ES2758563T3 - Fusión de moléculas bioactivas - Google Patents

Abstract

Proteína de fusión que comprende un polipéptido de unión a la superficie intestinal unido a una enzima, donde el polipéptido de unión a la superficie intestinal es un dominio de una proteína de unión a moco consistente en el dominio de unión a mucina de Lactobacillus reuteri 1063, y donde la enzima se selecciona del grupo que consiste en fitasa, xilanasa, galactanasa, alfa-galactosidasa, proteasa, fosfolipasa, beta-glucuronidasa, fosfatasa alcalina, amilasa, beta-glucanasa y celusala; o donde el polipéptido de unión a la superficie intestinal es un dominio de una proteína de unión a moco seleccionado del grupo que consiste en el dominio de unión a mucina de Lactobacilus reuteri 1063, el dominio de lectina semiliar a conA de adhesión específica a manosa Msa de Lactobacillus plantarum y el dominio de adhesión SpaB de lactobacillus rhamnosus GG y donde la enzima es una fitasa.

Description

DESCRIPCIÓN

Fusión de moléculas bioactivas

[0001] La presente invención se refiere a una vía innovadora de construir polipéptidos y enzimas para aumentar el tiempo de permanencia en el tracto gastrointestinal de animales en función de las características adaptativas de microorganismos que tienen propiedades de adhesión como las que se comentan en la presente a continuación.

[0002] En particular, la presente invención se refiere a un tipo nuevo de polipéptidos y enzimas, por ejemplo, enzimas alimentarias, que muestran un rendimiento mejorado en alimento para animales en comparación con un polipéptido o enzima de referencia.

Antecedentes de la invención

[0003] Los animales de granja, como por ejemplo cerdos y aves, son ambos animales que se suplementan rutinariamente con enzimas alimentarias para aumentar la utilización del alimento.

[0004] Las fitasas, por ejemplo, son enzimas alimentarias comúnmente usadas para animales monogástricos para mejorar el valor nutritivo del alimento para animales y para reducir la suplementación de fósforo en el pienso reduciendo así la contaminación ambiental en áreas con producción de ganado intensiva.

[0005] En cuanto a cualquier enzima alimentaria, la cantidad de producto generado (aquí el fósforo) es una función de la concentración de sustrato (aquí el fitato), la actividad enzimática y la cantidad de tiempo dado a la enzima para catalizar la reacción, sigue existiendo la necesidad de optimizar la utilización del alimento y la actividad enzimática modificando la formulación de enzima o desarrollando nuevos tipos de enzimas.

[0006] Applied and Environmental Microbiology, 2010, 76: 17, 5926-5933 se refiere a fitasas que se han fusionado sobre proteínas portadoras que residen en el interior o el exterior de esporas de Bacillus. Vaccine, 2006, 24, 4830-4837 divulga la proteína de fusión Cna-FnBP que está diseñada para unirse a S. aureus y evitar que las bacterias sean virulentas. The EMBO Journal, 1985, 4: 4, 1075-1080 divulga una proteína de fusión ProtA-beta galactosidasa y su unión a una columna de afinidad de IgG.

Breve descripción de los antecedentes técnicos

[0007] Los miembros del género Lactobacillus, pero también otras bacterias, en particular los miembros del género Bacillus, se encuentran a menudo en el tracto gastrointestinal de las aves y los mamíferos. Para que las bacterias sean capaces de colonizar este entorno de flujo abierto, la adhesión a la mucosa se considera un prerrequisito. Las células epiteliales del intestino están cubiertas por una capa protectora de moco, que es una mezcla compleja de glicoproteínas y glicolípidos donde la glicoproteína grande mucina es el componente principal. Las bacterias que colonizan la mucosa se pueden encontrar tanto en la capa mucosa como adhiriéndose a las células epiteliales. En la mayoría de los casos, se ha informado de que la adhesión está mediada por proteínas, pero también se ha descrito que fracciones de sacáridos en la superficie celular de lactobacilos interactúan con componentes de la mucosa. Resumiendo el presente conocimiento, se sabe que la capacidad de las cepas microbianas para adherirse a componentes gastrointestinales se basa en su afinidad con el moco gastrointestinal o su componente principal, la mucina, y con colágenos que están retenidos en el moco por eliminación de los enterocitos o son accesibles cuando el epitelio está dañado. También se sabe que las bacterias intestinales naturales (incluidos miembros del género Baci$$us) que son capaces de formar biopelículas y de adherirse a células epiteliales, persisten en el intestino significativamente más tiempo que las bacterias no capaces de generar biopelículas. Por lo tanto, la matriz de biopelícula extracelular autoproducida juega también un papel esencial en la capacidad de las cepas microbianas para adherirse a componentes gastrointestinales

[0008] Las proteínas de unión a moco se han caracterizado principalmente en lactobacilos. Se sabe que un gen de Lactobacillis reuteri 1063 codifica una proteína de la superficie celular designada Mub, que se adhiere a componentes del moco. Mub es una proteína multidominio grande (357 kDa) unida de manera covalente a la superficie celular como dominio de unión a mucina (MucBP, Pfam06458).

[0009] Los dominios de unión a colágeno se pueden dividir en dos categorías:

- proteínas de tipo Cna, cuyo arquetipo es la proteína A de Staphylococcus aureus (Pfam05738), median la adhesión bacteriana a colágenos

- dominios CBD, que son parte de las colagenasas clostridiales.

[0010] TasA es un componente proteico principal de la biopelícula producida por miembros del género Bacillus. TasA se ha detectado en asociación tanto con la EPS (sustancia polimérica extracelular) como con esporas, y se piensa que es requerido para la adhesión a la superficie.

Descripción de la invención

[0011] En particular, la presente invención se refiere a una proteína de fusión que comprende un polipéptido de unión a la superficie intestinal unido a una enzima, donde el polipéptido de unión a la superficie intestinal es un dominio de una proteína de unión a moco seleccionada del grupo que consiste en el dominio de unión a mucina de Lactobacillus reuteri 1063, el dominio de lectina similar a conA de adhesión específica a manosa Msa de Lactobacillus plantarum y el dominio de adhesión SpaB de Lactobacillus rhamnosus GG y donde la enzima se selecciona del grupo que consiste en fitasa, xilanasa, galactanasa, alfa-galactosidasa, proteasa, fosfolipasa, beta-glucuronidasa, fosfatasa alcalina, amilasa, beta-glucanasa y celulasa. La invención también se refiere al ADN que codifica tal proteína de fusión consistente en una enzima y un segmento de polipéptido de unión a la superficie intestinal, construcciones de ácido nucleico, vectores y células huésped que comprenden el ADN, así como métodos para su producción, así como su uso, por ejemplo, en alimento para animales y aditivos alimentarios para animales.

[0012] La invención también se refiere a un método de promoción de la digestibilidad del alimento en un animal que comprende administrar al animal una proteína de fusión según la invención. La invención proporciona también una composición de alimento o una premezcla que comprende tal proteína de fusión.

[0013] Las proteínas de fusión, en particular las enzimas de fusión que comprenden un segmento de polipéptido de unión a la superficie intestinal unido a la enzima, muestran un tiempo de permanencia aumentado en el intestino, lo que lleva a una mayor cantidad de tiempo dado a la enzima para catalizar la reacción correspondiente, que en el caso de las enzimas alimentarias lleva finalmente a la utilización mejorada del alimento.

[0014] En base a la homología de proteínas, los inventores han identificado en el genoma de la cepa candidata probiótica Bacillus subtilis BSP1 una proteína de unión a colágeno que está implicada en el fenómeno de adhesión anteriormente mencionado. Esta proteína es el primer ejemplo de un segmento de polipéptido de unión a la superficie intestinal descrito más adelante. Otro segmento de polipéptido de unión a la superficie intestinal que se puede usar es el dominio de unión a colágeno que viene del Staphyloccus aureus. Se conoce como Cna (ProtA).

[0015] Los inventores han construido proteínas de fusión que contienen dominios de unión a colágeno a partir de los genes bbsp1100 y bbsp1101 de la cepa probiótica B. subtilis BSP1 o parte del gen cna de S. aureus que se fusionaron con el gen appA de la fitasa de Citrobacter braakii.

[0016] En algunas descripciones de las proteínas de fusión, el segmento de polipéptido de unión a colágeno es un segmento de polipéptido de unión a colágeno bacteriano. En una forma de realización más específica, es un segmento de polipéptido de unión a colágeno de Clostridium.

[0017] En otra divulgación, el segmento de polipéptido de unión a colágeno es un segmento de una colagenasa, o una colagenasa bacteriana, o una colagenasa de Clostridium. Preferiblemente el segmento es solo una parte de la colagenasa y el segmento de polipéptido de unión a colágeno no tiene actividad de colagenasa.

[0018] La presente descripción también se refiere al uso de TasA, u otra proteína de la matriz extracelular de biopelículas, como un péptido de unión al intestino indirecto que viene de Bacillus subtilis y que se dirige tanto a biopelículas bacterianas como a esporas en el intestino. Se ha descubierto que la secuencia de la proteína TasA está altamente conservada entre los miembros del género Bacillus, como se indica a continuación.

Conservación de la secuencia de la proteína TasA entre miembros del género Baci$$us.

[0019] La secuencia de ADN que codifica TasA, u otra proteína de la matriz extracelular de biopelículas se puede fusionar en la parte carboxiterminal o aminoterminal de cualquier molécula de interés (por ejemplo, un péptido, una enzima) para ligarse a biopelículas y esporas en el intestino. Los inventores han construido una proteína de fusión que contiene un péptido de unión a biopelículas a partir del gen bbsp3753 de la cepa probiótica B. subtilis BSP1 que se fusionó con el gen appA de la fitasa de Citrobacter braakii.

[0020] La presente invención también se refiere a segmentos de polipéptido de unión a la superficie intestinal que tienen al menos un 90% de identidad con segmentos de polipéptido de unión a la superficie intestinal como se describe en los ejemplos.

[0021] Los términos "proteína de fusión", "polipéptido de fusión" o "enzima de fusión" se pueden usar para referirse a un polipéptido único que comprende dos segmentos funcionales, por ejemplo, un segmento de polipéptido de unión a la superficie intestinal y una enzima, preferiblemente una enzima alimentaria tal y como se define en las reivindicaciones. Las proteínas de fusión pueden ser de cualquier tamaño, y el polipéptido único de la proteína de fusión puede existir en una forma multimérica en su estado funcional, por ejemplo, por conexión de bisulfuro de cisteína de dos monómeros del polipéptido único. Un segmento de polipéptido puede ser un polipéptido sintético o un polipéptido de origen natural. Tales polipéptidos pueden ser una parte de un polipéptido o pueden comprender una mutación o más.

[0022] El término "de unión a la superficie intestinal" se puede usar para referirse a cualquier tipo de secuencia polipeptídica que se une a la superficie del tracto gastrointestinal de las aves y los mamíferos, ya sea directamente (uniéndose a colágenos o matrices extracelulares (MEC) como fibronectina, fibrinógeno, laminina, etc.) o indirectamente a través del moco (uniéndose a la mucina) que segrega el tracto gastrointestinal y las moléculas que atrapa después de la eliminación de enterocitos (colágenos y MEC) o a través de biopelículas o estructuras producidas por la microbiota y que se adhieren a la superficie intestinal.

[0023] Las enzimas preferidas según la invención se seleccionan de entre las enzimas usadas en la industria de alimentos o alimentaria, también denominadas en la presente "enzimas de alimento" o "enzimas alimentarias". Enzimas particularmente útiles se seleccionan de entre fitasa (EC 3.1.3.8 o 3.1.3.26), xilanasa (EC 3.2.1.8), galactanasa (EC 3.2.1.89), alfa-galactosidasa (EC 3.2.1.22), proteasa (EC 3.4.), fosfolipasas, beta-glucuronidasa (EC 3.2.1.31), fosfatasa alcalina, amilasa tal como, por ejemplo, alfa-amilasa (EC 3.2.1.1), beta-glucanasa (EC 3.2.1.4 o EC 3.2.1.6) o celulasa. Ejemplos de fosfolipasas son la fosfolipasa A1 (EC 3.1.1.32), la fosfolipasa A2 (EC 3.1.1.4), la lisofosfolipasa (EC 3.1.1.5), la fosfolipasa C (EC 3.1.4.3) o la fosfolipasa D (EC 3.1.4.4).

