ES2387203T3 - Variantes de fitasa - Google Patents

Abstract

Fitasa que tiene una termoestabilidad mejorada indicada como actividad residual determinada dividiendo unsobrenadante en dos partes, una parte se incuba durante 30 minutos a 60°C, y la otra parte durante 30 minutos a5°C, tras lo cual la actividad de ambas se determina en el p-nitrofenil fosfato a 37°C y pH 5,5, donde la actividadresidual de la fitasa es la actividad de la muestra que ha sido incubada a 60°C dividida por la actividad de la mismamuestra que ha sido incubada a 5°C, donde la actividad residual de la fitasa es al menos un 105% de la actividadresidual de la fitasa de referencia SEC ID NO:2, medida en las mismas condiciones, y dicha fitasa comprende almenos una alteración y no más de 4 alteraciones en comparación con la SEC ID NO:2; donde al menos una dedichas una a cuatro alteraciones se selecciona de las siguientes: 4P, 46E, 107G, 111P, 119K, 162C, 223E, 241Q,273L, 276K, 379K, 385D, 91C/46C, 52C/99C, 31C/176C, 31C/177C, 59C/100C, 141C/199C, 162C/247C,111P/241Q, 31C, 119K, 202N, 286Q, y 362K, R.

Description

Variantes de fitasa

5 Campo de la invención

[0001] La presente invención se refiere a una fitasa derivada de Citrobacter braakii ATCC 51113 y comprende al menos una alteración respecto a esta fitasa (es decir, es una variante de la misma). La invención también se refiere al ADN que codifica estas fitasas, a métodos de su producción, así como al uso de las mismas, por ejemplo, en el

10 alimento para animales y aditivos de alimento. La parte madura de la fitasa Citrobacter braakii ATCC 51113 está incluida en el listado de secuencias como SEC ID NO:2.

Antecedentes de la invención

15 Antecedentes de la técnica

[0002] La secuencia del gen phyA de Citrobacter freundii ha sido presentada por Zinin et al. a las bases de datos EMBL/GenBank/DDBJ con número de acceso AY390262. La secuencia de aminoácidos de fitasa correspondiente se encuentra en las bases de datos UniProt/TrEMBL con número de acceso Q676V7. La parte madura prevista de

20 Q676V7 se incluye en el presente listado de secuencias como SEC ID NO:4.

[0003] La publicación WO-2004/085638 divulga, como SEC ID NO:7, la secuencia de aminoácidos de una fitasa de Citrobacter braakii YH-15, depositada como KCCM 10427. La parte madura de esta secuencia de aminoácidos se incluye en este documento como SEC ID NO: 3. Esta secuencia se encuentra también en la base de datos 25 Geneseqp con número de acceso ADU50737. Esta fitasa (YH-15) fue más tarde clonada en y expresada en Sacchromyces cerevisae mostrando un modelo de glicación modificada y un cambio en la termoestabilidad, cuando se expresa en Sacchromyces cerevisae, Kim et al.: " Molecular cloning of the phytase gene from Citrobacter braakii and its expression in Saccharomyces cerevisiae." Biotechnology Letters 2006, vol. 28, n°. 1. La publicación WO 2006/037328 divulga la fitasa de tipo salvaje de Citrobacter braakii ATCC 51113 (es decir, SEC ID NO:2 en este

30 documento), así como una variante de la misma, la cual también se incluye en el presente listado de secuencias, a saber, como SEC ID NO:6.

[0004] Las publicaciones WO 2006/038062 y WO 2006/038128 revelan ambas la secuencia de aminoácidos del gen de fitasa de Citrobacter freundii P3-42, depositada con número de acceso NCIMB 41247. Esta secuencia de

35 aminoácidos se incluye en este documento como SEC ID NO:9.

[0005] Es un objetivo de la invención proporcionar fitasas de propiedades modificadas, preferiblemente, de propiedades mejoradas. Ejemplos no limitativos de tales propiedades son: termoestabilidad, perfil de temperatura, perfil de pH, actividad específica, rendimiento en el alimento para animales, sensibilidad de proteasa, y/o modelo de

40 glicosilación.

Resumen de la invención

[0006] La presente invención se refiere a una fitasa que tiene una termoestabilidad mejorada indicada como

45 actividad residual determinada dividiendo un sobrenadante en dos partes, una parte se incuba durante 30 minutos a 60°C, y la otra parte durante 30 minutos a 5°C, tras lo cual la actividad de ambas se determina en el fosfato de pnitrofenilo a 37°C y pH 5,5, donde la actividad residual de la fitasa es la actividad de la muestra que ha sido incubada a 60°C dividida por la actividad de la misma muestra incubada a 5°C, donde la actividad residual de la fitasa es al menos 105% de la actividad residual de la fitasa de referencia SEC ID NO:2, medida en las mismas condiciones, y

50 dicha fitasa comprende al menos una alteración y no más de 4 alteraciones en comparación con la SEC ID NO:2 de la cual se selecciona al menos uno de los siguientes: 4P, 46E, 107G, 111P, 119K, 162C, 223E, 241Q, 273L, 276K, 379K, 385D, 91C/46C, 52C/99C, 31C/176C, 31C/177C, 59C/100C, 141C/199C, 162C/247C, 111P/241Q, 31C, 119K, 202N, 286Q, y 362K,R.

55 [0007] La invención también se refiere al ADN que codifica estas fitasas, métodos de su producción, así como el uso del mismo, por ejemplo, en el alimento para animales y aditivos de alimento.

Breve descripción de los dibujos

60 [0008]

La Fig. 1 corresponde a la Tabla 2 de la publicación WO 2006/038062 y divulga varias variantes de la fitasa Citrobacter freundii NCIMB 41247 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:9 y la Fig. 2 es una alineación de las fitasas de la SEC ID NO:2 y 9.

65 [0009] Los números de posición en la Fig. 1 se refieren a la numeración de la SEC ID NO:9. Las posiciones de la SEC ID NO:2 correspondientes se pueden encontrar por deducción de 22 (p. ej., la variante P229S de la Fig.1 significa variante P207S usando la numeración de la presente aplicación).

5 Descripción detallada de la invención

[0010] En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una fitasa que tiene una termoestabilidad mejorada indicada como actividad residual determinada dividiendo un sobrenadante en dos partes, una parte se incuba durante 30 minutos a 60°C, y la otra parte durante 30 minutos a 5°C, tras lo cual la actividad de ambas se determina 10 sobre el fosfato de p-nitrofenilo a 37°C y pH 5,5, donde la actividad residual de la fitasa es la actividad de la muestra incubada a 60°C dividida por la actividad de la misma muestra que ha sido incubada a 5°C, donde la actividad residual de la fitasa es al menos 105% de la actividad residual de la fitasa de referencia SEC ID NO:2, medida en las mismas condiciones, y dicha fitasa comprende al menos una alteración y no más de 4 alteraciones en comparación con la SEC ID NO:2 de la cual se selecciona al menos uno de los siguientes: 4P, 46E, 107G, 111 P, 119K, 162C,

15 223E, 241Q, 273L, 276K, 379K, 385D, 91C/46C, 52C/99C, 31C/176C, 31C/177C, 59C/100C, 141C/199C, 162C/247C, 111P/241Q, 31C, 119K, 202N, 286Q, y 362K,R.

[0011] El porcentaje de identidad se determina como se describe en la sección "Polipéptidos de fitasa, porcentaje de identidad".

20 [0012] Los números de posición se refieren a la numeración de posición de la SEC ID NO:2, como se describe en la sección "Numeración de posición." Las posiciones correspondientes a estos números de posición SEC ID NO:2 en otras fitasas se determinan como se describe en la sección "Identificación de los números de posición correspondientes."

25 [0013] La fitasa de la invención es una variante de la fitasa de la SEC ID NO:2, a saber, no es idéntica a la SEC ID NO:2, puesto que comprende al menos una alteración en comparación con la SEC ID NO:2.

[0014] En una forma de realización particular, la fitasa de la invención comprende al menos una alteración en

30 comparación con la SEC ID NO:2 en al menos una posición seleccionada de las siguientes: 4P, 46E, 107G, 111P, 119K, 162C, 223E, 241Q, 273L, 276K, 379K, 385D, 91C/46C, 52C/99C, 31C/176C, 31C/177C, 59C/100C, 141C/199C, 162C/247C, 111P/241Q, 31C, 119K, 202N, 286Q, y 362K,R.

[0015] La nomenclatura usada en este documento para alteraciones se describe en detalle en la sección 35 "Alteraciones, tales como sustituciones, deleciones, inserciones."

[0016] La fitasa de la invención puede ser una variante de cualquier tipo salvaje o fitasa variante. En formas de realización particulares, es una variante de la fitasa de la SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, SEC ID NO:4, SEC ID NO:6, SEC ID NO:9, o una variante de cualquiera de las variantes de fitasa relacionadas con la SEC ID NO:9 y listada en

40 la Fig.1.

[0017] La fitasa de la invención puede además comprender al menos una alteración (sustitución) o una combinación de alteraciones (sustituciones) y no más de 4 alteraciones en comparación con la SEC ID NO:2 seleccionadas de entre las alteraciones (sustituciones) y combinaciones de alteraciones (sustituciones) listadas en cada fila de la

45 Fig.1.

[0018] La invención también se refiere a una fitasa que tiene al menos una alteración y no más de 4 alteraciones en comparación con la SEC ID NO:2 y que comprende al menos una de las siguientes alteraciones:

50 (i) 141C/199C, 91C/46C, 52C/99C, 31C/176C, 31C/177C, 59C/100C, y/o 162C/247C;

(ii) 4P, 111 P, 111P/241Q;

(iii) 119K;

(iv) 46E, 276K, 379K, 385D, y 362K,R.

55 Estrategia para preparar variantes

[0019] La estructura de la fitasa C. braakii ATCC 51113 fue construida mediante modelado por homología, usando como molde la estructura de la fitasa AppA de E. Coli (Protein Data Bank id.: 1DKO; Lim et al., Nat. Estruct. Biol. (2000), vol. 2, págs. 108-113).

60 [0020] La estructura fue sometida a simulaciones de dinámica molecular (DM) y cálculos electroestáticos. Las posiciones para puentes disulfuro putativos y prolinas fueron también identificadas, así como otras posiciones de importancia potencial en lo que respecta a las diversas propiedades enzimáticas deseables. Finalmente, los sitios de glicosilación putativa (tramos de NXT o NXS) fueron identificados.

