas de temperatura y humedad a fin de facilitar la hidrólisis de ácido fítico presente en la mezcla. El alimento para humanos tratado preparado de acuerdo a este método también se comprende por la invención. El alimento para humanos tratado tiene un contenido de ácido fítico reducido relativo al contenido de ácido fítico en alimento para humanos correspondiente que no se trata. La invención también proporciona un método para mejorar el procesamiento de grano que comprende agregar la fitasa termotolerante de la invención durante el procesamiento del grano . El método puede utilizarse para mejorar el procesamiento de todo el grano, y se utiliza preferentemente para mejorar el procesamiento de maíz, trigo, semilla de soya, cañóla o caña de azúca r. La invención proporciona además un método para mejorar el valor nutritivo de un producto de grano procesado o un método para procesar grano que comprende la adición de la fitasa termotolerante de la invención al producto de grano durante el procesamiento de grano en una cantidad efectiva para mejorar el nutritivo valuado del alimento. En una moda lidad preferida, el grano es ma íz y el método de procesamiento de grano es triturado en húmedo y los productos del procesamiento son alimento de gluten de maíz, y almidón de maíz. En modalidades preferidas adicionales, el grano es maíz, trigo, semilla de soya, cañóla o caña de - 14 -azúcar. En otras modalidades preferidas, el grano es semilla oleaginosa, tal como semilla de soya o cañóla o naba de semilla oleaginosa, y el producto d egrano procesado es el grano de semilla oleaginosa. La invención proporciona además un método para preparar una fitasa termotolerante que contiene composición para formulación de alimentos que comprende combinar una solución líquida que comprende la fitasa termotolerante de la invención y harina para producir una mezcla; y liofilizar la mezcla para producir una composición liofilizada. La invención también proporciona una composición liofilizada preparada por tal método. En una modalidad preferida, el método comprende combinar la composición liofilizada con otros componentes alimenticios para producir una mezcla adicional. En una modalidad preferida, la fitasa termotoelrante que contiene la composición comprende una fitasa termotolerante que tiene una actividad específica de más de 800 U/mg a pH 4.5 y 37°C. En otra modalidad preferida, la fitasa termotolerante tiene una vida media mayor a 25 minutos a un pH mayor a 2.0 y menor a 4.0. En aspectos adicionales, la invención proporciona métodos para preparar una célula vegetal transformada, parte vegetal y planta, que expresa la fitasa termotolerante de la invención. La invención también comprende la célula de planta transgénica, parte de planta y planta producida por estos métodos. En modalidades preferidas, el método comprende introducir en una célula vegetal una cinta de expresión que comprende un promotor operativamente enlazado a una molécula de ácido nucleico que codifica la fitasa termotolerante y obtener una planta transgénica de la célula vegetal transformada. La fitasa termotolerante - 1 5 -preferentemente retiene al menos 40% de actividad después de 30 minutos a 60°C y tiene una actividad específica mayor a 200 U/mg a pH 4.5 y 37°C. Más preferentemente , la fitasa termofolerante tiene una actividad específica mayor a 400 U/mg a pH 4.5 y 37°C . Aún más preferentemente, la fitasa termotolerante tiene una actividad específica mayor a 600 U/mg a pH 4.5 y 37°C. Aún más preferentemente, la fitasa termotolerante tiene una actividad específica mayor a 800 U/mg a pH 4.5 y 37°C . La célula vegetal transformada, parte de planta o planta puede ser una célula dicot o una célula monocot, preferentemente una célula de cereal, y más preferentemente una célula de trigo o maíz, o una célula de semilla de soya. En modalidades preferidas, el método se emplea para preparar célula de planta transgénica, parte de planta, o planta que comprende la fitasa termotolerante establecida en SEQ ID NO: 1 . La célula de planta transgénica, parte de planta y planta producida en la misma se incluyen dentro del alcance de la invención . En otra modalidad preferida del método de la invención, la fitasa termotolernate se expresa en la semilla de la planta . La semilla de tal planta se comprende dentro del alcance de la invención. También dentro del alcance de esta invención se encuentra una célula de planta transformada, parte de planta , y planta que comprende la cinta de expresión de la invención . Como se describe previamente, la cinta de expresión comprende u n promotor operativamente enlazado a una molécula de ácido n ucleico que cod ifica la fitasa termotolerante de la invención. El promotor puede ser un promotor ' - 16 -específico de embrión, tal como u n promotor de globulina-1 de maíz o un promotor 1 8 KD de oleosina de maíz, y es preferentemente un promotor específico de endoesperma, tal como un promotor de fosforilasa ADP-glucosa de maíz o un promotor de ?-zeína de maíz. La invención también comprende una célula vegetal transformada, parte de planta y una planta que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica u n polipéptido de fusión que comprende la fitasa termotolerante de la invención. En una modalidad preferida , la planta comprende un polipéptido de fusión que comprende una secuencia de señal de terminal N de ?-zeína operativamente enlazada a la fitasa termotolerante. En otra modalidad preferida , la planta comprende un polipéptido de fusión q ue comprende SEKDEL operativamente enlazada al término C de la fitasa termotolerante. En otra modalidad preferida, la planta comprende un polipéptido de fusión que comprende un péptido de objetivo amiloplasto ceroso de terminal N operativamente enlazado a la fitasa termotolerante. En otra modalidad preferida , la pla nta comprende un polipéptido de fusión que comprende un domino encapsulante de almidón ceroso operativamente enlazado al término C de la fitasa termotolerante. La invención también comprende u n producto de la planta de la invención tal producto comprende una fitasa termotolerante . El producto es preferentemente una semilla, grano o fruta. El producto puede ser u na planta, y en particular una planta h íbrida o una planta in nata . El producto también puede ser un producto de procesamiento de grano que comprende la fitasa termotolerante de la invención , tal como el producto de procesamiento de grano de ma íz y el producto de procesamiento de grano ' - 17 -de semilla oleaginosa previamente descrito en la presente o un producto de procesamiento de semilla oleaginosa. Los animales dentro del alcance de la invención incluyen animales poligástricos, por ejemplo, becerros, así como también animales tales como puercos, aves de corral (por ejemplo, pollos, pavos, gansos, patos, faisán, guacos, codorniz y avestruz), equinos, ovinos, caprinos, caninos y felinos, así como también peces y crustáceos. Los alimentos para animales o alimentos preferidos y/o empleados en la invención incluyen alimentos para puercos y aves de corral. Los niveles de fitasa en los alimentos o alimento son preferentemente de aproximadamente 50 hasta 5000 U/kg , más preferentemente 1 00 hasta 1200 U/kg o 300 hasta 1 200 U/kg . La invención también proporciona una planta transformada producida por los métodos de la invención. Preferentemente, la planta transformada es una planta de semilla de soya, trigo o ma íz.

BREVE DESCRIPCIÓN OE LAS FIGURAS Figura 1 demuestra la expresión del gen de fitasa de maíz optimizado de codón (Nov9X) que codifica una fitasa funcional que se acumula en la semilla de maíz. Parte superior: cada barra representa la fosfatasa total extraída de seis granos de plantas que secretan el transgen Nov9X. Parte inferior: la actividad de fitasa total (fosfatasa anterior se substrae antes de calcular la actividad). 1 unidad = µ?t??? de fosfato liberado/min por extracto total de 6 granos. 264A8C#14 es el control negativo (que carece de transgen Nov9X); 305A13 contiene plásmido ' - 1 8 -pNOV4057; 305B1 1 contiene el plásmido pNOV4061 . Figura 2 demuestra que la actividad de fitasa Nov9X recombinante producida en el ma íz es estable al calor. Las unidades se definen como se describe en la figura 1 . A. Actividad de fitasa tota l extraída. B. Gel SDS-PAGE de extractos coloreados con azul Coomassie. Figura 3 proporciona una comparación de niveles de fitasa en extractos de harina de granos secos. Todas las plantas contienen ya sea pNOV4057 o pNOV4061 . Parte superior: concentración de fosfato de reacciones. Parte inferior: unidades de fitasa se reportan como µ????ße de fosfato liberado/mg proteína/min. Copia Nov9X # parte superior 4: 305A24A, 2 copias; 305B 1 1 A, 20A, 27A todas las >3 copias. Figura 4 muestra la acumulación de fitasa (Nov9X) producida en maíz. Las figuras proporcionan una comparación de la actividad de fitasa en suspensiones de harina de maíz y cuatro extractos. 266B-2E es un control negativo. La concentración de fosfato de todas las muestras se muestra en la gráfica superior. Las unidades de fitasa se calculan después de corregir el fosfato endógeno presente en el control negativo 266B-2E. Los duplicados de cada control y tratamiento se muestran . La concentración de fosfato del control negativo se substrae de aquella de los tratamientos con objeto de determinar el fosfato liberado debido a la actividad de fitasa (gráficas inferiores). Figura 5 demuestra la expresión específica de endoesperma de Nov9X. La figura muestra actividad de fitasa (Nov9X) en extractos de endoesperma T2 y embrión . Las muestras duplicadas se extraen (conjuntos 1 & 2). - 1 9 - Figura 6 muestra que la fitasa Nov9X expresada de maíz es estable durante el calentamiento de los extractos de endoesperma y se enriquece altamente en la fracción soluble del sobrenadante calentado. A. Actividad de Fitasa de muestras calentadas y no calentadas. B. Actividad específica de fitasa de muestras calentadas y no calentadas. Figura 7 muestra las actividades de fitasa (FTU/g) de varias líneas que contienen 2 eventos. Cada punto de datos representa la actividad de fitasa extraida de 1 g de harina obtenida al pulverizar 1 0 granos. Las muestras duplicadas de 1 0 granos se pulverizan para cada línea (muestra 1 & 2). Los substituidos ID innatos para polinador, conservador y estéril como se utilizan en la versión previa. Figuras 8A, 8B y 8C muestran los índ ices de conversión de alimentos (FCRs) de tres pruebas de alimentación de pollo de 21 días que demuestran el beneficio del complemento con fitasa de maíz. FCRs se reportan como Lspromedio. Fósforo disponible: controles positivos, 0.400%, controles negativos, 0.225% . Dietas complementadas con fitasa se preparan al agregar maíz transgénico triturado para muestras de dietas bajas en fosfato (0.225% fósforo disponible = control negativo). La diferencia entre la dieta de control negativo y las dietas complementadas con enzima es la adición de maíz transgénico triturado que contiene fitasa Nov9X. Figura 8A: La fitasa se formula al triturar los granos de maíz transgénico completos en harina. La harina se agrega entonces directamente al alimento en malla (bajo en fosfato) y se mezcla completamente. Los animales se alimentan entonces con dietas en malla y ' - 20 -las ga nancias de peso se determinan a los 21 días. Triángulos: harina de semilla de maíz que contiene el vector pNOV4057. Diamantes: harina de semilla de maíz que contiene el vector pNOV4061 . Figura 8B: Fitasa formulada como maíz triturado se agrega a alimento de pollo bajo en fosfato antes del acondicionamiento por vapor y formación de pildoras. Cuadrados: harina de maíz de semilla de ma íz que contiene pNOV4061 . Diamantes: harina de maíz de semilla de maíz que contiene pNOV4057. Figura 8C: Fitasa formulada como ma íz triturado se agrega a alimento de pollo bajo en fosfato antes del acondicionamiento por vapor y formación de pildoras. La semilla de maíz que contiene fitasa (codificada por el vector pNOV4057) se tritura a diferentes tamaños de partícula promedio que varían de una harina fina a una molienda gruesa. Diamantes, molienda fina (harina); cuadrados, molienda media, triángulos, molienda gruesa . Material de molienda gruesa consiste predominantemente de partículas >2000 micrones. El material de molienda media fue predominantemente en el rango de tamaño de 500-2000 micrones. La molienda fina fue <500 micrones.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones "Niveles alterados" se refiere al nivel de expresión en células u organismos transformados o transgénicos que difieren de las células u organ ismos normales o sin transformación. El término "rasgo de planta tratada" significa cualquier cambio - 21 -genotípico o fenotípico en una planta transgénica relativa a huésped de planta tipo silvestre, no transformada o no transgénica. "Inhibición de antidetección" se refiere a la producción de transcripciones de ARN de antidetección capaces de suprimir la expresión de proteína a partir de un gen endógeno o un transgen . "Quimérico" se utiliza para indicar que una secuencia de ADN , tal como un vector o un gen, está comprendida de más de una secuencia de ADN de origen distinto que se fusiona en conju nto mediante técnicas recombinantes de ADN , dando como resultado una secuencia de ADN, que no ocurre naturalmente. El término "gen quimérico" se refiere a cualquier gen que contiene 1 ) secuencias de ADN, que incluyen secuencias reguladoras y codificadoras, que no se encuentran juntas en la naturaleza , o 2) secuencias que codifican partes de proteínas no naturalmente adjuntas, o 3) partes de promotores que no se unen naturalmente. De acuerdo con lo anterior, un gen quimérico puede comprender secuencias reguladores y secuencias codificadoras derivadas de la misma fuente, pero instaladas en una manera diferente a la encontrada en la naturaleza. "Cromosómicamente integrado" se refiere a la integración de un gen o construcción de ADN ajena en el ADN huésped mediante enlaces covalentes. Cuando los genes no se "integran cromosómica mente" pueden "expresarse de manera transitoria". La expresión transitoria de u n gen se refiere a la expresión de un gen que no se integra en el cromosoma huésped sino funciona de manera independiente, ya sea como parte de una plásmida o cinta de expresión de reproducción autónoma , por ejemplo, o como parte de otro sistema biológico, tal como un virus . - 22 - Los "vectores de clonación" típicamente contienen uno o algunos sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción en los cuales pueden insertarse las secuencias de ADN ajenas en una manera determinable sin pérdida de la función biológica esencial del vector, así como también como un gen marcador que es adecuado para utilizarse en la identificación y selección de células transformadas con el vector de clonación. Los genes marcadores típicamente incluyen genes que proporcionan resistencia a antibióticos tales como tetraciclina, higromicina o ampicilina, u otros medios para la selección de células transformadas. La "secuencia codificadora" se refiere a una secuencia de ADN o ARN que codifica una secuencia amino acida específica y excluye las secuencias no codificadoras que son 5' y 3' para la secuencia codificadora. Puede constituir una "secuencia de codificación sin interru pción", es decir, que carece de un intrón , tal como en un cADN o puede incluir uno o más intrones enlazados mediante uniones de división adecuadas. Un "intrón" es una secuencia de ARN que está contenida en la transcripción primara pero que se retira a través de la disociación y re-ligación del ARN dentro de la células a fin de crear el mARN maduro que puede traducirse en una proteina . La "expresión constitutiva" se refiere a la expresión que utiliza un promotor constitutivo o regulado. La "expresión condicional" y "regulada" se refiere a la expresión controlada por un promotor regulado. El "promotor constitutivo" se refiere a un promotor que es capaz de expresar el gen que controla en todos o casi todos los tejidos de planta durante todas o casi todas las etapas de desarrollo de la planta. - 23 - Cada uno de los elementos de activación de la transcripción no muestran una especificidad de tejido absoluta , pero median la activación trascripcional en la mayoría de las partes de planta a un nivel de > 1 % del nivel alcanzado en la parte de la planta en la cual la transcripción es más activa. El término "contactar" puede incluir cualquier método conocido o descrito para la introducción de un segmento de ácido nucleico en una célu la. La "expresión" se refiere a la transcripción y/o traducción de un gen endógeno o un transgen en una célula huésped . Por ejemplo, en el caso de construcciones de antidetección, la expresión puede referirse a la transcripción del ADN de antidetección solamente. Además, la expresión se refiere a la transcripción y acu mulación estable de (mARN) de detección o ARN funcional. La expresión también puede referirse a la producción de proteína. La "cinta de expresión", según se utiliza en la presente, significa una secuencia de ADN capaz de dirigir la expresión de una secuencia nucleótida en particular en una célula huésped adecuada , que comprende un promotor operablemente enlazado a la secuencia n ucleótida de interés que se enlaza de manera operable a señales de terminación. Típicamente, también comprende las secuencias requeridas para la traducción adecuada de la secuencia nucleótida . La cinta de expresión que comprende la secuencia nucleótida de interés puede ser quimérica, significando que al menos uno de sus componentes es heterólogo con respecto a por lo menos uno de sus otros componentes. La cinta de - 24 -expresión también puede ser una que es naturalmente ocurrente pero que se ha obtenido en una forma recombinante útil para expresión heteróloga. La expresión de la secuencia nucleótida en la cinta de expresión puede ser bajo control de un promotor constitutivo o de un promotor inducible que inicia la transcripción solamente cuando la célula huésped se expone a ciertos estímulos externos en particular. En el caso de un organismo multicelular, el promotor también puede ser específico para un tejido particular u órgano o etapa de desarrollo . El "patrón de expresión" de un promotor (con o sin mejorador) es el patrón de los niveles de expresión , que muestra donde en la planta y en que etapa de desarrollo se inicia la transcripción por el promotor. Los patrones de expresión de un conjunto de promotores se d ice q ue son complementarios cuando el patrón de expresión de un promotor muestra poca sobreposición con el patrón de expresión del otro promotor. El nivel de expresión de un promotor puede determinarse mediante medición de la concentración de 'estado continuo' de un mARN informante trascrito, estándar. Esta medición es indirecta ya que la concentración del mARN informante depende no solamente de su velocidad de síntesis, sino también de la velocidad con la cual el mARN se degrada. Por consiguiente, el nivel de estado contin uo es el producto délas velocidades de síntesis y velocidades de degradación . Sin embargo, la velocidad de degradación puede considerarse que procede a una velocidad fija cuando las secuencias transcritas son idénticas y, por lo tanto, este valor puede servir como una medición de las velocidades de síntesis. Cuando los promotores se comparan de esta - 25 -manera , las técnicas disponibles para aquellos expertos en la materia son el análisis de S 1 -ARNasa por hibridización , manchados Northern y RT-PCR competitivo. Esta lista de técnicas no representa de manera alguna a todas las técnicas disponibles, sino más bien describe procedimientos utilizados para analizar la actividad de transcripción y los niveles de expresión de mARN . El análisis de los puntos de inicio de transcripción en prácticamente todos los promotores ha revelado q ue normalmente no existe una sola base en la cual se inicia la transcripción , sino más bien un conjunto más o menos agrupado de sitios de inicio, cada uno de los cuales toma en cuenta algunos puntos de inicio del mARN. Ya que esta distribución varía de promotor en promotor, las secuencias del mARN informante en cada una de las poblaciones difiere de las otras. Ya que cada especie de mARN es más o menos propensa a la degradación , no puede esperarse una sola velocidad de degradación para diferentes mARNs informantes. Se ha demostrado para diversas secuencias promotoras eucarióticas que la secuencia que rodea el sitio de inicio ('iniciador') juega un papel importante en la determinación del nivel de expresión de ARN dirigido por ese promotor específico. Esto incluye también parte de las secuencias transcritas. La fusión directa de promotor a secuencias informantes conduciría , por consiguiente, a niveles sub-óptimos de transcripción . "Secuencia 5' no codificadora" se refiere a u na secuencia nucleótida localizada 5' (corriente arriba) en la secuencia codificadora. Se presenta en el mARN completamente procesado, corriente arriba del codón - 26 -de inicio y puede afectar el procesamiento de la transcripción primaria a mARN, la estabilidad de mARN o la eficiencia de traducción (Turner et al. , 1995). El término "gen" se utiliza ampliamente para referirse a cualquier segmento de ácido nucleico asociado con una función biológica . Por lo tanto, los genes incluyen secuencias codificadoras y/o las secuencias reguladoras requeridas para su expresión. Por ejemplo , el gen se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa mARN, o proteína especifica, incluyendo secuencias reguladoras. Los genes también incluyen segmentos de ADN no expresados que, por ejemplo, forman secuencias de reconocimiento para otras proteínas. Los genes pueden obtenerse de una variedad de fuentes, incluyendo clonación de una fuente de interés o sintetización a partir de información de secuencia predicha o conocida, y puede incluir secuencias designadas para tener parámetros deseados. "Genéticamente estable" y "hereditable" se refieren a elementos genéticos, cromosómicamente integrados que se mantienen de manera estable en la célula huésped y se heredan de manera estable por progenie a través de generaciones sucesivas. "Genoma" se refiere al material genético completo de un organ ismo. "Células de línea germinal" se refieren a células que se destinan a ser gamentos y cuyo material genético es hereditario . Los términos "secuencia de ADN heteróloga", "segmento de ADN exógeno" o "ácido polinucleico heterólogo", según se utilizan en la - 27 -presente, se refiere cada uno a una secuencia que se origina a partir de una fuente ajena a la célula huésped en particular o, si es de la misma fuente, se modifica de su forma original. Por lo tanto, un gen heterólogo en una célula huésped incluye un gen que es endógeno a la célula huésped en particular pero que se ha modificado a través de, por ejemplo, el uso de redistribución de ADN. Los términos también incluyen múltiples copias no naturalmente ocurrentes de una secuencia de ADN naturalmente ocurrente. Por lo tanto, los términos se refieren a un segmento de ADN que es ajeno o heterólogo a la célula, u homólogo a la célula pero en una posición dentro del ácido nucleico de célula huésped en el cual no se encuentra de manera ordinaria el elemento. Los segmentos de ADN exógeno se expresan para producir polipéptidos exógenos. "Promotor inducible" se refiere a aquellos promotores regulados que pueden activarse en una célula por un estímulo externo, tal como un químico, luz, hormona, tensión o un patógeno. El "sitio de inicio" es la posición circundante al primer nucleótido que es parte de la secuencia transcrita, la cual también se define como posición +1 . Con respecto a este sitio, todas las otras secuencias del gen y sus regiones de control se numeran. Las secuencias corriente abajo (es decir, las secuencias codificadoras de proteína adicionales en la dirección 3') se denominan positivas, mientras que las secuencias corriente arriba (la mayoría de las regiones de control en la dirección 5') se denominan negativas. El término "secuencia de localización intracelular" se refiere a una secuencia nucleótida que codifica una señal de direccionamiento - 28 -intracelular. Una "señal de direccionamiento intracelular" es u na secuencia amino acida que se traduce en conjunto con una proteína y la dirige a un compartimento sub-celular en particular. "Señal de tránsito de detención de retículo endoplásmico (ER)" se refiere a una extensión de terminal carboxi de un polipéptido, el cual se trad uce en conjunto con el polipéptido y origina que una proteína entre a la trayectoria segregadora para retenerse en el ER. "Secuencia de tránsito de detención de ER" se refiere a una secuencia nucleótida que codifica la señal de direccionamiento de ER. Otras secuencias de objetivo intracelular codifican las señales objetivo activas en semillas y/u hojas y señales de objetivo vacuolar. La invención abarca composiciones de proteína o ácido nucleico, aisladas o substancialmente purificadas. En el contexto de la presente invención , un segmento de ácido polinucleico (polinucleótido) "aislado" o "purificado" o un polipéptido "aislado" o "purificado" es un segmento de ácido polinucleico o polipéptido que, por la intervención del hombre, existe aparte de su ambiente nativo y, por consiguiente, no es un producto de la naturaleza . Un polipéptido o segmento de ácido polinucleico aislado puede existir en una forma purificada o puede existir en un ambiente no nativo, tal como , por ejemplo , una célula h uésped transgénica . Por ejemplo, un segmento o prote ína de ácido polinucleico "aislado" o "purificado", o una porción biológicamente activa de los mismos, se encuentra substancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o substancialmente libre de precursores químicos u otros q uímicos cuando - 29 -se sintetiza químicamente. Preferentemente, un ácido polinucleico "aislado" se encuentra libre de secuencias (preferentemente secuencias codificadoras de proteína) que flanquean de manera natural el ácido nucleico (es decir, las secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo a partir del cual se deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en diversas modalidades, la molécula de ácido nucleico aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb o 0.1 kb de secuencias nucleótidas que flanquean naturalmente la molécula de ácido nucleico en ADN genómico de la célula a partir de la cual se deriva el ácido nucleico. Una proteína