[0024] La fitasa de la invención puede ser una variante de cualquier fitasa de tipo salvaje o variante.

[0025] En el presente contexto, una fitasa es un polipéptido con actividad de fitasa, es decir, una enzima que cataliza la hidrólisis de fitato (hexakisfosfato de mioinositol) a (1) mioinositol y/o (2) mono-, di-, tri-, tetra- y/o pentafosfatos derivados y (3) fosfato inorgánico.

[0026] El sitio de enzimas en internet (http://www.expasy.ch/enzyme/) es un repositorio de información relativa a la nomenclatura de las enzimas. Está principalmente basado en las recomendaciones del Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (IUB-MB) y describe cada tipo de enzima caracterizada para la que se ha proporcionado un número EC (Comisión de Enzimas) (Bairoch A. The enzyme database, 2000, Nucleic Acids Res 28: 304-305. Véase también el manual Enzyme Nomenclature de NC-IUBMB, 1992).

[0027] Según el sitio de enzimas, se conocen tres tipos diferentes de fitasas: una denominada 3-fitasa (nombre alternativo 1-fitasa; una 3-fosfohidrolasa de hexafosfato de mioinositol, EC 3.1.3.8), una denominada 4-fitasa (nombre alternativo 6-fitasa, nombre basado en el sistema de numeración 1L y no la numeración 1D, EC 3.1.3.26), y una denominada 5-fitasa (EC 3.1.3.72). Para los fines de la presente invención, los tres tipos se incluyen en la definición de fitasa.

[0028] Ejemplos de fitasas son las fitasas bacterianas, por ejemplo, las fitasas gramnegativas, tales como las fitasas de E. coli, Citrobacter y Hafnia y variantes de las mismas, incluidas las fitasas de la presente invención. Ejemplos de huéspedes de expresión fúngicos son las especies de Pichia, Saccharomyces y Aspergillus.

[0029] Polipéptidos que se pueden unir a segmentos de unión a la superficie intestinal conforme a la presente invención son los péptidos antimicrobianos o antifúngicos.

[0030] Ejemplos de péptidos antimicrobianos (PAM) son CAP18, leucocina A, tritrpticina, protegrin-1, tanatina, defensina, lactoferrina, lactoferricina y ovispirina tal como novispirina (Robert Lehrer, 2000), plectasinas y estatinas, incluidos los compuestos y polipéptidos descritos en WO 03/044049 y WO 03/048148, así como variantes o fragmentos de los anteriores que retienen actividad antimicrobiana.

[0031] Ejemplos de polipéptidos antifúngicos (PAF) son péptidos de Aspergillus giganteus y Aspergillus niger, así como variantes y fragmentos de los mismos que retienen actividad antifúngica, como se describe en WO 94/01459 y WO 02/090384.

Rendimiento en alimento para animales

[0032] En una forma de realización particular, la fitasa de fusión de la invención tiene un rendimiento mejorado en un animal en comparación con una enzima de referencia mediante el aumento de su tiempo de permanencia en el tracto gastrointestinal del animal.

[0033] En una forma de realización preferida, la fitasa reticulada de la invención tiene rendimientos similares en comparación con una enzima de referencia respecto a la actividad enzimática. La actividad enzimática se puede determinar en un modelo in vitro, preparando muestras de alimento compuestas por harina de soja al 30% y harina de maíz al 70%; preincubándolas a 40°C y pH 3,0 durante 30 minutos seguido de la adición de pepsina (3000 U/g de alimento) y fitasa; incubando las muestras a 40°C y pH 3,0 durante 60 minutos seguido de pH 4,0 durante 30 minutos; parando las reacciones; extrayendo el ácido fítico y fosfatos de inositol por adición de HCI a una concentración final de 0,5 M e incubación a 40°C durante 2 horas, seguido de un ciclo de congelación-descongelación y 1 hora de incubación a 40°C; separando el ácido fítico y los fosfatos de inositol por cromatografía iónica de alto rendimiento; determinando la cantidad de fósforo de fitato residual (IP6-P); calculando la diferencia de IP6-P residual entre la muestra tratada con fitasa y el blanco no tratado con fitasa (esta diferencia es el IP6-P degradado); y expresando el IP6-P degradado de la fitasa de la invención con respecto al IP6-P degradado de la fitasa de referencia.

[0034] Por supuesto, la fitasa de fusión de la invención y la fitasa de referencia se dosifican en la misma cantidad, preferiblemente en base a unidades de actividad de fitasa (FYT). Una dosificación preferida es 125 FYT/kg de alimento. Otra dosificación preferida es 250 FYT/kg de alimento. Las fitasas se pueden dosificar en forma de fitasas purificadas o en forma de sobrenadantes de fermentación. Las fitasas purificadas tienen preferiblemente una pureza de al menos un 95%, determinada por SDS-PAGE.

[0035] En formas de realización preferidas, el valor de IP6-P degradado de la fitasa de fusión purificada de la invención, con respecto al valor de IP6-P degradado de la fitasa de referencia, es de al menos un 90%, un 95%, un 98% o al menos igual. En todavía otras formas de realización preferidas, el valor de IP6-P degradado de la fitasa purificada de la invención, con respecto al valor de IP6-P degradado de la fitasa de referencia, es de al menos un 105%, 110%.

[0036] En todavía otra forma de realización particular, el rendimiento relativo de la fitasa de fusión de la invención se puede calcular como el porcentaje del fósforo liberado por la fitasa de la invención, con respecto a la cantidad de fósforo liberado por la fitasa de referencia.

Secuencias y construcciones de ácido nucleico

[0037] La presente invención también se refiere a secuencias de ácido nucleico que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión o un polipéptido de fusión según la invención, preferiblemente una fitasa de fusión.

[0038] El término "secuencia de ácido nucleico aislada" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que está esencialmente libre de otras secuencias de ácido nucleico, por ejemplo, al menos aproximadamente un 20% pura, preferiblemente al menos aproximadamente un 40% pura, más preferiblemente al menos aproximadamente un 60% pura, aún más preferiblemente al menos aproximadamente un 80% pura y más preferiblemente al menos aproximadamente un 90% pura determinado por electroforesis de agarosa. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico aislada se puede obtener por procedimientos de clonación estándares usados en ingeniería genética para recolocar la secuencia de ácido nucleico de su ubicación natural a un sitio diferente donde se reproducirá. Los procedimientos de clonación pueden implicar la escisión y el aislamiento de un fragmento de ácido nucleico deseado que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido, la inserción del fragmento en una molécula de vector y la incorporación del vector recombinante en una célula huésped donde se replicarán copias o clones múltiples de la secuencia de ácido nucleico. La secuencia de ácido nucleico puede ser de origen genómico, ADNc, ARN, semisintético, sintético o cualquier combinación de los mismos.

Construcciones de ácido nucleico

[0039] Una construcción de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico de la presente invención operativamente unida a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula huésped adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. Se entenderá que expresión incluye cualquier paso implicado en la producción del polipéptido incluidas, pero de forma no limitativa, la transcripción, la modificación postranscripcional, la traducción, la modificación postraduccional y la secreción.

[0040] El término "construcción de ácido nucleico" como se utiliza en la presente se refiere a una molécula de ácido nucleico, ya sea mono- o bicatenaria, que se aísla de un gen de origen natural o que se modifica para contener segmentos de ácidos nucleicos de manera que de otro modo no existirían en la naturaleza. El término construcción de ácido nucleico es sinónimo con el término "casete de expresión" cuando la construcción de ácido nucleico contiene las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia codificante de la presente invención.

[0041] El término "secuencias de control" se define en la presente para incluir todos los componentes, que son necesarios o ventajosos para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa o foránea respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Tales secuencias de control incluyen, pero de forma no limitativa, un líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia de propéptido, un promotor, una secuencia de péptido señal y un terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de parada transcripcional y traduccional. Las secuencias de control pueden proporcionarse con conectores con el fin de introducir sitios de restricción específicos que facilitan el ligamiento de las secuencias de control con la región codificante de la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido.

[0042] El término "operativamente unido" denota en la presente una configuración donde una secuencia de control se coloca en una posición apropiada con respecto a la secuencia codificante de la secuencia del polinucleótido de manera que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia codificante de un polipéptido.

[0043] Cuando se usa en la presente, el término "secuencia codificante" (CDS) significa una secuencia de nucleótidos, que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de su producto proteínico. Los bordes de la secuencia codificante están determinados generalmente por un marco de lectura abierto, que empieza normalmente con el codón de inicio ATG o codones de inicio alternativos tales como GTG y TTG. La secuencia codificante puede ser un ADN, ADNc o secuencia de nucleótidos recombinante.

Vector de expresión

[0044] El término "expresión" incluye cualquier paso implicado en la producción del polipéptido, es decir, la proteína de fusión o el polipéptido de fusión de la invención, incluidas, pero de forma no limitativa, la transcripción, la modificación postranscripcional, la traducción, la modificación postraduccional y la secreción.

[0045] El término "vector de expresión" se define en la presente como una molécula lineal o circular de ADN que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de la invención, y que está operativamente unido a nucleótidos adicionales que proveen a su expresión.

[0046] Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una enzima de fusión de la invención se puede expresar usando un vector de expresión que incluye típicamente secuencias de control que codifican un promotor, operador, sitio de unión al ribosoma, señal de iniciación de la traducción y, opcionalmente, un gen represor o varios genes activadores.

[0047] El vector de expresión recombinante que lleva la secuencia de ADN codificante de la fitasa de fusión de la invención puede ser cualquier vector que puede ser sometido convenientemente a procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector dependerá a menudo de la célula huésped en la que se va a introducir. El vector puede ser uno que, cuando se introduce en una célula huésped, se integra en el genoma de la célula huésped y se replica junto con el/los cromosoma(s) en el/los que se ha integrado.

Células huésped

[0048] El término "célula huésped", como se utiliza en la presente, incluye cualquier tipo celular que es susceptible a la transformación, transfección, transducción y similares con una construcción de ácido nucleico que comprende un polinucleótido de la presente invención.

[0049] La presente invención también se refiere a células huésped recombinantes, que comprenden un polinucleótido de la presente invención, que son ventajosamente usadas en la producción recombinante de los polipéptidos. Un vector que comprende un polinucleótido de la presente invención se introduce en una célula huésped de modo que el vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico de replicación autónoma como se ha descrito anteriormente. El término "célula huésped" abarca cualquier descendiente de una célula parental que no es idéntico a la célula parental debido a las mutaciones que ocurren durante la replicación. La elección de una célula huésped dependerá en gran parte del gen que codifica el polipéptido y su fuente.

[0050] La célula huésped puede ser un microorganismo unicelular, por ejemplo, un procariota, o un microorganismo no unicelular, por ejemplo, un eucariota.

[0051] Microorganismos unicelulares útiles son células bacterianas tales como bacterias grampositivas incluidas, pero de forma no limitativa, una célula de Bacillus, por ejemplo, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis y Bacillus thuringiensisj o una célula de Streptomyces, por ejemplo, Streptomyces lividans y Streptomyces murinus, o bacterias gramnegativas tales como E. coli y Pseudomonas sp. En un aspecto preferido, la célula huésped bacteriana es una célula de Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus o Bacillus subtilis. En otro aspecto preferido, la célula de Bacillus es un Baci$$us alcalófilo.

[0052] La introducción de un vector en una célula huésped bacteriana puede, por ejemplo, efectuarse por transformación de protoplastos (véase, por ejemplo, Chang y Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), usando células competentes (véase, por ejemplo, Young and Spizizen, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), electroporación (véase, por ejemplo, Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), o conjugación (véase, por ejemplo, Koehler y Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278).

[0053] La célula huésped también puede ser un eucariota, tal como una célula de mamífero, de insecto, vegetal o fúngica.

[0054] En un aspecto preferido, la célula huésped es una célula fúngica. "Hongos" como se utiliza en la presente incluye los filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota y Zygomycota (como definen Hawkswort et al., en, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8a edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido), así como el Oomycota (como se cita en Hawkswort et al., 1995, supra, página 171) y todos los hongos mitospóricos (Hawkswort et al., 1995, supra).