[0021] Todas estas sugerencias fueron evaluadas en el marco de la estructura modelada y los resultados de la simulación, para la propiedad de termoestabilidad con énfasis particular en la alta temperatura final.

[0022] Las variantes de fitasa correspondientes fueron preparadas a través de métodos conocidos en la técnica y evaluadas como se describe en la parte experimental.

Polipéptidos de fitasa, porcentaje de identidad

[0023] En el presente contexto, una fitasa es un polipéptido con actividad de fitasa, es decir, una enzima que cataliza la hidrólisis de fitato (mioinositol hexakisfosfato) a (1) mioinositol y/o (2) mono-, di-, tri-, tetra- y/o pentafosfatos de los mismos y (3) fosfato inorgánico.

[0024] En el presente contexto el término sustrato de fitasa abarca, p.ej., ácido fítico y cualquier fitato (sal de ácido fítico), así como los fosfatos listados en el punto (2) más arriba.

[0025] El sitio web de ENZYME en internet (http://www.expasy.ch/enzyme/) es un repositorio de información relativa a la nomenclatura de enzimas. Está basado principalmente en las recomendaciones del Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (IUB-MB) y describe cada tipo de enzima caracterizada para la cual se ha proporcionado un número EC (Bairoch A. The ENZYME database, 2000, Nucleic Acids Res 28:304-305). Véase también el manual Enzyme Nomenclature de NC-IUBBM, 1992).

[0026] Según el sitio web de ENZYME, se conocen tres diferentes tipos de fitasas: una fitasa denominada 3-fitasa (nombre alternativo 1-fitasa; una mioinositol hexafosfato 3-fosfohidrolasa, EC 3.1.3.8), una fitasa denominada 4fitasa (nombre alternativo 6-fitasa, nombre basado en el sistema de numeración 1L y no en la numeración 1D, EC 3.1.3.26), y una fitasa denominada 5-fitasa (EC 3.1.3.72). Para los fines de la presente invención, los tres tipos se incluyen en la definición de fitasa.

[0027] En una forma de realización particular, las fitasas de la invención pertenecen a la familia de fosfatasas ácidas histidina, que incluye la fosfatasa ácida de pH 2,5 de Escherichia coli (gen appA) así como fitasas fúngicas tales como fitasas A y B de Aspergillus awamorii (EC: 3.1.3.8) (gen phyA y phyB). Las fosfatasas ácidas histidina comparten dos regiones de similitud de secuencia, cada una centrada alrededor de un residuo de histidina conservada. Estas dos histidinas parecen estar implicadas en el mecanismo catalítico de las enzimas. La primera histidina está localizada en la sección N-terminal y forma una histidina de fósforo intermedia mientras la segunda está localizada en la sección C-terminal y posiblemente actúa como donante de protón.

[0028] En una forma de realización particular adicional, las fitasas de la invención tienen un motivo de sitio activo conservado, a saber, R-H-G-X-R-X-P, donde X designa cualquier aminoácido (véase aminoácidos 16 a 22 de la SEC ID NOs: 2, 3, 4, 6 y aminoácidos 38-44 de la SEC ID NO:9). En una forma de realización preferida, el motivo de sitio activo conservado es R-H-G-V-R-A-P, es decir, los aminoácidos 16-22 (por referencia a la SEC ID NO:2) son RHGVRAP.

[0029] Para los fines de la presente invención la actividad de fitasa se determina en la unidad de FYT, siendo un FYT la cantidad de enzima que libera 1 micromol de ortofosfato inorgánico por min. bajo las siguientes condiciones: pH 5,5; temperatura 37°C; sustrato: fitato de sodio (C6H6O24P6Na12) en una concentración de 0,0050 mol/l. Ensayos de fitasa adecuados son los ensayos FYT y FTU descritos en el Ejemplo 1 de la publicación WO 00/20569. FTU es para determinar la actividad de fitasa en el alimento y premezclas. La actividad de fitasa también puede ser determinada usando los ensayos del Ejemplo 1 ("Determinación de la actividad de la fosfatasa” o "Determinación de la actividad de la fitasa").

[0030] En una forma de realización particular la fitasa de la invención está aislada. El término "aislada" como se utiliza en este caso se refiere a un polipéptido que es al menos un 20% puro, preferiblemente al menos un 40% puro, más preferiblemente al menos un 60% puro, incluso aún más preferiblemente al menos un 80% puro, de la forma más preferible al menos un 90% puro, e incluso aún más preferible al menos un 95% puro, según lo determinado por SDS-PAGE. En particular, se prefiere que los polipéptidos estén en "forma esencialmente pura", es decir, que la preparación de polipéptido está esencialmente liberada de otro material de polipéptido con el cual está originalmente asociada. Esto se puede lograr, por ejemplo, preparando el polipéptido mediante métodos recombinantes bien conocidos o por métodos de purificación tradicional.

[0031] La relación entre dos secuencias de aminoácidos es descrita por el parámetro "identidad". Para fines de la presente invención, la alineación de dos secuencias de aminoácidos se determina mediante el uso del programa Needle del paquete EMBOSS (http://emboss.org) versión 2.8.0. El programa Needle implementa el algoritmo de alineación global descrito en Needleman, S. B. y Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453. La matriz de sustitución usada es BLOSUM62, la penalización por abertura de gap (hueco) es 10, y penalización por extensión de gap es 0,5.

[0032] El grado de identidad entre una secuencia de aminoácidos de la presente invención ("secuencia de la invención") y la secuencia de aminoácidos a la que se hace referencia en las reivindicaciones (SEC ID NO:2) se calcula como el número de coincidencias exactas en una alineación de las dos secuencias, dividido por la longitud de la "secuencia de la invención," o la longitud de la SEC ID NO:2, la que sea más corta. El resultado se expresa en porcentaje de identidad.

[0033] Una coincidencia exacta ocurre cuando la "secuencia de la invención" y la SEC ID NO:2 tienen residuos de aminoácidos idénticos en las mismas posiciones de la superposición (en el ejemplo de alineación más abajo esto está representado con "I" ). La longitud de una secuencia es el número de residuos de aminoácidos en la secuencia

(p. ej., la longitud de aminoácidos 1-411 de la SEC ID NO:2 es 411).

[0034] El Ejemplo 13 es un ejemplo de una alineación de la fitasa de la SEC ID NO:2 y la fitasa de la SEC ID NO:9, y el ejemplo ilustra cómo calcular el porcentaje de identidad entre estas dos cadenas principales.

[0035] En otro ejemplo de alineación, puramente hipotético, más abajo, el solapamiento es la secuencia de aminoácidos "HTWGERNL" de la Secuencia 1; o la secuencia de aminoácidos "HGWGEDANL" de la Secuencia 2. En el ejemplo un gap se indica con un "-".

[0036] Ejemplo de alineación hipotética:

Secuencia 2: HGWGEDANLAMNPS

[0037] En una forma de realización particular, el porcentaje de identidad de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido con, o para, la SEC ID NO:2 es determinado i) alineando las dos secuencias de aminoácidos usando el programa Needle, con la matriz de sustitución BLOSUM62, una penalización por abertura de gap de 10, y una penalización por extensión de gap de 0,5 ii) contando el número de coincidencias exactas en la alineación; iii) dividiendo el número de coincidencias exactas por la longitud de la secuencia de aminoácidos más corta de las dos secuencias de aminoácidos, y iv) convirtiendo el resultado de la división de iii) en el porcentaje.

[0038] En el ejemplo hipotético anterior, el número de coincidencias exactas es 6, la longitud de la más corta de las dos secuencias de aminoácidos es 12; por consiguiente el porcentaje de identidad es del 50%.

Numeración de posición

[0039] La nomenclatura usada en este documento para definir las posiciones de aminoácidos se basa en la secuencia de aminoácidos de la fitasa derivada de Citrobacter braakii ATCC 51113, cuya secuencia madura se da en el listado de secuencia como la SEC ID NO:2 (aminoácidos 1-411 de la SEC ID NO:2). Por consiguiente, en el presente contexto, la base para posiciones de numeración es la SEC ID NO:2 empezando con E1 y finalizando con E411.

[0040] Cuando en este documento se usa el término parte (o secuencia) "madura" se refiere a la parte del polipéptido que es segregada por una célula que contiene, como parte de su equipamiento genético, un polinucleótido que codifica el polipéptido. En otras palabras, la parte madura del polipéptido se refiere a la parte del polipéptido que permanece después de que la parte de péptido señal, así como una parte de propéptido, si la hay, ha sido escindida. La parte de péptido señal puede ser predecida por programas conocidos en la técnica (p. ej. SignalP). La parte de péptido señal prevista de la SEC ID NO:2 se incluye en el presente listado de secuencias como SEC ID NO:8, que es codificada por la SEC ID NO:7. La SEC ID NO:2 es la parte madura prevista. Generalmente, el primer aminoácido de la parte madura de una enzima se puede determinar mediante la secuenciación N-terminal de la enzima purificada. Cualquier diferencia entre la parte de péptido señal y la parte madura debe entonces deberse a la presencia de un propéptido.

Alteraciones, tales como sustituciones, deleciones, inserciones

[0041] Una variante de fitasa puede comprender varios tipos de alteraciones en relación a un molde (es decir, una secuencia de aminoácidos de referencia o comparativa tal como la SEQ ID NO:2): un aminoácido puede ser sustituido por otro aminoácido; un aminoácido puede ser eliminado; un aminoácido puede ser insertado; al igual que cualquier combinación de cualquier número de alteraciones de este tipo. En el presente contexto, el término "inserción" tiene como objetivo abarcar también las extensiones N- y/o C-terminal.

[0042] La nomenclatura general usada en este documento para una única alteración es la siguiente: XDcY, donde "X" e "Y" designan independientemente un código de aminoácido de una sola letra, o un "*" (deleción de un aminoácido), "D" designa un número, y "c" designa un contador alfabético (a, b, c, etcétera), que únicamente está presente en inserciones. Se hace referencia a la Tabla 1 más abajo que describe ejemplos puramente hipotéticos de la aplicación de esta nomenclatura para varios tipos de alteraciones.

Tabla 1

Tipo

Descripción Ejemplo

Sustitución

X=Aminoácido en molde D=Posición en el molde c vacío Y=Aminoácido en variante G80A

Inserción

X="*" D=Posición en el molde antes de la inserción c="a" para la primera inserción en esta posición, "b" para la siguiente, etc *80aT *80bY *85aS

Deleción

X=Aminoácido en el molde D=Posición en el molde c vacío Y="*" V81*

Extensión N-terminal

Inserciones en posición "0". *0aA *0bT *0cG

Extensión C-terminal

Inserciones después del aminoácido N-terminal *275aS *275bT

5 [0043] Como se explica más arriba, el número de posición ("D") se cuenta a partir del primer residuo de aminoácido de la SEC ID NO:2.