que se encuentra substancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína o polipéptido que tienen menos de aproximadamente 30%, 20%, 10%, 5% (en peso seco) de proteína contaminante. Cuando la proteína de la invención, o fragmento biológicamente (por ejemplo, catalíticamente)activo de la misma, se produce de manera recombinante, preferentemente el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 30%, 20%, 10% o 5% (en peso seco) de los precursores químicos o químicos sin proteína de interés. Los fragmentos y variantes de las secuencias nucleótidas expuestas y las proteínas o proteínas de longitud parcial codificadas por la misma también se abarcan por la presente invención. Por "fragmento" se propone una porción de la secuencia nucleótida o una porción de la secuencia amino ácida y, por lo tanto, una porción del polipéptido o proteína codificados por la misma. Un "gen marcador" codifica una característica seleccionable. - 30 - El término proteína "madura" se refiere a un polipéptido procesado de manera post-traslacional sin su péptido de señal. Proteína "precursora" se refiere al producto primario de traducción de un mARN . "Péptido de señal" se refiere a la extensión de terminal amino de un polipéptido, el cual se traduce en conjunto con el polipéptido que forma un péptido precursor y el cual se requiere para su entrada en la trayectoria segregadora . El término "secuencia de señal" se refiere a una secuencia nucleótida que codifica el péptido de señal . El término "gen nativo" se refiere al gen que se presenta en el genoma de una célula no transformada. "Naturalmente ocurrente" se utiliza para describir un objeto que puede encontrarse en la naturaleza como distinto de lo producido artificialmente por el hombre. Por ejemplo, una proteína o secuencia nucleótida presente en un organismo (que incluye un virus), la cual puede aislarse de una fuente en la naturaleza y la cual no se ha modificado intencionalmente por el hombre en el laboratorio, es naturalmente ocurrente. Nov9X y Nov9X se utilizan de manera intercambiable. El término "polinucleótido", "ácido polinucleico" o "segmento de ácido polinucleico" se refiere a deoxiribonucleotidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en una forma ya sea de un solo filamento o de doble filamento, compuestos de monómeros (n ucleótidos) que contienen un azúcar, fosfato y una base que es ya sea purina o pirimidina . A menos que limite específicamente , el término abarca ácidos nucleicos q ue contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales q ue tienen propiedades de - 31 -enlace similares como el ácido nucleico de referencia y se metabolizan en una manera similar a los nucleótidos naturalmente ocurrentes. A menos que se indique de otro modo, una secuencia de ácido nucleico en particular también abarca de manera impl ícita las variantes modificadas de manera conservadora de la misma (por ejemplo, sustituciones de codón degeneradas) y las secuencias complementarias, así como también la secuencia explícitamente indicada . De manera específica, las sustituciones de codón degeneradas pueden log rarse mediante la generación de secuencias en las cuales su tercer posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye con residuos de base mezclada y/o deoxinosina (Batzer et al. , 1991 ; Ohtsuka et al. , 1985; Rossolini et al. , 1 994). Un "fragmento de ácido n ucleico" es una fracción de una molécula de ácido nucleico dada . En plantas más altas, ácido deoxiribonucleico (ADN) es el material genético, mientras que el ácido ribonucleico (ARN) se involucra en la transferencia de información contenida dentro de ADN hacia las proteínas. Un "genoma" es el cuerpo entero de material genético contenido en cada célula de un organismo . El término "secuencia nucleótida" se refiere a un polímero de ADN o ARN que puede ser de uno o de doble filamento, que contiene opcionalmente bases n ucleótidas no naturales o alteradas, capaces de incorporación en polímeros de ADN o ARN . Los términos "ácido nucleico" o "secuencia de ácido nucleico" también pueden utilizarse de manera intercambiable con gen , cADN , ADN y ARN codificados por u n gen (Batzer et a/. , 1 991 ; Ohtsuka er al. , 1 985; Rossolini et al. , 1 999). - 32 - Las cintas de expresión empleadas para introducir una estructura de lectura abierta codificadora de fitasa de la invención en una célula huésped , preferentemente comprenden una región de inicio transcripcional enlazada a la estructura de lectura abierta. Tal cinta de expresión puede estar provista con una pluralidad de sitios de restricción para la inserción de la estructura de lectura abierta y/u otros ADNs, por ejemplo, unas regiones reguladoras transcripcionales y/o gen(es) marcadores seleccionábles. La cinta transcripcional incluirá en la dirección 5'-3' de transcripción, una región de inicio transcripcional y traslacional, la secuencia de ADN de interés y una región de terminación transcripcional y traslacional, funcional en plantas. La región de terminación puede ser nativa con la región de inicio transcripcional, puede ser nativa con la secuencia de ADN de interés, o puede derivarse de otra fuente. Las regiones de terminación convenientes para las células vétales se encuentran disponibles del plásmido Ti de A. tumefaciens, tal como la sintasa de octopina y regiones de terminación de sintasa de nopa lina . Ver tambipen, Guerineau et al., 1 991 ; Proudfoot, 1 991 ; Sanfacon et al. , 1 991 ; ogen et al., 1 990; Muncoe et al., 1 990; Bailas et al., 1 989; Joshi et al. , 1 987). Los términos "estructura de lectura abierta" y "ORF" se refieren a la secuencia mino ácida codificada entre los codones de inicio y término de traslación de una secuencia codificadora. Los términos "codón de inicio" y "codón de término" se refieren a una unidad de tres nucleótidos adyacentes ('codón') en una secuencia codificadora que especifica el inicio - 33 -y el término de cadena , respectivamente, de la síntesis de proteína (traducción de mARN). Cuando se utiliza "operablemente enlazado" con respecto a ácido nucleico, significa que se une como parte de la misma molécula de ácido nucleico, adecuadamente colocada y orientada para transcripción a iniciarse a partir del promotor. ADN operablemente enlazado a un promotor es "bajo regulación de inicio transcripcional" del promotor. Las secuencias codificadoras pueden enlazarse de manera operable a secuencias reguladoras en orientación de detección o anti-detección. Cuando se utiliza con respecto a polipéptidos, "operablemente enlazado" significa unido como parte del mismo polipéptido, es decir, a través de enlaces de peptidilo. La "sobre-expresión" se refiere al nivel de expresión en células transgénicas u organismos que exceden niveles de expresión en células u organismos normales o no transformados. Los métodos conocidos de reacción en cadena de polimerasa "PCR" incluyen , pero sin limitarse, métodos que utilizan cargas de inicio igualadas, cargas de inicio encajadas, cargas de inicio específicas individuales, cargas de inicio degeneradas, cargas de inicio específicas de gen, cargas de inicio específicas de vector, cargas de inicio parcialmente desajustadas y lo similar. Ver también Innis et al. , 1 995; y Gelfand, 1 995; e Innis y Gelfand , 1 999. "Tejido de planta" incluye tejidos o plantas diferenciadas o no diferenciadas, incluyendo pero no limitándose a ra íces, tallos, brotes, hojas, polen, semillas, tejido de tumor y varias formas de células y cultivo · - 34 -tal como células únicas, protoplasto, embriones y tejido de callo . El tejido de planta puede ser en plantas o en cultivo de órgano, tejido o célula. "Transformador primario" y "generación TO" se refiere a plantas transgénicas q ue son de la misma generación genética ' como el tejido que se transforma inicialmente (es decir, no habiendo ido a meiosis y fertilización debido a la transformación). "Tejido de producción" se refiere a tejido cosechable, maduro que consiste de células terminalmente d iferenciadas, sin división. Excluye, tejido en desarrollo joven, que consiste de la línea herminal, meristemática y células no completamente diferenciadas. "Promotor" se refiere a una secuencia nucleótida, normalmente corriente arriba (5') de su secuencia codificadora , la cual controla la expresión de la secuencia codificadora al proporcionar el reconocimiento de polimerasa de ARN y otros factores requeridos para la adecuada transcripción. "Promotor" incluye un promotor mínimo que es una secuencia corta de ADN comprendida de una caja TATA y otras secuencias que sirven para especificar el sitio de in icio de transcripción, al cual se agregan elementos reguladores para control de expresión . "Promotor" también se refiere a una secuencia nucleótida que incluye un promotor m ínimo más elementos reguladores, que es ca paz de controlar la expresión de una secuencia codificadora o ARN funcional. Este tipo de secuencia promotora consiste en elementos corriente arriba próximos y más distantes, referidos los ú ltimos elementos con frecuencia como mejoradores. De acuerdo con lo anterior, un "mejorador" es una secuencia de ADN que puede estimular la actividad promotora y puede encontrarse en un elemento innato del promotor o un elemento heterólogo insertado para mejorar la especificidad del nivel o tejido de un promotor. Es capaz de operar en ambas orientaciones (normal o basculante) y es capaz de funcionar incluso cuando se mueve ya sea corriente arriba o corriente abajo del promotor. Tanto los mejoradores como también los otros elementos promotores corriente arriba se unen a proteína de enlace a ADN específicas de secuencia que median sus efectos. Los promotores pueden derivarse en su totalidad dé un gen nativo o componerse de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza, o incluso comprenderse de segmentos sintéticos de ADN. Un promotor también puede contener secuencias de ADN que se involucran en la unión de factores de proteína que controlan la eficacia del inicio de transcripción en respuesta a condiciones fisiológicas o de desarrollo. Los elementos promotores, particularmente un elemento TATA, que se encuentra inactivo o que tiene una actividad promotora enormemente reducida en ausencia de activación corriente arriba, son referidos como "promotores mínimos o de núcleo". En presencia de un factor o factores de transcripción adecuados, el promotor mínimo funciona para permitir la transcripción. Por lo tanto, un "promotor mínimo o de núcleo" consiste solamente en todos los elementos básales necesarios para inicio de transcripción, por ejemplo, una caja TATA y/o un iniciador. Los términos "proteína", "péptido" y "polipéptido" se utilizan de manera intercambiable en la presente. "Promotor regulado" se refiere a promotores que dirigen la expresión genética de manera no constitutiva pero en una manera temporal y/o espacialmente regulada e incluyen ambos promotores específicos de tejido e inducibles. Incluye secuencias naturales y sintéticas así como también secuencias que pueden ser una combinación de secuencias naturales y sintéticas. Los d iferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos de célula , o en diferentes etapas de desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones ambientales. Nuevos promotores de varios tipos útiles en las células de planta se descubren constantemente , numerosos ejemplos pueden encontrarse en la compilación por Okamuro et al. , ( 1989). Los promotores regulados típicos útiles en las plantas incluyen pero no se limitan a promotores inducibles más seguros, promotores derivados del sistema inducible por tetraciclina, promotores derivados de sistemas inducibles por salicilato, promotores derivados de sistemas inducibles por alcohol, promotores derivados de sistema inducible por glucocorticoide, promotores derivados de sistemas inducibles por patógeno y promotores derivados de sistemas inducibles por ecdisoma. "Secuencias reguladoras" y "secuencias reguladoras adecuadas" se refieren cada una a secuencias nucleótidas localizadas corriente arriba (secuencias no codificadoras 5'), dentro o corriente abajo (secuencias no codificadoras 3') de una secuencia codificadora , y las cuales tienen influencia sobre la transcripción , procesamiento o estabilidad de ARN , o traducción de la secuencia codificadora asociada . Las secuencia reguladoras incluyen mejoradores, promotores, secuencias guía de traducción, intrones y secuencias de señal de poliadenilación . Incluyen secuencias naturales y sintéticas, así como también secuencias que - 37 -pueden ser una combinación de secuencias naturales y sintéticas. Como se anota arriba , el término "secuencias reguladoras adecuadas" no se limita a promotores. Algunas secuencias reguladoras adecuadas útiles en la presente invención incluirán , pero sin limitarse, promotores constitutivos, promotores de planta , promotores específicos de tejido de planta , promotores específicos de desarrollo de planta, promotores de planta inducibles y promotores virales. El término "transcripción de ARN" se refiere al producto resultante de la transcripción catalizada por polimerasa de ARN de una secuencia de ADN. Cuando la transcripción de ARN es una copia complementaria perfecta de la secuencia de ADN, es referida como la transcripción primaria o puede ser una secuencia de ARN derivada del proceso post-transcripcional de la transcripción primaria y es referida como ARN maduro. El "ARN mensajero" (mARN) se refiere al ARN que se encuentra sin intrones y que puede traducirse en proteína por la célula . "cADN" se refiere a un ADN de uno o de doble filamento que es complementario a y se deriva de mARN . "Transformadores secundarios" y las "generaciones T1 , T2, T3, etc" se refieren a plantas transgénicas derivadas de transformadores primarios a través de uno o más ciclos de fertilización y meióticos. Pueden derivarse de auto-fertilización de transformadores primarios o secundarios o cruzas de transformadores primarios o secundarios con otras plantas transformadas o no transformadas. "Expresión específica" es la expresión de productos genéticos que se limita a uno o unos pocos tejidos de planta (limitación espacial) y/o a una o unas pocas etapas de desarrollo de planta (limitación temporal). Se reconoce que existe duramente una especificidad real: los promotores parecen cambiar preferentemente en algunos tejidos, mientras que en otros tejidos puede haber poca o nada de actividad. Este fenómeno se conoce como expresión indiscreto. Sin embargo, con expresión específica en esta invención se entiende expresión preferible en uno o pocos tejidos de planta. "Establemente transformado" se refiere a células que se han seleccionado y regenerado en un medio de selección después de la transformación. "Secuencia no codificadora 3'" se refiere a secuencias nucleótidas localizadas 3' (corriente abajo) para una secuencia codificadora e incluyen secuencias de señal de poliadenilación y otras secuencias que codifican señales reguladoras capaces de afectar el procesamiento de mARN o la expresión genética. La señal de poliadenilación se caracteriza normalmente por afectar la adición de tractos de ácido poliadenílico al extremo 3' del precursor de mARN. El uso de diferentes secuencias no codificadoras 3' diferentes se ejemplifica por Ingelbrecht et al., (1989). "Promotor específico de tejido" se refiere a promotores regulados que no se expresan en todas las células de un organismo, por ejemplo, no en todas las células de planta, pero solamente en uno o más tipos de células en órganos específicos (tales como hojas o semillas), tejidos específicos (tales como embriones y cotiledóneas), o tipos de células específicos (tales como células de almacenamiento de semilla o parenquima de hoja). También incluyen promotores que se regulan temporalmente, tales como embriogénesis temprana o posterior, durante la maduración de la fruta en semillas en desarrollo o fruta, en hoja completamente diferenciada, o al inicio de la senescencia. "Fragmento de tope de transcripción" se refiere a secuencias nucleótidas que contienen una o más secuencias reguladoras, tales como secuencias de señal de poliadenilación, capaces de terminar la transcripción. Los ejemplos incluyen las regiones no reguladoras 3' de los genes que codifican sintasa de nopalin y la subunidad pequeña de carboxilasa de bifosfato de ribulosa. El término "transformación" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico en el genoma de una célula huésped, resultando en herencia genéticamente estable. Las células huésped que contienen los fragmentos de ácido nucleico transformados son referidas como células "transgénicas", y los organismos que comprenden células transgénicas se refieren como "organismos transgénicos". Ejemplos de métodos de transformación de plantas y células de planta incluyen transformación mediada por Agrobacterium (De Blaere et al., 1987) y tecnología de bombardeo de partícula (Klein et al., 1987, Patente de E. U. No. 4,945,050), sin embargo, muchos otros métodos de transformación de células se conocen en la materia. Las plantas completas pueden regenerarse de células transgénicas por métodos bien conocidos para el experto (ver, por ejemplo, Fromm et al. , 1 990). "Transformado", "transgénico" y "recombinante" se refiere a un organismo huésped tai como una planta en la cual se ha introducido una - 40 -molécula de ácido nucleico heteróloga. La molécula de ácido nucleico puede integrarse de manera estable en el genoma mediante métodos generalmente conocidos en la materia, que se exponen en Sambrook et al. , 1989). Por ejemplo, células "transformadas", "transformantes" y "transgénicas" han sido a través del proceso de transformación y contienen un gen ajeno integrado en su cromosoma. El término "no transformado" se refiere a plantas normales que no han sido a través del proceso de transformación. Un "transgen" se refiere a un gen que se ha introducido en el genoma mediante transformación y se mantiene de manera estable. Los transgenes pueden incluir, por ejemplo, genes que son ya sea heterólogos u homólogos a los genes de una planta en particular por transformarse. De manera adicional, los transgenes pueden comprender genes nativos insertados en un organismo no nativo o genes quiméricos. El término "gen endógeno" se refiere a un gen nativo en su ubicación natural en el genoma de un organismo. Un gen "ajeno" se refiere a un gen que no se encuentra normalmente en la célula huésped pero que se introduce por transferencia genética. Una "planta transgénica" es una planta que tiene una o más células de planta que contienen una secuencia de ADN heteróloga. "Expresión transitoria" se refiere a expresión en células en las cuales un transgen se introduce, por ejemplo, por infección viral o por tales métodos como transformación mediada por Agrobacterium, electroporación, o bombardeo biolístico, pero no se selecciona para su mantenimiento estable.

"Transitoriamente transformado" se refiere a células en las cuales se ha introducido una cinta de expresión, polinucleotido o transgen, (por ejemplo, por tales métodos como transformación mediada por Agrobacterium o bombardeo biolístico) pero no se ha seleccionado para mantenimiento estable. El término "secuencia guía de traducción" se refiere a esa porción de secuencia de ADN de un gen entre el promotor y la secuencia codificadora que se transcribe en ARN y se presenta en el mARN completamente procesado, corriente arriba (5') del codón de inicio de traducción. La secuencia guía de traducción puede afectar el procesamiento de la transcripción primaria a mARN, la estabilidad o eficiencia de traducción de mARN. El "fragmento de detención de traducción" se refiere a secuencias nucleótidas que contienen una o más señales reguladoras, tal como uno o más codones de término en las tres estructuras, capaces de terminar la traducción. La inserción de un fragmento de tope de traducción adyacente a o cerca del codón de inicio en el extremo 5' de la secuencia codificadora dará como resultado la nula traducción o la traducción inadecuada. La separación del fragmento tope de traducción mediante recombinación específica de sitio dejará una secuencia específica de sitio en la secuencia codificadora que no interfiere con la traducción adecuada mediante el uso del codón de inicio. Se intenta que un polipéptido o enzima que exhibe actividad de "fitasa" o una "fitasa" cubra cualquier enzima capaz de efectuar la liberación de fosfato inorgánico o fósforo de diversos fosfatos de mío- - 42 -inositol . Los ejemplos de tales fosfatos de mio-inositol (substratos de fitasa) son ácido fítico y cualquier sal del mismo, por ejemplo, fitato de sodio o fitato de potasio o sales mezcladas. También cualquier estereoisómero del mono-, di-, tri-, tetra- o penta-fosfatos de mio-inositol pueden servir como un substrato de fitasa. De acuerdo con la definición anterior, la actividad de fitasa puede determinarse mediante el uso de cualquier ensayo en el cual se utilice uno de estos substratos. Una fitasa termotolerante de la invención incluye polipéptidos variantes, derivados de una fitasa termotolerante en particular mediante omisión (así llamada truncación) o adición de uno o más amino ácidos a la terminal N y/o extremo de terminal C de la proteína nativa; omisión o adición de uno o más amino ácidos en uno o más sitios en la proteína nativa ; o sustitución de uno o más amino ácidos en uno o más sitios en la fitasa termotolerante. Tales variantes pueden resultar de, por ejemplo, la manipulación humana . Los métodos para tales manipulaciones generalmente se conocen en la materia . Por ejemplo , las variantes de secuencia amino ácida de los polipéptidos pueden prepararse mediante mutaciones en el ADN. Los métodos para mutagénesis y alteraciones de secuencia nucleótida son muy conocidos en la materia. Ver, por ejemplo, Kunkel , 1985; Kunkel et al. , 1 987 ; Patente de E. U . No. 4, 873, 1 92 ; Walker y Gastar, 1 983 y las referencias citadas en la presente. La guía respecto a las sustituciones amino ácídas que no afectan la actividad biológica de la proteína de interés puede encontrarse en el modelo de Dayhoff et al. , 1 978, incorporado en la presente para referencia . Se prefieren las sustituciones conservadoras, tai como el intercambio de un amino ácido - 43 -con otro que tiene propiedades similares. Por lo tanto, los genes de fitasa termotolerante y las secuencias nucleótidas de la invención incluyen tanto las secuencias naturalmente ocurrentes como también las formas mutantes. De igual modo , los polipéptidos de fitasa termotolerantes de la invención abarcan tanto las proteínas naturalmente ocurrentes así como también las variaciones y formas modificadas de las mismas. Tales variantes continuarán poseyendo la actividad deseada . Las omisiones, inserciones y sustituciones de la secuencia polipéptida abarcada en la presente , no se espera que produzcan cambios radicales en las características del polipéptido. No obstante, un experto en la materia apreciará que el efecto se evaluará por ensayos de selección de rutina cuando es difícil predecir el efecto exacto de la substitución, omisión o inserción en avance para hacer eso. Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden optimizarse para expresión mejorada en un organismo de interés. Para plantas, ver por ejemplo, EPA035475; WO 091 /16432 ; Perlak er al., 1 991 ; y Murray er al., 1 989. De esta manera , los genes o fragmentos de genes pueden sintetizarse utilizando codones preferidos de planta. Ver, por ejemplo, Campbell y Gowri, 1 990 para una discusión de un uso de codón preferido en el huésped. Se reconoce que toda o parte de la secuencia gética puede ser optimizada o sintética . Es decir, también pueden utilizarse secuencias sintéticas o parcialmente optimizadas. Las secuencias y proteínas nucleótidas variantes también abarcan secuencias y proteínas derivadas de un procedimiento mutagénico y recombinogénico - 44 -tal como redistribución de ADN. Con tal procedimiento, una o más secuencias codificadoras diferentes puede manipularse para crear un nuevo polipéptido que posea las propiedades deseadas. De esta manera, las bibliotecas de polinucleótidos recombinantes se generan a partir de una población de polinucleótidos de secuencia relacionada que comprenden regiones de secuencia que tienen una identidad de secuencia substancial y pueden recombinarse de manera homologa in vitro o in vivo. Las estrategias para tal redistribución de ADN se conocen en la materia. Ver, por ejemplo, Stemmer, 1 994; Stemmer, 1 994; Crameri et al. , 1 997; Moore et al. , 1 997; Zhang et al. , 1 997 ; Crameri et al. , 1 998 ; y las Patentes de E. U. Nos. 5,605,793 y 5,837,458. Por "variantes" se proponen las secuencias substancialmente similares. Para las secuencias n ucleótidas, las variantes incluyen aquellas secuencias que, debido a la degeneración del código genético, codifican la secuencia amino ácida idéntica de la proteína de referencia . Las variantes alélicas naturalmente ocurrentes, tales como estas, pueden identificarse con el uso de técnicas de biología moleculares muy conocidas, como, por ejemplo, con reacción en cadena de polimerasa (PCR) y técnicas de híbridización. Las secuencias n ucleótidas variantes también incluyen secuencias nucleótidas sintéticamente derivadas, tales como aquellas generadas, por ejemplo, mediante el uso de mutagénesis dirigida a sitio que codifica la proteína de referencia, así como también aquellas que codifican un polipéptido que tiene sustituciones amino ácidas. En general, las variantes de secuencia nucleótida de la invención tendrán al menos 40%, 50%, 60%, preferentemente 70%, más preferentemente 80%, incluso más preferentemente 90%, más preferentemente 99% e identidad porcentual de unidad individual hacia la secuencia nucleotida nativa en base a estas clases. Por ejemplo, 71 %, 72%, 73% y lo similar, hasta al menos 90% de clase. Las variantes también pueden incluir un gen de longitud total correspondientes a un fragmento genético identificado. "Vector" se define que incluye, entre otras cosas, cualquier plásmido, cósmido, fago o vector binario Agrobacterium en forma lineal o circular, de uno o de doble filamento, a partir del cual puede o no ser auto-transmisible o mobilizable y el cual puede transformar un huésped procariótico o eucariótico ya sea mediante integración en el genoma celular o existir extracromosómicamente (por ejemplo, reproducción autónoma de plásmida con un origen de reprod ucción) .