[0055] En un aspecto más preferido, la célula huésped fúngica es una célula de levadura. "Levadura(s)" como se utiliza en la presente incluye levaduras ascoesporógenas (Endomycetales), levaduras basidioesporógenas y levaduras pertenecientes a los hongos imperfectos (Blastomycetes). Ya que la clasificación de las levaduras puede cambiar en el futuro, para los fines de esta invención, levadura debe definirse como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M. y Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).

[0056] En un aspecto más preferido, la célula huésped de levadura es una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia.

[0057] En un aspecto más preferido, la célula huésped de levadura es una célula de Pichia pastoris, Pichia methanolica, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis. En otro aspecto más preferido, la célula huésped de levadura es una célula de Kluyveromyces lactis. En otro aspecto más preferido, la célula huésped de levadura es una célula de Yarrowia lipolytica.

Métodos de producción

[0058] La presente invención también se refiere a métodos para producir una proteína de fusión de la presente invención que comprende (a) el cultivo de una célula huésped bajo condiciones propicias para la producción de la proteína de fusión; y (b) la recuperación de la proteína de fusión.

[0059] En los métodos de producción de la presente invención, las células se cultivan en un medio nutritivo adecuado para la producción del polipéptido o enzima de fusión usando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula se puede cultivar por cultivo en matraz de agitación y por fermentación a pequeña escala o a gran escala (incluidas las fermentaciones continuas, por lote, por lote alimentado o en estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales realizadas en un medio adecuado y bajo condiciones que permitan que se exprese y/o aísle el polipéptido (o la enzima). El cultivo tiene lugar en un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de nitrógeno y carbono y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica. Medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o se pueden preparar según composiciones publicadas (por ejemplo, en catálogos de la American Type Culture Collection). Si el polipéptido se secreta en el medio nutritivo, el polipéptido se puede recuperar directamente del medio. Si el polipéptido no se secreta, se puede recuperar a partir de lisados celulares.

[0060] El polipéptido o enzima de fusión resultante puede recuperarse usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido o la enzima se puede recuperar del medio nutritivo por procedimientos convencionales incluidos, pero de forma no limitativa, la centrifugación, la filtración, la extracción, el secado por pulverización, la evaporación o la precipitación.

[0061] El polipéptido o enzima de fusión de la presente invención se puede purificar por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica incluidos, pero de forma no limitativa, cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad, hidrofóbica, el cromatoenfoque y de exclusión por tamaño), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, el isoelectroenfoque preparativo), solubilidad diferencial (por ejemplo, la precipitación de sulfato amónico), SDS-PAGE o extracción (véase, por ejemplo, Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nueva York, 1989).

Composiciones y usos

[0062] En todavía otros aspectos, la presente invención se refiere a composiciones que comprenden una proteína de fusión de la presente invención, así como métodos para usarlas.

[0063] Las composiciones se pueden preparar conforme a métodos conocidos en la técnica y pueden estar en forma de un líquido o una composición seca. Por ejemplo, la composición puede estar en forma de granulados o microgranulados. La proteína de fusión que se va a incluir en la composición se puede estabilizar conforme a métodos conocidos en la técnica.

[0064] Por consiguiente, usos preferidos de las proteínas de fusión de la invención son en preparaciones de alimento para animales (incluido alimento para seres humanos) o en aditivos para tales preparaciones.

[0065] En una forma de realización particular, la proteína de fusión de la invención se puede usar para mejorar el valor nutricional de un alimento para animales. Ejemplos no limitativos de mejora del valor nutricional de alimento para animales (incluido alimento para seres humanos) son: mejora de la digestibilidad del alimento; promoción del crecimiento del animal; mejora de la utilización del alimento; mejora de la biodisponibilidad de las proteínas; aumento del nivel de fosfato digerible; mejora de la liberación y/o degradación del fitato; mejora de la biodisponibilidad de los oligoelementos; mejora de la biodisponibilidad de los macrominerales; eliminación o reducción de la necesidad de añadir fosfato, oligoelementos y/o macrominerales suplementarios; y/o mejora de la calidad de la cáscara de huevo. Por lo tanto, se aumenta el valor nutricional del alimento, y puede mejorarse la velocidad de crecimiento y/o el aumento de peso y/o la conversión de alimento (es decir, el peso de alimento ingerido con respecto al aumento de peso) del animal.

[0066] Además, la proteína de fusión de la invención se puede usar para reducir el nivel de fitato del estiércol.

Animales, alimento para animales y aditivos alimentarios para animales

[0067] El término animal incluye todos los animales, incluidos los seres humanos. Ejemplos de animales son los no rumiantes y los rumiantes. Los animales rumiantes incluyen, por ejemplo, animales tales como la oveja, la cabra y el ganado bovino, por ejemplo, la vaca tal como el ganado bovino para carne y las vacas lecheras. En una forma de realización particular, el animal es un animal no rumiante. Los animales no rumiantes incluyen animales monogástricos, por ejemplo, el cerdo o el puerco (incluidos, pero de forma no limitativa, lechones, cerdos en crecimiento y cerdas); aves tales como pavos, patos y pollos (incluidos, pero de forma no limitativa, pollos de engorde, gallinas ponedoras); peces (incluidos, pero de forma no limitativa, el salmón, la trucha, la tilapia, el siluro y la carpa); y crustáceos (incluidos, pero de forma no limitativa, la gamba y el langostino).

[0068] El término alimento o composición de alimento significa cualquier compuesto, preparación, mezcla o composición adecuada para o destinada a que la tome un animal.

[0069] En el uso según la invención, la enzima de fusión se puede alimentar al animal antes, después o simultáneamente con la dieta. Se prefiere esto último.

[0070] En una forma de realización particular, la proteína de fusión, en la forma en la que se añade al alimento, o cuando se incluye en un aditivo alimentario, es sustancialmente pura. En una forma de realización particular está bien definida. El término "bien definida" significa que la preparación enzimática es al menos un 50% pura como se determina por cromatografía de exclusión por tamaño (véase el ejemplo 12 de WO 01/58275). En otras formas de realización particulares, la enzima, por ejemplo, la preparación de fitasa, es al menos un 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94 o al menos un 95% pura como se determina por este método.

[0071] La preparación enzimática se puede (a) añadir directamente al alimento (o se puede usar directamente en un proceso de tratamiento de proteínas) o (b) se puede usar en la producción de una o más composiciones intermedias tales como aditivos alimentarios o premezclas que se añaden posteriormente al alimento (o se usan en un proceso de tratamiento). El grado de pureza anteriormente descrito se refiere a la pureza de la preparación polipeptídica original, ya se use según (a) o (b) anteriores.

[0072] En otro aspecto, la presente invención se refiere a composiciones para usar en alimento para animales, tales como aditivos alimentarios para animales, por ejemplo, premezclas.

[0073] Normalmente las vitaminas lipo- e hidrosolubles, así como los oligoelementos forman parte de una denominada premezcla destinada a la adición al alimento, mientras que los macrominerales se añaden normalmente por separado al alimento. Cualquiera de estos tipos de composición, cuando están enriquecidos con una enzima de la invención, es un aditivo alimentario para animales de la invención.

[0074] Ejemplos de vitaminas liposolubles son la vitamina A, la vitamina D3, la vitamina E y la vitamina K, por ejemplo, la vitamina K3.

[0075] Ejemplos de vitaminas hidrosolubles son la vitamina B12, la biotina y la colina, la vitamina B1, la vitamina B2, la vitamina B6, la niacina, el ácido fólico y el pantotenato, por ejemplo, el Ca-D-pantotenato.

[0076] Ejemplos de oligoelementos son el manganeso, el zinc, el hierro, el cobre, el yodo, el selenio y el cobalto.

[0077] Ejemplos de macrominerales son el calcio, el fósforo y el sodio.

[0078] Además, ingredientes opcionales de aditivos alimentarios son los agentes colorantes, por ejemplo los carotenoides tales como el beta-caroteno, la astaxantina y la luteína; los compuestos aromáticos; los estabilizadores; los péptidos antimicrobianos; los ácidos grasos poliinsaturados; las especies generadoras de oxígeno reactivo; y/o al menos otro polipéptido seleccionado de entre fitasa (EC 3.1.3.8 o 3.1.3.26); fosfatasa (EC 3.1.3.1; EC 3.1.3.2; EC 3.1.3.39); xilanasa (EC 3.2.1.8); galactanasa (EC 3.2.1.89); alfa-galactosidasa (EC 3.2.1.22); proteasa (EC 3.4.-.-), fosfolipasa A1 (EC 3.1.1.32); fosfolipasa A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipasa (EC 3.1.1.5); fosfolipasa C (3.1.4.3); fosfolipasa D (EC 3.1.4.4); amilasa tal como, por ejemplo, alfa-amilasa (EC 3.2.1.1); y/o beta-glucanasa (EC 3.2.1.4 o EC 3.2.1.6).

[0079] Ejemplos de ácidos grasos poliinsaturados son los ácidos grasos poliinsaturados C18, C20 y C22, tales como el ácido araquidónico, el ácido docosahexaenoico, el ácido eicosapentanoico y el ácido gamma-linolénico.

[0080] Ejemplos de especies generadoras de oxígeno reactivo son las sustancias químicas tales como el perborato, el persulfato o el percarbonato; y los polipéptidos tales como una oxidasa, una oxigenasa o una sintetasa.

[0081] La presente invención también se refiere a composiciones de alimento para animales. Las composiciones o dietas de alimento para animales tienen un contenido relativamente alto de proteína. Las dietas de aves y cerdos se pueden caracterizar como se indica en la tabla B de WO 01/58275, columnas 2-3. Las dietas de peces se pueden caracterizar como se indica en la columna 4 de esta tabla B. Además, tales dietas de peces tienen normalmente un contenido de grasa bruta de 200-310 g/kg.

[0082] Una composición de alimento para animales según la invención tiene un contenido bruto de proteína de 50-800 g/kg y comprende además al menos una enzima de fusión como se reivindica en la presente.

[0083] Además, o en la alternativa (al contenido bruto de proteína indicado anteriormente), la composición de alimento para animales de la invención tiene un contenido de energía metabolizable de 10-30 MJ/kg; y/o un contenido de calcio de 0,1-200 g/kg; y/o un contenido de fósforo disponible de 0,1-200 g/kg; y/o un contenido de metionina de 0,1-100 g/kg; y/o un contenido de metionina más cisteína de 0,1-150 g/kg; y/o un contenido de lisina de 0,5-50 g/kg.

[0084] En formas de realización particulares, el contenido de energía metabolizable, proteína bruta, calcio, fósforo, metionina, metionina más cisteína, y/o lisina está incluido en cualquiera de los rangos 2, 3, 4 o 5 en la tabla B de WO 01/58275 (R. 2-5).

[0085] La proteína bruta se calcula como el nitrógeno (N) multiplicado por un factor 6,25, es decir, proteína bruta (g/kg)= N (g/kg) x 6,25. El contenido de nitrógeno se determina por el método de Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis 14a ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington dC).

[0086] La energía metabolizable se puede calcular basándose en la publicación del NRC Nutrient requirements in swine, novena edición corregida 1988, subcommittee on swine nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, national research council. National Academy Press, Washington, D.C., págs. 2-6, y la European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs, Spelderholt centre for poultry research and extension, 7361 DA Beekbergen, Países Bajos. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN 90-71463-12-5.

[0087] El contenido dietético de calcio, fósforo disponible y aminoácidos en dietas completas de animales se calcula basándose en tablas alimenticias tal como Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7.

[0088] En una forma de realización particular, la composición de alimento para animales de la invención contiene al menos una proteína. La proteína puede ser una proteína animal, tal como harina de carne y huesos y/o harina de pescado; o puede ser una proteína vegetal. El término proteínas vegetales como se utiliza en la presente se refiere a cualquier compuesto, composición, preparación o mezcla que incluye al menos una proteína derivada de u originada a partir de un vegetal, incluidas las proteínas modificadas y los derivados de proteína. En formas de realización particulares, el contenido de proteína de las proteínas vegetales es de al menos un 10, 20, 30, 40, 50 o 60% (p/p).