[0044] Las diferentes alteraciones en la misma secuencia se separan por "/" (barra), por ejemplo, la designación

10 "1*/2*/3*" significa que los aminoácidos en el número de posición 1, 2, y 3 se eliminan todos, y la designación "104A/105F" significa que el aminoácido en el número de posición 104 se sustituye por A, y el aminoácido en el número de posición 105 se sustituye por F.

[0045] Las alteraciones alternativas se separan por "," (coma), p.ej., la designación "119R,K" significa que el 15 aminoácido en la posición 119 se sustituye por R o K.

[0046] Las comas usadas en este documento en otras varias enumeraciones de posibilidades significan lo que estas normalmente hacen gramaticalmente, a saber, frecuentemente y/o. P.ej., la primera coma en el listado "53V,Q, 121 D, y/o 167Q" denota una alternativa (V o Q), mientras que las dos comas siguientes deberían ser interpretadas como

20 opciones y/o: 53 V o Q, y/o 121 D, y/o 167Q.

[0047] En el presente contexto, "por lo menos uno" (p. ej. alteración) significa uno o más, p.ej. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,

o 10 alteraciones; o 12, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 24, 25, 28, o 30 alteraciones; etcétera, hasta un número máximo de

alteraciones de 125, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, o de 200. Las variantes de fitasa de la invención, no obstante, todavía deben ser por lo menos un 74% idénticas a la SEC ID NO:2, siendo determinado este porcentaje como se ha descrito anteriormente.

[0048] Una sustitución o extensión sin ninguna indicación de qué sustituir o extender se refiere a la inserción de cualquier aminoácido natural, o no natural, exceptuando el que ocupa esta posición en el molde.

[0049] El Ejemplo 13 proporciona otra ilustración de cómo aplicar esta nomenclatura.

Identificación de los números de posición correspondientes

[0050] Como se ha explicado anteriomente, la fitasa madura de Citrobacter braakii ATCC 51113 (SEC ID NO:2) se usa como el estándar para la numeración de posición y, de ese modo, también para la nomenclatura.

[0051] Para otra fitasa, en particular una variante de fitasa de la invención, la posición correspondiente a la posición D en la SEC ID NO:2 se encuentra alineando las dos secuencias como se ha especificado anteriormente en la sección titulada "Polipéptidos de fitasa, porcentaje de identidad". A partir de la alineación, la posición en la secuencia de la invención correspondiente a la posición D de la SEC ID NO:2 se puede identificar claramente y sin ambigüedad (las dos posiciones en la parte superior de cada una en la alineación).

[0052] El Ejemplo 13 es un ejemplo de una alineación de la fitasa de la SEC ID NO:2 y la fitasa de la SEC ID NO:9, y el ejemplo ilustra cómo se identifican las posiciones correspondientes en estas dos cadenas principales.

[0053] A continuación, se incluyen algunos ejemplos adicionales, puramente hipotéticos, que se derivan de la anterior Tabla 1 que incluye en la tercera columna varias alineaciones de dos secuencias:

[0054] Nótese la tercera celda en la primera fila de la Tabla 1: la secuencia superior es el molde, la inferior es la variante. El número de posición 80 se refiere al residuo de aminoácido G en el molde. El aminoácido A ocupa la posición correspondiente en la variante. Por consiguiente, esta sustitución es designada G80A.

[0055] Nótese ahora la tercera celda en la segunda fila de la Tabla 1: la secuencia superior es otra vez el molde y la inferior, la variante. El número de posición 80 se refiere de nuevo al residuo de aminoácido G en el molde. La variante tiene dos inserciones, a saber, TY, después de G80 y antes de V81 en el molde. Mientras que la T y la Y, por supuesto, tendrían su propio número de posición "real" en la secuencia de aminoácidos variante, para los fines presentes siempre se hace referencia a los números de posición de molde, y por consiguiente se dice que la T y la Y están en el número de posición 80a y 80b, respectivamente.

[0056] Finalmente, nótese la tercera celda en la última fila de la Tabla 1: el número de posición 275 se refiere al último aminoácido del molde. Se dice que una extensión C-terminal de ST está en el número de posición 275a y 275b, respectivamente, aunque, nuevamente, por supuesto tienen su propio número de posición "real" en la secuencia de aminoácidos variante.

Propiedades modificadas, fitasa de referencia

[0057] En una forma de realización particular, la fitasa de la invención ha modificado, preferiblemente mejorado, propiedades. Los términos "modificado" y "mejorado" implican una comparación con otra fitasa. Ejemplos de otras fitasas de referencia, o comparativas son: SEC ID NO:3, y/o SEC ID NO:4. Aún más ejemplos de fitasas de referencia pueden ser la SEC ID NO:2, y/o la SEC ID NO:6. Otro ejemplo más de una fitasa de referencia puede ser la SEC ID NO:9, y las variantes de la misma descritas en la Fig. 1.

[0058] Ejemplos no limitativos de propiedades que son modificadas, preferiblemente mejoradas, son los siguientes: termoestabilidad, perfil de pH, actividad específica, rendimiento en el alimento para animales, sensibilidad de proteasa, y/o modelo de glicosilación. La fitasa de la invención puede también tener un perfil de temperatura modificado, preferiblemente mejorado, y/o puede incorporar un cambio de un sitio de escisión potencial de proteasa.

Termoestabilidad

[0059] La termoestabilidad, o estabilidad de temperatura, se puede determinar como se describe en el Ejemplo 1 bajo el título de "Determinación de estabilidad de temperatura." Por consiguiente, en una forma de realización preferida, una fitasa de la invención tiene una actividad residual que es superior a la actividad residual de una fitasa de referencia, donde la actividad residual se determina de la siguiente manera: un sobrenadante de fermentación se divide en dos partes, una parte se incuba durante 30 minutos a una temperatura elevada deseada, y la otra parte durante 30 minutos a 5°C, tras lo cual la actividad de ambos se determina en el fosfato de p-nitrofenilo a 37°C y pH 5.5, y la actividad de la muestra incubada a una temperatura elevada se divide por la actividad de la misma muestra incubada a 5°C. Las temperaturas elevadas preferidas son 50°C, 55°C, 60°C, 65°C, 70°C, 75°C, 80°C, u 85°C. Si se desea, las muestras con enzima se pueden diluir en 0,1M NaAc pH 5,5. La actividad residual de una fitasa de la

invención es preferiblemente al menos un 105%, o al menos un 110%, 120%, 130%, 140%, 150% de la actividad residual de la fitasa de referencia. En todavía más formas de realización, la actividad residual de una fitasa de la invención es al menos un 200%, o al menos un 250%, 300%, 400%, o al menos un 500% de la actividad residual de la fitasa de referencia.

[0060] La termoestabilidad puede también ser determinada como se describe en el Ejemplo 5. Por consiguiente, en una forma de realización preferida, una fitasa de la invención tiene una actividad residual que es superior a la actividad residual de una fitasa de referencia, donde la actividad residual se determina de la siguiente manera: un sobrenadante de fermentación se divide en dos partes, una parte se incuba durante 30 minutos a 50°C, y la otra parte durante 30 minutos a 5°C, tras lo cual la actividad de ambos se determina en el p-nitrofenil fosfato a 37°C y pH 5,5, y la actividad de la muestra que ha sido incubada a una temperatura elevada se divide por la actividad de la misma muestra que ha sido incubada a 5°C. Si se desea, la muestras con enzimas se pueden diluir en 0,1M de NaAc pH 5,5. La actividad residual de una fitasa de la invención es preferiblemente al menos 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 10x, 15x, 20x, o al menos 25x la actividad residual de la fitasa de referencia de la SEC ID NO:3. La actividad residual de una fitasa de la invención es preferiblemente al menos un 105%, o al menos un 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, o al menos un 200% de la actividad residual de la fitasa de referencia de la SEC ID NO:2. Las siguientes sustituciones son particularmente preferidas puesto que éstas mejoran la termoestabilidad en comparación con la fitasa de la SEC ID NO:3 así como con la fitasa de la SEC ID NO:2 (véase la Tabla 3): 4P, 5P, 111P, 1*, 1*/2*, 1*/2*/3*, 273L, y/o 286Q.

[0061] La termoestabilidad puede también ser determinada como se describe en el Ejemplo 8. Por consiguiente, en una forma de realización preferida, una fitasa de la invención tiene una actividad residual que es superior a la actividad residual de una fitasa de referencia, donde la actividad residual se determina de la siguiente manera: un sobrenadante de fermentación se divide en dos partes, una parte se incuba durante 30 minutos a 60°C, y la otra parte durante 30 minutos a 5°C, tras lo cual la actividad de ambas se determina en el p-nitrofenil fosfato a 37°C y pH 5,5, y la actividad de la muestra incubada a una temperatura elevada se divide por la actividad de la misma muestra incubada a 5°C. Si se desea, las muestras con enzimas se pueden diluir en 0,1M de NaAc pH 5,5, opcionalmente incluyendo 0,005% de Tween-20. La fitasa y la fitasa de referencia se puede expresar en una cepa de huésped de Bacillus subtilis. La cepa huésped puede ser cultivada en 100ml de PS1 medio (100g/L de sacarosa, 40g/L de copos de soja, 10g/L de Na2HPO4.12H2O, 0,1ml/L de Dowfax 63N10 (Dow)) en frascos de agitación de 500ml durante cuatro días a 30°C a 300 r.p.m. La actividad residual de una fitasa es preferiblemente al menos un 32%, o al menos un 34%, 36%, 38%, o al menos un 40% de la actividad residual de la fitasa de referencia de la SEC ID NO:2. Más preferiblemente, la actividad residual de una fitasa de la invención es al menos un 50%, o al menos un 60%, 70%, 80%, 90%, o al menos un 100% de la actividad residual de la fitasa de referencia de la SEC ID NO:2. Incluso más preferiblemente la actividad residual de una fitasa es al menos un 120%, 140%, 160%, 180%, o al menos un 200% de la actividad residual de la fitasa de referencia de la SEC ID NO:2. Más preferiblemente, la actividad residual de una fitasa es al menos 2x, o al menos 3x, 4x, o al menos 5x la actividad residual de la fitasa de referencia de la SEC ID NO:2 Las siguientes sustituciones son particularmente preferidas (véase la Tabla 5):

(i)

119K;

(ii)

4P, 362K, 202N, 276K, 385D;

(iii) 111 P/241 Q, 162C, 241Q;

(iv)

223E, 286Q, 107G, 379K, 273L;

(v)

31C, 59C/100C;

(vi)

46E, 111 P, 76G, 362R;

(vii) 141C/199C, 52C/99C.