Construcciones preferidas y Células Huésped de la Invención La invención preferentemente proporciona una cinta de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico (promotor) capaz de dirigir la expresión de un polinucleotido que codifica una fitasa termotolerante ya sea in vitro o in vivo. Como se describe abajo, los polinucleótidos preferidos de la invención se optimizan para expresión en un organismo particular, por ejemplo, una planta . Los métodos para preparar y/o identificar una fitasa termotolerante incluyen mutagénesis , por ejemplo , mutagénesis recursiva y/o selección , por ejemplo, de fitasas que tienen actividad a temperaturas mayores de 60"C. Los métodos para mutagénesis y alteraciones de secuencia nucleotida son muy conocidos en la materia . Ver, por ejemplo, Kunkel, 1 985; Kunkel et al. , 1 987; la Patente - 46 -de E. U. No. 4,873, 192; Waiker y Gastar, 1 983 y las referencias citadas en la presente; y Arnold et al. , 1996. Una vez que el polinucleótido que codifica una fitasa termotolerante se idéntica, la secuencia del polinucleótido puede optimizarse. Los métodos para optimizar la expresión de un segmento de ácido nucleico en un organismo particular se conocen bien en la materia. Brevemente, una tabla de uso de codón que indica los codones óptimos utilizados por el organismo objetivo se obtiene y los codones óptimos se seleccionan para reemplazar aquellos en el polinucleótido objetivo y la secuencia optimizada se sintetiza entonces químicamente. Los codones preferidos para maíz se describen en la Patente de E. U. No. 5,625, 1 36]. ADN y Células Huésped Para Transformación Los vectores, plásmidas, cósmidos, YACs (cromosomas artificiales de levadura), BACs (cromosomas artificiales bacterianos) y segmentos de ADN para utilizarse en la transformación de células generalmente comprenderán el ADN codificador de fitasa, así como también otro ADN, tal como cADN, gen o genes que uno desea introducir en las células. Estas construcciones de ADN pueden incluir además estructuras tales como promotores, mejoradores, polienlazadores o incluso genes reguladores, según se desee. Uno de los segmentos de ADN o genes seleccionados para introducción celular con frecuencia codificará una proteína que se expresará en las células resultantes transformadas (recombinantes), de tal manera que dé como resultado una característica seleccionable y/o que imparta un fenotipo mejorado a la célula transformada. Sin embargo, este puede no ser siempre el caso, y la - 47 -presente invención también abarca células transformadas que incorporan transgenes no expresados. El ADN útil para introducción en células incluye el que se ha derivado o aislado de cualquier fuente, que puede caracterizarse posteriormente en cuanto a estructura, tamaño y/o función, puede alterarse químicamente e introducirse posteriormente en las células. Un ejemplo de ADN "derivado" de una fuente, sería una secuencia de ADN que se identifica como un fragmento útil dentro de un organismo dado, y el cual se sintetiza después químicamente en forma esencialmente pura. Un ejemplo de tal ADN "aislado" de una fuente sería una secuencia de ADN útil que se extirpa o retira de dicha fuente mediante medios químicos, por ejemplo, mediante el uso de endonucleasas de restricción, a fin de que pueda manipularse posteriormente, por ejemplo, amplificarse, para utilizarse en la invención, mediante la metodología de diseño genético. Tal ADN es comúnmente referido como "ADN recombinante". Por consiguiente, el ADN útil incluye ADN completamente sintético, ADN semi-sintético, ADN aislado de fuentes biológicas, y ADN derivado de ARN introducido. En general, el ADN introducido no es originalmente residente en el genotipo que es el recipiente de ADN, pero se encuentra dentro del alcance de la invención para aislar un gen de un genotipo dado, e introducir posteriormente múltiples copias del gen en el mismo genotipo, por ejemplo, a fin de mejorar la producción de un producto genético dado. El ADN incluye, pero sin limitarse, ADN de genes de planta, y genes de no planta tales como aquellos de bacterias, levaduras, hongos o ' . - 48 -virus. El ADN introducido pude incluir genes modificados o sintéticos, porciones de genes, o genes quiméricos, incluyendo genes del mismo o de diferente genotipo. El término "gen quimérico" o "ADN quimérico" se define como un gen o secuencia o segmento de ADN que comprende al menos dos secuencias o segmentos de especies que no combinan ADN bajo condiciones naturales, o cuyas secuencias o segmentos de ADN se colocan o enlazan en una manera que normalmente no ocurre en el genoma nativo de la célula no transformada. El ADN introducido, utilizado para transformación en la presente, puede ser circular o lineal , de doble filamento o de un solo filamento. En general, el ADN se encuentra en la forma de ADN quimérico, tal como ADN de plásmida, que también puede contener regiones codificadoras rodeadas por secuencias reguladoras que promueven la expresión del ADN recombinante presente en la célula transformada . Por ejemplo, el ADN puede comprender en sí o consistir en un promotor que se encuentra activo en una célula que se deriva de una fuente diferente a la de esa célula , o puede utilizar un promotor ya presente en la célula que es el objetivo de transformación . En general, el ADN introducido será relativamente pequeño, es decir, de menos de aproximadamente 30 kb para reducir cualquier susceptibilidad a degradación física, química o enzimática que se sabe se incrementa a medida que se incrementa el tamaño del ADN . El número de proteínas, transcripciones de ARN o mezclas de los mismos que se introducen en la célula, preferentemente se pre-selecciona y define, por ejemplo, desde que pueden formarse uno hasta aproximadamente 5-1 0 de ' , - 49 -tales productos del ADN introducido. La selección de un vector de expresión adecuado dependerá de las células huésped. Típicamente un vector de expresión contiene ( 1 ) elementos de ADN procariótico que codifican un origen bacteriano de reproducción y un gen de resistencia a antibióticos para proporcionar la amplificación y selección del vector de expresión en un huésped bacteriano; (2) elementos de ADN que controlan el inicio de transcripción de tal promotor; (3) elementos de ADN que controlan el procesamiento de transcripciones tales como intrones, secuencias de término de transcripción/poliadenilación; y (4) un gen de interés que se enlaza de manera operativa a los elementos de ADN a fin de controlar el inicio de la transcripción . El vector de expresión utilizado puede ser uno capaz de reproducirse de manera autónoma en el huésped anterior o capaz de integrarse en el cromosoma , conteniendo originalmente un promotor en un sitio que permite la transcripción del gen de fitasa enlazado . Si los procariotes, tales como bacterias, se utilizan en el huésped, el vector de expresión para la fitasa es preferentemente uno capaz de reproducirse de manera autónoma en el micro-organismo y que comprende un promotor, una secuencia de unión a ribosoma, un gen de fitasa novedoso y una secuencia de término de transcripción . El vector también puede contener u n gen para reg ular el promotor. Una descripción general de los vectores de expresión de planta y genes reportadores puede encontrarse en Gruber er al., (1 993). Los vectores de expresión de mam ífero pueden comprender u n origen de reproducción , un promotor adecuado y mejorador, y también - 50 -cualquier sitio de unión a ribosoma necesario, sitio de poliadenilación, donador de división y sitio aceptante, secuencias de término transcripcional y secuencias no transcritas de flanco 5' . Los vectores adecuados incluyen , a manera de ejemplo: para bacterias, pQE70, pQE60, pQE-9 (Quiagen), pBluescript II (Stratagene), pTRC99a, pKK223-3, pDR540, pRIT2T (Pharmacia); para células eucarióticas: pXT1 , pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVLSV40 (Pharmacia). Tales vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suiza) y GEM 1 (Promega Biotec, Madison, Wis, EUA). Sin embargo, cualquier otro plásmido o vector puede utilizarse siempre y cuando sean reproducibles y viables en el huésped . En ciertas modalidades, se contempla que uno puede desear emplear vectores virales competentes de réplica en transformación de monocot. Tales vectores incluyen, por ejemplo, vectores "lanzados" de virus de enanismo de trigo (WDV), tales como pW1 -1 1 y PW1 -GUS (Ugaki et al. , 1 991 ). Estos vectores pueden ser capaces de réplica autónoma en células de maíz así como también E. coli, y como tales pueden proporcionar sensibilidad incrementada para detectar ADN suministrado a células transgénicas. Un vector de réplica puede también ser útil para sumin istro de genes flanqueados por secuencias de ADN de elementos transportables tales como Ac, Ds, o Mu. También se contempla que los elementos transportables serían útiles para introducir fragmentos de ADN que carecen de los elementos necesarios para selección y mantenimiento del vector plásmido en bacterias, por ejemplo, genes de resistencia antibióticos y orígenes de réplica de ADN. También se propone que el uso - 51 -de un elemento transportable tal como Ac, Ds o Mu promovería de manera activa la integración del ADN deseado y por lo tanto incrementa la frecuencia de células establemente transformadas. Como ejemplos representativos de huéspedes adecuados, pueden mencionarse: células bacterianas tales como E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis; y diversas especies dentro del género Escherichia, Pseudomonas, Serratia, Streptomyces, Corynebacterium, . Brevibacterium, Bacillus, Microbacterium, y Staphylococcus, aunque también pueden emplearse otros como punto de selección ; las células fúngales que pertenecen al género Aspergillus, Rhizopus, Trichoderma, Neurospora, Mucor, Penicillium, etc. , tales como la levadura que pertenece al género Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Trichosporon, Schwanniomyces, etc. ; células de insecto tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales tales como CHO, COS o melanoma Bowes, estirpes de célula C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK; célu las de planta y lo similar. Cualquier huésped puede utilizarse hasta ahora ya q ue puede expresr el gen de interés. La construcción de vectores que pueden emplearse en conjunto con la presente invención se conocerá por aquellos de experiencia en la materia a la luz de la presente exposición (ver, por ejemplo, Sambrook et al. , 1 989; Gelvin et al. , 1 990). La cinta de expresión de la invención puede contener una o una pluralidad de sitios de restricción que permiten la colocación del polinucleotido que codifica una fitasa termotolerante bajo regulación de una secuencia reguladora. La cinta de expresión también puede contener - 52 -una señal de término operablemente enlazada al polinucleotido, así como también secuencias reguladoras requeridas para la traducción adecuada del polinucleotido. La cinta de expresión que contiene el polinucleotido de la invención puede ser quimérica, significando que al menos uno de sus componentes es heterólogo con respecto a por lo menos uno de los otros componentes. La expresión del polinucleotido en la cinta de expresión puede ser bajo el control de un promotor constitutivo, promotor inducible, promotor regulado, promotor viral o promotor sintético. La cinta de expresión puede incluir en la dirección 5'-3' de transcripción, una región de inicio transcripcional y traslacional, el polinucleotido de la invención y una región de término transcripcional y traslacional funcional in vivo y/o in vitro. La región de término puede ser nativa con la región de inicio transcripcional, puede ser nativa con el polinucleotido o puede derivarse de otra fuente. Las secuencias reguladoras pueden localizarse corriente arriba (secuencias no codificadoras 5'), dentro (intrón), o corriente abajo (secuencias no codificadoras 3') de una secuencia codificadora e influenciar la transcripción, el procesamiento o estabilidad de ARN, y/o traducción de la secuencia codificadora asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir, pero sin limitarse, mejoradores, promotores, sitios de enlace represores, secuencias guía de traducción, intrones y secuencias de señal de poliadenilación. Pueden incluir secuencias naturales o sintéticas así como también secuencias que pueden ser una combinación de secuencias naturales y sintéticas. El vector utilizado en la presente invención también puede - 53 -incluir secuencias adecuadas para amplificar la expresión. Secuencias Reguladoras Un promotor es una secuencia nucleótida que controla la expresión de una secuencia codificadora para proporcionar el reconocimiento de polimerasa de ARN y otros factores requeridos para la transcripción adecuada. Un promotor incluye un promotor mínimo, que consiste solamente en todos los elementos básales necesarios para el inicio de la transcripción, tal como una caja TATA y/o iniciador que es una secuencia corta de ADN comprendida de una caja TATA y otras secuencias que sirven para especificar el sitio de inicio de la transcripción al cual se agregan los elementos reguladores para el control de la expresión. Un promotor puede derivarse por completo de un gen nativo o componerse de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza o incluso comprenderse de segmentos sintéticos de ADN. Un promotor puede contener secuencias de ADN que se involucran en la unión de los factores de proteína que controlan la eficacia del inicio de la transcripción en respuesta a condiciones fisiológicas o de desarrollo. Un promotor también puede incluir un promotor mínimo más un elemento o elementos reguladores, capaces de controlar la expresión de una secuencia codificadora o ARN funcional. Este tipo de secuencia promotora contiene elementos próximos y más distales, refiriéndose a los últimos elementos como mejoradores. Los ejemplos representativos de los promotores incluyen, pero sin limitarse, promotores que se sabe controlan la expresión de genes en células procarióticas o eucarióticas o sus virus. Los promotores - 54 -bacterianos en particular incluyen lac o trp de E. coli, el fago lambda P¿, lacl , lacZ, T3, 17 , gpt, y promotores lambda PR. Los promotores eucarióticos incluyen CMV inmediato temprano, quinasa de timidina HSV, temprana y posterior SV40, LTRs de retrovirus, y metalotioneina-l de ratón . También, un aumentador para el gen IE de CMV de humano puede utilizarse junto con el promotor. Cualquier promotor capaz de expresarse en huéspedes de levadura puede utilizarse como el promotor. Los ejemplos de lo mismo incluyen promotores de genes de hexoquinasa y lo similar en la trayectoria glicolítica, y los promotores tales como el promotor gal 1 , promotor gal 1 0 , promotor de proteína de choque térmico, promotor MFa-1 y promotor CUP 1 . Puede utilizarse cualquier promotor capaz de expresar hongos filamentosos. Los ejemplos son un promotor inducido fuertemente por almidón o celulosa , por ejemplo , un promotor para glucoamilasa o a-amilasa del género Aspergillus o celulasa (celobiohidrasa) del género T choderma, un promotor para enzimas en la trayectoria glicolítica, tal como quinasa de fosfoglicerato (pgk) y dehidrogenasa de 3-fosfato de glicerilaldehído (gpd), etc. Dentro de una región promotora de planta existen varios dominios que son necesarios para función total del promotor. El primero de estos domin ios yace inmediatamente aguas arriba del gen estructural y forma la "región promotora n úcleo" que contiene secuencias consenso, normalmente 70 pares bases inmediatamente ag uas arriba del gen. La región promotora núcleo contiene las cajas TATA y CAAT características - 55 -más secuencias circundantes, y representa una secuencia de inicio de transcripción que define el punto de inicio de transcripción del gen estructural. La presencia de la región promotora de núcleo define una secuencia como siendo un promotor; si la región está ausente, el promotor no es funcional. Además, la región promotora de núcleo es insuficiente para proporcionar la actividad promotora total. Una serie de secuencias reguladoras aguas arriba del núcleo constituye el resto del promotor. Las secuencias reguladoras determinan el nivel de expresión, el patrón temporal y espacial de expresión y, para un subcojunto importante de promotores, la expresión bajo las condiciones inductivas (regulación por factores externos tales como luz, temperatura, químicos y hormonas). Un rango de promotores que ocurren de manera natural se conocen por ser operativos en plantas y se han utilizado para accionar la expresión de genes heterólogos (tanto externos como endógenos) en plantas: por ejemplo, el promotor del virus de mosaico de coliflor 35S constitutivo (CaMV), el promotor de poligalacturonasa de tomato aumentado por maduración (Birde et al., 1988), el promotor E8 (Diekman & Fischer, 1988) y el promotor 2A1 específico de fruta (Pear et al., 1989) y muchos otros. Se conocen dos métodos principales para el control de la expresión, viz.; sobre-expresión y sub-expresión. La sobre-expresión puede lograrse mediante inserción de uno o más de una copia extra del gen seleccionado. Sin embargo, no es desconocido para plantas o su progenie, originalmente transformadas con una o más copias extras de una - 56 -secuencia de nucleótidos, mostrar los efectos de subexpresión también como sobreexpresión. Para la sub-expresión, existen dos métodos principales que son comúnmente referidos en la materia "sub-regulación de anti-detección" y "sub-regulación de detección" (subregu lación de detección también referida como "cosupresión"). Genéricamente, estos procesos son referidos como "silenciador genético". Ambos métodos conducen a una inhibición de la expresión del gen objetivo. La obtención de niveles suficientes de expresión de transgen en los tejidos de planta apropiados es un aspecto importante en la producción de cultivos genéticamente formados. La expresión de secuencias de ADN heterólogas en un huésped de planta depende de la presencia de un promotor operativamente enlazado que es funcional dentro del huésped de planta . La elección de la secuencia promotora determinar cuando y donde dentro del organismo la secuencia de ADN heterologa se expresa . Por lo tanto, la selección de promotores para dirig ir la expresión de un transgen dado es crítica. Los promotores que son útiles para expresión de transgen de planta incluyen aquellos que son inducibles, virales, sintéticos, constitutivos (Odell et al., 1 985), temporalmente regulados, especialmente regulados, específicos de tejido, y espacio-temporalmente regulados. Donde la expresión en órganos o tejidos específicos se desea, los promotores específicos de tejido pueden utilizarse. En contraste, donde la expresión genética en respuesta a un estímulo se desea , los promotores inducibles son los elementos reguladores de elección. Donde - 57 -se desea la expresión continua por todas las células de una planta, los promotores constitutivos se utilizan. Las secuencias reguladoras adicionales aguas arriba y/o aguas debajo de la secuencia promotora núcleo pueden incluirse en las construcciones de expresión de vectores de transformación para traer niveles variables de expresión de secuencias de nucleótido heterólogas en una planta transgénica. Un número de promotores de planta se han descrito con varias características de expresión. Ejemplos de algunos promotores constitutivos que se han descrito incluyen actina 1 de arroz (Wang eí al., 1992; Patente de EE.UU. No. 5,641,876), CaMV 35S (Odell eí al., 1985), CamV 19S (Lawton eí al., 1987), sintasa de sucrosa, y los promotores de ubiquitina. Ejemplos de promotores específicos de tejido que se han descrito incluyen la lectina (Vodkin, 1983: Lindstrom et al., 1990), dehidrogenasa 1 de alcohol de maíz (Vogel et al., 1989; Dennis et al., 1984) , complejo de cosecha ligera de maíz (Simpson, 1986; Bansal et al., 1992), proteína de choque de calor de maíz (Odell et al., 1985), carboxilasa RuBP de subunidad pequeña de guisante (Poulsen et al., 1986; Cashmore et al., 1983), sintasa de manopina de plásmido Ti (Langridge et al., 1989); sintasa de nopalina de plásmido Ti (Langridge et al., 1989), iisomerasa de calcona petunia (vanTunen et al., 1988), proteína 1 rica en glicina de haba (Keller eí al., 1989), CaMV 35s truncada (Odell et al., 1985) ; patatina de papa (Wenzler et al., 1989), célula de raíz (Yamamoto et al., 1990), zeína de maíz (Reina et al., 1990; Kriz et al., 1987 Wandelt eí al., 1989; Langridge eí al., 1983; Reina eí al., 1990), globulina-1 - 58 - (Belanger et al., 1991 ), a-tu bulina, cab (Sullivan et al., 1989), PE PCase (Hundspeth & Grula, 1 989), promotores asociados complejos del gen R (Chandler et al., 1 989), y promotores de sintasa de calcona (Franken et al. , 1 991 ). Los promotores inducibles que se han descrito incluyen los promotores inducibles turgor y ABA, el promotor del gene de proteína de unión auxina (Schwob et al. , 1 993), el promotor de gen de transferasa de glicosilo de flavonoide glucosa UDP (Ralston eí al., 1 988), el promotor inhibidor de proteinaza MPI (Cordero et al., 1994), y el promotor de gen de dehidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato (Kohler et al. , 1995; Quigley et al., 1 989; Martínez eí al. , 1989). Varios genes regulados específicos de tejido y/o promotores se han reportado en plantas. Estos incluyen genes que codifican las proteínas de almacenamiento semilla (ta les como napina , cruciferina , beta-conglicina, y faseolina) zeína o proteínas corporales aceitosas (tal como oleosina), o genes incluidos en biosíntesis de ácido graso (incluyendo proteína vehículo de barrera de acilo, estearoil-ACP desaturasa, y Desaturasas de ácido graso (fad 2-1 )) , y otros genes expresados durante el desarrollo de embrión (tal como Bce4, ver, por ejemplo , EP 255378 y Kridl et al. , 1 991 ). Particularmente útil para la expresión específica de semilla es el promotor de vicilina de guisante (Cza ko et al., 1 992). (Ver también Pat. de E. U . No. 5,625, 1 36 , en la presente incorporada para referencia). Otros promotores útiles para expresión en hojas mad u ras son aquellos que se intercambian en el inicio de senescencia , tal como el promotor SAG de Arabidopsis (Gan et al., 1 995). - 59 - Una clase de promotores específicos de fruta expresados en o durante la antitesis a través del desarrollo de fruta, al menos hasta el comienzo de la maduración, se trata en E . U. 4,943,674 , la descripción de la cual se incorpora en la presente para referencia. Los clones cADN que se expresan preferentemente en fibra de algodón se han aislado (John et al. , 1992). Los clones de cADN de tomate que despliegan expresión diferencial durante el desarrollo de fruta se han aislado y caracterizado (Mansson et al., 1 985, Slater et al., 1 985). El promotor para gel de pologalacturonasa es activo en maduración de fruta. El gen de poligalacturonasa se describe en la Patente de E. U. No. 4, 535,060, Patente de E. U. No. 4,769,061 , Patente de E. U. No. 4, 801 ,590 y Patente de E. U . No. 5, 107,065, cuyas descripciones se incorporan en la presente para referencia. Otros ejemplos de promotores específicos de tejido incluyen aquellos que dirigen la expresión en las células de hojas después del daño a la hoja (por ejemplo, de insectos mastícadores), en tubérculos (por ejemplo , promotor de gen de patatina), y en células de fibra (un ejemplo de una proteína de célula de fibra regulada por desarrollo es E6 (John et al. , 1 992). El gen E6 es más activo en fibra , aunq ue niveles inferiores de transcripciones se encuentran en la hoja , óvulo y flor. La especificidad de tejido de algunos promotores "específicos de tejido" puede no ser absoluta o puede probarse por un experto en la materia utilizando la secuencia de toxina de difteria. Uno también puede log rar la expresión específica de tejido con expresión "agujerada" por una combinación de diferentes promotores específicos de tejido (Beals et al., - 60 - 1997). Otros promotores específicos de tejido pueden aislarse por un experto en la materia (ver, E. U. 5,589,379). Por último, los segmentos de ADN más deseables para introducción en un genoma monocto pueden ser genes homólogos o familias de gene que codifican un rasgo deseado (por ejemplo, hidrólisis de proteínas, lípidos o polisacáridos) y que se introducen bajo el control de nuevos promotores o mejoradores, etc. , o tal vez aún promotores homólogos o específicos de tejido (por ejemplo, específico de raíz, collar/cubierta, verticilio, pecíolo, parte marchita, grano y hoja) o elementos de control. En realidad, se contempla que un uso particular de la presente invención será el objetivo de un gen en una manera constitutiva o en una manera inducible. Los vectores útiles para utilizarse en el objetivo específico de tejido de genes en plantas transgénicas típicamente incluyen promotores específicos de tejido y también pueden incluir otros elementos de control específicos de tejido tales como secuencias mejoradoras. Los promotores que dirigen la expresión mejorada o específica en ciertos tejidos de planta se conocerán por aquellos expertos en la materia en vista de la presente descripción. Estos incluyen, por ejemplo, el promotor rbcS, específico para tejido verde; promotores oes, nos y mas que tienen actividad más alta en raíces y tejido de hoja doblada ; un promotor truncado (-90 a +8) que dirige la expresión mejorada en ra íces, un gen de a-tubulina que dirige la expresión en raíces y promotores derivados de genes de proteína de almacenamiento de zeína que dirigen la expresión en endoesperma . La expresión específica de tejido puede realizarse - 61 -funcionalmente al introducir un gen constitutivamente expresado (todos los tejidos) en combinación con un gen antidetección que se expresa solamente en aquellos tejidos donde el producto genético no se desea. Por ejemplo, un gen que codifica una lipasa puede introducirse de manera que se expresa en todos los tejidos utilizando el promotor 35S de Virus de Mosaico de Coliflor. La expresión de una transcripción antidetección del gen de lipasa en un grano de maíz, utilizando por ejemplo un promotor de zeína, evitaría la acumulación de la proteína de lipasa en semilla. Por lo tanto la proteína codifica por el gen introducido estaría presente en todos los tejidos excepto el grano. La expresión de un gen una planta transgénica puede desearse solamente en un cierto periodo de tiempo durante el desarrollo de la planta. La temporización en desarrollo se correlaciona frecuentemente con expresión genética específica de tejido. Por ejemplo, expresión de proteínas de almacenamiento de zeína se inicia en el endoesperma aproximadamente 15 días después de la polinación. Se conocen varios promotores inducibles en la materia. Muchos se describen en una revisión de Gatz (1996) (también ver Gatz, 1997). Los ejemplos incluyen sistema represor de tetraciclina, sistema represor de Lac, sistemas inducibles de cobre, sistemas inducibles de salicilato (tal como el sistema PR1a), sistemas inducibles de glucocorticoides (Aoyama T et al., 1997) e inducibles de ecdisoma. También se incluyen los sistemas inducibles de sulfonamida de benceno (Patente de E.U. No. 5,364,780) e inducible de alcohol (WO 97/06269 y WO 97/06268) y promotores de S-transferasa de glutationa. En el caso de - 62 -un organismo multiceular, el promotor también puede ser específico para un tejido particular, órgano o etapa de desarrollo. Ejemplos de tales promotores incluyen, pero no se limitan a , ADP-gpp Zea mays y promotor de ?