[0089] Las proteínas vegetales pueden derivar de fuentes de proteína vegetales, tales como leguminosas y cereales, por ejemplo, materiales de plantas de las familias Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae y Poaceae, tales como la harina de soja, la harina de altramuces y la harina de colza.

[0090] En todavía otras formas de realización particulares, la composición de alimento para animales de la invención contiene 0-80% de maíz; y/o 0-80% de sorgo; y/o 0-70% de trigo; y/o 0-70% de cebada; y/o 0-30% de avena; y/o 0-40% de harina de soja; y/o 0-25% de harina de pescado; y/o 0-25% de harina de carne y huesos; y/o 0-20% de suero de leche.

[0091] Por ejemplo, las dietas de animales pueden fabricarse como alimento triturado (no granulado) o alimento granulado o alimento extruido. Típicamente, se mezclan los piensos molidos y se añaden cantidades suficientes de vitaminas y minerales esenciales según las especificaciones para la especie en cuestión. Las enzimas de fusión según la invención se pueden añadir como formulaciones polipeptídicas sólidas o líquidas. Por ejemplo, una formulación polipeptídica sólida se añade típicamente antes o durante la etapa de mezclado; y una preparación polipeptídica líquida se añade típicamente después del paso de granulación.

[0092] La concentración de enzima de fusión final en la dieta está incluida en el rango de 0,01-200 mg de proteína polipeptídica por kg de dieta, por ejemplo, en el rango de 5-30 mg de proteína polipeptídica por kg de dieta de animales.

[0093] Por supuesto, la enzima de fusión, en particular la fitasa de fusión, de la invención debería aplicarse en una cantidad eficaz, es decir, en una cantidad adecuada para mejorar la solubilización y/o mejorar el valor nutricional del alimento. Actualmente se contempla que el polipéptido se administre en una o varias de las siguientes cantidades (rangos de dosificación): 0,01-200; 0,0l-100; 0,5-100; 1-50; 5-100; 10-100; 0,05-50 o 0,10-10 -donde todos estos rangos están en mg de enzima o proteína polipeptídica de fitasa por kg de alimento (ppm).

[0094] Para determinar los mg de enzima o proteína polipeptídica de fitasa por kg de alimento, la enzima o la fitasa se purifica a partir de la composición de alimento, y la actividad específica de la enzima purificada se determina usando un ensayo pertinente.

Ejemplos

[0095] La invención descrita y reivindicada en la presente no debe limitarse en su alcance por las formas de realización específicas descritas en la presente, ya que estas formas de realización se destinan a ilustrar varios aspectos de la invención. Cualquier forma de realización equivalente se destina a estar incluida dentro del alcance de esta invención. De hecho, varias modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas en la presente serán evidentes para aquellas personas expertas en la técnica a partir de la descripción precedente. Tales modificaciones están destinadas también a caer dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Metodología general

[0096] En los primeros párrafos se resume la metodología general:

Cepas v plásmidos. Cepas de Bacillus subtilis de la presente invención derivan de la cepa 1A747 (Bacillus Genetic Stock Center, The Ohio State University, Columbus, Ohio 43210 EE.UU.), que es un derivado prototrófico de B. subtilis 168 (trpC2) (GenBank AL009126).

Medios. El medio mínimo estándar (MM) para B. subtilis contiene sales de Spizizen 1X, glutamato sódico al 0,04% y glucosa al 0,5%. El medio completo sólido estándar es caldo de agar sangre triptona (TBAB, Difco). El medio completo líquido estándar es caldo de extracto de levadura-infusión de ternera (VY). Las composiciones de estos medios se describen a continuación:

Medio TBAB: 33 g de base de agar sangre triptona de Difco (n.0 de catálogo 0232), 1 l de agua. Autoclave. Medio VY: 25 g de caldo de infusión de ternera de Difco (n.o de catálogo 0344), 5 g de extracto de levadura de Difco (n.o de catálogo 0127), 1l de agua. Autoclave.

Medio mínimo (MM): 100 ml de sales de Spizizen 10X; 10 ml de glucosa al 50%; 1 ml de glutamato sódico al 40%, csp 1l de agua. Sales de Spizizen 10X: 140 g K2HPO4, 20 g (NH4)2SO4, 60 g KH2PO4, 10 g Na3 citrato.2H2O; 2g MgSO4.7H2O; csp 1 l con agua.

Medio mínimo VFB 10X (VFB MM 10X): 2,5 g de Na-glutamato; 15,7 g de KH2PO4, 15,7 g de K2HPO4, 27,4 g de Na2HPO4.12H2O; 40 g NH4O; 1 g de ácido cítrico; 68 g (NH4)2SO4; csp 1 l de agua.

Solución de oligoelementos: 1,4 g de MnSO4-H2O; 0,4 g de CoCl2-6H2O; 0,15 g de (NH4)eMo/O24'4H2O; 0,1g de A O 36 H2O; 0,075 g de CuCl2'2H2O; csp 200 ml de agua.

Solución de Fe: 0,21 g de FeS04.7H20; csp 10 mi de agua.

Solución de CaCh: 15,6 g de CaCÍ2.2H20; csp 500 mi de agua.

Solución de Mg/Zn: 100 g de MgSO4.7H20 ; 0,4 g de ZnS04.7H20 ; csp 200 mi de agua.

Medio MM VFB: 100 mi de VFB MM 10X; 10 mi de glucosa al 50%; 2 mi de solución de oligoelementos; 2 mi de solución de Fe; 2 mi de solución de CaCh; 2 mi de solución de Mg/Zn; 882 mi de agua destilada estéril. Medio MSgg para promover el desarrollo de biopelículas: 2,5 mM de KH2P04, 2,5 mM de K2HP04,100 mM de M0PS, 2 mM de MgCl2, 700 yM de CaCl2, 50 yM de MnCl2, 1 yM de ZnCl2, 50 yM de FeCl3, 2 yM de tiamina, glicerol al 0,5%, ácido glutámico al 0,5%, 50 yg/ml de triptófano, 50 yg/ml de fenilalanina.

Técnicas moleculares v genéticas. Técnicas genéticas y de biología molecular estándar se conocen generalmente en la técnica y se han descrito previamente. Transformación de ADN, transducción generalizada de PBS1 y otras técnicas genéticas estándar de B. subtilis se conocen también generalmente en la técnica y se han descrito previamente (Harwood y Cutting, 1992).

Purificación de proteína. Tras la incubación en medio VY a 37°C durante 24h, se centrifugaron los cultivos a 6000 r.p.m. durante 10 min. Para concentrar las proteínas, se añadió sulfato amónico al 80% al sobrenadante que contenía la proteína de interés marcada con His, a través de una adición lenta de a 4°C. Después de una centrifugación a 10.000 r.p.m. durante 15 min, las proteínas del sedimento se recuperaron en 5 mi de 20 mM Tris-HCI, 20 mM imidazol, 500 mM NaCl, tampón pH 7,4, antes de dos diálisis consecutivas a 4°C en 1 i del mismo tampón. Después de la filtración, se aplicaron las proteínas concentradas a una columna de cromatografía de afinidad por histidina (HisTrap Fast Flow, GE Healthcare). La proteína de interés marcada con His se purificó según las recomendaciones del fabricante y como conoce la gente experta en la técnica. Las fracciones que contenían la proteína de interés, identificadas a través de SDS-PAGE, se dializaron para eliminar rastros de imidazol.

Ensayo de actividad de fitasa. La actividad de fitasa de Citrobacter braakii se evaluó a 50°C y pH 4 como se describe por Han Woo et al. (2003). Primero, se incubaron 75 yl de muestra a 50°C con 300 yl de tampón de reacción 100 mM C4H604, 2 mM C6H18024P6, 1 mM CaCb; pH 4. La reacción enzimática se detuvo después de 30 min por adición de 375 yl de ácido tricloroacético al 15% (v/p). Entonces los ortofosfatos, que se liberaron, se midieron incubando 50 yl de la reacción preliminar detenida durante 20 min a 50°C con 450 yl de agua destilada y 500 yl de una solución de 600 mM H2S04, 100 mM C6H/Na06, 4 mM (NH4)6Mo/024. La densidad óptica se midió entonces a 820 nm. La actividad enzimática se midió después conforme a la fórmula siguiente:

Actividad (U/L) = [(0D^muestra - 0D ^bianco) X factor de dilución] / (coeficiente^cai X 30 min)

Ensayo de unión por transferencia puntual. Los ensayos de unión a colágeno de tipo I y tipo IV se realizaron según el procedimiento ELISA usando anticuerpos primarios anti-etiqueta de His (Santa Cruz Biotechnologies) y anticuerpos secundarios anticonejo acoplados a peroxidasa (Sigma). El revelado se realizó con el kit ECL Plus (GE Healthcare) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Las proteínas se localizaron previamente en una membrana de transferencia según el procedimiento de transferencia puntual bien conocido por la gente experta en la técnica.

Ensayo de unión a biopelículas. Después de purificarse como se describe en la sección "Purificación de proteína", la fusión del dominio de unión a biopelículas TasA de Bacillus subtilis con el amino terminal de la fitasa de Citrobacter braakii se mezcló con un precultivo de Bacillus subtilis BSP1 formador de biopelículas preparado en medio VY durante toda la noche. Se preparó un control siguiendo el mismo procedimiento, pero omitiendo mezclar la proteína de fusión TasA_BSP1-Phy con el precultivo de Bacillus subtilis BSP1. Se vierten 100 yl de las respectivas mezclas sobre la superficie de medio MSgg, suplementado con agar al 0,5%. Los cultivos en reposo se incubaron a 22°C durante 5 días para inducir la formación de biopelículas. Las biopelículas se recogieron luego con un asa estéril y se lavaron 3 veces con una solución compuesta de 20 mM Tris-HCI, 300 mM NaCl y 1 mM CaCl2, para eliminar la fusión de proteína TasA_BSP1-Phy que no se ha incorporado en la biopelícula de Bacillus subtilis BSP1. Las biopelículas se suspendieron luego en el tampón de reacción para el ensayo de actividad de fitasa, como se describe en la sección "Ensayo de actividad de fitasa".

EJEMPLO 1 - diseño de Cna BSP1-phv de fusión traduccional

[0097] Este ejemplo describe el gen sintético diseñado para sobreexpresar la fusión de un dominio de unión a colágeno de tipo Cna identificado en la cepa beneficiosa no domesticada B. subtilis BSP1, con el amino terminal de la fitasa de Citrobacter braakii.

[0098] De 5' a 3', la construcción contiene respectivamente (tabla 1):

-) la región promotora de amyQ de B. sutbilis

-) el péptido señal del gen ytwD de B. subtilis (que codifica los 32 primeros AA)

-) la secuencia de genes de B. subtilis BSP1 que codifica una proteína de unión a colágeno de tipo Cna de 1076 AA que contiene potencialmente tres motivos de unión < con sus 36 primeros AA eliminados (péptido señal) -) un espaciador de diez alaninas (que inclu<e un sitio de restricción PvuW)

-) el gen appA de la fitasa de Citrobacter brakii con optimización de pares de codones con sus primeros 22 AA eliminados (péptido señal)

-) una secuencia de 56 pb que contiene respectivamente un sitio de escisión de trombina, una etiqueta de hexahistidina, dos codones de parada sucesivos < un sitio de escisión Nhel.