[0062] La termoestabilidad puede también ser determinada como se describe en el Ejemplo 9, es decir, usando mediciones de calorimetría diferencial de barrido (DSC, por sus siglas en inglés) para determinar la temperatura de desnaturalización, Td, de la proteína de fitasa purificada. La Td es indicativa de la termoestabilidad de la proteína: cuanto más alta sea la Td, más alta será la termoestabilidad. Por consiguiente, una fitasa tiene una Td que es superior a la Td de una fitasa de referencia, donde la Td se determina en muestras de fitasa purificada (preferiblemente con una pureza de al menos el 95%, determinada por SDS-PAGE), después de la diálisis en 20mM de Na-acetato pH 4,0 (preferiblemente en un paso de 2-3 h seguido de un sobre paso de noche), seguido de 0,45um de filtración y dilución con tampón de diálisis para una concentración de proteína correspondiente a aproximadamente 2 unidades de absorbancia (A280), aplicando calorimetría diferencial de barrido a una tasa de barrido de 90°C/h de 20-90°C en20 mM de tampón de Na-acetato, pH 4,0. La Td de la fitasa es superior a la Td de la fitasa de la SEC ID NO:4. Las mediciones por calorimetría diferencial de barrido se pueden también realizar como se describe en el Ejemplo 1 ("mediciones DSC"), o Ejemplo 2 ("Termoestabilidad por DSC").

[0063] La termoestabilidad puede también ser determinada como se describe en el Ejemplo 12. Por consiguiente, la fitasa, tras la incubación durante 60 minutos a 70°C y pH 4,0, tiene una actividad residual mejorada en comparación con la actividad residual de una fitasa de referencia tratada de la misma manera, siendo calculada la actividad residual para cada fitasa en relación a la actividad encontrada antes de la incubación (a 0 minutos). La actividad residual es medida preferiblemente en fitato de sodio a pH 5.5 y 37°C. La incubación es preferible en 0,1 M de acetato sódico, pH 4,0. La fitasa es preferiblemente purificada, más preferiblemente a una pureza de al menos un

95%, determinada por SDS-PAGE. Un tampón de ensayo de actividad de fitasa preferida es 0,25 M de Na-acetato pH 5,5. Usando este método, la actividad residual de la fitasa es preferiblemente al menos un 105% de la actividad residual de la fitasa de referencia, más preferiblemente al menos 110%, 115%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, o al menos un 200%. En la alternativa, la actividad residual relativa a la actividad a 0 minutos es preferiblemente al menos un 31%, o al menos un 32%. Se prefieren las siguientes sustituciones que proporcionan una termoestabilidad mejorada (véase la Tabla 9): 273L, 46E, 362R, y/o 53V.

[0064] En una forma de realización particular, la variante de fitasa de la invención es más termoestable que la fitasa de referencia, donde la termoestabilidad es determinada usando cualquiera de las cuatro pruebas mencionadas anteriormente (basadas en los Ejemplos 1, 5, 8, 9, o 12).

[0065] En formas de realización particulares, una termoestabilidad mejorada se espera de las siguientes variantes de la fitasa la SEC ID NO:2 (en orden de preferencia, dentro de cada agrupamiento):

(i)

K141C/V199C, Q91C/W46C, G52C/A99C, N31C/E176C, N31C/T177C, G59C/F100C, S162C/S247C;

(ii)

Q111P, N4P;

(iii) K107G, M273L,N286Q;

(iv)

E119K;

(v)

1362R,K, T276K, 1379K, Q223E, N385D, W46E.

Perfil de temperatura

[0066] Tanto si una fitasa de la invención tiene o no un perfil de temperatura modificada en comparación con una fitasa de referencia se puede determinar como se describe en el Ejemplo 10. Por consiguiente, una fitasa tiene un perfil de temperatura modificada en comparación con una fitasa de referencia, donde el perfil de temperatura se determina como actividad de fitasa como una función de temperatura en el fitato de sodio a pH 5,5 en el intervalo de temperatura de 20-90°C (en pasos de 10°C). Un tampón preferido es en un tampón de 0,25 M de Na-acetato pH 5,5. La actividad a cada temperatura es indicada preferiblemente como actividad relativa (en %) normalizada al valor a temperatura óptima. La temperatura óptima es la temperatura dentro de las temperaturas evaluadas (es decir, aquellas con saltos de 10°C) donde la actividad es máxima.

[0067] Una fitasa tiene una actividad relativa a 70°C de al menos un 18%, o al menos un 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, o al menos un 25%. Como se ha explicado anteriormente, esto es relativo a la actividad a la temperatura óptima. Más preferiblemente, la fitasa tiene una actividad relativa a 70°C de al menos un 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, o al menos un 32%. Las sustituciones preferidas que proporcionan un perfil de temperatura modificada (en la forma de una actividad relativa mayor a 70°C) son (véase la Tabla 7): 107G, 273L, 362K, 46E, 362R, y/o 241Q. Su actividad relativa a 70°C es más elevada en comparación con la fitasa de referencia de la SEC ID NO:3 y 4, y en algunos casos (107G, 273L, 362K, y/o 362R,) también en comparación con la fitasa de referencia de la SEC ID NO:2.

Perfil de pH

[0068] Tanto si una fitasa de la invención tiene o no un perfil de pH modificado en comparación con una fitasa de referencia se puede determinar como se describe en el Ejemplo 11. Por consiguiente, una fitasa a tiene un perfil de pH modificado en comparación con una fitasa de referencia, donde el perfil de pH se determina como actividad de fitasa como una función de pH en fitato de sodio a 37°C en el intervalo pH de 2,0 a 7,5 (en pasos de unidad de pH de 0,5). Un tampón preferido es un cóctel de 50mM de glicina, 50mM de ácido acético y 50mM de Bis-Tris. Otro tampón preferido es 0,25M de acetato sódico. La actividad en cada pH es indicada preferiblemente como actividad relativa (en %) normalizada al valor de pH óptimo.

[0069] Un ejemplo de un perfil de pH modificado es donde la curva del pH (actividad relativa como función de pH) se desplaza hacia un pH más alto, o más bajo. Las sustituciones preferidas que proporcionan un cambio de 0,5 unidades de pH a un pH más alto en comparación con la fitasa de referencia de la SEC ID NO:2, 3 o 4 son (véase la Tabla 8): 46E, y/o 218Q.

[0070] Otro ejemplo de un perfil de pH modificado es donde el pH óptimo es cambiado, en dirección hacia arriba o hacia abajo. Las sustituciones preferidas que proporcionan un pH óptimo inferior en comparación con la SEC ID NO:2, 3, y 4 son (véase la Tabla 8): 46E, 121 D, y/o 200K. Las sustituciones preferidas que proporcionan un pH óptimo más elevado en comparación con la SEC ID NO:2,3, y 4 son (véase la Tabla 8): 218Q, y/o 241Q.

[0071] Un perfil de pH modificado puede también ser determinado como se describe en el Ejemplo 1 ("Perfil de pH modificado: Determinación de pH 3,5/5,5 de radio de actividad), a saber, comparando la actividad de fosfatasa a pH 3,5 y 5,5. Alternativamente, la actividad a pH 3,5 se puede comparar con la actividad a pH 4,0; 4,5; o 5,0. En todavía otra alternativa, las actividades de fitasa se comparan en lugar de actividades de fosfatasa.

[0072] Una fitasa puede tener un perfil de pH modificado en comparación con una fitasa de referencia. Más en particular, el perfil de pH se enmienda en el rango de pH de 3,5-5,5. Todavía más en particular, la actividad a pH 4,0; 4,5; 5,0 y/o 5,5 está a un nivel de al menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o al menos un 95% de la actividad al pH óptimo (pH 3,5).

[0073] El perfil de pH, así como el pH óptimo, de un polipéptido se puede determinar incubándolo a varios valores de pH, usando un sustrato en una concentración predeterminada y una temperatura de incubación fija. El perfil de pH es una representación gráfica de la actividad de fitasa frente al pH, el pH óptimo es determinado a partir del perfil de pH. En una forma de realización particular, se usa el ensayo de fosfatasa o fitasa del Ejemplo 1, p. ej., el sustrato es 5mM de fitato de sodio, la temperatura de reacción 37°C, y la actividad se determina a varios valores de pH, por ejemplo pH 2-12, reemplazando el tampón de acetato de pH 5.5 por un tampón adecuado. Ejemplos de tampones adecuados son: 0,1 M de glicina/HCl (pH 2,0-3,5), 0,1 M de NaAc/Ac (pH 4,0-5,0), 0,1 M de Bis-Tris/HCl (pH 5,56,5), 0,1 M Tris/HCl (pH 7,0). Otros ejemplos de tampones son: 100mM de ácido succínico, 100mM de HEPES, 100mM de CHES, 100mM de CABS ajustados a valores de pH 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0; 10,0; 11,0; y 12,0 con HCl o NaOH.

[0074] En formas de realización particulares, un perfil de pH modificado se espera de las siguientes variantes de la fitasa de la SEC ID NO:2 (en orden de preferencia, dentro de cada agrupación):

(i)

E218Q, D324N, T200R,K, N121D, E196Q, D202N, E406A, E167Q, E53V,Q, E241Q, D314N,G, E239Q, E285N;

(ii)

reemplazando el bucle entre residuos 114 y 124 (YQKDEEKNDPL) que se da al sitio activo con un bucle seleccionado de, p.ej., HQEKMGTMDPT, HQQDIKQVDSL, HQPEIGKMDPV, TQADTSSPDPL, HQQDIKQADPL, TQTDTSSPDPL, NQADLKKTDPL.

Actividad específica

[0075] Una fitasa puede tener una actividad específica mejorada en relación a una fitasa de referencia. Más en particular, la actividad específica de una fitasa es al menos un 105%, en relación a la actividad específica de una fitasa de referencia determinada por el mismo procedimiento. La actividad específica relativa es al menos 110, 115, 120, 125, 130, 140, 145, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 350 o incluso un 400%, todavía en relación a la actividad específica de la fitasa de referencia como se determina mediante el mismo procedimiento.

[0076] En la alternativa, el término actividad específica alta se refiere a una actividad específica de al menos 200 FYT/mg de proteína enzimática (PE). La actividad específica es al menos 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 o 3000 FYT/mg de PE.