-zeína Zea mays. Otros estudios se han enfocado en genes regulados de manera inducible en respuesta a las tensiones ambientales o estímulos tales como salinidad incrementada. Sequ ía, patógeno y doblado (Graham ef al., 1 985; Graham et al. , 1985, . Smith et al., 1 986). La acumulación de proteína inhibidora de metalocarboxipeptidasa se ha reportado en las hojas de plantas de papa dobladas (Graham et al. , 1 981 ). Otros genes de planta se han reportado por ser aseguradores herbicidas, tensión anaeróbica , choque de calor, productores, hasmonato de metilo inducido. La expresión regulada de una proteína de reproducción viral de transacción quimérica puede regularse aún más por otras estrategias genéticas. Por ejemplo, la activación genética mediada por Cre segú n se describe por Odell et al. , 1 990. Por lo tanto, un fragmento de ADN que contiene una secuencia reguladora 3' unida por sitios lox entre el promotor y la secuencia codificadora de proteína de reproducción q ue bloquea la expresión de un gen de reproducción quimérica del promotor pueden retirarse mediante extirpación mediada por Cre y dar como resultado la expresión del gen de reproducción de trans-acción. En este caso, el gen quimérico de Cre, el gen de reprod ucción q uimérico de trans-acción o ambos pueden encontrarse bajo el control de promotores específicos de desarrollo o inducibles. Una estrategia genética alterna es el uso de un gen supresor de tARN . Por ejemplo, la expresión regulada de un gen - 63 -supresor de tARN puede controlar condicionalmente la expresión de una secuencia codificadora de proteína de reproducción de trans-acción que contiene un codón de terminación adecuado, según se describe por Ulmasov et al., 1997. Nuevamente, ya sea el gen supresor de tARN quimérico, el gen de reproducción dé trans-acción quimérico o ambos pueden encontrarse bajo el control de promotores específicos de desarrollo o inducibles. Además del uso de un promotor en particular, otros tipos de elementos pueden influenciar la expresión de transgenes. En particular, los intrones han demostrado el potencial de mejorar la expresión de transgenes. Por ejemplo, Callis ef al., (1987) describe un intrón del gen de dehidrogenasa de alcohol de maíz, que es capaz de aumentar la expresión de transgenes en células de planta transgénica. De manera similar, Vasil et al., (1989) describe un intrón del gen de sintasa de sucrosa de maíz que tiene actividad de mejora similar. El intrón de actina 1 de arroz, se ha utilizado ampliamente en el aumento de la expresión de trangen en un número de cultivos transgénicos diferentes (McEIroy eí al., 1991). Otros elementos incluyen aquellos que pueden regularse mediante agentes endógenos o exógenos, por ejemplo, mediante proteínas digitales de cinc, que incluyen proteínas digitales de cinc naturalmente ocurrentes o proteínas digitales de cinc quiméricas. Ver, por ejemplo, Patente de E.U. No. 5,789,538; WO 99/48909; WO 99/45132; WO 98/53060; WO 98/53057; WO 98/53058; WO 00/23464; WO 95/19431; y WO 98/54311. - 64 - Un mejorador es una secuencia de ADN que puede estimular la actividad del promotor y puede ser un elemento innato del promotor o un elemento heterólogo insertado para mejorar el nivel o especificidad de tejido de un promotor en particular. Un mejorador es capaz de operar en ambas orientaciones (5' a 3' y 3' a 5' con relación al gen de la secuencia codificadora de interés) y es capaz de funcionar incluso cuando se mueve ya sea corriente arriba o corriente abajo del promotor. Ambos mejoradores y otros elementos promotores corriente arriba enlazan las proteínas de unión a ADN específicas de secuencias que median sus efectos. Los vectores para utilizarse de acuerdo con la presente invención pueden construirse a fin de incluir un elemento mejorador oes. Este elemento se identifica primero como un mejorador palindrómico de 16bp del gen de sintasa de octopina (oes) de Agrobacterium (Ellis ef al., 1987) y está presente en al menos 10 otros promotores (Bouchez et al., 1989). El uso de un elemento mejorador, tal como el elemento eos y particularmente múltiples copias del elemento, actuará para incrementar el nivel de transcripción de los promotores adyacentes cuando se aplican en el contexto de la transformación de monocot. Las construcciones de la invención también incluirán el gen de interés junto con una secuencia de ADN de extremo 3' que actúa como una señal para terminar la transcripción y permitir la poliadenilación del mARN resultante. Los elementos 3' preferidos para plantas incluyen aquellos del gen de sintasa de nopalina de Agrobacterium tumefaciens (Bevan et al., 1983), el terminador de la transcripción T7 del gen de sintasa de octopina de Agrobacterium tumefaciens, y el extremo 3' de los genes de inhibidor I - 65 -o II de proteasa de papa o tomate. Los elementos reguladores tales como intrón 1 Adh (Callís et al., 1987), íntrón de sintasa de sucrosa (Vasil et al., 1989) o elemento omega TMV (Gallie , et al., 1 989), puede incluirse además donde se desee. Las regiones de terminación de planta convenientes se encuentran disponibles del plásmido Ti de A. tumefaciens, tal como la sintasa de octopina y regiones de terminación de sintasa de nopalina. Ver, también, Guerineau et al., (1 991 ); Proudfoot (1 991 ), Sanfacon et al., (1991 ); ogen et ai., (1 990); Munroe et al. , (1 990), Bailas et al., ( 1989); Joshi et al., (1 987). Adicionalmente, los vectores pueden construirse y emplearse en el objetivo intracelular de un producto de gen específico dentro de las células de una planta transgénica o en dirigir una proteína al ambiente extracelular. Esto generalmente se logrará al unir una secuencia de ADN q ue codifica una secuencia péptida de señal o de transito a la secuencia codificadora de un gen particular. El transito resultante, o señal, péptido transportará la proteína a un destino intracelular particular, o extracelular, respectivamente, y entonces se removerá post-traslacionalmente . Los péptidos de señal o tránsito actúan al facilitar el transporte de proteínas a través de las membranas intracelulares, por ejemplo, vacuola, vesícula , plástico y membranas mitocondriales, o dirigir las proteínas a través de la membrana extracelular. En plantas, la secuencia de señal puede tener como objetivo el polipéptido codificado por el polinucleótido a un compartimiento específico dentro de una planta . Ejemplos de tales objetivos incluyen , peor no se limitan a, una vacuola, retículo endoplástmico, cloroplasto, o gránulo de almidón. Un ejemplo de una - 66 -secuencia de señal incluye la secuencia de señal de terminal N de ?-zeína de ma íz para tener como objetivo el retículo endoplásmico y secreción en el apoplasto (Torrent et al. , 1997). Otra secuencia de señal es la secuencia aminoácida SEKDEL para retener los polipéptidos en el retículo endoplásmico (Munro y Pelma, 1987) . Un polipéptido también puede tener como objetivo el amiloplasto por fusión al péptido objetivo de amiloplasto ceroso (Klosgen et al., 1 986) o a un granu lo de almidón . Por ejemplo , puede ser útil tener como objetivo ADN introducido al núcleo ya que esto puede incrementar la frecuencia de transformación. Dentro del núcleo por sí mismo sería útil tener como objetivo un gen para log rar la integración de sitio específico. Por ejemplo, sería útil tener un gen introd ucido a través del reemplazo por transformación de un gen existente en la célula. Ya que la secuencia de ADN entre el sitio de inicio de transcripción y el inicio de la secuencia codificadora , es decir, la secuencia gu ía sin traducir, puede influenciar la expresión genética , uno también puede desear emplear una secuencia guía en particular, Las secuencias gu ía preferidas se contempla que incluyen aquellas que incluyen secuencias predichas a dirigir la expresión óptima del gen anexo , es decir, para incluir una secuencia guía de consenso preferida que puede incrementar o mantener la estabilidad de mARN y prevenir el inicio inadecuado de la traducción . La selección de tales secuencias se conocerá por aquellos expertos en la materia a la luz de la presente exposición. Las secuencias que se derivan de los genes que se expresan altamente en las plantas se preferirán más. - 67 - Genes Marcadores Con objeto de mejorar la habilidad de identificar transformantes, uno puede desear emplear un gen seleccionable o observable como, o en adición a, el gen expresable de interés. Los "genes marcadores" son genes que imparten un fenotipo distinto a células que expresan el gen marcador y por lo tanto permiten que tales células transformadas se distingan de las células que no tienen el marcador. Tales genes pueden codificar ya sea un marcador observable o examinable, dependiendo de si el marcador otorga una característica que uno puede seleccionar mediante medios químicos, es decir, a través del uso de un agente selectivo (por ejemplo, un antibiótico o lo similar) o de si es simplemente una característica que uno puede identificar a través de observación o examinación, es decir, mediante 'examinación' (por ejemplo, el rasgo de lugar R). Por supuesto, se conocen muchos ejemplos de genes marcadores adecuados en la materia y pueden emplearse en la práctica de la invención. Se incluye dentro de los términos genes marcadores seleccionares u observables también a los genes que codifican un "marcador segregable" cuya secreción puede detectarse como un medio de identificación o selección de células transformadas. Los ejemplos incluyen marcadores que codifican un antígeno segregable que puede identificarse mediante interacción de anticuerpo, o incluso enzimas segregables que pueden detectarse mediante su actividad catalítica. Las proteínas segregables caen en un número de clases, incluyendo pequeñas proteínas difusoras detectables, por ejemplo, mediante ELISA y pequeñas enzimas - 68 -activas detectables en solución extracelular (por ejemplo, a-amilasa, ß-lactamsa, acetiltransfersa de fosfinotricina); y proteínas que se insertan o atrapan en la pared celular (por ejemplo, proteínas que incluyen una secuencia guía tal como aquella encontrada en la unidad de expresión de extensina o PR-S de tabaco). Con respecto a los marcadores secretables seleccionables, el uso de un gen que cod ifica una proteína que puede secuestrarse en la pared celular, y tal proteína incluye un epítope único se considera que es particularmente ventajoso. Tal marcador de antígeno secretado emplearía idealmente una secuencia epítope que proporcionaría antecedentes inferiores en tejido vegetal , u na secuencia guía promotora que impartiría expresión eficiente y objetivo a través de la membrana de plasma, y produciría una proteína que se une en la pared celular y aún accesible a los anticuerpos. Una proteína de pared normalmente secretada modificada incluiría un epítope ú nico que satisface ta les req uerimientos. Un ejemplo de una proteína adecuada para modificación en esta manera es extensina, o glicoproteína rica en hidroxiprolina (H PRG). Por ejemplo, la molécula HPRG de ma íz (Steifel et al., 1 990) se caracteriza bien en términos de biología molecular, expresión y estructu ra de proteína . Sin embargo, cualquiera de u na va riedad de extensivas y/o proteínas de pared rica en glicina (Keller et al., 1 989) podría modificarse por la adición de un sitio antigénico para crear un marcador seleccionable. Marcadores seleccionables Los marcadores seleccionables posibles para utilizarse en conexión con la presente invención incluyen , pero no se limitan a, un gen - 69 -neo (Potrykis et al., 1985) que codifica la resistencia a canamicina y puede seleccionarse para utilizar canamicina, G418, y lo similar; un gen bar que codifica la resistencia a bialafos; un gen que codifica una proteína de sintasa EPSP alterado (Hinchee et al., 1988) confiriendo así resistencia a glifosato; un gen de nitrilasa tal como bxn de Klebsiella ozaenae que confiere resistencia a bromoxinilo (Stalker et al., 1988); un gen de sintasa de acetolactato muíante (ALS) que confiere resistencia a imidazolinona, sulfonílurea u otros químicos que inhiben ALS (Solicitud de Patente Europea 154,204, 1985); un gen DHFR resistente a metotrexato (Thillet et al., 1988); un gen dehalogenasa dalapón que confiere resistencia al dalapón herbicida o un gen de sintasa de antranilato mutado que confiere resistencia a 5-metil triptofan. Donde un gen de sintasa EPSP mutante se emplea, el beneficio adicional puede realizarse a través de la incorporación de un péptido de transito de cloroplasto adecuado, CTP (Solicitud de Patente Europea 0,218,571, 1987). Una modalidad ilustrativa de un gen marcador seleccionable capaz de utilizarse en sistemas para seleccionar los transformadores son los genes que codifican la acetiltransferasa de fosfinotricina de enzima, tal como el gen bar de Streptomyces hygroscopicus o el gen pat de Streptomyces viridochromogenes. La transfersada de acetil de fosfinotricina de enzima (PAT) inactiva el ingrediente activo en bialafos herbicida, fosfinotricina (PPT). PPT inhibe la sintetasa de glutamina (Murakami et al., 1986; Twell et al., 1989) causando la rápida acumulación de amoniaco y muerte celular. El éxito de utilizar este sistema selectivo junto con monocots es particularmente sorprendente debido a las - 70 -d ificu ltades principales que se han reportado en la transformación de cereales (Potrykus, 1 989). Donde se desee emplear un gen de resitencia bialofos en la práctica de la invención, un gen particularmente útil para este propósito es el gen pat o bar obtenible de especies de Streptomyces (por ejemplo, ATCC No. 21 ,705). La clonación del gen bar se ha descrito (Murakami et al., 1986; Thompson et al., 1 987) como el uso del gen bar en el contexto de plantas diferentes a monocots (De Block et al. , 1 987; De Block et al., 1 989). Los marcadores seleccionabas para utilizarse en procariotas incluyen una resistencia de tetraciclina o un gen de resistencia de ampicilina. Marcadores Seleccionables Los marcadores seleccionables q ue pueden emplearse incluyen , pero sin limitarse, un gen de ß-glucuronidasa o uidA (GUS) que codifica una enzima para la cual se conocen d iversos substratos cromogénicos; un gen lugar R, que codifica un producto que regula la producción de pigmentos de antocíanina (color rojo) en tejidos de planta (Della porta et al., 1 986); un gen ß-lactamaso (Sutcliffe, 1 978), el cual codifica una enzima para la cual se conocen diversos substratos cromogénicos (por ejemplo, PADAC, una cefaloesporina cromogénica); u n gen xylE (Zukowsky et al. , 1 983) que codifica u na dioxigenasa de catecol que puede convertir los catecoles cromogénicos; un gen a-amilasa (Ikuta et al. , 1 990); un gen de tirosinasa (Katz et al. , 1 983) q ue cod ifica una enzima capaz de oxidar tirosina hacia DOPA y dopaquinona la cual a su - 71 -vez se condensa para formar la melanina compuesta fácilmente detectable; un gen ß-galactosidasa, el cual codifica una enzima para la cual existen substratos cromogénicos; un gen de luciferasa (lux) (Ow et al. , 1986), el cual permite la detección de bioluminiscencia; o incluso un gen de ecuorín (Prasher et al. , 1985), el cual puede emplearse en la detección de bioluminiscencia sensible al calcio, o un gen de proteína fluorescente verde (Niedz et al. , 1995). Los genes del complejo de gen R de maíz se contemplan para ser particularmente útiles como marcadores seleccionables. El complejo de gen R en maíz codifica una proteína que actúa para regular la producción de pigmentos de antrocianina en la mayoría de las semillas y tejido vegetal. Un gen del complejo de gen R se aplica a transformación de maíz, debido a que la expresión de este gen en las células transformadas no daña las células. De esta manera, un gen R introducido en tales células causará la expresión de un pigmento rojo y, si se incorpora establemente, puede clasificarse visualmente como un sector rojo. Si una línea de maíz lleva alelos dominantes para genes que codifican los intermedios enzimáticos en trayectoria biosintética de antrocianina (C2, A1 , A2, Bz1 y Bz2), pero lleva un alelo recesivo en el lugar R, la transformación de cualquier célula de esa línea con R resultará en formación de pigmento rojo. Las líneas ejemplificativas incluyen Wisconsin 2 que contiene el alelo rg-Stadler y TR1 1 2, un derivado K55 que es r-g, b, P1 . Alternativamente, cualquier genotipo de maíz puede utilizarse si los alelos C1 y R se introducen juntos. Un marcador seleccionable adicional contemplado para el uso en la presente invención - 72 -es luciferaza de luciérnaga, codificada para el gen lix. La presencia del gen lix en células transformadas puede detectarse utilizando, por ejemplo, película de rayos X, conteo de centelleo, espectrofotometría fluorescente, cámaras de vídeo con poca luz, cámaras de conteo de fotón o luminometría de múltiples cavidades. También se comprende que este sistema pueda desarrollarse para selección populacional para bioluminescencia, tal como en placas de cultivo de tejido o aún para selección de planta total. Transformación La cinta de expresión o u na construcción de vector que contiene la cinta de expresión , puede insertarse en una célula. La cinta de expresión o construcción de vector pueden llevarse a cabo de manera episomal o integrarse en el genoma de la célula , por ejemplo, derivados de SV40; plásmidas bacterianas, AQN fago; baculovirus; plásmidas de levadura ; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y fago ADN , ADN viral tal como vaccinia, adenovira , virus de ave de corral y pseudo-rabias. Sin embargo, puede utilizarse cualquier vector siempre y cuando sea reproducibles y viable en el huésped. Si la cinta de expresión se modifica en una célula vegetal, una célula vegetal transformada puede desarrollarse en una planta transgénica. De acuerdo con lo anterior, la invención proporciona plantas transgénicas y los productos de la pla nta transgénica. Tales productos pueden incluir, pero no limita rse a , las semillas, fruta, progenie, y productos de la progrenie de la planta transgénica. Se encuentran disponibles y se conocen por aquellos expertos - 73 -en la materia una variedad de técnicas para la introducción de construcciones en un huésped celular. La transformación de bacterias y muchas células eucarióticas puede llevarse a cabo a través del uso de glicol de polietileno, cloruro de calcio, infección viral, dextrano DEAE, infección de fago, electroporación y otros métodos conocidos en la materia. La transformación de hongos puede llevarse a cabo de acuerdo con Goñi et al. (1987). La introducción del vector recombinante en levaduras puede llevarse a cabo mediante métodos que incluyen electroporación, uso de esferoplastos, acetato de litio y lo similar. Puede utilizarse cualquier método capaz de introducir ADN en células animales: por ejemplo, electroporación, fosfato de calcio, lipofección y lo similar. La cinta de expresión puede insertarse en una célula de insecto utilizando un baculovirus (ver, por ejemplo, Baculovirus Expresión Vectors, A Laboratory Manual (1992)). Por ejemplo, el vector en el cual el gen recombinante se ha introducido puede introducirse junto con baculovirus en una célula de insecto de manera que un virus recombinante se obtiene en el sobrenadante de la célula de insecto cultivada. Las células de insecto se infectan entonces con el virus recombinante mediante el cual la proteína puede expresarse. El vector que introduce el gen utilizado en este método puede incluir por ejemplo pLV1392, pVL1393 y pBlueBaclll (todos productos de Invitrogen). El baculovirus, puede ser, por ejemplo, virus de polihedrosis nuclear de Autographa californica, que es un virus que infecta ciertos insectos de polilla. Las células de insecto, pueden ser células ováricas Sf9 y Sf2 de Spodoptera frugiperda y High 5 (Invitrogen), que es una célula ovárica de trichoplusia ni, etc. Para co- - 74 -introducción de tanto el vector que tiene el gen recombinante como el vaculovirus en una célula de insecto para prparar un virus recombinante, el fosfato de calcio o métodos de lipofección pueden utilizarse. Los métodos para introducir los vectores de expresión en tejido vegetal incluyen la infección directa o co-cultivo de una célula vgetal con Agrobacterium tumefaciens (Horsch et al., 1 985). Las descripciones de los sistemas vectores de Agrobacterium y métodos para transferencia de gen mediada por Agrobacterium se proporciona por Gruber et al., (1997). Las técnicas para transformar las células de planta incluyen transformación con ADN que emplea A. tumefaciens o A. rhizogenes como el agente transformador, electroporación, inyección de ADN, bombardeo de microproyectirl, aceleración de partícula, y lo similar (ver, por ejemplo, EP 295959 y EP 138341 ). Se prefiere particularmente el uso de vectores tipo binario de plásmidos Ti y Ri de Agrobacterium spp. Los vectores derivados de Ti transforman una amplia variedad de plantas más altas, incluyendo plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, tales como semilla de soya, algodón, naba, tacabaco y arroz. (Pacciotti et al., 1985; Byrne et al., 1987; Sukhapinda et al., 1987; Lorz et al., 1985; Potrykus et al., 1985; Park et al., 1985; y Hiei et al., 1994). El uso de T-ADN para transformar las células de planta ha recibido estudio extensivo y se describe ampliamente (ver, por ejemplo, EP 120516; Hoekema 1985; Krauf et al., 1983 y An et a., 1 985). Otros métodos de transformación se encuentran disponibles para aquellos expertos en la materia, tales como toma directa de - 75 -construcciones de ADN externa (ver EP 295959), técnicas de electroporación (Fromm et al., 1 986) o bombardeo balístico de alta velocidad con partículas de metal revestidas con las construcciones de ácido nucleico ( line er al., 1987 y Patente de E . U. No. 4,945,050). Una vez transformadas, las células pueden regenerarse por aquellos expertos en la materia. De particular relevancia son los métodos recientemente descritos para transformer genes externos en cultivos comercialmente importantes, tlaes cornos semilla de naba (De Block et al., 1989), girasol (Everett et al., 1987), semilla de soya (McCabe et al., 1988; Hinchee et al., 1988; Chee et al., 1989; Christou et al., 1989; y EP 301 749), arroz (Hiei er al., 1994) y maíz (Gordon Kamm er al., 1 990; y Fromm et al., 1990). Los vectores de expresión que contienen fragmentos sintéticos o genómicos pueden introducirse en protoplastos o en tejidos intacto o células aisladas. Preferentemente, los vectores de expresión se introducen en tejido intacto. Los métodos generales de cultivo detejidos vegetales se proporcionan por ejemplo por Maki et al., (1993); y por Phillips er al., (1988). Preferentemente, los vectores de expresión se introducen en maíz y otros tejidos vegetales utilizando método de transferencia de gen directa tía como suministro mediado por microproyectil, inyección de ADN, electroporación y lo similar. Más preferentemente, los vectores de expresión se introducen en tejidos de planta utilizando el suministro de medios de microproyectil con el dispositivo biolístico. Ver, por ejemplo, Tomes et al., (1995). Aquellos expertos en la materia apreciarán que la elección del - 76 -método puede depender del tipo de planta, es decir, monocotiledóneas o dicotiledóneas, objetivo para transformación. Los métodos adecuados de transformación de células de planta incluyen, pero no se limitan a , microinyección (Crossway et al., 1986), electroporación (Riggs et al., 1986), transformación mediada por agrobacterium (De Blaere et al., 1987; y Hinchee et al., 1988), transferencia de gen directa (Paszkowski et al., 19845 cita nuestra patente), y aceleración de partícula balística utilizando dispositivos disponibles de Agracetus, Inc., Madison, Wis y BioRad, Hercules, Calif. (ver, por ejemplo, Sanford et al., Pat. de E.U. No. 4,945,050; y McCabe et al., 1988). También ver, Weissinger et al., 1988; Sanford et al., 1987 (cebolla); Christou et al., 1988 (semilla de soya); McCabe et al., 1988 (semilla de soya); Datta er al., 1990 (arroz); Klein et al., 1988 (maíz); Klein et al., 1988 (maíz); Klein er al., (1988); Fromm et al., 1990 (maíz); y Gordon-Kamm et al., 1990 (maíz); Svab et al., 1990 (cloroplasto de tabaco); Koziel et al., 1993 (maíz); Shimamoto et al., 1989 (arroz); Christou er al., 1991 (arroz); Solicitud de Patente Europea EP 0 332 581 (pasto y otro Pooideae); Vasil er al., 1993 (trigo); Weeks er al., 1993 (trigo); y Methods in Molecular Biology (1998). La transformación de plantas puede tomarse con una molécula de ADN única o múltiples moléculas de ADN (es decir, co-transformación), y ambas de estas técnicas son adecuadas para utilizarse con las cintas de expresión y construcciones de la presente invención. Numerosos vectores de transformación se encuentran disponibles para transformación de la planta, y las cintas de expresión de esta invención pueden utilizarse junto con cualquiera de tales vectores. La selección de vector dependerá de la - 77 -técnica de transformación preferida y las especies objetivo para transformación. Muchos vectores se encuentran disponibles para transformación utilizando Agrobacterium tumefaciens. Estos típicamente llevan al menos una secuencia borde de T-ADN e incluyen vectores tales como pBIN 19. Bevan ( 1 984). Un vector adicional útil para transformación mediada por Agrobacterium es el vector binario pCIB 1 0, que contiene un gen que codifica la resistencia a canamicina para selección en plantas, y secuencias de borde izquierdas y derechas e incorpora secuencias del plásmido de huésped de amplio rango pRK252 que permite replicarse tanto en E. coli como Agrobacterium. Su construcción se describe por Rothstein et al., (1 987) . Varios derivados de pCIB I O se han construido los cuales incorporan el gen para fosfotransferasa de hiromicina B descrita por Gritz et al., (1 983). Estos derivados permiten la selección de células de planta transgénica en higromicina solamente (pCIB743) o higromicina y canamicina (pCIB71 5, pCIB717) . Los métodos para utilizar cualquier forma de transferencia de gen directa de transferencia mediada por Agrobacterium usualmente, pero no necesariamente , se toman con un marcador seleccionable que puede proporcionar resistencia a un antibiótico (por ejemplo, ca namicina , higromicina y metotrexato) o