Tabla 1. Secuencia de la fusión traduccional Cna_BSP1-ph<. Los sitios de clonación BamHI, SaH, PvulI < Nhe\ están en negrita subra<ada. La región espaciadora de alanina está en mavúsculas subra<adas. La secuencia de fitasa con optimización de pares de codones está en mavúsculas en cursiva. La etiqueta de His está en minúsculas en negrita. Los codones de parada están en mavúsculas en negrita. La señal peptídica está en minúsculas subra<adas. El promotor está en minúsculas en cursiva.

cggccgcccagactgtccgctgtgtaaaaaataggaataaaggggggttg ttattattttactgatatgtaaaatataatttgtataagaaaatgagagg gagaggaaattaattaaaaaaggagcgatttacatatgagttatgcagtt tgtagaatgcaaaaagtgaaatcagggGGATCCagaaaggaggtgatcca atqaacacactqqcaaactqqaaqaaqtttttqcttqtgqcqgttatcat ttgttttttggttccaattatgacaaaagcggagattgcggaagctgctG TCGACGTAACGTCCAGTGACAGCCAATTTTTCGATTTGGTAACAGTTAAG GACGCCAAAGGCCAGATAGTTGACGGATCAAAAGGAAACGAACCGGCACT AACACCGGGGGACGAAGTGACACTGACATATGAATGGTCATTGAAAAAAG ACAAAAAAGCAGATAGCGAACAGGATAT CAAT GT GGAGT TACCTAAAAGC TTTACATTTGATAAAGGTGCTGAAGGTGAGATCAAATCTGCTGATCAGGT CATCGGCAGCTATCAAGTGCCGGCGGGCAGCAGCACCATGACAGTAAAAT TAACAACTGCATCCGCGGATTCTCTTGATGCCAAGGGGACCATTACACTG CCAGCTAAGTTTACTGCAGATGTAAAAGAAGATGAACATACAGCAGCAGC CCTTTTTCAGCTAGGCGGAGGCAAAACCCAGCAGGTGATCATTCCTGTTA AGAAAGAGGAGACACCAGATGCCGAGGCGGAAGAGCCAAAAAACGACTCT TCTGATACTGCGGGTGATCAGGAAGGGAAAGATGACAAACCTGCACCTTC AGTCAGCAAGGATCAAAAAGAGGAAGAACAGCAGCCGTCAGATGACTCTA AGAGCGGCGAAGCCTCTAAGAGTGATGATTCAAAAAAAGTGTCATCCTCA AGTCAATCAGCTTTCAAAAGCTTGCAAACTGAAGAAAAACAAATCACGCA ACATATTTTAACTGGCGTGACGTTGACGGACGAAAACGGAAAGCCATATG ACAAGGGCAATCGCGCCAATACGAATTCTCCGGTGAAAATTTCAATTGAT TGGGCTATTCCTGACGATTTAGGAAAAACGATCAATGCCGGCGATAAATA TGAATTTGATTTGCCTAAAGAATTTATTATGCATAATGACATTGTGAACC GCCGTTAGGCGCCGGAGACACCACCTACGGGACATTTTCTATTGATACGA CGGACAT GTGGTGAT GACAT TTAACGGC GAGGTAAAAGAAAGT TCTAAT G CAAAGGCACATTGGTTATCAATACGCAGTTCAACGAGAAAAAAATAACGG TTCGACAACACAAAAGATTCCATTTCCTGTGAATGCCGATACTCCTGAAA AACAGTTTATTTTAAACCCAATGTGAGTAAAACCATTGATAAATCAGGTG GCTGGATAAAGGCATCAACCCTGGTAAAGTAACATGGACGGTCGATGTCA TAAGAAGTTGGATCAAGTCAAAAATGCCAAACTCACGGAAAGCTTTCCAG TGGCGTAATCTACCGTTCAGTTAAAGTGTATGAACTCAATGTGAACATTG TGGTTCTGTCAGCAGAGGAAATGAAGTTTCTTCAGGCTACAGTGTTGATT AAAAGGAAATGTCACATTTGACGGGACAATTGATTCAGCCTACCGCCTTG ATACGAAACCGACATTGACAATGGTGCGAAGCCGAGTGAAGGCGGAAATA AACGCTGACAAATAAGGCGGCATTCAGCGGAGACAACCTGGAACCCATTT TGCAGAAGCCACTGTTGCAGCCAAGTATGGAAAAATGATCGCGAAATCAT GACCGGCTATGATGGAGAATCTCAAACATTCAGTTGGGCTCTTGCATACA CTACGGTGAGAAACAGATCGACCAATCCAAGGCCAGCATTAAAGATTCTT TGGAACTGGTGATTTGCATCTTGTGAAAGATTCTTTGAAGGTTATTCCTA TACCTTTGGTCAGAATGGCAGCGAGCAAGCGGGCAGGCCTTTAAAGGAAG CGAGGACTACACGCTGATCGATAATGGAAGCGGATTTGAAGTCAAATTTA TAAAAACGTAACGAGCGCTTACAAAATCACATATCAAACAAAGGTCAACA CGGAGTGATCATTGATAAATCTACAACATACACCAATAGCGTTGTGACCG AACAGGGGATTCAAAAGAAGCT TCTGGAATAGCCAT T CAGCAAAATCTCA CAAAGGATATTCAAACGTTGATTATGAGAAGAAGACGGCTGATTGGACGA TACAGTTAATAAAAATAAATACTTGATGAACAATTGGACTTTGGATGATC ATTTGAAAGCGGCGGAATGGTTCTGCTTGATGAATCGTTCAAGCTTCAAG ACACAACGAACAACAAAACATTACAGAAAGACAAAGACTACACGTTAACA AAAAAACCTGATCATAAAGGCTTTACTTTGGCATTGATCGGGGATTATGC AAAAACAGACAGTCAATTTAAGATCACTTATACGACAACGTTCAATGCCG ATTATTCTAACGAAAGCGTTAAGAATACAGCTCAGTCTACATGGACTGAT CAAAACGGCAATGAGCGCACGAATAAGGTATCAAGCGGTTTTACGCCGAA TAATCAGACGACAAACAATGGTTTCAAGAACGGTTCATACAACGCGGTTT CAAAGGAAATCACGTGGAAAATCGGCGTCAATTATAATGGCGAGCCGACG AAAAACCCTTATATCAAAGATGCCATAACAGATCCTCAGCAATTTGTGCC GGGTTCCGTTGTGGTTAAGAGCTATACGATCAATAAAAACGGCTCCATCA CAGAAGGAGACGCGCTGGATCTGCAAGTTTATGATGTCGAAGAGCCTTCT GCAAAAAATGAACACACTCTGACGGTACACCTTAAAACAGGCGATTCTGT ACCATATCTGATTGAGTTTAAGACATCACTCAAAGGACAGGTCATTGATC AGAATCAGTACACAAACAAGGCAACCTACTATAATGACGGTTATGCAGAC CGCACACTGACGGGCTCTGTTTCAGTTACGAACGGAGGAAGCCTGGTTTT CAAAGGCGGCAAACAAAATGGAAGCTACATCGATTGGAACATCAATGTCA ACTCCAGCCAATCAACGCTGGATGACGTAAAAGTTACTGACACGCCGGAT GAAAATCAAATACTAGATGCAGATTCTTTTAAAGTATATCAAGCAAAATA TGATGAAAACGGAGTGGTCAAAGACAGCAGCGGAAATCTGACCGCGGGAG ATGTCGAGCTTCAAAAAGACAAAGACTACACGTTAGACATCAAAACGGAC AATACAACAGGTGAACAATCGTTTGTCCTGAAATTCATAGGCAGCTATAA GCAAATTGATCGCGCCTATGTGATCAAATACCGGTCTCTGATTAACATAG CCGGCACGAGCGGCCATGTTAAAAATAAGGTGTCCATTTCAGGAACAAAT GTG AAGGAGGCAGCAGCTGC TGCT GC GG CT GC GG CAGC A GAAGAACAAAfl CGGCATGAAGCTTGAACGCGTTGTCATTGTCAGCAGACACGGCGTTCGTG CGCCGACAAAATTCACACCGATTA TGAAGGA TGTGA CA CC TGA CCAA TGG CCGCAATGGGATGTGCCGCTCGGCTGGCTGACGCCAAGAGGCGGAGAGCT TGTTTCTGAGCTCGGACAATATCAGCGCTTGTGGTTTACAAGCAAAGGTC TCCTGAATAACCAAACGTGCCCATCTCCAGGACAAGTAGCTGTTATCGCT GACACTGATCAGCGGACAAGAAAAACAGGCGAAGCATTTTTGGCAGGGCT TGCGCCGAAA TGCCAAA T TCAAGTACACTA TCAAAAA GA CGAA GAAAAAA ACGACCCGCTGTTCAACCCGGTTAAAATGGGAAAATGCTCGTTTAACACT CTAAAGGTGAAGAATGCGATTTTAGAGCGTGCCGGCGGAAACATTGAGCT TTACACACAGCGCTATCAATCATCTTTCCGTACGCTTGAAAATGTGCTGA ACTTCTCTCAATCTGAAACATGCAAAACAACAGAAAAATCAACAAAATGC ACGCTTCCTGAAGCGCTGCCATCTGAGTTTAAAGTAACGCCTGACAATGT ATCCCTTCCTGGTGCATGGAGCCTTTCCTCAACGCTGACTGAGATTTTCC TATTGCAGGAAGCTCAAGGCATGCCGCAAGTCGCCTGGGGCCGGATTACC GGCGAAAAAGAGTGGAGGGATTTGCTGTCACTTCACAACGCTCAATTTGA CCTTCTTCAGCGTACACCAGAGGTTGCCCGCTCCCGTGCAACCCCGCTTC TTGATATGATTGACACAGCTTTGCTGACAAATGGCACAACTGAAAACCGT TACGGCATCAAACTTCCGGTTTCTCTATTGTTTATTGCAGGGCATGACAC AAACCTTGCCAACCTTTCCGGCGCGCTTGATTTAAAATGGTCGCTGCCAG GACAGCCGGACAATACGCCGCCCGGCGGAGAACTCGTATTTGAAAAATGG AAACGCACTTCTGACAACACTGACTGGGTACAGGTTTCTTTCGTTTATCA AACGCTTCGTGACATGCGTGACATACAGCCGCTCAGCCTTGAAAAGCCTG C CGGAAAAG TA GA CT TAAAA T TAA TCGCA TG T GAA GA GAAAAA TTCTCAA GGTATGTGCTCGCTGAAATCATTCTCTCGCTTGATTAAAGAAATCCGCGT GCCTGAATGTGCTGTCACAGAGCTGGTGCCGCGCGGCAGCAGCAGCGGCc.

acc ac cacc ac cac cacTAATAAGCTAGC

EJEMPLO 2 - diseño de Cna-phv de fusión traduccional

[0099] Este ejemplo describe el gen sintético diseñado para sobreexpresar la fusión del dominio de unión a colágeno Cna de Staphyloccus aureus con el amino terminal de la fitasa de Citrobacter braakii.

[0100] De 5' a 3', la construcción contiene respectivamente (tabla 2):

-) la región promotora de amyQ de B. sutbilis

-) el péptido señal del gen ytwD de B. subtilis (que codifica los 32 primeros AA)

-) secuencia cna de Staphylococcus aureus que codifica una proteína de unión a colágeno de 313 AA con sus 30 primeros AA eliminados (péptido señal)

-) un espaciador de diez alaninas (que incluye un sitio de restricción PvuW)

-) el gen appA de la fitasa de Citrobacter brakii con optimización de pares de codones con sus primeros 22 AA eliminados (péptido señal)

-) una secuencia de 56 pb que contiene respectivamente un sitio de escisión de trombina, una etiqueta de hexahistidina, dos codones de parada sucesivos y un sitio de escisión Nhe\.

Tabla 2. Secuencia de la fusión traduccional Cna-phy. Los sitios de clonación BamHl, SalI, PvuW y Nhe\ están en negrita subrayada. La región espaciadora de alanina está en mayúsculas subrayadas. La secuencia de fitasa con optimización de pares de codones está en mayúsculas en cursiva. La etiqueta de His está en minúsculas en negrita. Los codones de parada están en mayúsculas en negrita. La señal peptídica está en minúsculas subrayadas. El promotor está en minúsculas en cursiva.

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EJEMPLO 3 - construcción de una cepa de B. subtilis que expresa la Cna BSP1-phy de fusión

[0101] Este ejemplo describe la construcción de la cepa de B. subtilis BSPB29 diseñada para sobreexpresar la fusión Cna_BSP1-phy.

[0102] El gen sintético cna_BSP1-phy se insertó en un plásmido multicopia transformado luego en una cepa de B. subtilis deficitaria en proteasa como conoce la gente experta en la técnica.

EJEMPLO 4 - construcción de la cepa de B. subtilis que expresa la Cna-phy de fusión

[0103] Este ejemplo describe la construcción de la cepa de B. subtilis BSPB32 diseñada para sobreexpresar la Cnaphy.

[0104] El gen sintético Cna-phy se insertó en un plásmido multicopia transformado luego en una cepa de B. subtilis deficitaria en proteasa como se conoce por gente experta en la técnica.