[0077] La actividad específica se mide en muestras altamente purificadas (un gel de poliacrilamida SDS debería mostrar la presencia de un único componente). La concentración de proteína enzimática se puede determinar por análisis de aminoácido, y la actividad de fitasa en las unidades de FYT, determinada como se describe en el Ejemplo

1. La actividad específica es una característica de la variante de fitasa específica en cuestión, y se calcula como la actividad de fitasa medida en unidades FYT por mg de proteína enzimática de variante de fitasa. Véase el Ejemplo 7 para más detalles.

[0078] Una actividad específica modificada se espera de las siguientes variantes de la fitasa de la SEC ID NO:2, en la que, en orden de preferencia, el bucle entre residuos los 114 y 124 (YQKDEEKNDPL) que da al sitio activo es sustituido por un bucle seleccionado de, p.ej., HQEKMGTMDPT, HQQDIKQVDSL, HQPEIGKMDPV, TQADTSSPDPL, HQQDIKQADPL, TQTDTSSPDPL, NQADLKKTDPL.

Rendimiento en alimento para animales

[0079] En una forma de realización particular, la fitasa de la invención tiene un rendimiento mejorado en el alimento para animales en comparación con una fitasa de referencia. El rendimiento en el alimento para animales se puede determinar por el modelo in vitro del Ejemplo 6. Por consiguiente, en una forma de realización preferida, la fitasa de la invención tiene un rendimiento mejorado en el alimento para animales, donde el rendimiento se determina en un modelo in vitro, preparando muestras de alimento compuestas por un 30% de soja triturada y 70% de harina de maíz con CaCl2 añadido a una concentración de 5 g de calcio por kg de alimento; preincubándolos a 40°C y pH 3,0 durante 30 minutos seguidos de adición de pepsina (3000 U/g de alimento) y fitasa; incubando las muestras a 40°C y pH 3,0 durante 60 minutos seguidos de pH 4,0 durante 30 minutos; parando las reacciones; extrayendo ácido fítico y inositol fosfatos mediante adición de HCl a una concentración final de 0,5M e incubación a 40°C durante 2 horas, seguido de un ciclo de congelación-descongelación y 1 hora de incubación a 40°C; separando ácido fítico y inositol fosfatos mediante cromatografía iónica de alto rendimiento; determinando la cantidad de fósforo de fitato residual (IP6-P); calculando la diferencia en IP6-P residual entre la fitasa tratada y una muestra en blanco de una fitasa no tratada (esta diferencia es IP6-P degradado); y expresando el IP6-P degradado de la fitasa de la invención relativo al IP6-P degradado de la fitasa de referencia (p.ej., las fitasas con la SEC ID NO:3 y 4).

[0080] La fitasa de la invención y la fitasa de referencia son, por supuesto, dosificadas en la misma cantidad, preferiblemente en base a unidades de actividad de fitasa (FYT). Una dosificación preferida es 125 FYT/kg de alimento. Otra dosificación preferida es 250 FYT/kg de alimento. Las fitasas se pueden dosificar en la forma de

5 fitasas purificadas, o en la forma de sobrenadantes de fermentación. Las fitasas purificadas tienen preferiblemente una pureza de al menos un 95%, como se determina mediante SDS-PAGE.

[0081] En formas de realización preferidas, el valor de IP6-P degradado de la fitasa purificada de la invención, en relación al valor IP6-P degradado de la fitasa de referencia, es al menos 101%, o al menos 102%, 103%, 104%,

10 105%, 110%, 115%, o al menos 120%. En todavía más formas de realización preferidas, el valor IP6-P degradado de la fitasa purificada de la invención, en relación al valor IP6-P degradado de la fitasa de referencia, es al menos 125%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, o al menos 200%. Preferiblemente, el valor IP6-P degradado de la fitasa de la invención, en relación al valor degradado IP6- P de la fitasa de la SEC ID NO:2, es al menos un 105%, 110%, 113%, 115%, 120%, 125%, o al menos un 130%.

15 [0082] Las siguientes sustituciones proporcionan un rendimiento in vitro en el alimento para animales mejorado o al menos tan bueno como (ver tabla 4A) en comparación con la fitasa de la SEC ID NO:3: 4P, 111 P, 286Q.

[0083] Las siguientes sustituciones también proporcionan un rendimiento in vitro en el alimento para animales 20 mejorado o al menos tan bueno como (ver tabla 4B) en comparación con la fitasa de la SEC ID NO:3: 107G, 362K, 362R, y 202N.

[0084] Las sustituciones incluso más preferidas en lo que se refiere al rendimiento de alimento para animales son 362K, 362R, y 202N.

25 [0085] El rendimiento relativo de una fitasa de la invención puede también ser calculado como el porcentaje del fósforo liberado por la fitasa de referencia.

[0086] En otra forma de realización particular, el rendimiento relativo de la fitasa de la invención se puede calcular 30 como el porcentaje del fósforo liberado por la fitasa de la invención, relativo a la cantidad de fósforo liberado por la fitasa de referencia.

[0087] El rendimiento relativo de la fitasa es al menos 105%, preferiblemente al menos 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, o al menos 200%. 35 Modelo de glicosilación

[0088] La glicosilación es un fenómeno que sólo se observa cuando las proteínas se expresan en eucariotas tales como hongos y plantas transgénicas, pero no en procariotas tales como bacterias. Hay varios tipos de glicosilación,

40 pero en el presente contexto el más pertinente es la N-glicosilación, es decir la glicosilación ligada a asparagina donde los azúcares se unen a una proteína, empezando por una molécula de N-acetiglucosamina unida a asparaginas. Se ha descubierto que la N-glicosilación sólo tiene lugar en asparaginas que en la secuencia son parte de los siguientes tripéptidos: N-X-T o N-X-S, donde X designa cualquier aminoácido.

45 [0089] Sorprendentemente, se observó una termoestabilidad inferior cuando la fitasa de la SEC ID NO:2 fue expresada en el hongo (levadura) Pichia pastoris, en comparación a cuando fue expresada en la Bacillus subtilis, véase el Ejemplo 2.

[0090] Esta observación ha conducido a la propuesta de que la termoestabilidad se puede mejorar para fitasas 50 expresadas en hongos alterando los sitios de glicosilación potencial.

[0091] Las variantes de fitasa con un modelo de glicosilación modificada, tendrán lugar preferiblemente en sitios de N-glicosilación modificada. La glicosilación modificada está prevista para conferir una termoestabilidad mejorada sobre la variante de fitasa, cuando se expresa en un hongo.

55 [0092] Ejemplos de fitasas son las fitasas bacterianas, p.ej. fitasas gram-negativas, tales como E.coli y fitasas de Citrobacter y variantes de las mismas, incluidas las fitasas de la presente invención al igual que las fitasas de la SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, SEC ID NO:4, SEC ID NO:6, y SEC ID NO:9 de este documento. Ejemplos de huéspedes de expresión fúngica son Pichia, Saccharomyces, y especies de Aspergillus.

60 [0093] En particular se espera un modelo de glicosilación modificada de las fitasas siguientes (p.ej. variantes de la SEC ID NO:2), en orden de preferencia: N31T, N74A, N171T, N203T, N281H, N316D, N308A. Los siguientes están reemplazando un patrón de tipo N-X-T: N31T, N74A, N281H. Los siguientes están reemplazando un patrón de tipo N-X-S: N171T, N203T, N308A, N316D.

Variantes hipoalergénicas

[0094] En una forma de realización específica, las fitasas de la presente invención son (también) variantes hipoalergénicas, diseñadas para recurrir a una respuesta inmunológica reducida cuando es expuesta a animales, incluyendo el hombre. El término respuesta inmunológica debe ser entendido como cualquier reacción del sistema inmunológico de un animal expuesto a la variante de fitasa. Un tipo de respuesta inmunológica es una respuesta alérgica que conduce a niveles aumentados de IgE en el animal expuesto. Las variantes hipoalergénicas pueden ser preparadas usando técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, la variante de fitasa se puede conjugar con partes de protección de fracciones poliméricas o epítopos de la variante de fitasa implicados en una respuesta inmunológica. La conjugación con polímeros puede implicar acoplamiento químico in vitro del polímero a la variante de fitasa, p.ej. como se describe en las publicaciones WO 96/17929, WO 98/30682, WO 98/35026, y/o WO 99/00489. La conjugación puede además o alternativamente a estos implicar un acoplamiento in vivo de polímeros a la variante de fitasa. Tal conjugación se puede conseguir por ingeniería genética de la secuencia de nucleótidos que codifica la variante de fitasa, insertando secuencias de consenso que codifican sitios de glicosilación adicional en la variante de fitasa y expresando la variante de fitasa en un huésped capaz de glicosilar la variante de fitasa, véase p.ej. la publicación WO 00/26354. Otro modo de proporcionar variantes hipoalergénicas es la ingeniería genética de la secuencia de nucleótidos que codifican la variante de fitasa para provocar que las variantes de fitasa se autooligomericen, logrando que los monómeros de variante de fitasa puedan proteger los epítopos de otros monómeros de variante de fitasa y así reducir la antigenicidad de los oligómeros. Tales productos y su preparación se describen p.ej. en la publicación WO 96/16177. Los epítopos implicados en una respuesta inmunológica se pueden identificar por varios métodos tales como el método de visualización de fago descrito en las publicaciones WO 00/26230 y WO 01/83559, o el enfoque aleatorio descrito en la publicación EP 561907. Una vez que un epítopo ha sido identificado, su secuencia de aminoácidos se puede alterar para producir propiedades inmunológicas alteradas de la variante de fitasa mediante conocidas técnicas de manipulación de genes tales como mutagénesis de sitio dirigido (véase p.ej. las publicaciones WO 00/26230, WO 00/26354 y/o WO 00/22103) y/o la conjugación de un polímero puede realizarse con proximidad suficiente al epítopo para que el polímero proteja al epítopo.

Secuencias de ácidos nucleicos y constructos

[0095] La presente invención también se refiere a secuencias de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de ácido nucléico que codifica una variante de fitasa de la invención.