un herbicida (por ejemplo , fosfinotricina) . La elección de marcador seleccionable para transformación de planta no es, sin embargo, critica para la invención . Para ciertas especies de planta, diferentes marcadores de selección herbicidas o antibióticos pueden preferirse. Los marcadores de - 78 -selección utilizados de manera rutinaria en transformación incluyen el gen nptll que confiere resistencia a canamicina y antibióticos relacionados (Messing & Vierra 1982; Bevan et al., 1 983), el gen bar que confiere resistencia a la fosfinotricina herbicida (White et al. , 1 990; S pencer et al., 1 990), el gen hph que confiere resistencia a la higromicina antibiótica (Blochinger & Diggelmann), y el gen dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Bourouis et al., 1 983). Tal vector útil para técnicas de transferencia de gen directa en combinación con la selección por Basta herbicida (o fosfinotricina) es pCIB3064. Este vector se basa en el plásmido pCIB246, que comprende el promotor CaMV 35S en fusión operacional al gen GUS E. coli y el terminador transcripcional CaMV 35S y se describe en WO 93/07278. incorporado en la presente para referencia. Un gen útil para conferir resistencia a fosfinotricina es el gen bar de Streptomyces viridochromogenes (Thompson et al., 1 987) . Este vector es adecuado para la clonación de cintas de expresión de planta que contienen sus propias señales reguladoras. Un vector de transformación adicional es pSOG35 que utiliza reductasa de dihidrofolato de gen E. coli (DHFR) como un marcador seleccionable que confiere resistencia a metotrexato. Cualquier tejido vegetal capaz de propagación clona subsecuente, ya sea por organogénesis o embriogénesis, puede transformarse con una construcción de la presente invención. El término organogénesis significa un proceso mediante el cual los brotes o raíces se desarrollan secuencialmente de centros meristemáticos mientras q ue el término embriogénesis significa un proceso mediante el cual los brotes y - 79 -raíces se desarrollan juntos en una manera concertada (no secuencialmente), ya sea de células somáticas o gametos. El tejido particular elegido variará dependiendo de los sistemas de propagación clónales disponibles para, y que se ajustan mejor a , las especies particulares que se transforman . Los objetivos de tejido ejemplificativos incluyen discos de hoja, polen , embriones, cotiledóneas, hipocotil, megagametofitos, tejido callosos, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristemos apicales, brotes axiliares, y meristemos de raíz) y tejido de meristemo inducido (por ejemplo, meristemo de cotiledón y meristemo de hipocotil). Las plantas de la presente invención pueden tomar una variedad de formas. Las plantas pueden ser quimeras de células transformadas y células no transformadas; las plantas pueden ser transformadores clónales (por ejemplo, todas las células transformadas para contener la cinta de expresión); las plantas pueden comprender injertos de tejidos transformados y no transformados (por ejemplo , una reserva de raíz transformada injertada a un sción no transformado en especies citrosas) . Las plantas transformadas pueden propagarse por una variedad de medios, tales como por propagación clonal o técnicas de alimentación clásticas. Por ejemplo, pintas transformadas de primera generación (o T1 ) puede dar las plantas transformadas de segunda generación homocigosa (o T2), y las plantas T2 se propagan además a través de técnicas de alimentación clásticas. Un marcador seleccionable dominante (tal como npt I I) puede asociarse con la cinta de expresión para ayudar en alimentación. - 80 - La presente invención puede utilizarse para transformación de cualquier especie de planta, incluyendo, pero no limitándose a, Zea mayz, Brassica sp. (por ejemplo, S. Napus, B, Rapa, B. Júncea), particularmente aquellas especies Brassica útiles como fuente de semilla oleaginosa, tal como cañóla, Medicago sativa, Oryza sativa, Sécale cereale, sorghum (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), Pennisetum glaucum, Panicum miliaceum, Setaria itálica, Eleusine coracana, Helianthus annus, Carthamu trinctorius, Triticum aestiyum, Glycine max, Nicotina tabacum, Solanum tuberosum, Arachis hypogaea, Gossypium barbadense, Gossypíum hisutum, Ipomoea batatus, Manihot esculenta. Cofea spp, Cocos nucífera, Ananas comosus, Citrus spp, Theobroma cacao, Camellia sinensis. Musa spp., Persea americana, Ficus casica, Psidium guajava, Mangifera indica, Olea europaea, Carica papaya, Anacardium occidentale, Macadamia integrifolia, Prunos amygdalus, Beta vuigaris, Saccharum spp., avena, cebada, vegetales, ornamentales y coniferas. Los vegetales incluyen Lucopersicon esculentum, Lactuca sativa, Phaseolus vuigaris, Phseolus limensis, Lathurys spp, y miembros del género Cucumis tal como C. sativus, C. cantalupensis, C. meló. Ornamentales incluyen Rhododendron spp, Macrophylla hydrangea, Hibiscus rosasanensis, Rosa spp., Tulipa spp, Narcicuss spp, Petunia híbrida, Dianthus caryophyllus, Euphorbia pulcherrima, y crisantemo. Las coniferas que pueden emplearse en la practica de la presente invención incluyen, por ejemplo, pinos tales como Pinus taeda, Pinus elliotti, Pinus ponderosa, Pinus controta, Pinus radiata, Pseudotsuga menziessi, Tsuga canadensis, Pieca glauca, Sequía sempervirens, Abies amabilis, Abies - 81 -balsamea, y cedros tales como cedro rojo y cedro amarillo. Las plantas leguminosas incluyen guisantes y arvejas. Los guisantes incluyen guar, guisante loco, alholva, semilla de soya, guisantes de jardín, caupí, mungo, lima, fava , lentejas, garbanzo, etc. Las leg umbres incluyen, pero no se limitan a, Arachis, por ejemplo, cacahuates Vicia , por ejemplo, vicia corona, vicia pilosa, guisante adzuki, mungo, y garbanzo, Lupinus, por ejemplo, lupina , trifolio, Faseola, por ejemplo guisante común y guisante de lima , Piso, por ejemplo, guisante de campo, Melilotus, por ejemplo, trébol, Medicago, por ejemplo, alfafa, Loto, por ejemplo, trifolio, lentejas por ejemplo, lenteja, e índigo falos. Forrage preferido y pasto para utilizarse en los métodos de la invención incluyen alfalfa, pasto, pasto alto pasto perenial, pasto de cultivo y pasto rojo. Preferentemente, las plantas de la presente invención son plantas de cultivo, por ejemplo, maíz, alfata, girasol , Brassica , semilla de soya, algodón, girasol, cacahuate, sorgo, trigo, arroz, tabaco, cebada, arroz, tomate, papa , melones, cultivos de legumbres, por ejemplo, guisante y semilla de soya y lo similar. Enzima Recombinante Para la preparación de fitasa recombinante, después de la transformación de un huésped adecuado y el crecimiento del huésped, puede inducirse un promotor seleccionado mediante med ios adecuados (por ejemplo, desplazamiento de temperatura o inducción química) y las células pueden cultivarse durante un periodo adicional a fin de producir enzima recombinante. Las células se cosechan entonces típicamente mediante centrifugación, se interrumpe por medios físicos o químicos y el extracto crudo resultante se retiene para purificación adicional. Las células empleadas en la expresión de proteínas pueden interrumpirse mediante cualquier método convencional, incluyendo ciclos de congelamiento-descongelamiento, sonificación , interrupción mecánica o uso de agentes de lisis celular, tales métodos son muy conocidos por aquellos expertos en la materia. La enzima puede recuperarse y purificarse a partir de cultivos celulares recombinantes mediante métodos que incluyen sulfato de amoniaco o precipitación por etanol, extracción por ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía por interacción hidrofóbica, cromatografía por afinidad, cromatografía por hidroxilapatita y cromatografía por lectina. Pueden utilizarse etapas de re-doblez de proteína, según sea necesario, al completar la configuración de la proteína madura. Finalmente, la cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC) puede emplearse para etapas de purificación finales. Las enzimas de la presente invención pueden ser un producto de procedimientos sintéticos químicos, o pueden producirse mediante técnicas recombinantes a partir de un huésped eucariótico tía como una planta más alta. Dependiendo del huésped empleado en el procedimiento de producción recombinante, la enzima de la presente invención puede o no modificarse de manera covalente a través de glicosilación. En células eucarióticas, la glicosilación de las proteínas segregadas sirve para modular el doblez de proteínas, la estabilidad conformacional y - 83 -termoestabilidad y ia resistencia a la proteolisis. Dada una aplicación específica del uso de fitasa, una versión glicosilada de la enzima puede ser preferible sobre una forma no glicosilada . Por ejemplo, el uso de una fitasa glicosilada en alimentos animales ayuda a proteger a la enzima de la desnaturalización térmica durante la formación de gránu los de los alimentos y de la inactivación proteolítica a medida que pasa a través del estómago del animal, ayudando a suministrar la enzima activa al tracto intestinal y sitio de acción . Para aplicaciones de procesamiento de alimentos donde se desea actividad de la enzima solamente durante el procesamiento y no en el producto final, se prefiere una fitasa no glicosilada, termolábil y proteolítica, susceptible . Las enzimas de esta invención pueden emplea rse para cualquier propósito en el cual sea necesario o deseable tal actividad de enzima. En una modalidad preferida, la enzima se emplea para catalizar la hidrólisis de fitato en alimentación animal . En otra modalidad preferida , la enzima se emplea para catalizar la hidrólisis de fitato en alimentos. Producción v caracterización de plantas establemente transformadas Las célu las de planta transformadas se colocan en un medio selectivo apropiado para selección de células transgénicas que se desa rrollan al callo. Los brotes se desarrollan del callo y plántulas generadas del brote al desarrollar en medio de raíz. Las diversas construcciones normalmente se unirán a un marcador para selección en células de planta. Convenientemente el marcador puede ser resistente a biocida (particularmente un antibiótico , ta l como canamicina , G41 8 , bleomicina , higromicina, cloranfenicol , herbicida o lo similar) . El marcador - 84 -particular utilizado permitirá la selección de células transformadas en comparación con las células que carecen de ADN que se han introducido. Los componentes de las construcciones de ADN, incluyendo cintas de transcripción/expresión de esta invención, pueden prepararse de secuencias que son nativas (endógenas) o externas (exógenas) al huésped. Por "externo" se entiende que la secuencia no se encuentra en el huésped tipo silvestre en el cual la construcción se introduce. Las construcciones heterólogas contendrá al menos una región que no es nativa al gen del cual se deriva la región de inicio-transcripción. Para confirma la presencia de transgenes en células transgénicas y plantas, una variedad de análisis puede realizarse. Tales análisis incluyen, por ejemplo, análisis "biológicos moleculares" bien conocidos por aquellos expertos en la materia, tales como Southern and Northern blotting, hibridización in situ y métodos de amplificación a base de ácido nucleico tal como PCR o RT-PCR; análisis "bioquímico", tal como detección de la presencia de un producto proteínico, por ejemplo, por medios inmunológicos (ELISAs y Western blots) o por función enzimática; análisis de partes de la planta, tales como análisis de raíz u hoja; y también, al analizar el fenotipo de la totalidad regenerada. ADN puede aislarse de células o un organismo de tejido de las mismas incluyendo cualquier parte de la planta para determinar la presencia de un segmento de ácido nucleico particular a través del uso de técnicas bien conocidas por aquellos expertos en la materia. Observe que las secuencias intactas no siempre estarán presentes, presumiblemente debido al reordenamiento o eliminación de secuencias en la célula. 1 - 85 - La presencia de elementos de ácido nucleico introducidos a través de los métodos de esta invención puede determinarse por reacción de cadena de polimerasa (PCR). Utilizando esta técnica fragmentos discretos de ácido nucleico se amplifican y detectan por electroforesis de gel. Este tipo de análisis permite determinar si un segmento de ácido nucleico preseleccionado está presente en un transformador estable, pero no prueba la integración del segmento de ácido nucleico prseleccionado introducido en el genoma de célula huésped. Además, no es posible utilizar técnicas PCR para determinar si los transformadores tienen genes exógenos introducidos en sitios diferentes en el genoma, es decir, si los transformadores son de origen independiente. Se contempla que el utilizar técnicas PCR sería posible para clonar fragmentos del ADN genómico huésped adyacente a un segmento de ADN particular introducido. La prueba positiva de integración de ADN en el genoma huésped y las identidades independientes de transformadores pueden determinarse utilizando la técnica de hibridización Southern. Utilizando esta técnica las secuencias de ADN específicas que se introducen en el genoma huésped y secuencias de ADN del huésped de flanqueo pueden identificarse. Por lo tanto, el patrón de hibridización Southern de un transformador dado sirve como una característica de identificación de ese transformador. Además es posible a través de la hibridización Southern demostrar la presencia de segmentos de ADN particulares introducidos en ADN de alto peso molecular, es decir, confirma que el segmento de ADN particular introcudio se ha integrado en el genoma de célula huésped. La técnica de hibridización Southern proporciona información que se obtiene - 86 -utilizando PCR, por ejemplo, la presencia de un segmento de ADN particular, pero también demuestra la integración en el genoma y caracteriza cada transformador individual. Se contempla que utilizando las técnicas de hibridización de mancha de ranura o punto que son modificaciones de las técnicas de hibridización Southern uno podría obtener la misma información que se deriva de PCR, por ejemplo, la presencia de un segmento de ADN particular. Tanto las técnicas de hibridización de PCR como Southern pueden utilizarse para demostrar la transmisión de un segmento de ADN particular para la progenie. En muchos casos, los patrones de hibridización Southern característicos para un transformado dado segregarán en progenie como uno o más genes Mendelianos (Spencer et al., 1992; Laursen et al., 1994) indicando la herencia estable del gen. La naturaleza no quimérica del callo y los transformadores de origen (R0) se sugiere por transmisión de línea germinal y los patrones de hibridización de Southern blot idénticos e intensidades del ADN de transformación en callo, plantas R0 y progenie Ri que segregan el gen transformado. Aunque las técnicas de análisis de ADN pueden conducirse utilizando ADN aislado de cualquier parte de una planta, ARN puede solamente expresarse en células particulares o tipos de tejido y por lo tanto será necesario preparar ARN para análisis de estos tejidos. Las técnicas PCR también pueden utilizarse para detección y cuantificación de ARN producido de segmentos de ADN particulares introducidos. En esta aplicación de PCR es necesario primero invertir el ARN transcrito en ADN, - 87 -utilizando enzimas tales como transcriptasa inversa, y después a través del uso de técnicas de PCR convencionales amplificar el ADN. En la mayoría de los casos las técnicas PCR, aunque útiles, no demuestran la integridad del producto de ARN . Información adicional acerca de la naturaleza del producto de ARN puede obtenerse por Northern blotting. Esta técnica demostrará la presencia de una especie de ARN y da información acerca de la integridad del ARN. La presencia o ausencia de una especia de ARN también puede determinarse utilizando hibridización Northern blot de ranura o punto. Estas técnicas son modificaciones de Northern blotting y solamente demostrarán la presencia o ausencia de una especie ARN. De esta manera, aunque Southern blotting y PCR pueden utilizarse para detectar el segmento de ADN particular en cuestión, no proporcionan información en cuanto a si el segmento de ADN particular se expresa. La expresión puede evaluarse al identificar específicamente los productos proteínicos de los segmentos de ADN particulares introducidos o evaluar los cambios fenotípicos traídos por su expresión. Los análisis para la producción e identificación de proteínas específicas pueden hacer uso de propiedades físico-químicas, estructurales, funcionales u otras de las proteínas. Las propiedades estructurales o físicas-químicas únicas permiten que las proteínas se separen e identifiquen por procedimientos electroforéicos, tales como electroforesis de gel desnaturalizante o nativo o enfoque isoeléctrico, o por técnicas cromatográficas tales como intercambio de ión o cromatografía de exclusión de gel. Las estructuras únicas de proteínas - 88 -individuales ofrecen oportunidades para utilizarse para anticuerpos específicos para detectar su presencia en formatos tal como un análisis ELISA. Las combinaciones de planteamientos pueden emplearse con mayor especificidad tal como Western blotting en el cual los anticuerpos se utilizan para ubicar los productos genéticos individuales que se han separado por técnicas electroforéticas. Las técnicas adicionales pueden emplearse para confirmar absolutamente la identidad del producto de interés tal como evaluación por secuenciación aminoácida después de purificación . Aunque estos se encuentran entre los procedimientos más comúnmente empleados, pueden utilizarse adicionalmente otros. Los procedimientos de análisis también pueden utilizarse para identificar la expresión de proteínas por su funcionalidad , especia lmente la habilidad de las enzimas para catalizar las reacciones químicas específicas incluyendo productos y substratos específicos. Estas reacciones pueden seguirse al proporcionar y cuantificar la pérdida de substratos o la generación de productos de las reacciones por procedimientos químicos o físicos. Ejemplos son tan variables como la enzima a analizarse. Muy frecuentemente la expresión de un producto genético se determina al evaluar los resultados fenotípicos de su expresión . Estos análisis también pueden tomar la forma incluyendo pero no limitándose a analizar cambios en la composición qu ímica, morfología, o propiedades fisiológicas de la planta . Composiciones de Fitasa En general, las composiciones de fitasa son líquidas o secas.

Las composiciones líquidas no necesitan contener nada más que la enzima de fitasa, preferentemente en una forma altamente purificada. Sin embargo, puede agregarse un estabilizador tal como glicerol, sorbitol o mono propilen glicol. La composición líquida también puede comprender otros aditivos, tales como sales, azúcares, preservativos, agentes ajustadores de pH, proteínas y fitato (un substrato de fitasa). Las composiciones líquidas típicas son acuosas o mezclas acuosas a base de aceite. Las composiciones líquidas pueden agregarse a un alimento o alimentos antes o después de una formación de gránulos opcional de los mismos. Las composiciones secas pueden ser composiciones liofilizadas o secadas por aspersión , en cuyo caso la composición no necesita contener nada más que la enzima en una forma seca. Las composiciones pueden ser granulados que pueden mezclarse fácilmente con, por ejemplo, componentes alimenticios o alimentos, o más preferentemente, formar un componente de una pre-mezcla. El tamaño de partícula de los granulados de enzima preferentemente es compatible con el de los otros componentes de la mezcla. Esto proporciona un medio seguro y conveniente para incorporar enzimas en, por ejemplo, alimento procesado o alimentos de animales. Por ejemplo, una formulación de enzima de fitasa estable puede prepararse mediante congelamiento de una mezcla de solución de enzima líquida con un agente de volumen tal como harina de soya molida, y posteriormente la liofilización de la mezcla. La reducción de humedad u las interacción de la fitasa con el agente de volumen protegen a la enzima - 90 -de los factores ambientales externos tales como temperaturas extremas experimentadas durante la elaboración del alimento compuesto. Las formulaciones secas pueden mejorar aún más la estabilidad mediante reducción de la actividad de enzimas proteolíticas potenciales que pueden presentarse como sub-productos en la mezcla de fermentación líquida utilizada para elaborar la enzima objetivo. La mezcla de enzima seca-harina de soya resultante de la presente invención puede soportar extremos elevados de temperatura. Por ejemplo, después de 120 minutos de calentamiento a 96°C, la formulación de enzima seca retuvo 97.8% de su actividad enzimática original. Esta mezcla de enzima formulada puede utilizarse como un complemento alimenticio para utilizarse en la crianza de puercos y aves de corral. Por ejemplo, la adición de 500 unidades de enzima de una fitasa termotolerante de la invención a 1 kg de una dieta estándar de maíz-soya para aves de corral, permitió una reducción en los niveles de la complementación de fosfato inorgánico actualmente utilizada en nutrición animal, es decir, desde 0.45% hasta 0.225%. Los pollos se elevaron en un 0.225% de dieta de fosfato complementada con la fitasa formulada llevada a cabo así como también las aves alimentadas con una dieta estándar que contiene 0.45% de fosfato. Además, una reducción en la complementación de fosfato da como resultado niveles disminuidos de contaminación de fosfato, lo cual a su vez disminuye significativamente el impacto ambiental de la producción comercial de animales, intensiva. Las desventajas potenciales con el uso de formulaciones secas de tamaño de partícula pequeño son sus tendencias a formación de polvo y la alta concentración local de la enzima objetivo en la superficie de las - 91 -partículas. Las partículas de polvo impregnadas con proteína de enzima pueden poseer interés inmunológico, mientras que la ubicación de enzima predominantemente en la superficie de las partículas pequeñas pueden afectar la estabilidad, particularmente durante el periodo prolongado de almacenamiento y durante la fabricación de alimento. De esta manera, se proporciona además por la invención un método no fabricado de formulación , que comprende producir y suministrar la enzima objetivo de la invención en grano tal como maíz, trigo o soya . El grano intacto protege la enzima objetivo de factores ambientales externos y minimiza la producción de polvo. Este método de suministro de enzima agrega ahorros significativos a un costo de formulación, particularmente cuando se compara con los costos de formulaciones de granulado bajas en polvo actualmente utilizadas comercialmente. La enzima que contiene grano puede agregarse a alimento animal en la forma de semilla agrietada , semilla triturada o en una forma más refinada. Alternativamente, un extracto de proteína puede hacerse de semilla , y después el extracto puede procesase además en ya sea un líquido estabilizado o en un estado seco por liofílización o secado por rocío. Por ejemplo, fitasa enzimáticamente activa puede producirse en maíz en un nivel de 1 , 000,000 u nidades por kg de semilla, y enzima activa se recupera de la semilla por extracción acuosa. Los granulados en aglomeración se preparan mediante el uso de técnicas de aglomeración en una mezcladora de alto cizallamiento durante lo cual se co-aglomeran un material de relleno y la enzima a fin de formar granulos. Los granulados de absorción se preparan al tener - 92 -núcleos de un material vehículo a fin de absorber/ser cubiertos por la enzima. Los materiales de relleno típicos son sales tales como sulfato de disodio. Otros materiales de relleno incluyen caolina , talco, silicato de aluminio de magnesio y fibras de celulosa. Opcionalmente, los aglutinantes tales como dextrinas también se incluyen en granulados de aglomeración. Los materiales vehículo típicos incluyen almidón, por ejemplo, en forma de yuca , maíz, papa, arroz y trigo. También pueden utilizarse sales. Opcionalmente, los granulados se cubren con una mezcla de cubierta. Tal mezcla comprende agentes de cubierta, preferentemente agentes de cubierta hidrofóbicos, tal como aceite de palma hidrogenado y sebo de res y, si se desea, otros aditivos tales como carbonato de calcio o caolina . Adicionalmente, las composiciones de fitasa pueden contener otros sustitutos tales como agentes colorantes, compuestos de aroma, estabilizantes, vitaminas, minerales, otros alimentos o enzimas mejoradoras de alimentos y lo similar. Esto es así en particular para las así llamada pre-mezclas. Un "alimento o aditivo de alimentos" es un compuesto esencialmente puro o una composición de múltiples componentes que se propone o es adecuada para agregarse a un alimento o alimentos. En particular, es una sustancia que por su uso propuesto se vuelve un componente de un alimento o producto alimenticio o afecta cualquier - 93 -característica de un alimento o producto alimenticio. Por lo tanto, una aditivo de fitasa se entiende como una fitasa que no es un constituyente natural del alimento principal o substancias alimenticias y que no se presenta en su concentración natural en los mismos, por ejemplo, la fitasa se agrega a los alimentos por separado de las substancias alimenticias, sola o en combinación con otros aditivos alimenticios, o la fitasa es una parte integral de una de las substancias alimenticias pero se ha producido en la presente por tecnología de ADN recombinante. Un aditivo típico normalmente comprende uno o más compuestos tales como vitaminas, minerales o enzimas mejoradoras de alimentos y vehículos y/o excipientes adecuados. Un aditivo de fitasa "listo para usarse" se define en la presente como un aditivo que no se produce in situ en alimentos animales o en alimentos procesados. Un aditivo de fitasa listo para usarse puede alimentarse a humanos o animales directamente o, preferentemente, de. manera directa después de mezclarse con otros alimentos o constituyentes alimenticios. Por ejemplo, un aditivo alimenticio de acuerdo con este aspecto de la presente invención se combina con otros componentes alimenticios a fin de producir alimentos. Tales otros componentes alimenticios incluyen uno o más complementos de enzima diferentes (preferentemente termoestables), aditivos alimenticios de vitaminas, aditivos alimenticios de minerales y aditivos alimenticios amino ácidos. El aditivo alimenticio resultante (combinado) que incluye posiblemente varios tipos diferentes de compuestos puede entonces mezclarse en una cantidad adecuada con los otros componentes alimenticios, tal como complementos - 94 -de cereal y proteínas para formar un alimento animal. El procesamiento de estos componentes en un alimento animal puede llevarse a cabo mediante el uso de cualquiera