EJEMPLO 5 - diseño de Cna Dd-amy de fusión traduccional

[0105] Este ejemplo describe el gen sintético diseñado para sobreexpresar la fusión del dominio de unión a colágeno Cna de Denitrobacteríum detoxificans (cortesía del Dr. Stanton, National Animal Disease Ctr, USDA-Agricultural Research Service, Ames, lowa, EE.UU.) con el amino terminal de una a-amilasa.

[0106] De 5' a 3', la construcción contiene respectivamente (tabla 3):

-) la región promotora de amyQ de B. sutbilis

-) el péptido señal del gen ytwD de B. subtilis (que codifica los 32 primeros AA)

-) secuencia de Denitrobacterium detoxificans Dd01g014920 que codifica una proteína de 771 AA de unión a colágeno

-) un espaciador de diez alaninas (que incluye un sitio de restricción Pvull)

-) el gen amyL de a-amilasa de Bacillus licheniformis con sus primeros 38 AA eliminados (péptido señal) -) una secuencia de 56 pb que contiene respectivamente un sitio de escisión de trombina, una etiqueta de hexahistidina, dos codones de parada sucesivos y un sitio de escisión Nhel.

Tabla 3. Secuencia de la fusión traduccional Cna_Dd-amy. Los sitios de clonación BamHl, Sa/l, Pvull y Nhel están en negrita subrayada. La región espaciadora de alanina está en mayúsculas subrayadas. La secuencia de a-amilasa de B. licheniformis está en minúsculas. La etiqueta de His está en minúsculas en negrita. Los codones de parada están en mayúsculas en negrita. La señal peptídica está en minúsculas subrayadas. El promotor está en minúsculas en cursiva.

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EJEMPLO 6 - unión de afinidad por colágeno de la fusión Cna BSP1-phv

[0107] Este ejemplo demuestra la unión in vitro de la fusión Cna BSP1-phy purificada con colágeno de tipo I y tipo IV.

[0108] La figura 1 muestra una transferencia puntual con la fusión Cna BSP1-phy. Diferentes cantidades decrecientes de colágenos se han localizado en una membrana antes de ser incubadas con una cantidad constante de fusión Cna_BSP1-phy (5 nM). El revelado se realizó mediante ELISA usando un anticuerpo primario dirigido contra la etiqueta de his de la fusión traduccional.

EJEMPLO 7 - unión de afinidad por colágeno de la fusión Cna-phy

[0109] Este ejemplo demuestra unión in vitro de la fusión Cna-phy purificada con colágeno de tipo I y tipo IV.

[0110] La figura 2 muestra una transferencia puntual con la fusión Cna-phy. Diferentes cantidades decrecientes de colágeno se han localizado en una membrana antes de ser incubadas con una cantidad constante de fusión Cna-phy (5 nM). El revelado se realizó mediante ELISA usando un anticuerpo primario dirigido contra la etiqueta de his de la fusión traduccional.

EJEMPLO 8 - espectro de afinidad de Cna-BSP1-phv

[0111] Este ejemplo demuestra que las fusiones que contienen dominios de unión a colágeno también son capaces de unirse in vitro a otras proteínas de la matriz extracelular (MEC), es decir, laminina, fibronectina y fibrinógeno.

[0112] La figura 3 muestra una transferencia puntual con la fusión Cna BSP1-phy. Dos cantidades diferentes de proteínas de la matriz extracelular (MEC) se han localizado en una membrana antes de ser incubadas con una cantidad constante de fusión Cna_BSP1-phy (5 nM). El revelado se realizó mediante ELISA usando un anticuerpo primario dirigido contra la etiqueta de his de la fusión traduccional.

EJEMPLO 9 - actividad de fitasa de la fusión Cna-phy unida a colágeno

[0113] Este ejemplo demuestra que las fusiones unidas a colágenos presentan una actividad de fitasa significativa.

[0114] La figura 4 muestra los histogramas de actividad enzimática de fitasa unida a colágeno de tipo I y IV. Cantidades diferentes de colágeno diana tal y como se menciona en la figura 4 se han recubierto en placa de microtitulación antes de ser incubadas con una cantidad constante de fusión Cna-phy (50 nM). Después de lavar, la actividad de fitasa de la fusión unida a colágeno se evaluó como se describe en Metodología general. La actividad de fitasa unida a colágeno es significativamente superior a la observada tras la incubación en pocilios recubiertos con BSA (10 pg) EJEMPLO 10 - diseño CBD-phv de fusión traduccional

[0115] Este ejemplo describe el gen sintético diseñado para sobreexpresar la fusión del dominio de unión a colágeno CBD de la colagenasa de Clostridium histolyticum con el amino terminal de la fitasa de Citrobacter braakii.

[0116] De 5' a 3', la construcción contiene respectivamente (tabla 4):

-) la región promotora de amyQ de B. sutbilis

-) el péptido señal del gen ytwD de B. subtilis (que codifica los 32 primeros AA)

-) secuencia de Clostridium histolyticum que codifica 215 AA de los dominios S2B < S3 de colH (Yoshihara et al., 1994)

-) un espaciador de diez alaninas (que inclu<e un sitio de restricción Pvull)

-) el gen appA de la fitasa de Citrobacter brakii con optimización de pares de codones con sus primeros 22 AA eliminados (péptido señal)

-) una secuencia de 56 pb que contiene respectivamente un sitio de escisión de trombina, una etiqueta de hexahistidina, dos codones de parada sucesivos < un sitio de escisión Nhel.

Tabla 4. Secuencia de la fusión traduccional CBD-ph<. Los sitios de clonación BamHI, SaH, PvuW < Nhel están en negrita subra<ada. La región espaciadora de alanina está en mavúsculas subra<adas. La secuencia de fitasa con optimización de pares de codones está en mavúsculas en cursiva. La etiqueta de His está en minúsculas en negrita. Los codones de parada están en mavúsculas en negrita. La señal peptídica está en minúsculas subra<adas. El promotor está en minúsculas en cursiva.

cggccgcccagactgtccgctgtgtaaaaaataggaataaaggggggttg ttattattttactgatatgtaaaatataatttgtataagaaaatgagagg gagaggaaattaattaaaaaaggagcgatttacatatgagttatgcagtt tgtagaatgcaaaaagtgaaatcagggGGATCCagaaaggaggtgatcca atqaacacactqqcaaactgqaaqaaqtttttqcttqtqqcqqttatcat ttgttttttgqttccaattatqacaaaaqcqqaqattqcqqaaqctgc tgtcgacGAAATAAAGGATCTTTCAGAAAATAAACTTCCAGTTATATA TATGCATGTACCTAAATCCGGAGCCTTAAATCAAAAAGTTGTTTTCTA TGGAAAAGGAACATATGACCCAGATGGATCTATCGCAGGATATCAATG GGACTTTGGTGATGGAAGTGATTTTAGCAGTGAACAAAACCCAAGCCA TGTATATACTAAAAAAGGTGAATATACTGTAACATTAAGAGTAATGGA TAGTAGTGGACAAATGAGTGAAAAAACTATGAAGATTAAGATTACACA TCCGGTATATCCAATAGGCACTGAAAAAGAACCAAATAACAGTAAAGA AACTGCAAGTGGTCCAATAGTACCAGGTATACCTGTTAGTGGAACCAT AGAAAATACAAGTGATCAAGATTATTTCTATTTTGATGTTATAACACC AGGAGAAGTAAAAATAGATATAAATAAATTAGGGTACGGAGGAGCTAC TTGGGTAGTATATGATGAAAATAATAATGCAGTATCTTATGCCACTGA TGATGGGCAAAATTTAAGTGGAAAGTTTAAGGCAGATAAACCAGGTAG ATATTACATCCATCTTTACATGTTTAATGGTAGTTATATGCCATATAG AAT TAAT ATAGAAGGT T CAGT AGGAAGAGCAGCAGCTGCTGCTGCGGC

11GGGGGAGGAGAAGAACAAAACGGCATGAAGCTTGAACGCGTTGTCAT TGTCAGCAGACACGGCGTTCGTGCGCCGACAAAATTCACACCGATTAT GAAGGATGTGACACCTGACCAATGGCCGCAATGGGATGTGCCGCTCGG CTGGCTGACGCCAAGAGGCGGAGAGCTTGTTTCTGAGCTCGGACAATA TCAGCGCTTGTGGTTTACAAGCAAAGGTCTCCTGAATAACCAAACGTG CCCATCTCCAGGACAAGTAGCTGTTATCGCTGACACTGATCAGCGGAC AAGAAAAACAGGCGAAGCATTTTTGGCAGGGCTTGCGCCGAAATGCCA AATTCAAGTACACTATCAAAAAGACGAAGAAAAAAACGACCCGCTGTT CAACCCGGTTAAAATGGGAAAATGCTCGTTTAACACTCTAAAGGTGAA GAATGCGATTTTAGAGCGTGCCGGCGGAAACATTGAGCTTTACACACA GCGCTATCAATCATCTTTCCGTACGCTTGAAAATGTGCTGAACTTCTC TCAATCTGAAACATGCAAAACAACAGAAAAATCAACAAAATGCACGCT TCCTGAAGCGCTGCCATCTGAGTTTAAAGTAACGCCTGACAATGTATC CCTTCCTGGTGCATGGAGCCTTTCCTCAACGCTGACTGAGATTTTCCT ATTGCAGGAAGCTCAAGGCATGCCGCAAGTCGCCTGGGGCCGGATTAC CGGCGAAAAAGAGTGGAGGGATTTGCTGTCACTTCACAACGCTCAATT TGACCTTCTTCAGCGTACACCAGAGGTTGCCCGCTCCCGTGCAACCCC GCTTCTTGATATGATTGACACAGCTTTGCTGACAAATGGCACAACTGA AAACCGTTACGGCATCAAACTTCCGGTTTCTCTATTGTTTATTGCAGG GCATGACACAAACCTTGCCAACCTTTCCGGCGCGCTTGATTTAAAATG GTCGCTGCCAGGACAGCCGGACAATACGCCGCCCGGCGGAGAACTCGT ATTTGAAAAATGGAAACGCACTTCTGACAACACTGACTGGGTACAGGT TTCTTTCGTTTATCAAACGCTTCGTGACATGCGTGACATACAGCCGCT CAGCCTTGAAAAGCCTGCCGGAAAAGTAGACTTAAAATTAATCGCATG TGAAGAGAAAAATTCTCAAGGTATGTGCTCGCTGAAATCATTCTCTCG CTTGATTAAAGAAATCCGCGTGCCTGAATGTGCTGTCACAGAGCTGGT GCCGCGCGGCAGCAG CAG CG GCcaccaccaccacaccacTAATAAGCT

AGC

EJEMPLO 11 - diseño de MubBP(RI+RII)-phv de fusión traduccional

[0117] Este ejemplo describe el gen sintético diseñado para sobreexpresar la fusión del dominio de unión a mucina de Lactobacillus reuteri 1063 con el amino terminal de la fitasa de Citrobacter braakii.

[0118] De 5' a 3', la construcción contiene respectivamente (tabla 5):

-) la región promotora de amyQ de B. sutbilis

-) el péptido señal del gen ytwD de B. subtilis (que codifica los 32 primeros AA)

-) 390 AA de Mub1 de Lactobacillus reuteri 1063 (repeticiones RI+RII) entre la posición 549 y la posición 939 en la secuencia Genebank AF120104 (Roos y Jonsson, 2002)

-) un espaciador de diez alaninas (que incluye un sitio de restricción PvuW)

-) el gen appA de la fitasa de Citrobacter brakii con optimización de pares de codones con sus primeros 22 AA eliminados (péptido señal)

-) una secuencia de 56 pb que contiene respectivamente un sitio de escisión de trombina, una etiqueta de hexahistidina, dos codones de parada sucesivos y un sitio de escisión Nhe\.