[0096] El término "secuencia de ácido nucleico aislada" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que está esencialmente libre de otras secuencias de ácidos nucleicos, p.ej., al menos aproximadamente un 20% puro, preferiblemente al menos aproximadamente un 40% puro, más preferiblemente al menos aproximadamente un 60% puro, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente un 80% puro, y de la forma más preferible al menos aproximadamente un 90% puro como se determina por electroforesis de agarosa. Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos aislada se puede obtener por clonación estándar procedimientos usados en ingeniería genética para desplazar la secuencia de ácidos nucleicos de su ubicación natural a un sitio diferente donde ésta será reproducida. Los procedimientos de clonación pueden implicar escisión y aislamiento de un fragmento de ácido nucleico deseado comprendiendo la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido, la inserción del fragmento en una molécula de vector, y la incorporación del vector recombinante en una célula huésped donde múltiples copias o clones de la secuencia de ácidos nucleicos serán duplicadas. La secuencia de ácidos nucleicos puede ser de origen genómico, ADNc, ARN, semisintético, sintético, o cualquier combinación de los mismos.

[0097] Las secuencias de ácidos nucleicos de la invención se pueden preparar introduciendo al menos una mutación en una secuencia codificante de fitasa de molde o una subsecuencia de la misma, donde la secuencia mutante de ácidos nucleicos codifica una fitasa variante. La introducción de una mutación en la secuencia de ácidos nucleicos para intercambiar un nucleótido por otro nucleótido se puede realizar mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica, p.ej. por mutagénesis de sitio dirigido, por mutagénesis aleatoria, o por mutagénesis dopada, adicionada, o aleatoria localizada.

[0098] La mutagénesis aleatoria se realiza adecuadamente ya sea como mutagénesis localizada o aleatoria en una región específica en al menos tres partes del gen traduciendo a la secuencia de aminoácidos mostrada en cuestión,

o en el gen entero. Cuando la mutagénesis se realiza por el uso de un oligonucleótido, el oligonucleótido puede ser dopado o adicionado con los tres nucleótidos no progenitores durante la síntesis del oligonucleótido a las posiciones que deben ser cambiadas. El dopaje o adicionado se puede realizar de modo que se eviten codones para aminoácidos indeseados. El oligonucleótido dopado o adicionado se puede incorporar al ADN que codifica la enzima de fitasa mediante cualquier técnica, usando, p.ej., PCR, LCR o cualquier polimerasa y ligasa de ADN según se estime oportuno.

[0099] Preferiblemente, el dopado se realiza usando un "dopado aleatorio constante", en el que el porcentaje de tipo salvaje y mutación en cada posición está predefinido. Además, el dopaje puede ser dirigido hacia una preferencia para la introducción de determinados nucleótidos, y así una preferencia para la introducción de uno o más residuos de aminoácidos específicos. El dopaje se puede realizar, p.ej., para permitir la introducción de un 90% de tipo

salvaje y un 10% de mutaciones en cada posición. Una consideración adicional en la elección de un esquema de impurificación se basa en limitaciones genéticas así como estructurales de proteínas.

[0100] La mutagénesis aleatoria puede ser localizada de manera ventajosa en una parte de la fitasa progenitora en cuestión. Esto puede, p.ej., ser ventajoso cuando determinadas regiones de la enzima han sido identificadas por ser de especial importancia para una propiedad dada de la enzima.

[0101] Los métodos alternativos para suministrar variantes de la invención incluyen transposición de genes p.ej. como se describe en la publicación WO 95/22625 o en la publicación WO 96/00343, y el proceso de derivación de consenso como se describe en la publicación EP 897985.

Constructos de ácido nucleico

[0102] Un constructo de ácidos nucleicos comprende una secuencia de ácido nucleico de la presente invención enlazada de manera operativa a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula huésped adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. La expresión se entiende que incluye cualquier paso implicado en la producción del polipéptido incluyendo, pero no limitado a, transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional, y secreción.

[0103] El término "constructo de ácidos nucleicos" como se utiliza en este documento se refiere a una molécula de ácido nucleico, mono- o bicatenaria, que se aisla de un gen de origen natural o que se modifica para contener segmentos de ácidos nucleicos de un modo tal que si no fuera así no existirían en la naturaleza. El término constructo de ácidos nucleicos es sinónimo del término "casete de expresión" cuando el constructo de ácidos nucleicos contiene las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia codificante de la presente invención.

[0104] El término "control de secuencias" está definido en este documento para incluir todos los componentes, que son necesarios o ventajosos para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa o extranjera a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Tales secuencias de control incluyen, pero de forma no limitativa, un líder, secuencia de poliadenilación, secuencia de propéptido, promotor, secuencia de péptido señal, y terminador de transcripción. En un mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor, y señales de parada transcripcional y traduccional. Las secuencias de control se pueden proporcionar con enlaces con la intención de introducir sitios de restricción específicos facilitando ligación de las secuencias de control con la región de codificación de la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido.

[0105] El término "enlazado de manera operativa" denota en este documento una configuración en la que una secuencia de control se coloca en una posición apropiada en relación a la secuencia codificante de la secuencia polinucleótida de manera que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia codificante de un polipéptido.

[0106] Cuando se usa aquí el término "secuencia codificante" (SC) significa una secuencia de nucleótidos, que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de su producto proteínico. Los límites de la secuencia codificante son generalmente determinados por un marco de lectura abierto, que inicia normalmente con el codón de inicio ATG o codones de inicio alternativos tales como GTG y TTG. La secuencia codificante puede ser una secuencia ADN, ADNc, o secuencia de nucleótidos recombinante

Vector de expresión

[0107] El término "expresión" incluye cualquier paso implicado en la producción del polipéptido incluyendo, pero no de manera limitativa, transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional, y secreción.

[0108] El término "vector de expresión" se define en este documento como una molécula lineal o circular de ADN que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de la invención, y que está operativamente enlazado a nucleótidos adicionales que proveen a su expresión.

[0109] Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una variante de fitasa de la invención puede ser expresada usando un vector de expresión que incluye típicamente secuencias de control que codifican un promotor, operador, sitio de unión al ribosoma, señal de iniciación de traducción, y, opcionalmente, un gen represor o varios genes activadores.

[0110] El vector de expresión recombinante que lleva la secuencia de ADN que codifica una variante de fitasa de la invención puede ser cualquier vector que pueda ser convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinante, y la elección de vector dependerá frecuentemente de la célula huésped en la cual ha de ser

introducida. El vector puede ser uno que, cuando está introducido en una célula huésped, se integra en el genoma de la célula huésped y se duplica junto con el cromosoma(s) en el cual ha sido integrado.

[0111] La variante de fitasa puede también ser coexpresada junto con al menos otra enzima de interés de alimento para animales, tal como una fitasa, fosfatasa, xilanasa, galactanasa, alfa-galactosidasa, proteasa, fosfolipasa, amilasa, y/o beta-glucanasa. Las enzimas se pueden coexpresar desde distintos vectores, desde un vector, o usando una mezcla de ambas técnicas. Cuando se usan vectores diferentes, los vectores puede tener marcadores seleccionables diferentes, y orígenes diferentes de replicación. Cuando se usa solo un vector, los genes se pueden expresar a partir de uno o más promotores. Si se clona bajo la regulación de un promotor (di- o multicistrónico), el orden en que los genes son clonados puede afectar los niveles de expresión de las proteínas. La variante de fitasa puede también ser expresada como una proteína de fusión, es decir que el gen que codifica la variante de fitasa ha sido fusionado en el marco del gen que codifica otra proteína. Esta proteína puede ser otra enzima o un dominio funcional de otra enzima.

Células huésped

[0112] El término "célula huésped", como se utiliza en este documento, incluye cualquier tipo de célula que sea susceptible de transformación, transfección, transducción, y similares con un constructo de ácidos nucleicos que comprendan un polinucleótido de la presente invención.

[0113] La presente invención también se refiere a células huésped recombinantes, que comprenden un polinucleótido de la presente invención, que es usado ventajosamente en la producción recombinante de los polipéptidos. Un vector que comprende un polinucleótido de la presente invención se introduce en una célula huésped de modo que el vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extracromosomal que se duplica como se describe anteriormente. El término "célula huésped" engloba cualquier progenie de una célula progenitora que no sea idéntica a la célula progenitora debido a mutaciones que ocurren durante la replicación. La elección de una célula huésped dependerá en gran parte del gen que codifica el polipéptido y su fuente.

[0114] La célula huésped puede ser un microorganismo unicelular, p.ej., un procariota, o un microorganismo no unicelular, p.ej., un eucariota.

[0115] Los microorganismos unicelulares útiles son células bacterianas tales como bacterias gram positivas incluyendo, pero no de manera limitada, una célula de bacillus, p.ej., Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, y Bacillus thuringiensis; o una célula de Streptomyces, p.ej., Streptomyces lividans y Streptomyces murinus, o bacterias gram negativas tales como E. Coli y Pseudomonas sp. En un aspecto preferido, la célula huésped bacteriana es un Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, o célula de Bacillus subtilis. En otro aspecto preferido, la célula de Bacillus es un Bacillus alcalofílico.

[0116] La introducción de un vector en una célula huésped bacteriana puede, por ejemplo, ser efectuada mediante transformación de protoplasto (véase, p.ej., Chang y Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), usando células competentes (véase, p.ej., Young y Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), electroporación (véase, p. ej., Shigekawa y Dowen, 1988 Biotécnicas 6: 742-751), o conjugación (véase, p. ej., Koehler y Torne, 1987, Journal of Bacteriology

169: 5771-5278).

[0117] La célula huésped puede también ser una eucariota, tal como una célula de mamífero, insecto, planta, o de hongos.

[0118] En un aspecto preferido, la célula huésped es una célula de hongos. "Hongos" como se utiliza en este documento incluye la phyla Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, y Cigomicota (como es definido por Hawkswort et al., en, Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8ª edición, 1995, CAB Internacional, University Press, Cambridge, Reino Unido) así como también la Oomycota (como se cita en Hawkswort et al., 1995, supra, página 171) y todos los hongos mitospóricos (Hawkswort et al., 1995, supra).

[0119] En un aspecto más preferido, la célula huésped fúngica es una célula de levadura. "Levadura" como se utiliza en este documento incluye levadura de ascoesporogenous (Endomicetales), levadura de basidiosporogenous, y levadura perteneciente a los hongos imperfectos (Blastomicetes). Puesto que la clasificación de levadura puede cambiar en el futuro, para los fines de esta invención, la levadura debe ser definida como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., y Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Serie de simposio n°. 9, 1980).

[0120] En un aspecto aún más preferido, la célula huésped de levadura es una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Yarrowia.

[0121] En un aspecto más preferido, la célula huésped de levadura es una célula Pichia pastoris, Pichia methanolica, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis. En otro aspecto más preferido, la célula huésped de levadura es una célula Kluyveromices lactis. En otro aspecto más preferido, la célula huésped de levadura es una célula de Yarrowia lipolytica.