de los aparatos de procesamiento actualmente utilizados, tal como una máq uina de doble formación de grán ulos, u n granulador de vapor, un expansor o una extrusora . De manera similar, un aditivo alimenticio de acuerdo con este aspecto de la presente invención se combina con otros componentes alimenticios a fin de producir productos alimenticios procesados. Tales otros componentes alimenticios incluyen uno o más complementos de enzima diferentes (preferentemente termoestables), aditivos alimenticios vitamínicos y aditivos alimenticios minerales. El aditivo alimenticio resultante (combinado), incluyendo posiblemente varios diferentes ti pos de compuestos, puede mezclarse entonces en una cantidad adecuada con los otros componentes alimenticios, tales como proteínas de cereal y plantas a fin de formar un producto alimenticio procesado. El procesamiento de estos componentes en un producto alimenticio procesado puede llevarse a cabo mediante el uso de cualq uier de los aparatos de procesamiento actualmente utilizados. En una modalidad preferida, las composiciones de fitasa de la invención comprenden adicionalmente una cantidad eficaz de u na o más alimentos o enzimas mejoradoras de alimentos, en particular, alimentos o enzimas mejoradoras de alimentos seleccionados a partir del grupo que consiste en a-galactosidasas , ß-galactosidasas, en particular lactasas, otras fitasas, ß-glucanasas, en particular, endo-ß-1 ,4-glucanasas y endo-ß-1 , 3(4)-glucanasas, celulasas, xilosidasas, galactanasas, en particular, - 95 -endo-1 ,4-p-galactosidasas de arabinogalactano y endo-1 , 3-ß-galactosidasas de arabinogalactano, endoglucanasas, en particular, endo-1 ,2-P-glucanasa, endo-1 , 3-a-glucanasa, y endo-1 , 3-p-glucanasa , enzimas degradantes de pectina, en particular, pectinasas, pectinesterasas, liasas de pectina , poligalacturonasas, arabinasas, ramnogalacturonasas, esterasas de ramnogalacturonano acetilo, ramnogalacturonan-alfa-ramnosidasa, liasas de pectato, y alfa-galacturonisidasas, mañanazas, beta-mannosidasas, esterasas de mannan acetilo, esterasas de xilano acetilo, proteasas, xilanasas, arabinoxilanasas y enzimas lipoliticas tales como lipasas, fosfolipasas y cutinasas. El aditivo alimenticio animal de la invención se proporciona como complemento al animal antes o simultáneamente con la dieta . Preferentemente, el aditivo alimenticio anima l de la invención se proporciona como complemento al animal de manera simultánea con la dieta. Una cantidad eficaz de fitasa en el alimento o alimentos es desde aproximadamente 10 hasta 20 ,000 FTU/kg; preferentemente desde aproximadamente 1 0 hasta 1 5 ,000 FTU/kg , más preferentemente desde aproximadamente 1 0 hasta 1 0,000 FTU/kg, en particular desde aproximadamente 1 00 hasta 5 ,000 FTU/kg , especialmente desde aproximadamente 1 00 hasta aproximadamente 2, 000 FTU/kg de alimentos o alimento. También dentro del alcance de esta invención se encuentra el uso de fitasa para el procesamiento y elaboración de alimentos para humanos y alimentos para animales. Los g ranos y harinas destinados para - 96 -alimentos humanos pueden tratarse enzimáticamente con fitasa a fin de reducir el contenido de fitina del material. Los niveles reducidos de fitina mejoran la calidad del alimento al incrementar la disponibilidad de nutrientes de minerales esenciales tales como hierro, calcio, y cinc. Además de incrementar la calidad nutricional de los alimentos, la fitasa utilizada durante el procesamiento de alimentos puede mejorar la eficiencia total del método de producción de alimentos. Por ejemplo , la adición de fitasa a hojuelas de soya blancas durante la elaboración del aislado de proteína de soya puede incrementar significativamente la producción y calidad de la proteína extraíble. Durante la elaboración de alimentos, la fitasa se encuentra activa solamente durante la elaboración y procesamiento, y no se encuentra activa en el producto alimenticio final. Este aspecto es relevante, por ejemplo, en la elaboración y cocción de pasta. De manera similar, los granos alimenticios animales tales como granos molidos de soya tostada o granos molidos de cánola , pueden pre-procesarse con fitasa antes de la elaboración de los alimentos compuestos. El retiro de los factores anti-nutritivos en componentes alimenticios animales antes de la elaboración de los alimentos compuestos, produce una calidad nutricionalmente mayor y un ingrediente alimenticio animal más valioso . En este método de procesamiento , la fitasa se encuentra activa durante la elaboración de alimentos y puede o no encontrarse activa en el tracto digestivo del animal después de la ingesta de los alimentos tratados. Además de utilizar fitasa como un auxiliar en el procesamiento de alimentos, el alcance de esta invención abarca el uso de fitasa como un - 97 -auxiliar digestivo complementario humano. La fitasa en forma de tableta puede ingerirse al momento de consumir alimentos a fin de suministrar enzima activa al tracto gastrointestinal del recipiente. Las ganancias nutricionales para el consumidor se experimentarían in vivo y pueden tomarse con alimentos que no pueden tratarse con una fitasa durante el procesamiento de alimentos. También dentro del alcance de la invención se encuentra el uso de una fitasa de la invención durante la preparación de alimentos o preparaciones o aditivos alimenticios, es decir, la fitasa se encuentra activa solamente durante la elaboración y no se encuentra activa en el alimento o producto alimenticio final. Este aspecto es particularmente relevante, por ejemplo, en la elaboración y cocción de pasta y en la producción de otros productos en base a cereal listos para comerse. Otra posibilidad para la adición exógena de fitasa a alimento animal y alimento procesado es agregar material de planta transgénica que contiene fitasa al alimento, preferentemente semilla transgénica procesada, en la cual la fitasa se ha sintetizado a través de la expresión genética heteróloga. Las partes de las plantas que expresan la fitasa heteróloga, por ejemplo, la semilla de las plantas transgénicas y otros mateiales de planta tales como raíces, tallos, hojas, madera, flores, corteza, y/o fruta pueden incluirse en alimento animal, ya sea como tal o después de procesamiento adicional. En alimentos o alimento a base de cereal, el cereal es preferentemente trigo, cebada, maíz, sorgo, centeno, avena, tritical o arroz. La fitasa también puede utilizarse ventajosamente en monogástricos así como también en poligástricos, especialmente en - 98 -bovinos jóvenes. Las dietas para peces y crustáceos también pueden complementarse con fitasa para mejorar aún más el índice de conversión alimenticia y reducir el nivel de fósforo excretado para sistemas de producción intensivos. Los alimentos de acuerdo con la presente invención también pueden proporcionarse a animales tales como aves de corral, por ejemplo, pavos, gansos, patos, así como también puercos, equinos, bovinos, ovinos, caprinos, caninos y felinos, así como también peces y crustáceos. Sin embargo, es particularmente preferible que los alimentos se proporcionen a cerdos o aves de corral, incluyendo, pero sin limitarse, pollos tiernos, gallinas, en particular gallinas, pavos y patos de postura. Composiciones Alimenticias y Métodos De Uso Las fitasas (formuladas como se describe arriba) de la invención actual pueden combinarse con otros ingredientes para dar como resultado composiciones alimenticias novedosas con ventajas particulares. Por ejemplo, es preferible que las operaciones de producción animal intensivas limiten la contaminación por fosfato que se contiene en las heces de los animales que se producen. La cantidad de fosfato presente en la dieta y la disponibilidad del fosfato en la dieta para el animal son los factores principales que influencian el fosfato excretado presente en las heces del animal. Actualmente, la disponibilidad de la planta, o fosfato derivado de grano, presente en granos molidos de soya, granos de maíz (y otros forrajes) es baja ya que el fosfato se encuentra básicamente en la forma de ácido fítico. Con objeto de maximizar las eficiencias de los animales, se agrega fosfato inorgánico a los alimentos, - 99 -dando como resultado una composición alimenticia que contiene niveles adecuados de fosfato disponible. Sin embargo, estas formulaciones alimenticias contienen demasiado fosfato en total y dan como resultado contaminación por fosfato. Aunque las fitasas comercialmente disponibles al momento dan como resultado una mayor disponibilidad del fosfato, se recomienda utilizarlas con niveles elevados de fosfato inorgánico agregado. Las fitasas de la presente invención son tan activas que puede utilizarse para crear novedosas formulaciones alimenticias animales que tienen a) niveles significativamente reducidos de fosfato inorgánico, y b) permiten una eficiencia superior de conversión alimenticia y ganancia de peso mejorada con relación a las dietas normales. En la actualidad, las fitasas comercialmente disponibles no permitirán que los animales se críen de manera eficiente en alimentos que no contienen fósforo inorgánico agregado. Específicamente, la alimentación animal de la invención comprende la combinación de una fitasa de la presente invención en combinación con ingredientes alimenticios animales a fin de formar un alimento que tiene niveles de fósforo inorgánico substancialmente disminuidos. En una modalidad preferida, las composiciones alimenticias de la invención comprenden ingredientes alimenticios típicos, micronutrientes, vitaminas, etc. y una cantidad eficaz de fitasa termoestable y fosfato inorgánico donde las cantidades de la fitasa y el fósforo se encuentran desde aproximadamente entre los niveles de 50-20,000 unidades de fitasa por kg de alimento y menos de 0.45% de fósforo - 100 -inorgánico; preferentemente entre los niveles de 100-10,000 unidades de fitasa por kg de alimento y menos de 0.225% de fósforo inorgánico; en particular, entre los niveles de 150-10,000 unidades de fitasa por kg de alimento y menos de 0.15% de fósforo inorgánico o especialmente entre los niveles de 250-20,000 unidades de fitasa por kg de alimento y sin fósforo inorgánico exógenamente agregado. También, dentro del alcance de la invención se encuentran métodos para mejorar las ganancias de peso y los índices de conversión alimenticia (FCR) asociados con la producción de animales de granja. Una fitasa de la presente invención permite ganancias de peso mejoradas y FCR especialmente cuando se utiliza en combinación con dietas que son bajas en fosfato inorgánico. Específicamente, el método de la presente invención para mejorar el FCR o ganancia de peso de una dieta baja en fosfato inorgánico mediante alimentación de una dieta a un animal que comprende una fitasa de la presente invención y un nivel de fosfato inorgánico en o por debajo del nivel de 0.45%. Preferentemente, el método comprende la alimentación de una dieta que contiene la fitasa y menos de 0.225% de fosfato inorgánico, o más preferentemente, el método comprende la alimentación con una dieta que contiene la fitasa y nada de fósforo inorgánico agregado. La alimentación animal de la presente invención puede utilizarse en animales monogástricos o poligástricos. La alimentación animal de la presente invención puede ser alimento para aves de corral, o cerdos o becerros, o animales de compañía tales como perros o gatos o caballos. Los ejemplos de tales alimentos y el uso de los alimentos se - 101 -proporciona en el Ejemplo 3. La presente invención también proporciona un método para crianza de animales que da como resultado una carga de fosfato ambiental significativamente reducida. El método comprende la alimentación de manadas o rebaños enteros de animales de granja que contienen una fitasa de la presente invención y una reducida cantidad de fósforo inorgánico (menos de 0.45%). Más preferentemente, el método comprende la alimentación de manadas o rebaños enteros de animales de granja con una composición alimenticia que contiene una fitasa de la presente invención y una cantidad significativamente reducida de fósforo inorgánico (menos de 0.225%), o más preferentemente el método comprende la alimentación de manadas o rebaños enteros de animales de granja con una composición alimenticia que contiene una fitasa de la presente invención y sin fósforo inorgánico. Este método permitirá que se mantengan densidades elevadas de animales mientras se reduce la liberación ambiental de fosfato a partir de la operación de crianza de animales de granja. La invención se describirá además por los siguientes ejemplos, que no se proponen limitar el alcance de la invención en ninguna manera. EJEMPLO 1 La secuencia aminoácida deducida de Nov9x (SEQ ID NO: 1 ) se convierte en secuencia ácido nucleica optimizada de maíz utilizando el análisis Wisconsin GCG programa Backtransalte y la tabla de codón para genes de maíz altamente expresados (ver, por ejemplo, Patente de E. U. No. 5,625, 136). El gen sintético se prepara por Integrated DNA - 102 -technologies, Inc. (Coralville, ??). Secuencia aminoácida de fitasa Nov9X (las 8 mutaciones están en negritas y subrayadas) (SEQ ID NO: 1 ) MAQSEPEIJ ESWIVSRHGVRAPTKATQLMQDVTPDAWPIWV LGELT P GGEIJAYLGHYWQRLVADGLLP CGCPQSGQVAIIADVDERTRKTGEA FAAGLAPDCAITVHTQADTSSPDPLIWLKTGVCQLDNANVTOAILERAGG SIADFTGHYQTAFRELER^NFPQS LCLKREKQDESCSLTQALPSELKVSA D^SLTGAVSLASMLllII^LQQAQGMPEPGWGRrroSHQWi LSLHNAQ FDLLQRTTEVARSRATTI DLIKTALTPHPPQKQAYGVTI^TSVLFIAGHDW LAlsnLGGALELKW LPGQPD TIPPGGELVFERWRRLSDNSQWIQVSLVFQTL QQMimKTPI^LNTPPGEV LTlAGCEE3^^ SL Secuencia ácida nucleica optimizada de ma íz de fitasa Nov9X (SEQ I D NO:2) sitios de clonación BamHI y SacI (subrayados) se incluyen en los extremos 5' y 3', respectivamente. Los codones de inicio y detención se muestran en negritas. GGATCCACCATGGCGCAGTCCGAGCCGGAGCTGAAGCTGGAGTCCGTG GTGATCGTGTCCCGCCACGGCGTGCGCGCCCCGACCAAGGCCACCCAGC TCATGCAGGACGTGACCCCGGACGCCTGGCCGACCTGGCCGGTGAAGCT CGGCGAGCTGACCCCGCGCGGCGGCGAGCTGATCGCCTACCTCGGCCAC TACTGGCGCCAGCGCCTCGTGGCCGACGGCCTCCTCCCGAAGTGCGGCT GCCCGCAGTCCGGCCAGGTGGCCATCATCGCCGACGTGGACGAGCGCAC CCGCAAGACCGGCGAGGCCTTCGCCGCCGGCCTCGCCCCGGACTGCGCC ATCACCGTGCACACCCAGGCCGACACCTCCTCCCCGGACCCGCTCTTCA ACCCGCTCAAGACCGGCGTGTGCCAGCTCGACAACGCCAACGTGACCGA CGCCATCCTGGAGCGCGCCGGCGGCTCCATCGCCGACTTCACCGGCCAC TACCAGACCGCCTTCCGCGAGCTGGAGCGCGTGCTCAACTTCCCGCAGT CCAACCTCTGCCTCAAGCGCGAGAAGCAGGACGAGTCCTGCTCCCTCAC CCAGGCCCTCCCGTCCGAGCTGAAGGTGTCCGCCGACTGCGTGrCGCrC ACCGGCGCCGTGTCCCTCGCCTCCATGCTCACCGAAATCTTCCTCCTCCA GCAGGCCCAGGGCATGCCGGAGCCGGGCTGGGGCCGCATCACCGAGTCC CACCAGTGGAACACCCTCCTCTCCCTCCACAACGCCCAGTTCGACCTCCT CCAGCGCACCCCGGAGGTGGCCCGCTCCCGCGCCACCcéGCTCctCGAC CTCATCAAGACCGCCCTCACCeeGCACCCGCCGCAGAAGCAGGCCTACG GCGTGACCCTCCCGACCTCCGTGCTCTTCATCGCCGGCCACGACACCAAC CTCGCCAACCTCGGCGGCGCCCTGGAGCTGAACTGGACGCTCCCGGGCC AGCCGGACAACACCCCGCCGGGCGGCGAGCTGGTGTTCGAGCGCTGGCG CCGCCTCTCCGACAACTCCCAGTGGATTCAGGTGTCCCTCGTGTTCCAGA CCCTCCAGCAGATGCGCGACAAGACCCCGCTCTCCCTCAACACCCCGCC GGGCGAGGTGAAGCTCACCCTCGCCGGCTGCGAGGAGCGCAAGGCGCA GGGCATGTGCTCCCTCGCCGGCTTCACCCAGATCGTGAACGAGGCCCGC ATCCCGGCCTGCTCCCTCTAATAGAGCTC A. Preparación de cintas de expresión que tienen un gen de fitasa optimizado de maíz - 1 03 - Las siguientes cintas Nov9x se construyen para expresar la fitasa Nov9x en semilla de maíz con varias señales objetivo. La secuencia de codificación Nov9x tiene un sitio de clonación BamHI en el extremo 5' y un sitio de clonación Sacl en el extremo 3'- pNOV4054 comprende la secuencia de señal de terminal N de ?-zeína (MRVLLVALALLALAASATS) (SEQ ID NO: 3) fusionada a la fitasa Nov9X sintétca para objetivo del retículo endoplásmico y secreccion en el apoplasto (Torrent ef al. , 1 997). El primer residuo después de la secuencia de señal es Ala. Este reemplaza Met I en Nov9x. Secuencia aminoácida de fusión de fitasa pNOV4054 (S EQ ID NO:4) (secuencia de ?-zeína está en negritas) MRVLL VALA LLALAASATS AAQSEPEL LES V Vi VSRHG V AFT ATQLM QDVT DAWPTWPV LGELTPRGGELIAYLGHYWRQRLVADGLLPKCGCPQ SGQVAI1ADVDERTRKTGEAFAAGIAPDCAITVHTQADTSSPDPLFNPLKTG VCQLDNA>mOAILEPJ^GGSlADFTGHYQTAi^LERVLNFPQS LCLKRE QDESCSLTQALPSEIJ VSADCVSLTGAVSLASMLTEIFLLQQAQGMPEPG WGRITDSHQWNTLLSLHNAQFDLLQRTPEVARSRATPLLDLIKTALTPHPPQ KQAYGVTLPTSVLI'IAGHDTNLANLGGALELNW'rLPGQPDNTPPGGELVFE RWRRI^DNSQWIQVSLWQTLQQAIRDKTPLSLNTPPGEVKLTLAGCEERNA QGMCSLAGFTQIVNEARIPACSL Secuencia nucleotida de fusión de fitasa pNOV4054 (SEQ I D NO:5) que muestra los sitios de clonación de flanqueo 5' BamHI y 3' Sacl (subrayados). Los codones de inicio y detención se indican en tipo negrita. - 104 - G ATCCACCATGAGGGTGTTGCTCGTTGCCCTCGCTCTCCTGGCTCTCGC TGCGAGCG CACCAGCGCTGCGCAGTCCGAGCCGGAGCTGAAQCTGGA GTCGGTGGTGATCOTGTCCCGCCACGGCGTGCGCGCCCCGACCAAGGCC ACCCAGCTCATGCAGGACGTGACCCCGGACGCCTGGCCGACCTGGCCGG TGAAGCTCGGCGAGCTGACCCCGCGCGGCGGCGAGCTGATCGCCTACCT CGGCCACTACTGGCGCCAGCGCCTCGTGGCCGACGGCCTCCTCCCGAAG TGCGGCTGCCCGCAGTCCGGCCAGGTGGCCATCATCGCCGACGTGGACG AGCGCACCCGCAAGACCGGCGAGGCCTTCGCCGCCGGCCTCGCCCCGGA CTGCGCCATCACCGTGCACACCCAGGCCGACACCTCCTCCCCGGACCCG CTCTTCAACCCGCTCAAGACCGGCGTGTGCCAGCTCGACAAGGCCAACG TGACCGACGCCATCCTGGAGCGCGCCGGCGGCTCCATCGCCGAerrCAC CGGCCACTACCAGACCGCCTTCCGCGAGCTGGAGCGCGfGCTCAAGTTC CCGCAGTCCAACCTCTGCCTCAAGCGCGAGAAGCAGGACGAGTCCTGCT CCCTCACCCAGGCCCTCCCGTCCGAGCTGAAGGTGTCCGCCGACTGCGT GTCCCTCACCGGCGC8TGTCCCTCGCC CCATXJCTCACCGAAATCTTCC TCCTCCAGCAGGCCCAGGGCATGCCGGAGCCGGGCTGGGGCCGCATCAC CGACTCCCACCAGTGGAACACCCTCCTCTCCCTCCACAACGCCCAGTTCG ACCTCCTCCAGCGCACCCCGGAGGTGGCCCGCTCCCGCGCCACCCCGCT CCTCGACCTCATCAAGACCGCCCTCACCCCGCACCCGCCGCAGAAGCAG GCCTACGGCGTGACCCTCCCGACCTCCGTGCTCTTCATCGCCGGCCACGA CACCAACCTCGCCAACCTCGGCGGCGCCCTGGAGCTGAACTGGACCCTC CCGGGCCAGCCGGACAACACCCCGCCGGGCGGCGAGCTGGTGTTCGAGC GCTGGCGCCGCCTCTCCGACAACTCCCAGTGGATTCAGGTGTCCCTCGTG TTCCAGACCCTCCAGCAGATGCGCGACAAGACCCCGCTCTCCCTCAACA CCCCGCCGGGCGAGGTGAAGCTCACCCrCGCCGGCTGCGAGGAGCGCAA CGCCCAGGGCATGTGCTCCCTCGCCGGCTTCACCCAGATCGTGAACGAG GCCCGCATCCCGGCCTGCTCCCTCTAATAGAGCTC pNOV4058 comprende la secuencia de señal de terminal N de ?-ze ína fusionada a la fitasa ????? sintética con una adición de terminal C de la secuencia SEKDEL, para tener como objetivo y retención en el retículo endoplásmico (Munro y Pelma , 1 987). E l primer residuo después de la secuencia de señal es Ala. Este reemplaza Met í en Nov9x. Secuencia aminoácida de fusión de fitasa pNOV4058 (SEQ ID NO:6) (?-zeína en el término N y secuencia SEKDEL en el término C se muestran en negritas): IVmVLLVALALLALAASATSAAQSEPELKLESVVIVSRHGVRAPTKATQLM QDVTPDAWTWPVKLGELTPRGGELIAYLGHYWRQRLVÁDGLLP GGCPQ SGQVAIIAD VDE T KTGEAF AAGL APDC AITVHTQADTS SPDPLFNPLKTG VCQI-DNA-WTOAILERAGGSIADFTGHYQTAFRELERVL FPQSNLCL RE KQDESCSLTQAIJPSEI-KVSAPÍJVSLTGAVSI^ LTEIFLLQQAQG PEPG WGRITDSHQ NTLI^LHNAQFOLLQRTPEVARSRATPLLDLIKTALTPHPPQ KQAYGVTLPTSVIJIAGHiyn^LANl jGALELNWTL RWRRI^DNSQWIQVSL QTLWMR KTP^LNTTPGEV ITIAGCEERNA QGMCSLAGFTQIVNEARIPACSLSEKDEX - 1 05 - Secuencia de nucleótido de fusión de fitasa pNOV4058 (SEQ ID NO: 7) que m uestra sitios de clonación 5'BamH I y 3'Sacl de flanq ueo (subrayados) , Las secuencias que codifican la secuencia de seña l gam ma-ze ' i n a y la seña l S EKDE L se muestran en tipo negrita .

GGATCCACCATGAGGGTGTTGCTCGTTGCCCTCGCTCTCCTGGCTCr CGCTGCGAGCGCCACCAGCGCTGCGCAGTCCGAGCCGGAGGTGAAGC TGGAGTCCGTGGTGATCGTGTCCCGCCÁCGGCGTGCGCGC ccéACCAA GGCCACCCAGCTCATGCAGGACGTGACCCCGGACGCCTGGCCGACCTGG CCGGTGAAGCTCGGCGAGCTGACCCCGCGCGGCGGCGÁGGTGATCGCCT ACCTCGGCCACTACTGGCGCCAGCGCCTCGTGGCCGAGGGCCTCCTCCC GAAGTGCGGCTGCCCGCAGTCCGGCCAGGTGGCCATCATCGCCGACGTG GACGAGCGCACCCGCAAGACCGGCGAGGCCTTCGCCGCCGGCCTCGCCC CGGACTGCGCCATCACCGTGCACACCCAGGCCGACACCTCCTCCCCGGA CCCGCTCTTCAACCCGCTCAAGACCGGCGTGTGCCAGCTCGACAACGCC AACGTGACCGACGCCATCCTGGAGCGCGCCGGCGGCTCCATCGCCGACT TCACCGGCCACTACCAGACCGCCTTCCGCGAGCTGGAGCGCGTGCTCAA C1TCCCGCAGTCCAACCTCTGCCTCAAGCGCGAGAAGCAGGACGAGTCC TGCTCCCTCACCCAGGCCCTCCCGTCCGAGCTGAAGGTGTCCGCCGACTG CGTGTCCCTCACCGGCGCCGTGTCCCTCGCCTCCATGCTCACCGAAATCT TCCTCCTCCAGCAGGCCCAGGGCATGCCGGAGCCGGGCTGGGGCCGCAT CACCGACTCCCACCAGTGGAACACCCTCCTCTCCCTCCACAACGCCCAGT TCGACCTCCTCCAGCGCACCCCGGAGGTGGCCCGCTCCCGCGCCACCCC GCTCCTCGACCTCATCAAGACCGCCCTCACCCCGCACCCGCCGCAGAAG CAGGCCTACGGCGTGACCCTCCCGACCTCCGTGCTCTTCATCGCCGGCCA CGACACCAACCTCGCCAACCTCGGCGGCGCCCTGGAGCTGAACTGGACC CTCCCGGGCCAGCCGGACAACACCCCGCCGGGCGGCGAGCTGGTGTTCG AGCGCTGGCGCCGCCTCTCCGACAACTCCCAGTGGATTCAGGTGTCCCTC GTGTTCCAGACCCTCCAGCAGATGCGCGACAAGACCCCGCTCTCCCTCA ACACCCCGCCGGGCGAGGTGAAGCTCACCCTCGCCGGCTGCGAGGAGCG CAACGCCCAGGGCATGTGCTCCCTCGCCGGCTTCACCCAGATCGTGAAC GAGGCCCGCATCCCGGCCTGCTCCCTCTCCGAGAAGGACGAGCTGTAA TAGAGCTC B. Aisla miento de promotores pa ra expresión específica de endoespe rma en ma íz El promotor del gen ?-ze ína Zea mays (o btenido de Dr. Bria n Larki ns) se a mplifica como u n fragmento 673 bp de pGZ27.3. E l pro m otor ?-ze ína se ha mostrado q ue es específico de end oesperma (Torrent et al. , - 106 - 1 997). Los sitios de clonación Hindi y BamH I se introducen en extremos 5' y 3', respectivamente. Estos sitios se subrayan. Secuencia ácido nucleica de promotor ?-zeína Zea mavs (SEQ ID NO: 8) AAGCTTCGATCATCCAGGTGCAACCGTATAAGTCCTAAAGTGÓTGAGGA ACACGAAACAACCATGCATTGGCATGTAAAGCTCCAAGAATTTGTTGTA TCCTTAACAACTCACAGAACATCAACCAAAATTGCACGTCAAGGG ATT GGGTAAGAAACAATCAAACAAATCCTCTCTGTGTGCAAAGAAACACGGT GAGTCATGCCGAGATCATACTCATCTGATATACATGCTTACAGCTCACA AGACATTACAAACAACTCATATTGCAT ACAAAGATCGTTTCATGAAAA ATAAAATAGGCCGGACAGGACAAAAATCCTTGACGTGtAAAGTAAATTr ACAACAAAAAAAAAGCCATATGTCAAGCTAAATCTAATTCGTTTTACGT AGATCAACAACCTGTAGAAGGCAACAAAACTGAGCCACGCAGAAGTAC AGAATGATTCCAGATGAACCATCGACGTGCTACGTAAAGAGAGTGACGA GTCATATACATTTGGCAAGAAACCATGAAGCTGCCTACAGCCGTCTCGG TGGCATAAGAACACAAGAAATTGTGTTAATTAATCAAAGCTATAAATAA CGCTCGCATGCCTGTGCACTTCTCCATCACCACCACTGGGTCTTCAGACC ATTAGCTTTATCTACTCCAGAGCGCAGAAGAACCCGATCGACAGGATCC C. Aislamiento de promotores para expresión específica de embrión en maíz El promotor y región sin codificación 5' de la globulina de embrión de maíz principal, globi , se amplifica como un fragmento de 1427 pares bases de ADN genómico de maíz utilizando cargas de inicio designadas del banco genético acceso L22344. El promotor de globulina se ha mostrado que es principalmente específico del embrión (Belanger y Kriz, 1 989). Sitios de clonación Hindi y BamH I donde se introduce en los extremos 5' y 3' , respectivamente. Estos sitios se subrayan . Secuencia ácido nucleico promotora de globulina 1 Zea mavs (SEQ ID NO.9) - 107 - AAGCITAGTGCCATCCTTGGACACTCGATAAAGTATATTTTAri l 1 1 1 1 i ATTTTGCCAACCAAACTTTTTGTGGTATGTTCCTACACTATGTAGATCTA CATGTACCATTITGGCACAATTACATATTrACAAAAATGTTTTCTATAAA TATTAGATTTAGTTCGTTTATTTGAATTTCTTCGGAAAATTCACATTTAAA CTGCAAGTCACTCGAAACATGGAAAACCGTGCATGCAAAATAAATGATA TGCATGTTATCTAGCACAAGTTACGACCGATTTCAGAAGCAGACCAGAA TCnTCAAGCACCATGCTCACTAAACATGACCGTGAACTTGTTATCTAGTT GTTTAAAAATTGTATAAAACACAAATAAAGTCAGAAATTAATGAAACTT GTCCACATGTCATGATATCATATATAGAGGTTGTGATAAAAATTTGATA ATGTTTCGGTAAAGTTGTGACGTACTATGTGTAGAAACCTAAGTGACCT ACACATAAAATCATAGAGT TCAATGTAGTTCACTCGAGAAAGACTTTG TCAAGTGTCCGATAAAAAGTACTCGACAAAGAAGCCGTTGTCGATGTAC TGrrCGTCGAGATCTCTTTGTCGAGTGTCACACTAGGCAAAGTCTTTACG GAGTGTTTTTCAGK3CTTTGACACTCGGCAAAGCGCTCGATTCCAGTAGTG ACAGTAATTTGCATCAAAAATAGCTGAGAGATTTAGGCGCCGTTTCAAT CTCACGGGATAAAGTTTAGCT CCTGCTAAACTTTAGCTÁTATGAATTGA AGTGCTAAAGTTTAGTTTCAATTACCACCATTAGCTCTCCTGTTTAGATT ACAAATGGCTAAAAGTAGCTAAAAAATAGCTGCTAAAGTTTATCTGGCG AGATTGAAACAGGGCCTTAAAATGAGTCAACTAATAGACeAAGTAATTA TTAGCTATTAGTCGTTAGCTTCTTTAATCTAAGCTAAAACCAACTAATAG CTTATTTGTTGAATTACAATTAGCTCAACGGAATTCTCTGTTTmCTATA AAAAAAGGGAAACTGCCCCTCATTTACAGCAAATTGTCCGCTGCCTGTC GTCCAGATACAATGAACGTACCTAGTAGGAACTCTTTTACACGCTCGGT CGCTCGCCGCGGATCGGAGTCCCAGGAACACGACACCACTGTGTAACAC GACAAAGTCTGCTCAGAGGCGGCCACACCCTGGCGTGGACCGAGCCGGA GCCCGGATAAGCACGGTAAGGAGAGTACGGCGGGACGTGGCGACCCGT GTGTCTGCTGCCACGCAGCCTTCCTCCACGTAGCCGCGCGGCCGCGCCA CGTACCAGGGCCCGGCGCTGGTATAAATGCGCGCTACCTCCGCTTTAGTT CTGCATACAGTCAACCTAACACACCCGAGCATATCACAGTGGGATCC D. Construcción de vectores de transformación de planta para el Gen de Fitasa optimizado de maíz Los vectores binarios para transformación de maíz se construyen en dos pasos. En el primer paso, tres fragmentos se fusionan para generar una cinta de expresión . La cinta de expresión consiste de una cinta promotora Hindi-BamH I (secciones B & C arriba) fusionada a una cinta Nov9x BamHI-SacI (sección A arriba) fusionada a la cinta de terminador Sacl-Kpn l. La cinta de terminador incluye un intrón PEPC - 108 - invertido. La cinta de expresión se transfiere entonces como un fragmento Hindi-Kpn l en el vector binario pNOV21 1 7, que contiene el gen isomerasa de fosfamenosa (PMI) que permite la selección de células transgénicas con mañosa. Un resumen de los vectores binarios prparados para transformación de planta se muestra en la Tabla 1 . Los seis vectores se introducen en maíz. Los vectores binarios Nov9X listados en la Tabla 1 contienen la misma cinta de terminador con un intrón PEPC. Los vectores pNOV4051 , 4055 y 4059 contienen la cinta de promotor de globulina, y los vectores pNOV4053, 4057 y 4061 contienen la cinta de promotor gamma- zeína. Los vectores pNOV4051 y 4053 contienen la secuencia Nov9X mostrada en SEQ ID NO:2 con objetivo citoplásmico. Los vectores pNOV4055 y 4057 contienen la cinta Nov9X de pNOV4054 con objetivo de apoplasto. Los vectores pNOV4059 y 4061 contienen la cinta Nov9X de pNOV4058 con retención ER. Tabla 1 Los vectores pNOV4057 y pNOV4059 se han depositado en la - 109 - Colección de Cultivo de Búsqueda Agrícola (NRRL), 1 81 5N, University Street, Peoría, Illinois 61 604 , USA, una Autoridad de Depósito Internacional como se establece bajo el Tratado de Budapest en el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para los propósitos de procedimiento de patente, números de acceso NRRL B-30537, y NRL B-30538, respectivamente, el 28 de Diciembre de 2001 . EJEMPLO 2 Modificación genética de maíz y trigo El gen Nov9x sintético insertado en un vector apropiado como se describe arriba se introducen en maíz por transformación mediada por Agrobacterium y en trigo por transformación biolística . Los transformadores estables se regeneran del tejido cultivado en medio selectivo utilizando el sistema Positech de acuerdo con las Patentes de E . U. Nos. 5,767 ,378 y 5,994 ,629. Transformación de maíz mediada por Agrobacterium La transformación de embriones de maíz inmad uro se realiza esencialmente como se describe en Neg rotto et al., (2000) Plant Cell Reports 1 9:798-803. Varios constituyentes de medios descritos en la presente pueden substituirse . Plásmidos de transformación y marcador seleccionable Los genes utilizados para transformación se clonan en u n vector adecuado para transformación de maíz como se describe arriba. Los vectores utilizados contienen gen isomerasa de fosfomanosa (PMI) (Negrotto et al. , (2000) Plant Cell Reports 1 9: 798-803) como u n marcador seleccionable. - 110 - Preparación de Agrobactarium tumefaciens Cepa de Agrobacterium LBA4404 (pSB1) que contiene el plásmido de transformación de planta se desarrolla en YEP (extracto de levadura (5 g/L), peptona (10 g/L), NaCI (5 g/L), 15 g/l agar, pH 6.8) medio sólido por 2 a 4 días a 28°C. aproximadamente 