Tabla 5. Secuencia de la fusión traduccional MubBP(RI+RII)-phy. Los sitios de clonación BamHl, Sa/I, PvuW y Nhe\ están en negrita subrayada. La región espadadora de alanina está en mayúsculas subrayadas. La secuencia de fitasa con optimización de pares de codones está en mayúsculas en cursiva. La etiqueta de His está en minúsculas en negrita. Los codones de parada están en mayúsculas en negrita. La señal peptídica está en minúsculas subrayadas. El promotor está en minúsculas en cursiva.

cggccgcccagactgtccgctgtgtaaaaaataggaataaaggggggttg ttattattttactgatatgtaaaatataatttgtataagaaaatgagagg gagaggaaattaattaaaaaaggagcgatttacatatgagttatgcagtt tgtagaatgcaaaaagtgaaatcagggGGATCCagaaaggaggtgatcca atgaacacactggcaaactggaagaagtttttgcttgtggcggttatcat ttgttttttggttccáatLátgacáááágcggágattgcggáágctgctg tcgacGTTGTTTATGTAGCTGACACGCAAGAAGCTGCCATCAGCTTCTAT GACGAGACAGACCACAAGCCACTGAATGACCAAACGATTCAGCAGACTGG CAAGACTGGTGAAAAGATCAGCCATACCGAAGCTAATCAAACACTGGCTA AGCTGGGAAAGCAAGGCTATGTTGTAGACCAGAATACTTTTGCTGATGAT GCAACGTATGACAACGATACGCAAGCACCACAAGAGTTTACGATCTACCT CAAGCATGATACGACCCATACTGACGCAACTAGCTCAAAGGCAGATCAAA AGACCGTCAGCGAAACGATTCACTACGTCTACAAAGATGGGGTCAACGCT AATAAGCCGGTAGCTGATGACGCTAATACAACGGTTACCTTCAAACGCGG CTACACGACTGACAAAGTTACGGGAAAGATTGTTTCCTATGATCCTTGGA CGGTTGATGGCAAGCAAGCCGACAGCAAGACGTTTGATGCCGTCAAGAGT CCAGTCATTGCTGGTTACACGGCCGATCAAGCAGAAGTTGCCGCTCAAAC GGTAACGCCAGATTCCCAAAATATTAACAAGACAGTTTACTATACCGCTG ACACGCAAGAAGCTGCCATCAACTTCTATGACGAGACAGGCCACAAGCTG TTAGATAACCAAACGATTCATTTGACTGGCAAGACCGGTGAAAAGGTAGA CCGGACGCAAGCGGACCAGACGTTGGCTGATCTGGTAAAGCAAGGCTATG TTTTGGATAAAGAAAACACGGCCAAGGCATTCCCAGCTAACGCGGTAT ATGACAACAATGACCAAACGCCACAAGAGTTTACGATCTACCTCAAGC ATG G TACG ACCCATACTG ACG CAACCAG CTCAAAG G CAG ATCAAAAG A CCGTCAGCGAAACGATTCACTACGTCTACAAAGATGGGGTCAACGCTA ATAAGCCGGTAGCTGATGACGCTAATACAACGGTTACCTTCAAACGCG GCTACACGACTGACAAAGTTACGGGAAAGATTGTTTCCTATGATCCTT GGACGGTTGATGGCAAGCAAGCCGACAGCAAGACGTTTGATGCCGTCA AGAGTCCAGTCATTGCTGGTTACACGGCCGATCAAGCAGAAGTTGCCG CTCAAACGGTAACGCCAGATTCCCAAAATATTAACAAGACACAGCTGC TGCTGCG GCTGCGG CAGCAGAAG AACAAAACG GCArGAAGCTTG AACG CGTTGTCATTGTCAGCAGACACGGCGTTCGTGCGCCGACAAAATTCAC

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TAATAAGCTAGC

EJEMPLO 12 - producción de la fusión MubBP(RI+RII)-phy

[0119] Este ejemplo describe la construcción de la cepa de B. subtilis BSPB33 diseñada para sobreexpresar la MubBP(RI+RII)-phy y su purificación.

[0120] El gen sintético MubBP(RI+RII)-phy se insertó en un plásmido multicopia transformado luego en una cepa de B. subtilis deficitaria en proteasa como conoce la gente experta en la técnica. Después de purificar según el procedimiento descrito en la sección de Metodología general, se obtuvo una fusión MubBP(RI+RII) con una actividad de fitasa específica de 3500 U/g.

EJEMPLO 13 - unión de afinidad por mucina del fusión MubBP(RI+RII)-phv

[0121] Este ejemplo demuestra la unión in vitro de la fusión MubBP(RI+RII)-phv purificada con mucina.

[0122] La figura 5 muestra una transferencia puntual con la fusión MubBP(RI+RII)-phv. Dos cantidades diferentes de mucina se han localizado en una membrana antes de ser incubadas con una cantidad constante de fusión MubBP(RI+RII)-phv (30 nM). El revelado se realizó mediante ELISA usando un anticuerpo primario dirigido contra la etiqueta de his de la fusión traduccional.

EJEMPLO 14 - diseño de MubBP(R5+R6)-phv de fusión traduccional

[0123] Este ejemplo describe el gen sintético diseñado para sobreexpresar la fusión del dominio de unión a mucina R5 v R6 de Lactobacillus reuteri 1063 con el amino terminal de la fitasa de Citrobacter braakii.

[0124] De 5' a 3', la construcción contiene respectivamente (tabla 6):

-) la región promotora de amyQ de B. sutbilis

-) el péptido señal del gen ytwD de B. subtilis (que codifica los 32 primeros AA)

-) 370 AA de repeticiones R5+R6 de Lactobacillus reuteri 1063 entre la posición 2105 v la posición 2475 en la secuencia Genebank AF120104 (Roos v Jonsson, 2002)

-) un espaciador de diez alaninas (que incluve un sitio de restricción Pvull)

-) el gen appA de la fitasa de Citrobacter brakii con optimización de pares de codones con sus primeros 22 AA eliminados (péptido señal)

-) una secuencia de 56 pb que contiene respectivamente un sitio de escisión de trombina, una etiqueta de hexahistidina, dos codones de parada sucesivos v un sitio de escisión Nhel.

Tabla 6. Secuencia de la fusión traduccional MubBP(R5+R6)-phv. Los sitios de clonación BamHI, Sa/I, PvuII v NheI están en negrita subravada. La región espaciadora de alanina está en mavúsculas subravadas. La secuencia de fitasa con optimización de pares de codones está en mavúsculas en cursiva. La etiqueta de His está en minúsculas en negrita. Los codones de parada están en mavúsculas en negrita. La señal peptídica está en minúsculas subravadas. El promotor está en minúsculas en cursiva.

c g g c c g c c c a g a c tg t c c g c tg tg ta a a a a a ta g g a a ta a a g g g g g g fc tg f c t a t f c a t t t t a c t g a t a t g f c a a a a t a t a a t t t g t a t a a g a a a a t g a g a g g g a g a g g a a a t t a a t t a a a a a a g g a g c g a t t t a c a t a t g a g t t a t g c a g t t tg ta g a a tg c a a a a a g tg a a a tc a g g g G G A T C C a g a a a g g a g g tg a tc c a a t q a a c a c a c t q q c a a a c t q q a a q a a q t t t t t q c t t q t g q c q q t t a t c a t t t q t t t t t t q g t t c c a a t t a t q a c a a a a q c q q a q a t t q c q q a a q c t q c t g t c q a c AGAAAGGAGGTGATCCAATGAACACACTGGCAAACTGGAAGAAGT TTTTGCTTGTGGCGGTTATCATTTGTTTTTTGGTTCCAATTATGACAAAA GCGGAGATTGCGGAAGCTGCTGTCGACGGTTATGAACTGTTCAAGGACAA CTTCCCAGCAGGTGAGAAGTTCGATAACGATGACACCAACGATCAATTCT ACACGGTAATCTTCAAGCACCATCGTGAAAACGTTGATCCAAACCACTCC TCGGCTGATGGCACGAAGGGTACGAAGACGCTGACGGAAACGGTTCACTA CAAGTACGCTAATGGCACCAAGGCGGCTGAAGATCAGACGGCTCAGGTAA CGTTTACGCGGAACGGTGTCCTGGATGACGTTACGGGTATCGTGGCCTGG GGCAAGTGGAACGAAGCCAGCCAGAGCTACAAGGCTTTGACTTCACCAAC GATTGCCGGCTACGCGCCAAGCGAAGCGGTGGTAAAGCGCAGTTCCAACA GCGATGCCGAACAAGGCCCAACGCTTACGGTCATCTACACGGCTGATGCC CAAAAGGTTCACGTTCAATACATTGATGGTGAAACTGACCAGATGCTGCG TCAGGATGATTTGGACGGCTACACGGATGAAACGATTCCTTACAGCACGG CTGAAGGCATCAAGAAGTTTGAAGGCGACGGTTATGAACTGTTCAAGGAC AACTTCCCAGCAGGTGAGAAGTTCGATAACGATGACAAGAATGACCAAAC CTACACGGTAATCTTCAAGCACCATCGTGAAAACGTTGATCCAAACCACT CCTCGGCTGATGGCACGAAGGGTACGAAGACGCTGACGGAAACGGTTCAC TACAAGTACGCAGATGGTACCAAGGCCGCTGAAGATCAGACGGCTCAGGT AACGTTTACGCGGAACGGTGTCCTGGATGACGTTACGGGTATCGTGGCCT GGGGCAAGTGGAACGAAGCCAGCCAGAGCTACAAGGCTTTGACTTCACCA ACGATTGCCGGCTACACGCCAAGCGAAGCGGTGGTAAAGCGCAGTTCCAA CAGCGATGCCGAACAAGGCCCAACGCTTACGGTCATCTACACGGCTGATG CCCAAAAGGTTCACGTTCAATACATTGATGGTGAAACTGACCAGATGCTG CGTCAGGATGATTTGGACGGCTACACGGATGAAACGATTCCTTACAGCAC GGCTGAAGGCATCAAGAAGTTTGAAGGCGACGCAGCAGCTGGTGCCGCGG CGGChGChGCAGAAGAACAAAACGGCATGAAGCTTGAACGCGTTGTCATT GTCAGCAGACACGGCGTTCGTGCGCCGACAAAATTCACACCGATTATGAA GGATGTGACACCTGACCAATGGCCGCAATGGGATGTGCCGCTCGGCTGGC TGACGCCAAGAGGCGGAGAGCTTGTTTCTGAGCTCGGACAATATCAGCGC TTGTGGTTTACAAGCAAAGGTCTCCTGAATAACCAAACGTGCCCATCTCC AGGACAAGTAGCTGTTATCGCTGACACTGATCAGCGGACAAGAAAAACAG GCGAA GCA T TTTTGGCAGGG C T TGCGCCGAAA TGCCAAA TTCAAG TA CA C

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c c g c g c g g c a g c a g c a g c g g c c a c c a c c a c c a c c a c c a c T A A T A A G C T A G

G

EJEMPLO 15 - diseño de SpaB-phv de fusión traduccional

[0125] Este ejemplo describe el gen sintético diseñado para sobreexpresar la fusión del dominio de adhesión de SpaB de Lactobacillus rhamnosus GG con el amino terminal de la fitasa de Citrobacter braakii.

[0126] De 5' a 3', la construcción contiene respectivamente (tabla 7):

-) la región promotora de amyQ de B. sutbilis

-) el péptido señal del gen ytwD de B. subtilis (que codifica los 32 primeros AA)

-) 177 AA del dominio de adhesión de Lactobacillus rhamnosus GG entre la posición 27 y la posición 203 en la secuencia LGG_00443

-) un espaciador de diez alaninas (que incluye un sitio de restricción PvuW)

-) el gen appA de la fitasa de Citrobacter brakii con optimización de pares de codones con sus primeros 22 AA eliminados (péptido señal)

-) una secuencia de 56 pb que contiene respectivamente un sitio de escisión de trombina, una etiqueta de hexahistidina, dos codones de parada sucesivos y un sitio de escisión Nhe\.