[0122] En otro aspecto más preferido, la célula huésped fúngica es una célula fúngica filamentosa. Los "hongos filamentosos" incluyen todas formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (según es definido por Hawkswort et al., 1995, supra). Los hongos filamentosos están generalmente caracterizados por una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano, y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es por elongación hifal y el catabolismo de carbono es estrictamente aeróbico. En cambio, el crecimiento vegetativo por levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae es por injerto de un talo unicelular y el catabolismo de carbono puede ser fermentativo.

[0123] En un aspecto aún más preferido, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Coprinus, Coriolus, Criptococo, Filobasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporte, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromices, Pleurotus, Schizophyllum, talaromices, Termoascus, Thielavia, Tolipocladium, Trametes, o Trichoderma.

[0124] En un aspecto más preferido, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae. En otro aspecto más preferido, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, o Fusarium venenatum. En otro aspecto más preferido, la célula huésped fúngica filamentosa es una cepa de célula Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, o Ceriporiopsis subvermispora, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride.

[0125] Las células fúngicas se pueden transformar mediante un proceso que implica la formación de protoplasto, la transformación de los protoplastos, y la regeneración de la pared celular en un modo conocido per se. Los procedimientos adecuados para la transformación de las células huéspedes Aspergillus y Trichoderma están descritos en la publicación EP 238 023 y Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA

81: 1470-1474. Los métodos adecuados para la transformación de especies de Fusarium son descritos por Malardier et al., 1989, gen 78: 147-156, y WO 96/00787. La levadura puede ser transformada usando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, en Abelson, J.N. y Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, volumen 194, págs 182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; y Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920.

Métodos de producción

[0126] La presente invención también se refiere a métodos para producir una fitasa de la presente invención que comprende (a) cultivo de una célula huésped bajo condiciones propicias para la producción de la fitasa; y (b) recuperación la fitasa.

[0127] En los métodos de producción de la presente invención, las células se cultivan en un medio nutritivo adecuado para la producción de los polipéptidos usando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula se puede cultivar por cultivo en matraz de agitación, y fermentación a gran o pequeña escala (incluyendo fermentaciones continuas de lote, lote alimentado o en estado sólido) en el laboratorio o fermentadores industriales realizados en un medio adecuado y bajo condiciones que permitan al polipéptido ser expresado y/o aislado. El cultivo se desarrolla en un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrogeno y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica. Hay disponibles medios adecuados de proveedores comerciales o se pueden preparar según composiciones publicadas (p.ej., en catálogos de la American Type Culture Collection). Si el polipéptido es secretado en el medio nutritivo, el polipéptido se puede recuperar directamente del medio. Si el polipéptido no es secretado, se puede recuperar de lisatos celulares.

[0128] El polipéptido resultante puede ser recuperado usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido puede ser recuperado del medio nutritivo por procedimientos convencionales incluyendo, pero no de manera limitada, centrifugado, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación, o precipitación.

[0129] Los polipéptidos de la presente invención se pueden purificar por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica incluyendo, pero no de manera limitada, cromatografía (p.ej., intercambio iónico, afinidad, hidrofóbico, cromatoenfoque, y exclusión de tamaño), procedimientos electroforéticos (p.ej., enfoque isoeléctrico preparativo), solubilidad diferencial (p.ej., precipitación de sulfato amónico), SDS-PAGE, o extracción (véase, p.ej., Protein Purification, J.-C. Janson y Lars Riden, editores, VCH Publishers, Nueva York, 1989).

Plantas transgénicas

[0130] La presente invención también se refiere a una planta transgénica, parte de planta, o célula vegetal que ha sido transformada con una secuencia nucleótida que codifica un polipéptido con actividad de fitasa de la presente invención para expresar y producir el polipéptido en cantidades recuperables. El polipéptido se puede recuperar de la planta o parte de planta. Alternativamente, la planta o parte de planta con el polipéptido recombinante se puede utilizar como tal para mejorar la calidad de un alimento o pienso, p.ej., mejorando el valor nutricional, palatabilidad, y propiedades reológicas, o para destruir un factor antinutritivo.

[0131] En una realización particular, el polipéptido se dirige a las vacuolas de almacenamiento de endospermo en semillas. Esto se puede obtener sintetizándolo como un precursor con un péptido señal adecuado, véase Horvath et al. en PNAS, Feb. 15, 2000, vol. 97, n°. 4, p. 1914-1919.

[0132] La planta transgénica puede ser dicotiledónea (una dicota) o monocotiledónea (una monocota) o variantes creadas genéticamente a partir de las mismas. Ejemplos de plantas monocotiledóneas son hierbas, tales como césped de pradera (poa pratense, Poa), hierba forrajera tales como Festuca, Lolium, hierba templada, tal como Agrostis, y cereales, p.ej., trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo, tritical (híbrido estabilizado de trigo (Triticum) y centeno (Secale), y maíz (grano). Ejemplos de plantas dicotiledónea son tabaco, leguminosas, tales como girasol (Heliantus), algodón (Gossipium), altramuces, patata, remolacha azucarera, guisante, haba y semilla de soja, y plantas crucíferas (familia Brassicaceae), tales como coliflor, semilla de colza, y la Arabidopsis thaliana como organismo modelo estrechamente relacionado. Plantas de bajo fitato como se describen p.ej. en la patente estadounidense Nº 5,689,054 y en la patente estadounidense Nº 6,111,168 son ejemplos de plantas creadas genéticamente.

[0133] Ejemplos de partes de planta son vástago, callo, hojas, raíz, frutas, semillas, y tubérculos, al igual que los tejidos individuales que comprenden estas partes, p.ej. epidermis, mesófilo, parénquima, tejidos vasculares, meristemas. También los compartimentos de célula vegetal específicos, tales como cloroplasto, apoplasto, mitocondria, vacuola, peroxisomas, y citoplasma se consideran una parte de planta. Además, cualquier célula vegetal, sea cual sea el origen del tejido, se considera una parte de planta. Asimismo, partes de planta tales como tejidos específicos y células aisladas para facilitar la utilización de la invención también son consideradas partes de planta, p.ej. embriones, endospermas, aleurona y revestimientos de semilla.

[0134] También incluido dentro del campo de la presente invención se encuentra la progenie de tales plantas, partes de planta y células vegetales.

[0135] La planta transgénica o célula vegetal expresando un polipéptido de la presente invención se puede construir conforme a métodos conocidos en la técnica. Brevemente, la planta o célula vegetal se construye incorporando uno

o más constructos de expresión que codifican un polipéptido de la presente invención en el genoma de la planta huésped y propagan la planta o célula vegetal modificada resultante en una planta transgénica o célula vegetal.

[0136] Convenientemente, el constructo de expresión es un constructo de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de la presente invención operativamente enlazado con secuencias reguladoras apropiadas requeridas para la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos en la planta o parte de planta de elección. Además, el constructo de expresión puede comprender un marcador seleccionable útil para identificar células huésped en las que se ha integrado el constructo de expresión y secuencias de ADN necesario para la introducción del constructo en la planta en cuestión (ésto último depende del método de introducción del ADN a aplicar).

[0137] La elección de secuencias reguladoras, tales como secuencias de promotor y terminador y opcionalmente secuencias de señal o tránsito son determinadas, por ejemplo, en base a cuándo, dónde, y cómo se desea expresar el polipéptido. Por ejemplo, la expresión de los genes que codifican un polipéptido de la presente invención puede ser constitutiva o inducible, o puede ser desarrollable, específica de fase o tejido, y el producto genético puede estar dirigido a un compartimento específico de célula, tejido o parte de planta tales como semillas u hojas. Las secuencias reguladoras se encuentran descritas, por ejemplo por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.

[0138] Para expresión constitutiva, se pueden utilizar los siguientes promotores: el promotor 35S-CaMV (Franck et al., 1980, célula 21: 285-294), la ubiquitina de maíz 1 (Christensen AH, Sharrock RA y Quail 1992). Genes de poliubiquitina de maíz: estructura, perturbación térmica de expresión y transcripción de empalme, y actividad promotora seguida de transferencia a protoplastos por electroporación), o el promotor de actina de arroz 1 (Plant Mo. Biol. 18, 675-689.; Zhang W, McElroi D. y Wu R 1991, Analysis of rice Act1 5' region activity in transgenic rice plants. Plant Cell 3, 1155-1165). Promotores específicos de un órgano pueden ser, por ejemplo, un promotor de tejidos sumidero de almacenamiento tales como semillas, tubérculos de patata, y frutas (Edwards & Coruzzi, 1990, Ana. Rev. Genet. 24: 275-303), o de tejidos sumideros metabólicos tales como meristemas (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), un promotor específico de semilla tales como la glutelina, prolamina, globulina, o promotor de albúmina de arroz (Wu et al., 1998, Plant and Physiology Cell 39: 885-889), un promotor de Vicia faba de la legúmina B4 y los genes de proteína de semilla desconocida de Vicia faba (Conrado et al., 1998, Journal of Plant Physiology 152: 708-711), un promotor de una proteína de cuerpo de aceite de semilla (Chen et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 935-941), el promotor de la proteína de almacenamiento napA de Brassica napus, o cualquier otro promotor específico de semilla conocido en la técnica, p.ej., como se describe en WO 91/14772. Además, el promotor puede ser un promotor específico de hoja tal como el promotor de RbcS de arroz o tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiology 102: 991-1000, el promotor del gen de metiltransferasa de adenina de virus de Chlorella (Mitra y Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93), o el promotor de gen aldP de arroz (Kagaya et al., 1995, Molecular and General Genetics 248: 668-674), o un promotor inducible enrollado tal como el promotor de patata pin2 (Xu et al., 1993, Plant Molecular Biology 22: 573-588). Asimismo, el promotor puede ser inducible mediante tratamientos abióticos tales como temperatura, sequía o alteraciones en la salinidad o inducible por sustancias exógenamente aplicadas que activan el promotor, p.ej. etanol, estrógenos, hormonas vegetales como etileno, ácido abscísico, ácido giberélico, y/o metales pesados.

[0139] Un elemento promotor intensificador puede también ser usado para conseguir una expresión más alta del polipéptido en la planta. Por ejemplo, el elemento promotor intensificador puede ser un intrón que se coloca entre el promotor y la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención. Por ejemplo, Xu et al., 1993, supra revela el uso del primer intrón del gen de actina 1 de arroz para mejorar la expresión.