0.8X 109 Agrobacteria se suspenden en LS-inf medio complementado con 100 µ? acetosirongona (As) (medio LSAs) (Negrotto er al., (2000) Plant Cell Rep 19:798-803). Las bacterias se pre-inducen en este medio por 30-60 minutos. Inoculación Los embriones inmaduros de A188 u otros genotipos de maíz adecuados se cortan de orejas de 8-12 días de edad en LS-inf líquido + 100 µ? As (LSAs). Los embriones se colocan en vórtice por 5 segundos y enjuagan una vez con medio de infección fresco. El medio de infección se remueve y la solución Agrobacterium se agrega entonces y los embriones se colocan en vórtice por 30 segundos y se dejan establecer con la bacteria por 5 minutos. Los embriones se transfieren entonces de lado hasta el medio LSAs y cultivan en la oscuridad por dos a tres días. Subsecuentemente, entre 20 y 25 embriones por placa de petri se transfieren a medio LSDc complementado con cefotaxima (250 mg/l) y nitrato de plata (1.6 mg/l) (Negrotto et al., 2000) y cultivan en la oscuridad por 28°C por 10 días. Selección de células transformadas y regeneración de plantas transformadas Los embriones inmaduros que producen callos embriogénicos se transfieren a medio LSDI 0.5S (LSDc con 0.5 mg/1,2,4-D en lugar de - 111 - Dicamba, 10g/I mañosa, 5 g/l de sucrosa y sin nitrato de plata). Los cultivos se selecciona en este medio por 6 semanas con una etapa de subcultivo en 3 semanas. Los callos de supervivencia se transfieren ya sea a medio LSD1M0.5S para abultarse en el medio Regí (como se describe en Negrotto et al., 2000). Después de cultivo en la luz (16 horas de luz/8 horas de régimen de oscuridad), los tejidos verdes se transfieren entonces al medio Reg2 sin reguladores de crecimiento (como se describe en Negrotto et al., 2000) e incuba por 1-2 semanas. Las plántulas se transfieren a cajas Magenta GA-7 (Magenta Corp, Chicago III.) que contienen medio Reg3 (como se describe en Negrotto et al., 2000) y se desarrollan en luz. Las plantas que son positivas de PCR para la cinta de expresión Nov9x se transfieren al suelo y se desarrollan en el invernadero. Análisis de ADN La presencia del gen Nov9X se determina por análisis +/- PCR o por un análisis de número de copia Taqman. La presencia del marcador selectivo PMI se determina por un análisis de número de copia Taqman. La presencia del marcador selectivo de gen de resistencia de espectinomicina se determina por análisis +/- PCR. EJEMPLO 3 Extracción de proteína de semillas de maíz Las orejas de plantas de maíz transgénico de primera y segunda generación se cosechan en 24-40 días o aproximadamente 30 días después de polinación (DAP). Los granos frescos y endoesperma aislado se pulverizan en agua a temperatura ambiente. Las proteínas se extraen en agua utilizando un mortero y pestillo. - 1 12 - Alternativamente, los granos se secan en cob a 1 05°F por 5 días. Los granos secos se pulverizan para producir una harina utilizando un pulverizador de tejido Kleco a temperatura ambiente por 20-30 segundos. Las proteínas se extraen de 1 00 mg de harina por adición de 1 mi de regulador e incubación por 20 min a temperatura ambiente. El material insoluble se remueve por centrifugación por 10 min a 4°C. Los extractos se mantienen en hielo. La concentración de proteína se determina utilizando el reactivo de análisis de proteína ADV01 (Cytoskeleton, Denver, CO) con BSA como el estándar. Los análisis de proteína se realizan en las placas de 96 cavidades y reacciones de 31 0 µ?. La absorción se mide en 595 nm utilizando un lector de placa SpectraMaxPlus (Molecular Devices). Típicamente 1 0 µ? de una dilución de 1 0 veces del extracto se diluye además con 300 µ? de reactivo ADV01 . Análisis de enzima Estimación de actividad de fitasa La determinación de actividad de fitasa, en base a la estimación de fosfato inorgán ico liberado en hidrólisis de ácido fítico, puede realizarse a 37°C después del método descrito por Engelen et al. , (2001 ). Una u nidad de actividad de enzima se define como la cantidad de enzima que libera 1 µ???? de fosfato orgánico por minuto bajo condiciones de análisis. Por ejemplo, la actividad de fitasa puede medirse al incubar 2.0 mi de la preparación de enzima con 4.0 mi de 9. 1 mM de fitato de sod io en 250 mM de regulador de acetato de sodio pH 5.5 , complementado con 1 mM CaCI2 por 60 minutos a 37°C. Después de la incubación, la reacción se detiene al agregar 4.0 mi de un reactivo de detención de color que - 1 1 3 -consiste de partes iguales de un molibdato de amonio 1 0% (p/v) y 0.235% (p/v) de solución de reserva de vanadato de amonio. Fosfato liberado se mide contra un conjunto de estándares de fosfato espectrofotométricamente a 41 5 nm. La actividad de fitasa se calcula al interpolar los valores de absorción A41 5 nm obtenidos para fitasa que contiene muestras que utilizan la cu rva estándar de fosfato generada . Alternativamente, una curva de actividad de fitasa generada al utilizar una referencia de fitasa estandarizada cuya actividad se certifica por el fabricante puede utilizarse en lugar de una curva estándar de fosfato para determinar la actividad enzimática . La actividad específica puede expresarse en unidades de actividad de enzima por mg de proteína. Alternativamente, la actividad de fitasa puede medirse de acuerdo al procedimiento de Wyss et al, 1 999 con modificaciones. Los análisis se realizan en tubos de 1 .5 mi y microplacas de 96 cavidades. Los análisis del tubo se in ician al mezclar 5 µ? 1 M de acetato de sodio (pH 4.5), 1 0 µ? de ácido fítico de 10 mM (Sigma Cat# P8810), 5 µ? de agua destilada, y 5 µ? de extracto dilu ido. La reacción se incuba a 37°C por 10 min, después que los tubos se colocan en huelo y la reacción se enfría inmediatamente por la adición de 25 µ? 1 5% ácido tricloroacético (TCA). La reacción enfriada se diluye con 450 µ? de agua destilada. La determinación colorimétrica de concentración de fosfato se inicia por la adición de 500 µ? de reactivo colorimétrico (0.6M de ácido sulfúrico, 2% de ascorbato, 0.5% molibdato de amonio) e incubación a 50°C por 1 5 min. La concentración de fosfato se determina al medir la a bsorción a 800 nm y la comparación con una curva estándar de fosfato de - 1 14 - potasio. Los análisis en microplacas (fondo plao, volumen de cavidad de 300 µ?) se inician al mezclar 20 µ? en 1 M de acetato de sodio, 40 µ? de 10 mM de ácido fítico, y 40 µ? de extracto d iluido. La placa se mantiene en huelo durante el mezclado. La placa se sella con papel aluminio y se coloca en un calentador de placas (Boekel-Grant PH-1 00) a 37°C por 1 0 min . La placa se transfiere a hielo y las reacciones se enfrían por la adición de 1 00 µ? 1 5% TCA. 1 5 µ? de la reacción enfriada se d iluye con 1 35 µ? de agua destilada en una segunda placa, y la reacción colorimétrica se inicia por la adición de 1 50 µ? del reactivo colorimétrico. La segunda placa incluye estándares de fosfato. La placa se sella con papel aluminio e incuba en el calentador de placa a 50°C por 1 5 min. La absorción a 820 nm se mide por estándares duplicados y muestras. SDS-PAGE y análisis Western blot El regulador de muestra de electroforesis y regulador de paso son de acuerdo a a Laemmli, 1 970. Las muestras se hierven por 2 minutos antes de la electroforesis utilizando los geles prefundidos NOVEX Tris-Glycina (Invitrogen). Las transferencias electroforéticas se realizan utilizando el sistema Mini-Cell NOVEX (Invitrigen) utilizando el procedimiento del fabricanete y las recetas reguladoras. El regulador de transferencia contiene 1 2 mM Tris, 96 mM glicina , y 20% metanol. Los polipéptidos se transfieren a nitrocelu losa (NOVEX LC2000) por 1 -2 horas a 25 V y temperatura ambiente. Las membranas se bloquean por 1 5 min a temperatura ambiente por incubación en 30 mM Tris-HCI (pH 1 0.2), 1 50 mM NaCI, y 0.05% Tween-20 (TBST) compelementado con 3% BSA. - 1 1 5 - El suero inmune primario de la cabra se obtiene de Duncroft, Inc. (Lovettsville, VA). La cabra se inocula con fitasa Nov9x recombinante extraída de E. coli (obtenida de Diversa). Las manchas se incuban con anticuerpo primario (1 :2000 dilución en TBST) por 1 hora a temperatura ambiente seguido por lavados de 35 minutos con TBST. El procedimiento se repite utilizando anticuerpo secundario (IgG anti-cabra de ratón) diluido 1 :50,000 en TBST. Las manchas se desarrollan utilizando quemiluminescencia mejorada (Pierce SuperSignal Ultra). EJEMPLO 3 Acumulación de fitasa Nov9x en semilla de maíz de las plantas transgénicas de la primer generación transformadas con vectores pNOV4057 y pNOV4061 . Una formulación ejemplificativa de enzima de fitasa producida en semilla de ma íz está en la forma de un extracto líquido. Aquí, el enriquecimiento de fitasa Nov9x por degerminación , extracción de agua , calentamiento y centrifugación se describe. Los granos frescos de dos de las plantas transgénicas de la primera generación para producir orejas maduras se analizan para actividad de fitasa. Las plantas se derivan de embriones que se han transformado con plásmidos pNOV4057 (evento 305A 1 3) y pNOV4061 (evento 305B1 1 ). Los granos frescos de la misma edad se obtienen de una tercer oreja que no contienen el gen de fitasa Nov9X. Esta planta de control (evento 264A8C#14) contiene el vector pNOV4314, que codifica una enzima heteróloga. Seis granos y seis endoespermas de cada una de las tres orejas se agrupan y trituran utilizando un mortero y pestillo. Un - 1 16 -total de 10 mi ddH20 se agregan a los granos. Las fracciones solubes de las suspensiones se analizan para la proteína total y actividad de fitasa. Los resultados del análisis de fitasa de extractos de endoesperma y grano se muestran en la figura 1 . El análisis mide la concentración de fosfato en la reacción después de incubación a 1 0 minutos a 37°C. Los extractos del tejido de control negativo se incluyen para determinar el nivel de fosfato endógeno (figura 1 , superior). Este nivel de fosfato anterior se reproduce en base al análisis de varias extracciones de harina de muestras de control (datos no mostrados). Después de corregir para fosfato anterior, la actividad de fitasa se calcula para las dos plantas que contienen el gen de fitasa Nov9x. La actividad de fitasa se reporta como unidades totales extraídas de 6 granos y se muestra en la figura 1 , inferior. Las diferencias en la actividad de fitasa total entre los granos y endoesperma de la misma oreja se debe a la segregación del(los) transgen(es). Una porción de cada uno de los extractos de endoesperma analizados en la figura 1 se calienta a 60°C por 30 min. Como se muestra en la figura 2A, la actividad de fitasa en estos extractos no se afecta por calentamiento. Las muestras de extractos de endoesperma calentadas y no calentada se analizan por SDS-PAGE (figura 2B). El tamaño calculado del producto de gen Nov9x es 43 kDa. Una proteína en el rango de 40-50 kD fue abundante en el extracto de 305B1 1 . Esta proteína permaneció soluble durante el calentamiento y fue la proteína más abundante en la fracción soluble del extracto de endoesperma calentado. Una banda en esta región del gel se identifica por análisis Western blot utilizando - 1 1 7 -antisuero de una cabra inoculado con Nov9x producido en E. coli. Esta banda es un buen candidato para la enzima de fitasa recombinante. Una fuente adicional de enzima para una formulación líquida es utilizar semilla seca o harina obtenida de semilla seca . La semilla puede molerse para producir harina. La semilla recolectada 30 DAP (días después de polinación) de varias plantas se seca por cinco días a 1 05°F. La semilla seca se pulveriza y las proteínas se extraen en regulador como se describe arriba. Una comparación de actividad de fitasa en extractos de grano de 22 plantas se muestra en la figura 3. Cuatro plantas con los niveles más altos de actividad de fitasa de una selección inicial de 24 plantas se incluyen en el análisis. Otra formulación ejemplificativa de enzima de fitasa producida en semilla de maíz es como grano molido o agrietado, o harina. La harina que contiene fitasa puede agregarse directamente a alimentos animales como un complemento, o puede procesarse más, por ejemplo a una forma de pildora . El siguiente experimento compara la actividad de fitasa de un extracto líquido con harina. Veinte miligramos (mg) de harina se incuban en 200 µ? de regulador por 20 minutos a temperatura ambiente. Un conjunto de tubos se enfría entonces en hielo mientras el material insolu ble en el segundo conjunto se remueve por centrifugación a 4°C. La suspensión total del primer conjunto y la fracción de sobrenadante total del segundo conjunto de tubos se diluye entonces a un volumen final de 5 mi con regulador de extracción . Ácido fítico (1 0 mi 0.1 ) y acetato de sodio (1 0 mi 0.5 M , pH 5) se agrega y los tubos se incuban por 1 0 min a 37°C. La concentración - 1 1 8 -final de 40 mM de ácido fítico representa un incremento 1 0 veces sobre aquel utilizado en el análisis estándar descrito arriba. Las reacciones se enfrían en hielo e inmediatamente se extingue por la adición de un volumen igual (25 mi) de 1 5% TCA. El material insoluble se remueve por centrifugación (15 min , 4 °C, 3, 7000 rpm) y una porción de la fracción sobrenadante se utiliza para medir la concentración de fosfato como se describe arriba. La actividad de fitasa en extractos de harina y suspensiones de harina se compara con objeto de determinar la eficiencia del procedimiento de extracción regulador. La harina de grano total (20 mg) se incluye con 200 µ? de regulador de extracción y la actividad de fitasa total de la fracción de sobrenadante y suspensión de harina se determina . Los resultados se muestran en la figura 4. Las concentraciones de fosfato total en porciones equivalentes de las reacciones se muestran en la gráfica su perior. El evento 266B-2E es un control negativo que no contiene fitasa recombinante. Estas muestras se analizan para determinar los niveles de fosfato endógeno. Los eventos 305B-20A y 305A-24A son eventos de fitasa transgénica transformados con vectores pNOV4061 y pNOV4057, respectivamente. Las barras amarillas indican las concentraciones de fosfato en reacciones que contienen el extracto soluble y las barras azules indican los niveles de fosfato en reacciones que contienen la suspensión de harina. Para ambos transgénicos el fosfato adicional se libera en la presencia de harina transgénica. Las gráficas en la parte inferior de la figura 4 comparan la actividad de fitasa en los extractos solubles (amarillos) y suspensiones de - 1 1 9 -harina (azules) de los dos eventos. Para eventos 305B-20A (pNOV4061 ) y 305A-24A (pNOV4057) la actividad adicional de 50% y 80%, respectivamente, permaneció asociada con la harina . EJEMPLO 4 Expresión específica de endoesperma de fitasa Nov9X en semilla T2 Las orejas de las plantas T2 que contienen la construcción pNOV4057 se recolectan los días 24 y 26 después de polinación . Diez granos de cada planta se disecan en embriones, endoesperma y vainas. Diez endoespermas y diez embriones se combinan y pulverizan con un mortero y pestillo en 8 mi de agua destilada a temperatura ambiente. El material insoluble se remueve mediante centrifugación. La actividad específica de las fracciones sobrenadantes de muestras de embrión y endoesperma se determinan. Como se muestra en la figura 5, la actividad específica de fitasa en extractos de endoesperma transgénico excede 500. En contraste la actividad específica de extractos de embriones transgénicos fue menor a 10. Esta actividad casi detectable se debe probablemente a la contaminación de embriones con piezas pequeñas de endoesperma. Fitasa Nov9x es altamente enriquecida por extractos de agua de calentamiento de endoesperma T2 fresco Como se describe arriba , una formulación ejemplificativa de enzima de fitasa producida en semilla de maíz está en la forma de un extracto líquido. Aqu í, el enriquecimiento de fitasa Nov9x por degerminación, extracción de agua, calentamiento y centrifugación se describe. - 120 - Como se describe arriba, los granos se degerminan manualmente y el endoesperma se pulveriza en agua utilizando un mortero y pestillo. Los extractos de agua de endoesperma fresco se calientan a 60°C por 30 min, y el material insoluble se remueve por centrifugación . Las muestras calentadas y no calentadas se analizan por SDPS-PAGE (gel no mostrado). Una proteína de aproximadamente 45 kD (flecha), el tamaño predicho de fitasa Nov9X, se enriquece en las muestras calentadas. Esta proteína no está presente en los extractos de control y fue la proteína más abundante en los extractos transgénicos. Concluimos que esta proteína es fitasa Nov9X. La actividad de fitasa total fue la misma en muestras calentadas o no calentadas (figura 6A) que demuestra que la fitasa Nov9x producida en maíz es termoestable. La actividad específica de las muestras calentadas aumentó hasta dos veces (figura 6B). Estos resultados demuestran una estrategia posible para preparar una formulación líquida de fitasa Nov9x de semilla de algodón. El mismo planteamiento utilizando endoesperma seco o harina de grano completo también debe producir un extracto altamente enriquecido para la enzima recombinante. Producción y procesamiento de semilla de invernadero T2 para pruebas de alimentación de aves de corral Como se describe arriba, una formulación ejemplificativa de enzima de fitasa producida en semilla de maíz es un grano molido o agrietado, o harina. La harina que contiene fitasa puede agregarse directamente a alimentos animales como un complemento, o puede procesarse además, por ejemplo a una forma de pildora. - 121 - Las plantas de maíz se desarrollan en el invernadero de la semilla T1 de siete diferentes eventos transgénicos TO. Todas las plantas contenían una o más copias del gen Nov9X como se determina por análisis Taqnrtan . Estas plantas T1 son ya sea idénticas o se fertilizan con polen de una relacionada o de J HAF031 . Las orejas se recolectan a aproximadamente 30 d ías después de la polinación y se secan por 5 días a 105°F. La semilla T2 de diferentes orejas se agrupa para cada uno de los seis eventos transgénicos. Las semillas se muelen a temperatura ambiente en una cubierta utilizando Kitchen Mili (K-TEC) fijado para la trituración más fina. Los grupos de semilla varían de 66g a 398g . La harina se transfiere inmediatamente de la cámara de molino a bolsas de plástico selladas en una cubierta. La temperatura de la harina se mide inmediatamente después de la transferencia a las bolsas de plástico y no excede 41 °C. La harina se almacena a 4°C. La semilla de ma íz T2 derivada de seis diferentes eventos transgénicos TO se agrupan y muelen como se describe arriba . Una muestra de semilla de ma íz en crianza A1 88 también se procesa para utilizarse como un control negativo. El nivel de actividad de fitasa en harina de maíz se determina utilizando el procedimiento descrito arriba de la extracción de proteína de semilla seca y análisis de fitasa utilizando un formato de microplaca . Las extracciones de proteína se realizan utilizando muestras de harina por duplicado de aproximaamente 1 00 mg. Los seis eventos transgénicos seleccionados para incremento de semilla se listan en la Tabla 2. Se derivan de plásmidos pNOV4057 y pNOV4061 , que codifican las formas retenidas de ER y objetivo de - 1 22 - apoplasto de fitasa Nov9X, respectivamente. La fracción de semilla derivada de plantas cruzadas o similares varía considerablemente entre grupos de evento. También la mayoría de las plantas T1 no fueron homocigoticas para Nov9X. Estos factores hacen posible correlacionar las producciones de enzima con el número de copia en la semilla T2 final. El nivel de actividad de fitasa extraíble medida en unidades por kg de harina varió de 325,000 a 1 ,300,000 (Tabla 2). La tabla 2 muestra la producción de actividad de fitasa extraíble por regulador en harina de semilla de invernadero T2. A1 88 es una crianza no transgénica. Tabla 2 El maíz molido a temperatu ra ambiente no resulta en actividad de fitasa reducida. La semilla agrupada derivada del evento 305A-24A se divide en la mitad antes del molido. Un grupo se muele a temperatura ambiente. La temperatura de la harina de este grupo inmediatamente después de la transferencia fue 38°C . El otro grupo se enfría , junto con el molino, en un ambiente frío de 4°C por 45 minutos. Este grupo se muele entonces en el ambiente frío. El molino sellado se mueven entonces a la cubierta a temperatura ambiente y la harina se transfiere a una bolsa de plástico. La temperatura de esta harina molida fría se mide - 123 - inmediatamente después de que la transferencia fue 24°C. Como se muestra en la fila de abajo las dos filas de la tabla 2, semillas enfriadas de molienda en el frío no mejoran las producciones de actividad de fitasa extraíble. La producción de fitasa de semillas derivadas del evento 305A- 24A que se muelen a temperatura ambiente (RT) fue 1 ,283,91 0 unidades/kg comparadas con 1 , 306, 934 unidades/kg para semillas frías del mismo grupo molido en frío. La tabla 3 muestra la harina total y las producciones de fitasa cuando los eventos separados se agrupan por vector. Estos datos son las sumas de los datos específicos de evento en la tabla 2. Las producciones totales de actividad de fitasa extraíble para ambas formas retenidas de ER y objetivo de apopasto de la enzima fueron mayores a 800,000 unidades totales de menos de 1 kg de harina. La harina descrita aquí es un ejemplo de una formulación posible de fitasa Nov9X para utilizarse como un aditivo alimenticio. La tabla 3 proporciona las producciones de fitasa de semilla de invernadero T2 agrupada para apoplasto objetivo y formas retenidas ER. Tabla 3 EJEMPLO 5 Actividad de fitasa en semillas de crianza de maíz Muestras de harina (1 gramo) de varias líneas que contienen eventos gula se extraen en 50 mM Tris-HCI (pH 8.0), 100 mM NaCI, 2 mM para 1 hora a temperatura ambiente con agitación . El volumen de - 1 24 -extracción fue 1 00 mi. Los extractos se clarifican por centrifugación y diluyen con regulador de acetato de sodio (pH 5.5). la actividad de fitasa se mide a pH 5.5 y 37C utilizando el método de Engelen et al., (2001 ) con modificaciones. Los análisis se realizan en microplacas a un volumen de reacción final de 1 mi. Los resultados se establecen en la figura 7. EJEMPLO 6 Pruebas de alimentación Una formulación de fitasa de semilla de maíz es una harina o masa de maíz. La figura 8A, 8B y 8C resu men los resultados de tres pruebas de alimentación en los cuales el alimento de pollo se complementa con fitasa Nov9X formulada como harina de maíz. Las muestras de semilla de maíz transgénico que contiene actividad de fitasa extra íble se muelen utilizando un molino de disco o martillo y se agregan directamente a las muestras de alimentos y mezclan completamente. Los alimentos tratados se utilizan ya sea directamente como alimento de malla (prueba I) o se acond iciona a vapor y forma en pildoras (pruebas I I y I I I). En todos los casos la harina de maíz de fitasa se agrega a proporciones de alimentación que contienen niveles reducidos de fosfato (control negativo). Esto permitió la comparación de dieta baja en fosfato (control negativo), dieta rica en fosfato (control positivo), y dietas bajas en fosfato complementadas con fitasa formulada como ma íz molido. Los resultados en la figura 8 (A, B y C) se diagraman como índices de conversión de alimentos (FCRs). FCR se refiere a la cantidad de alimento consumido dividido por la ganancia de peso neto del pollo. Una proporción inferior indica que un pollo ganó más peso por unidad de - 1 25 -alimento consumido. Una proporción inferior indica que un pollo utiliza más eficientemente los alimentos que lo que los consume. Las dietas de aves de corral estándar se utilizan y dos niveles de fosfato inorgánico se incorporan en las dietas, 0.450% (control positivo) y 0.225 (control negativo y dietas complementadas con enzima). El nivel 0.45% se utiliza comúnmente en dietas de aves de corral comerciales. Las plumas replicadas de 8 pollos para cada dieta se desarrollan hasta los 21 días de edad, y los pesos finales determinados al extraer el peso de los pollitos de 1 día. Los registros mantienen la cantidad de alimento consumido por cada pluma de pollos, y un consumo de alimento promedio se determina. La figura 8A muestra resultados de una prueba en los cuales los pollos se alimentan por dietas de malla. Para esta prueba, la fitasa Nov9X se formula al triturar los granos de maíz transgénico completos en harina. Los granos transgénicos se recolectan de plantas que contienen vectores pNOV4057 (apoplasto-fitasa objetivo) o pNOV4061 (fitasa retenida ER) (tabla 2). La complementación de dietas bajas en fosfato con fitasa Nov9X como harina de maíz mejoró FCR y restauró el desempeño a niveles iguales a o mejores que el control positivo. Estos resultados demuestran que la fitasa Nov9X formulada como harina de maíz mejora FCR en alimentos para pollos de una dieta baja en fosfato. La figura 8B muestra los resultados de una prueba en la cual los pollos se alimenta con alimento en pildora. Para esta prueba fitasa Nov9X formulada como harina de maíz se agrega a alimento de pollo bajo en fosfato antes del acondicionamiento a vapor y formación de pildoras. Como en la figura 8A, la forma retenida ER y objetivo de apoplasto de - 1 26 -fitasa Nov9x se prueban . La complementación de fitasa restauró el desempeño a niveles ¡guales o mejores que los observados para el control positivo. Estos resultados demuestran que la fitasa Nov9x que se sintetiza directamente en semilla de maíz y formula como harina de maíz mejora FCR en alimentos para pollo de una dieta baja en fosfato. La figura 8C muestra los resultados de una prueba en la cual la forma objetivo de apoplasto de fitasa Nov9x (codificada por el vector pNOV4057) se formula como una harina de ma íz de molienda fina, una molinda media, o una harina de maíz de molienda gruesa . El material de molienda gruesa consiste predominantemente de partículas >2000 micrones; material de molienda medio fue predominantemente en el rango de tamaño de 500-200 micrones, y la harina de trituración fina fue <500 micrones. Las tres formulaciones se agregan a proporcionas bajas en fosfato para acondicionamiento de vapor y formación de pildoras como en la figura 8B. Las proporciones de conversión de alimentación se mejoran en todas las dosis probadas para tres formulaciones. Y todas las tres formulaciones se realizan en el control positivo en las dosis probadas. Estos resultados demuestran la eficacia en pollos de la formulación preferida de fitasa Nov9X como semilla de maíz agrietada. - 127 - Referencias Abelson, P. H., Science. 283: 2015 (1999). An. et al.. EMBO J.. 4:277 (1985). Aoyama T. et al., N-H Plant Journal, 11 :605 (1997). Arnold et al,, Chem. Ene. Sci..51 :5091 (1996). Bailas et al., Nucleic Acids Res.. G7:7891 (1989). Bansal et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 89:3654 (1992).