Tabla 7. Secuencia de la fusión traduccional SpaB-phy. Los sitios de clonación BamHl, SalI, PvuW y Nhe\ están en negrita subrayada. La región espadadora de alanina está en letra minúscula subrayada en cursiva. La secuencia de fitasa con optimización de pares de codones está en mayúsculas en cursiva. La etiqueta de His está en minúsculas en negrita. Los codones de parada están en mayúsculas en negrita. La señal peptídica está en minúsculas subrayadas. El promotor está en minúsculas en cursiva.

cggccgcccagactgtccgctgtgtaaaaaataggaataaaggggggttg

a gagaggaaattaattaaaaaaggagcgatttacatatgagttatgcagtt tgtagaatgcaaaaagtgaaatcagggGGATCCagaaaggaggtgatcca atgaacacactggcaaactggaagaagtttttgcttgtggcggttatcat ttgttttttqqttccaattatqacaaaaqcgqaqattgcqgaaqctgctg

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GCTAGC

EJEMPLO 16 - diseño de Msa-phv de fusión traduccional

[0127] Este ejemplo describe el gen sintético diseñado para sobreexpresar la fusión del dominio de lectina similar a conA de adhesión específica a mañosa Msa de Lactobacillus platarum con el amino terminal de la fitasa de Citrobacter braakii.

[0128] De 5' a 3', la construcción contiene respectivamente (tabla 8):

-) la región promotora de amyQ de B. sutbilis

-) el péptido señal del gen ytwD de B. subtilis (que codifica los 32 primeros AA)

-) dominio de lectina similar a la concavalina de Lactobacillus plantarum Msa: 257 AA entre la posición 263 y la posición 517 en la secuencia EHS83650

-) un espaciador de diez alaninas (que incluye un sitio de restricción PvuW)

-) el gen appA de la fitasa de Citrobacter brakii con optimización de pares de codones con sus primeros 22 AA eliminados (péptido señal)

-) una secuencia de 56 pb que contiene respectivamente un sitio de escisión de trombina, una etiqueta de hexahistidina, dos codones de parada sucesivos y un sitio de escisión Nhe\.

Tabla 8. Secuencia de la fusión traduccional Msa-phy. Los sitios de clonación BamHl, Sa/I, PvuW y Nhe\ están en negrita subrayada. La región espadadora de alanina está en letra minúscula subrayada en cursiva. La secuencia de fitasa con optimización de pares de codones está en mayúsculas en cursiva. La etiqueta de His está en minúsculas en negrita. Los codones de parada están en mayúsculas en negrita. La señal peptídica está en minúsculas subrayadas. El promotor está en minúsculas en cursiva.

c g g c c g c c c a g a c t g t c c g c t g t g t a a a a a a t a g g a a t a a a g g g g g g t t g t t a t t a t t t t a c t g a t a t g t a a a a t a t a a t t t g t a t a a g a a a a t g a g a g g g a g a g g a a a t t a a t t a a a a a a g g a g c g a t t t a c a t a t g a g t t a t g c a g t t tg ta g a a tg c a a a a a g tg a a a tc a g g g G G A T C C A G A A A G G A G G T G A T C C A ATGAACACACTGGCAAACTGGAAGAAGTTTTTGCTTGTGGCGGTTATCAT TTGTTTTTTGGTTCCAATTATGACAAAAGCGGAGATTGCGGAAGCTGCTG TCGACTCTGATGAAGCGGCCTTGACTCATGTAGACAAGGACAATTTCCTA AAGTATTTTAGTTTGAACGGATCTGCAACATATGATGCCAAGACGGGAAT TG TAAC TATTACG CC CAATC AAAATAATCAAG TTG G TAATTTTTC ATTAA CCAGTAAGATTGATATGAATAAAAGCTTTACATTAACTGGTCAGGTAAAT CTGGGGTCTAACCCGAATGGTGCGGATGGAATTGGGTTTGCTTTTCACAG TGGCAATACAACTGACGTGGGAAATGCTGGTGGTAATTTAGGTATTGGTG GATTGCAAGACGCTATCGGGTTCAAGCTAGACACATGGTTTAATAGCTAC CAAGCAC CAT CATCAGATAAAAAT GGGAGT GAAAT CTCATCAACAAATT C TAATGGCTTTGGTTGGAATGGTGACTCAGCCAACGCACGATATGGCACCT TTGTCAAGACGAGTAACCAAGAAATTTCGACTGCGAATGGTTCTAAGGTA CAGCGATGGTGGGCTCAAGATACAGGAGAGTCGCAGGCGTTAAGTAAAGC G G ATATTGATG GTAACTTTCATG ATTTTG TAG TTAACTATG ATG GTGCTA CAAGAACGTTAACCGTTAGTTATACGCAAGCTAGTGGTAAAGTATTAACT TGGAAGACGACTGTTGACAGTTCTTATCAAGCAATGGCCATGGTTGTCAG T GCAT CAACT GGTGCAGC TAAAAATT TACAACAAT T TAAGT T GAC TAGC T TCGATTTTCAAGAAGCAGCGGC A G C A G c lg c tg c c g c g g c g g c a g c a g c a GAAGAACAAAACGGCATGAAGCTTGAACGCGTTGTCATTGTCAGCAGACA CGGCGTTCGTGCG CC GA CAAAA TTCA CACO GA T TA TGAAGGA TGTGA CA C CTGACCAATGGCCGCAATGGGATGTGCCGCTCGGCTGGCTGACGCCAAGA GGCGGAGAGCTTGTTTCTGAGCTCGGACAATATCAGCGCTTGTGGTTTAC AAGCAAAGGTCTCCTGAATAACCAAACGTGCCCATCTCCAGGACAAGTAG C TGTTA TCGCTGACAC TGA. TCAGCGGACAAGAAAAA CAGGC GAAGCA T T T TTGGCAGGGCTTGCGCCGAAATGCCAAATTCAAGTACACTATCAAAAAGA CGAAGAAAAAAACGACCCGCTGTTCAACCCGGTTAAAATGGGAAAATGCT CGTTTAACACTCTAAAGGTGAAGAATGCGATTTTAGAGCGTGCCGGCGGA AACATTGAGCTTTACACACAGCGCTA TCAA TCATCTTTCCGTACGCTTGA AAATGTGCTGAACTTCTCTCAATCTGAAACATGCAAAACAACAGAAAAAT CAACAAAA TGCACGCTTCC TGAAGCGCTGCCA TCTGAGTTTAAAG TAACG CCTGACAATGTATCCCTTCCTGGTGCATGGAGCCTTTCCTCAACGCTGAC

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agcagcggccaccaccaccaccaccacTAATAAGCTAGC

EJEMPLO 17 - diseño de tasA BSPI-ofty de fusión traduccional

[0129] Este ejemplo describe la secuencia de genes diseñada para sobreexpresar la fusión de una proteína TasA de la cepa beneficiosa no domesticada B. subtilis BSP1, con el amino terminal de la fitasa de Citrobacter braakii.

[0130] De 5' a 3', la construcción contiene respectivamente (tabla 9):

-) la región promotora de amyQ de B. sutbilis

-) el péptido señal del gen ytwD de B. subtilis (que codifica los 32 primeros AA)

-) secuencia de genes de B. subtilis BSP1 que codifica una proteína TasA de 261 AA (que codifica un componente principal de la matriz de biopelícula), con su codón de terminación eliminado

-) un espaciador de diez alaninas (que incluye un sitio de restricción PvuW)

-) el gen appA de la fitasa de Citrobacter brakii con optimización de pares de codones con sus primeros 22 AA eliminados 15 (péptido señal)

-) una secuencia de 56 pb que contiene respectivamente un sitio de escisión de trombina, una etiqueta de hexahistidina, dos codones de parada sucesivos y un sitio de escisión Nhe\.

Tabla 9. Secuencia de la fusión traduccional tasA BSP^-phy. Los sitios de clonación BamHl, SalI, PvuW y Nhe\ están en negrita subrayada. La región espadadora de alanina está en mayúsculas subrayadas. La secuencia de fitasa con optimización de pares de codones está en mayúsculas en cursiva. La etiqueta de His está en negrita.

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EJEMPLO 18 - construcción de una cepa de B. subtilis que expresa la fusión tasA BSP^-phv

[0131] Este ejemplo describe la construcción de la cepa de B. subtilis BSP1-28 diseñada para sobreexpresar la fusión tasA_BSP'\-phy.

[0132] El gen tasA_BSP1 se amplificó por PCR con un cebador que contiene el sitio de restricción Sail (5-GCATGTCGACATGGGTATGAAAAAGAAATTGAG) y un cebador que contiene PvuW (5-GCATCAGCTGCTGCATTTTTATCCTCGCTGTGCGCTTTTTC). El producto de PCR resultante fue doblemente digerido por las enzimas de restricción Sail y PvuW. Después de la purificación en gel, el fragmento tasA_BSP1 se insertó en un plásmido multicopia (descrito en el ejemplo GS3) que ha sido previamente doblemente digerido por las enzimas de restricción Sail y PvuW. El vector recombinante que lleva la fusión tasA_BSP'\-phy se transformó luego en la cepa B. subtilis 168 como conoce la gente experta en la técnica.

EJEMPLO 19 - actividad de fitasa de la fusión TasA BSP1-Phy de unión a biopelículas

[0133] Este ejemplo demuestra que las fusiones unidas a una biopelícula bacteriana presentan una actividad de fitasa significativa. La figura 6 (actividad de fitasa de la biopelícula de B. subtilis BSP1 suplementada con la proteína de fusión TasA_BSP1-Phy) muestra los histogramas de actividad enzimática de fitasa unida a la biopelícula de B. subtilis BSP1. Después de lavar, la actividad de fitasa de la fusión unida a la biopelícula se evaluó como se describe en la sección "Metodología general". El control preparado omitiendo la mezcla de la proteína de fusión TasA_BSP1-Phy con el precultivo formador de biopelículas de Bacillus subtilis BSP1 indica la actividad de fitasa endógena de B. subtilis. La actividad de fitasa evaluada en la biopelícula que se ha incubado con la proteína de fusión TasA_BSP1-Phy (720 U/mg de proteína total) es significativamente superior a la actividad de fitasa endógena de B. subtilis BSP1. Esta actividad adicional se debe a la fitasa unida a la biopelícula. Una unidad de fitasa se definió como la cantidad de enzima requerida para liberar 1 pmol de fosfato inorgánico a partir de fitato de sodio en 1 min.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Proteína de fusión que comprende un polipéptido de unión a la superficie intestinal unido a una enzima, donde el polipéptido de unión a la superficie intestinal es un dominio de una proteína de unión a moco consistente en el dominio de unión a mucina de Lactobacillus reuteri 1063, y donde la enzima se selecciona del grupo que consiste en fitasa, xilanasa, galactanasa, alfa-galactosidasa, proteasa, fosfolipasa, beta-glucuronidasa, fosfatasa alcalina, amilasa, betaglucanasa y celulasa; o

donde el polipéptido de unión a la superficie intestinal es un dominio de una proteína de unión a moco seleccionado del grupo que consiste en el dominio de unión a mucina de Lactobacillus reuteri 1063, el dominio de lectina similar a conA de adhesión específica a manosa Msa de Lactobacillus plantarum y el dominio de adhesión SpaB de Lactobacillus rhamnosus GG y donde la enzima es una fitasa.

2. Secuencia de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión según la reivindicación 1.

3. Construcción de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 2 operativamente unida a una o más secuencias de control que dirigen la producción de la proteína de fusión en un huésped de expresión adecuado.

4. Vector de expresión recombinante que comprende la construcción de ácido nucleico según la reivindicación 3.

5. Célula huésped recombinante que comprende la construcción de ácido nucleico según la reivindicación 3 y/o el vector de expresión según la reivindicación 4.

6. Método para la producción de la proteína de fusión según la reivindicación 1, que comprende (a) el cultivo de la célula huésped según la reivindicación 5 para producir un sobrenadante que comprende la proteína de fusión y (b) la recuperación de la proteína de fusión.

7. Composición que comprende la proteína de fusión según la reivindicación 1.

8. Composición según la reivindicación 7 que está en forma de granulados o microgranulados.

9. Composición de alimento para animales que comprende la composición según la reivindicación 8 o la proteína de fusión según la reivindicación 1, y

(a) al menos una vitamina liposoluble;

(b) al menos una vitamina hidrosoluble; y/o

(c) al menos un oligoelemento.

10. Composición según la reivindicación 7 o proteína de fusión según la reivindicación 1 para usar en la mejora del valor nutricional de un alimento para animales.

11. Composición según la reivindicación 7 para usar en la promoción de la utilización del alimento en animales.

12. Uso de la composición según la reivindicación 7 para promover la utilización del alimento en animales.