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Todas las publicaciones citadas, patentes y solicitudes de patente se incorporan en la presente para referencia . Aunque en la especificación anterior esta invención se ha descrito en relación a ciertas modalidades preferidas de la misma , y muchos detalles se ha n establecido - 134 -para propósitos de ilustración , será aparente para aquellos expertos en la materia que la invención es susceptible de modalidades adicionales y que ciertos detalles descritos en la presente pueden variarse considerablemente sin apartarse de los principios básicos de la invención .

Claims

- 1 35 - REIVINDICACIONES 1 . Un método para preparar una fitasa termotolerante, caracterizado porque comprende: expresar en una célula de planta una cinta de expresión q ue comprende un promotor operablemente enlazado a una molécula de ácido nucleico que codifica una fitasa termotolerante que retiene al menos 40% de la actividad después de 30 minutos a 60°C y tiene una actividad específica de más de 200 U/mg a pH 4.5 y 37°C.
2. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque comprende el aislamiento de la fitasa termotolerante.
3. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque la fitasa termotolerante comprende la SEQ I D NO: 1 . 4. El método según la reivind icación 1 , caracterizado porque la fitasa termotolerante tiene una actividad específica de más de 400 U/mg a pH
4.5 y 37°C.
5. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque la fitasa termotolerante tiene una actividad específica de más de 600 U/mg a pH 4.5 y 37°C.
6. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque la fitasa termotolerante tiene u na actividad específica de más de 800 U/mg a pH 4.5 y 37°C.
7. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque el promotor es un promotor de ubiquitina.
8. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque el promotor es un promotor específico de tejido de planta.
9. El método seg ún la reivindicación 8, caracterizado porque el promotor es un promotor específico de endoesperma.
10. El método según la reivindicación 9, caracterizado porque el promotor especifico de endoesperma es un promotor de ?-zeína de maíz o un promotor de fosforilasa de ADP-glucosa de maíz. 1 1 . El método según la reivindicación 10, caracterizado porque el promotor comprende SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:9. 12. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque el promotor es un promotor específico de embrión de planta. 1 3. El método según la reivindicación 1 2 , caracterizado porque el promotor comprende un promotor de globulina 1 de maíz. 14. El método según la reivindicación 1 2 , caracterizado porque el promotor comprende un promotor de oleosina KD 1 8 de ma íz. 15. El método seg ún la reivindicación 4, caracterizado porque la célula de planta es una célula de maíz, trigo o semilla de soya. 1 6. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido de fusión que comprende la fitasa termotolerante . 1 7. El método según la reivindicación 16, caracterizado porque el polipéptido de fusión comprende una secuencia de señal q ue se enlaza operativamente a la fitasa . 1 8. El método según la reivindicación 1 7, caracterizado porque la secuencia de señal tiene como objetivo la fitasa para un amiloplasto, retículo endoplásmico, apoplasto, o gránulo de almidón en las células de una planta. - 1 37 - 1 9. El método según la reivindicación 1 7, caracterizado porque la secuencia de señal es una secuencia de señal de terminal N de cerosa o secuencia de señal de terminal N de y-zeína. 20. El método según la reivindicación 1 7 , caracterizado porque la secuencia de señal es un dominio de unión de almidón. 21 . El método según la reivindicación 20, caracterizado porque el dominio de unión de a lmidón es un dominio encapsulante de almidón ceroso que se enlaza operativamente al término C de la fitasa termotolerante. 22. El método según la reivindicación 1 7 , caracterizado porque el polipéptido de fusión comprende S EKDE L operativamente enlazada al término C de la fitasa termotolerante. 23. El método seg ún la reivindicación 1 , caracterizado porque la fitasa termotolerante tiene una vida media de más de 25 minutos a un pH mayor a 2.0 y menor a 4.0. 24. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque la fitasa termotolerante se glicosila. 25. Un método para la preparación de alimentos animales, caracterizado porque comprende: a) proporcionar una mezcla que comprende un componente alimenticio y una preparación que comprende la fitasa termotolerante según la reivindicación 1 o 2; y b) tratar la mezcla bajo condiciones de temperatura y humedad que hidrolizan el ácido fítico presente en dicha mezcla a fin de producir un alimento animal. - 138 - 26. Alimentos para animales preparados mediante el método según la reivindicación 25, caracterizados porque dichos alimentos animales tienen un contenido de ácido fítico reducido con relación al contenido de ácido fítico que estarían presentes en alimentos hechos con el componente sin tratar. 27. Un método para la preparación de alimentos animales, caracterizado porque comprende: a) proporcionar una mezcla que comprende componentes alimenticios animales y una preparación de fitasa que comprende la fitasa termotolerante según la reivindicación 1 o 2; y b) calentar la mezcla a una temperatura mayor de 50°C a fin de producir una mezcla alimenticia animal termo-tratada. 28. El método según la reivindicación 27, caracterizado porque la preparación de fitasa es una mezcla líquida. 29. El método según la reivindicación 27, caracterizado porque la preparación de fitasa es una mezcla sólida. 30. El método según la reivindicación 27, caracterizado porque la preparación es material de planta transgénica. 31 . El método según la reivindicación 30, caracterizado porque el material transgénico es grano de maíz transgénico, maíz agrietado, harina de maíz, o un extracto de enzima preparado de maíz. 32. El método según la reivindicación 27, caracterizado porque la preparación de fitasa comprende además al menos una vitamina, mineral, una enzima diferente a una fitasa termotolerante, un ácido orgánico, probiótico (bacteriano) o aceite esencial o un co-producto. o e - 139 - 33. El método según la reivindicación 27, caracterizado porque la preparación de fitasa comprende menos de aproximadamente 1 % de fosfato inorgánico. 34. El método según la reivindicación 27, caracterizado porque la mezcla en a) tiene menos de 0.45% de fosfato inorgánico. 35. Una mezcla alimenticia animal termo-tratada, producida mediante el método según la reivindicación 27. 36. El método según la reivindicación 27, caracterizado porque comprende además la extrusión de la mezcla termo-tratada a través de una trituradora de gránulos a fin de producir alimentos animales granulados. 37. Los alimentos animales granulados, producidos mediante el método según la reivindicación 36. 38. La composición alimenticia animal caracterizada porque comprende una fitasa según la reivindicación 1 o 2. 39. La composición alimenticia animal según la reivindicación 38, caracterizada porque la fitasa tiene una actividad específica de más de 400 U/mg a pH 4.5 y 37°C. 40. La composición alimenticia animal según la reivindicación 38, caracterizada porque la fitasa tiene una actividad específica de más de 600 U/mg a pH 4.5 y 37°C. 41 . La composición alimenticia animal según la reivindicación 38, caracterizada porque la fitasa tiene una actividad específica de más de 800 U/mg a un pH 4.5 y 37°C. 42. La composición alimenticia an imal según la - 140 -reivindicación 38, caracterizada porque la fitasa termotolerante tiene una vida media en fluido gástrico simulado de más de 25 minutos a un pH mayor de 2.0 y menor de 4.0. 43. Un aditivo alimenticio de enzima , caracterizado porque comprende la fitasa termotolerante según la reivindicación 1 ó 2. 44. El aditivo alimenticio de enzima según la reivindicación 43, caracterizado porque la fitasa termotolerante tiene una actividad específica de más de 400 U/mg a un pH 4.5 y 37°C. 45. El aditivo alimenticio de enzima según la reivindicación 43, caracterizado porque la fitasa termotolerante tiene una actividad específica mayor de 600 U/mg a pH 4.5 y 37°C. 46. El aditivo alimenticio de enzima según la reivindicación 43, caracterizado porque la fitasa termotolerante tiene una actividad específica de más de 800 U/mg a pH 4.5 y 37°C. 47. El aditivo alimenticio de enzima según la reivindicación 43, caracterizado porque la fitasa termotolerante tiene u na vida media de más de 25 minutos a un pH mayor de 2.0 y menor de 4.0. 48. Un método para la preparación de una fitasa termotolerante que contiene una composición para la formulación alimenticia , que comprende: a) combinar una solución l íquida que comprende la fitasa termotolerante según la reivindicación 1 o 2 y harina de grano molido de soya a fin de producir una mezcla; y b) liofilizar la mezcla a fin de producir u na composición liofilizada . - 141 - 49. El método según la reivindicación 48, caracterizado porque comprende además la combinación de la composición liofilizada con otros componentes alimenticios a fin de producir una mezcla adicional. 50. El método según la reivindicación 48, caracterizado porque la fitasa termotoierante tiene una actividad específica de más de 200 U/mg a pH 4.5 y 37°C. 51 . El método según la reivindicación 48, caracterizado porque la fitasa termotoierante tiene una vida media de más de 25 min utos a un pH mayor de 2.0 y menos de 4.0. 52. Una composición liofilizada, preparada mediante el método según la reivindicación 48. 53. Un método para dismin u ir el índice de conversión de alimentos e incrementar la ganancia de peso de un animal, caracterizado porque comprende : alimentar a un animal con un alimento que comprende la fitasa termotoierante según la reivindicación 1 o 2 , en una cantidad para disminuir el índice de conversión de alimentos en el animal . 54. Un método para mejorar el reducir los índices de conversión de alimentos o incrementar la ganancia de peso en animales alimentados con dietas de fosfato inorgánico a niveles por debajo de 0.45% , caracterizado porque comprende: alimentar a un animal con un alimento que comprende fosfato inorgánico por debajo de 0.45% y la fitasa termoestable según la reivindicación 1 o 2 , en una cantidad eficaz para mejorar el índice de conversión de alimentos o la ganancia de peso en el animal . - 142 - 55. Un método para reducir los requisitos dietéticos del fósforo en un animal, caracterizado porq ue comprende: alimentar a un animal con alimentos que comprenden la fitasa termotolerante según la reivindicación 1 o 2 , en una cantidad para incrementar la biodisponibilidad del fósforo en los alimentos para el animal. 56. Un método para reducir los requisitos dietéticos del fósforo en un animal, caracterizado porque comprende: alimentar a un animal con alimentos que comprenden la fitasa termotolerante según la reivindicación 1 o 2. 57. Un método para mejorar la utilización del fósforo presente en alimentos para un an imal , caracterizado porque comprende: alimentar al animal con alimentos que comprenden la fitasa termotolerante según la reivindicación 1 o 2 en una cantidad para incrementar la biodisponibilidad del fósforo en los alimentos para el animal. 58. Un método para mejorar la utilización del fósforo orgán ico proveniente de fuentes de fósforo orgánico en alimentos para un animal , caracterizado porque comprende: alimentar al animal con una alimentación que com prende la fitasa termotolerante según la reivindicación 1 o 2, en una cantidad eficaz para incrementar la biodisponibilidad de fósforo inorgánico en la alimentación para el animal. 59. Un método para disminuir los niveles de fosfato en el excremento de un animal, caracterizado porque comprende: - 143 - alimentar al animal con una alimentación que comprende la fitasa termotolerante según la reivindicación 1 o 2, en una cantidad para disminuir los niveles de fosfato en el excremento del animal. 60. Un método para disminuir los niveles de fosfato en el excremento de un animal, caracterizado porque comprende: alimentar al animal con una alimentación que comprende menos de 0.45% de fósforo inorgánico y la fitasa termotolerante según la reivindicación 1 o 2, en una cantidad para disminuir los niveles de fosfato en el excremento del animal. 61 . El método segú n cualquiera de las reivindicaciones 53 a 60, caracterizado porque la alimentación es alimento para aves de corral . 62. El método según cualq uiera de las reivindicaciones 53 a 60, caracterizado porque la alimentación es alimento para puercos. 63. El método según cualquiera de las reivindicaciones 53 a 60, caracterizado porque la fitasa termotolerante comprende la SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO:4 o S EQ ID NO:5. 64. El método según cualquiera de las reivindicaciones 53 a 60, caracterizado porque la fitasa termotolerante tiene una vida media de aproximadamente 30 minutos en el tracto digestivo del animal. 65. Un método para mejorar el procesamiento de grano que comprende agregar la fitasa termotolerante de la reivindicación 1 o 2 durante el procesamiento de dicho grano. 66. El método según la reivindicación 65, caracterizado porque el grano es almidón, trigo, semilla de soya, cañóla o caña de azúcar. - 144 - 67. Un método para mejorar el valor nutritivo de un producto de grano o un método para procesar grano, caracterizado porque «rende: agregar la fitasa termotolerante de la reivindicación 1 o 2 al producto de grano durante el proceso en una cantidad efectiva para mejorar el valor nutritivo de la alimentación . 68. El método según la reivindicación 67 caracterizado porque el grano es maíz y el método de procesamiento de grano se tritura en húmedo y los productos del procesamiento son alimentación de gluten de maíz, gluten de maíz y almidón de maíz. 69. El método según la reivindicación 67 caracterizado porque el grano es maíz, trigo, semilla de soya, cañóla y caña de azúcar. 70. El método según la reivindicación 67 caracterizado porque el grano una semilla oleaginosa tal como semilla de soya o cañóla o naba de semilla oleaginosa y el producto de grano procesado es la masa de semilla oleaginosa. 71 . Un método para mejorar el valor nutritivo de la alimentación para animal, caracterizado porque comprende agregar la fitasa termotolerante según la reivindicación 1 o 2 durante la preparación de dicho alimento para animal en una cantidad eficaz para mejorar el valor nutritivo de la alimentación. 72. Un método para mejorar el valor nutritivo de la alimentación para humano, caracterizado porque comprende agregar la fitasa termotolerante según la reivindicación 1 o 2 durante la preparación de dicho alimento para humano en una cantidad eficaz para mejorar el - 145 -valor nutritivo de la alimentación. 73. Una composición alimenticia, caracterizada porque comprende la fitasa termotolerante según la reivindicación 1 o 2. 74. Un método para preparar alimentos humanos, caracterizado porque comprende: a) proporcionar una mezcla de un componentes alimenticio y la fitasa termotolerante según la reivindicación 1 o 2; y b) tratar la mezcla bajo condiciones de temperatura y humedad que hidrolizan el ácido fítico presente en dicha mezcla a fin de producir alimento tratado para humano. 75. Alimento tratado para humano, preparado mediante el método según la reivindicación 74, caracterizado porque dicho alimento humano tiene un contenido reducido de ácido fítico con relación al contenido de ácido fítico en alimento humano correspondiente que no se trata. 76. Un aditivo alimenticio caracterizado porque comprende la fitasa termotolerante según la reivindicación 1 o 2. 77. El aditivo alimenticio según la reivindicación 76, caracterizado porque la fitasa termotolerante tiene una actividad específica de más de 400 U/mg a pH 4.5 y 37°C. 78. El aditivo alimenticio según la reivindicación 76, caracterizado porque la fitasa termotolerante tiene una actividad específica de más de 600 U/mg a pH 4.5 y 37°C. 79. El aditivo alimenticio según la reivindicación 76, caracterizado porque la fitasa termotolerante tiene una actividad específica - 146 -de más de 800 U/mg a pH 4.5 y 37°C. 80. El aditivo alimenticio según la reivindicación 76, caracterizado porque la fitasa termotolerante tiene una vida media de más de 25 minutos a un pH mayor de 2.0 y menos de 4.0. 81 . Un método para preparar una fitasa termotolerante que contiene composición para la formulación de alimentos, caracterizado porque comprende: a) combinar una solución líquida que comprende la fitasa termotolerante de la reivindicación 1 o 2 y harina de grano molido para producir una mezcla; y b) liofilizar la mezcla para producir una composición liofilizada. 82. El método según la reivindicación 81 , caracterizado porque comprende además combinar la composición liofilizada con otros componentes alimenticios para producir una mezcla adicional. 83. El método según la reivindicación 81 , caracterizado porque la fitasa termotolerante tiene una actividad específica de más de 800 U/mg a pH 4.5 y 37°C. 84. El método según la reivindicación 81 , caracterizado porque la fitasa termotolerante tiene una vida media de más de 25 minutos y un pH mayor de 2.0 y menor de 4.0. 85. Una composición liofilizada preparada mediante el método según la reivindicación 81 . 86. Un gránulo alimenticio que comprende la fitasa termotolerante según la reivindicación 1 . - 147 - 87. Un granulo alimenticio que comprende la fitasa termotolerante según la reivindicación 2. 88. Un método para preparar una planta transformada que expresa una fitasa termotolernte que comprende : a) introducir en una célula de planta una cinta de expresión que comprende un promotor operativamente enlazado a una molécula de ácido nucleico que codifica una fitasa termotolerante que retiene al menos 40% de actividad después de 30 minutos a 60°C y tiene una actividad específica de más de 200 U/mg a pH 4.5 y 37°C para prod ucir una célula de planta transformada; b) obtener una planta transgénica de la célula de planta transformada, tal planta expresa la fitasa termotolerante en las célu las de la planta. 89. El método según la reivindicación 88, caracterizado porque la célula de planta es una célula dicot. 90. El método según la reivindicación 88, ca racterizado porque la célula de planta es una célula monocot. 91 . El método según la reivindicación 88, caracterizado porque la célula de planta es una célula de cereal . 92. El método según la reivindicación 88, caracterizado porque la célula de planta es una célula de maíz. 93. El método según la reivindicación 88, caracterizado porque la célula de planta es una célula de semilla de soya. 94. El método según la reivindicación 88, caracterizado porque la fitasa termotolerante comprende SEQ ID NO: 1 - 148 - 95. El método según cualquiera de las reivindicaciones 88 a 94, caracterizado porque la fitasa termotolera nte tiene una actividad específica de más de 400 U/mg a pH 4.5 y 37°C . 96. El método según cualquiera de las reivind icaciones 88 a 94, caracterizado porque la fitasa termotolerante tiene una actividad específica de más de 600 U/mg a pH 4.5 y 37°C. 97. El método según cualquiera de las reivindicaciones 88 a 94, caracterizado porque la fitasa termotolerante tiene una actividad específica de más de 800 U/mg a pH 4.5 y 37°C. 98. Una planta transformada que comprende una cinta de expresión que comprende un promotor operativamente enlazado a una molécula de ácido nucleico que codifica una fitasa termotolerante que retiene al menos 40% de actividad después de 30 minutos a 60°C y tiene una actividad específica de más de 200 U/mg a pH 4.5 y 37°C. 99. El método según la reivindicación 98 , caracterizado porque la fitasa termotolerante comprende SEQ ID NO: 1 . 1 00. La planta según la reivindicación 98 que es una planta dicto. 1 01 . La planta según la reivindicación 1 00 que es una planta de semilla de soya . 102. La planta según la reivindicación 98 que es una planta monocot. 103. La planta segú n la reivindicación 1 02 que es una planta de trigo o maíz. 104. La planta según la reivindicación 98, caracterizada - 149 -porque la fitasa termotolerante se expresa en las semillas de la planta . 105. La planta según la reivindicación 98, caracterizada porque el promotor es un promotor específico de embrión . 1 06. La planta según la reivindicación 1 05, caracterizada porque el promotor específico de embrión es un promotor de globulina 1 de maíz o un promotor de oleosina KD 18 de maíz. 107. La planta según la reivindicación 98, caracterizada porque el promotor es un promotor específico de endoesperma. 1 08. La planta según la reivindicación 1 07 , caracterizada porque el promotor específico de endoesperma es un promotor de fosforilasa de glucosa-ADP o un promotor de ?-zeína de ma íz. 1 09. La planta según la reivindicación 98, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido de fusión que comprende la fitasa termotolerante. 1 1 0. La planta seg ún la reivindicación 1 09 , caracterizada porque el polipéptido de fusión comprende una secuencia de señal de terminal N de ?-zeína operativamente enlazada a la fitasa termotolerante. 1 1 . La planta según la reivindicación 1 09, caracterizada porque el polipéptido de fusión comprende SEKDEL operativamente enlazada al término C de la fitasa termotolerante. 1 1 2. La planta según la reivindicación 1 09 , caracterizada porque el polipéptido de fusión comprende u n péptido objetivo de amiloplasto ceroso de terminal N operativamente enlazado a la fitasa termotolerante . 1 1 3. La planta según la reivindicación 109, caracterizada - 150 -porque el polipéptido de fusión comprende un dominio encapsulante de almidón ceroso operativamente enlazado al término C de la fitasa termotolerante. 1 14. La planta según la reivindicación 98, caracterizada porque la fitasa termotolerante tiene una actividad específica de más de 400 U/mg a pH 4.5 y 37°C. 1 1 5. La planta según la reivindicación 98, caracterizada porque la fitasa termotolerante tiene una actividad específica de más de 600 U/mg a pH 4.5 y 37°C. 1 16. La planta según la reivindicación 98, caracterizada porque la fitasa termotolerante tiene una actividad específica de más de 800 U/mg a pH 4.5 y 37°C. 1 17. Un producto de la planta según la reivindicación 98 que comprende la fitasa termotolerante. 1 18. El producto según la reivindicación 1 17 que es una semilla, grano o fruta. 1 19. El producto según la reivindicación 1 17 que es una planta. 120. El producto según la reivindicación 1 1 9, caracterizado porque la planta es una planta híbrida. 121 . El producto según la reivindicación 1 20, caracterizado porque la planta es una planta de crianza. 122. El producto de procesamiento de grano según la reivindicación 65 que comprende la fitasa termotolerante de la reivindicación 1 o 2. - 151 - 123. El producto de procesamiento de grano según la reivindicación 67 que comprende la fitasa termotolerante de la reivindicación 1 o 2. 124. El producto de procesamiento de grano según la reivindicación 68 que comprende la fitasa termotolerante de la reivindicación 1 o 2. 125. Una planta transformada producida por la reivindicación 1 o 2. 126. El método según la reivindicación 125, caracterizado porque la planta transformada es maíz, trigo o semilla de soya. 127. El método según la reivindicación 48, caracterizado porque la fitasa termotolerante tiene una actividad específica de más de 400 U/mg a pH 4.5 y 37°C. 128. El método según la reivindicación 48, caracterizado porque la fitasa termotolerante tiene una actividad específica de más de 600 U/mg a pH 4.5 y 37°C. 1 29. El método según la reivindicación 48, caracterizado porque la fitasa termotolerante tiene una actividad específica de más de 800 U/mg a pH 4.5 y 37°C. - 1 52 - RESUMEN La invención proporciona un polinucleótido de fitasa sintético que se optimiza para expresión en plantas y que se codifica en una fitasa termotoierante, así como también enzima de fitasa termotoierante aislada. También se proporcionan productos alimenticios o comida que comprenden una fitasa termotoierante, y plantas transgénicas que expresan la fitasa termotoierante. Además se proporcionan métodos para hacer y utilizar fitasas termotolerantes, por ejemplo, un método para utilizar una fitasa termotoierante en procesamiento de alimentos y comida .