[0140] Aún más, el uso de codón se puede optimizar para las especies vegetales en cuestión para mejorar la expresión (véase Horvath et al. mencionado anteriormente).

[0141] El gen marcador seleccionable y cualquier otra parte del constructo de expresión se pueden elegir de aquellas disponibles en la técnica.

[0142] El constructo de ácidos nucléicos se incorpora en el genoma de planta según técnicas convencionales conocidas en la técnica, incluyendo transformación mediada por Agrobacterium, transformación mediada de virus, microinyección, bombardeo de partícula, transformación biolística, y electroporación (Gasser et al., 1990, Science

244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).

[0143] Actualmente, la transferencia de genes mediados por Agrobacterium tumefaciens es el método de elección para generar dicotiledóneas transgénicas (para una reseña, véase Hooykas y Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19: 15-38), y esto puede también ser usado para la transformación de monocotas, aunque otros métodos de transformación son usados más frecuentemente para estas plantas. Actualmente, el método de elección para generar monocotas transgénicas, complementando el método de Agrobacterium, es el bombardeo de partículas (oro microscópico o partículas de tungsteno revestidas con el ADN transformador) de callos embrionarios o embriones en desarrollo (Christou, 1992, Plant Journal 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Un método alternativo para la transformación de monocotiledóneas se basa en la transformación de protoplasto como se describe por Omirulleh et al., 1993, Plant Molecular Biology 21: 415-428.

[0144] Después de la transformación, los transformantes que tienen incorporados constructos de expresión incorporados se seleccionan y regeneran en plantas enteras según métodos bien conocidos en la técnica. Frecuentemente el procedimiento de transformación se diseña para la eliminación selectiva de genes de selección bien durante la regeneración o en las siguientes generaciones usando, p.ej., la cotransformación con dos constructos ADN-T separados o una escisión específica de sitio del gen de selección por una recombinasa específica.

[0145] La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención que comprende (a) el cultivo de una planta transgénica o una célula vegetal que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido con actividad de fitasa de la presente invención bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) la recuperación del polipéptido.

Animales transgénicos

[0146] La presente invención también se refiere a un animal transgénico, no humano y productos o elementos del mismo, ejemplos de los cuales son líquidos biológicos tales como leche y sangre, órganos, carne, y células

animales. Técnicas para expresar proteínas, p.ej. en células mamíferas, se conocen en la técnica, véase p.ej. el manual Protein Expression: A Practical Approach, Higgins and Hames (eds), Oxford University Press (1999), y los otros tres manuales en esta serie acerca de la transcripción genética, procesamiento del ARN, y procesamiento postraduccional. En términos generales, para preparar un animal transgénico, las células seleccionadas de un animal seleccionado se transforman en una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido con actividad de fitasa de la presente invención para expresar y producir el polipéptido. El polipéptido puede ser recuperado del animal, p.ej. a partir de la leche de animales hembra, o el polipéptido se puede expresar en el beneficio del propio animal, p.ej. para ayudar a la digestión del animal. Ejemplos de animales se mencionan más abajo en la sección titulada Alimentos para animales.

[0147] Para producir un animal transgénico con el propósito de recuperar el polipéptido de la leche del animal, se puede insertar un gen que codifica el polipéptido en los óvulos fecundados de un animal en cuestión, p.ej. usando un vector de expresión transgénico que comprende un promotor de proteína de la leche adecuada, y el gen que codifica el polipéptido. El vector de expresión transgénico se microinyecta en óvulos fecundados, y preferiblemente se integra de manera permanente en el cromosoma. Una vez el óvulo comienza a crecer y a dividirse, el embrión potencial se implanta en una madre de alquiler, y los animales que llevan el transgénico son identificados. El animal resultante puede entonces ser multiplicado por crianza convencional. El polipéptido se puede purificar a partir de la leche del animal, véase p.ej. Meade, H.M. et al. (1999): Expression of recombinant proteins in the milk of transgenic animals, Gene expression systems: Using nature for the art of expression. J. M. Fernández y J. P. Hoeffler (eds.), Academic Press.

[0148] En la alternativa, para producir un animal transgénico no humano que lleva en el genoma de sus células germinales y/o somáticas una secuencia de ácidos nucleicos que incluye un constructo transgénico heterólogo que incluye un transgénico que codifica el polipéptido, el transgénico puede estar operativamente enlazado a una primera secuencia reguladora para la expresión específica de glándula salival del polipéptido, como se describe en la publicación WO 00/064247.

Composiciones y usos

[0149] En todavía otros aspectos, la presente invención se refiere a composiciones comprenden un polipéptido de la presente invención, al igual que métodos de uso de éstas.

[0150] Las composiciones del polipéptido se pueden preparar conforme a métodos conocidos en la técnica y pueden ser en forma de un líquido o una composición seca. Por ejemplo, la composición del polipéptido puede estar en forma de granulados o microgranulados. El polipéptido que se ha de incluir en la composición se puede estabilizar conforme a métodos conocidos en la técnica.

[0151] La fitasa de la invención se puede usar para la degradación, en cualquier contexto industrial, de, por ejemplo, fitato, ácido fítico, y/o el mono-, di-, tri-, tetra- y/o pentafosfatos de mioinositol. Es bien conocido que las fracciones de fosfato de estos compuestos quelan cationes divalentes y trivalentes tales como iones metálicos, es decir, los iones nutricionalmente esenciales de calcio, hierro, zinc y magnesio así como el magnesio de oligoelementos, cobre y molibdeno. Además, el ácido fítico también une hasta cierto punto proteínas por interacción electrostática.

[0152] Por consiguiente, los usos preferidos de los polipéptidos de la invención son preparaciones de alimento para animales (incluida la alimentación humana) o en aditivos para preparaciones de este tipo.

[0153] En una realización particular, el polipéptido de la invención se puede usar para mejorar el valor nutricional de un alimento para animales. Ejemplos no limitativos de mejora del valor nutricional del alimento para animales (incluida la alimentación humana), son: mejorar la digestibilidad del alimento; estimular el crecimiento del animal; mejorar la utilización del alimento; mejorar la biodisponibilidad de proteínas; aumentar el nivel de fosfato digerible; mejorar la liberación y/o degradación de fitato; mejorar la biodisponibilidad de oligoelementos; mejorar la biodisponibilidad de macrominerales; eliminar la necesidad de añadir fosfato suplementario, oligoelementos, y/o macrominerales; y/o mejorar la calidad de la capa del óvulo. El valor nutricional del alimento es, por lo tanto, más elevado, y el índice de crecimiento y/o aumento de peso y/o conversión alimenticia (es decir, el peso del alimento ingerido en relación al aumento de peso) del animal se pueden mejorar.

[0154] Además, el polipéptido de la invención se puede usar para reducir el nivel de fitato de abono.

Animales, alimento para animales, y aditivos de alimento para animales

[0155] El término animal incluye todos los animales, seres humanos incluidos. Ejemplos de animales son rumiantes, y no rumiantes. Los animales rumiantes incluyen, por ejemplo, animales tales como oveja, cabra, y ganado, p.ej., ganado vacuno y vacas lecheras. En una forma de realización particular, el animal es un animal no rumiante. Los animales no rumiantes incluyen animales monogástricos, p.ej. el cerdo o el puerco (incluyendo, pero no de manera limitada, lechones, cerdos en crecimiento, y cerdas); aves de corral tales como pavos, patos y pollos (incluyendo,

pero no de manera limitada, pollos de engorde, gallinas ponedoras); peces (incluyendo, pero no de manera limitada, salmón, trucha, tilapia, siluro y carpa); y crustáceos (incluyendo, pero no de manera limitada, gamba y langostino).

[0156] El término alimento o composición alimentaria significa cualquier compuesto, preparación, mezcla, o composición adecuada para, o destinada a la ingesta por parte de un animal.

[0157] En el uso según la invención, el polipéptido se puede suministrar al animal antes, después, o simultáneamente con la dieta. Se prefiere esto último.

[0158] En una forma de realización particular, el polipéptido, en la forma en la que se añade al alimento, o cuando se incluye en un aditivo alimenticio, es sustancialmente puro. En una forma de realización particular está bien definido. El término "bien definido" significa que la preparación de fitasa es al menos un 50% pura como se determina mediante cromatografía de exclusión por tamaño (véase el Ejemplo 12 de la publicación WO 01/58275). En otras formas de realización particulares, la preparación de fitasa es al menos un 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94, o al menos un 95% pura como se determina mediante este método.

[0159] Una preparación de polipéptido sustancialmente pura, y/o bien definida es ventajosa. Por ejemplo, es mucho más fácil dosificar correctamente un polipéptido al alimento que está esencialmente libre de interferir o contaminar otros polipéptidos. El término dosificar correctamente se refiere en particular al objetivo de obtener resultados consistentes y constantes, y la capacidad de optimizar la dosificación basada en el efecto deseado.

[0160] No obstante, para uso en el alimento para animales, el polipéptido de fitasa de la invención no necesita ser tan puro; puede, p.ej., incluir otros polipéptidos, en cuyo caso se podría denominar una preparación de fitasa.

[0161] La preparación de fitasa puede ser (a) añadida directamente al alimento (o usarse directamente en un proceso de tratamiento de proteínas), o (b) se puede usar en la producción de una o más composiciones intermedias tales como aditivos alimenticios o premezclas que se añaden posteriormente al alimento (o usarse en un proceso de tratamiento). El grado de pureza anteriormente descrito se refiere a la pureza de la preparación del polipéptido original, si se usa según los puntos (a) o (b) anteriores.

[0162] Las preparaciones de polipéptido con purezas de este orden de magnitud se encuentran en partículas obtenibles usando métodos recombinantes de producción, mientras que no se obtienen tan fácilmente y también están sujetas a una variación de lote a lote mucho más elevada cuando el polipéptido se produce por métodos de fermentación tradicional.

[0163] Tal preparación del polipéptido puede, por supuesto, mezclarse con otros polipéptidos.

[0164] El polipéptido se puede añadir al alimento en cualquier forma, ya sea como un polipéptido relativamente puro,

o en la mezcla con otros componentes destinados a añadirse al alimento para animales, es decir, en forma de aditivos alimenticios, tales como las denominadas premezclas para alimento para animales.

[0165] En otro aspecto la presente invención se refiere a composiciones para su uso en el alimento para animales, tales como alimentos para animales, y aditivos para alimentos para animales, p.ej. premezclas.

[0166] Además del polipéptido de la invención, los aditivos para alimentos para animales de la invención contienen al menos una vitamina fitosoluble, y/o al menos una vitamina soluble en agua, y/o al menos un oligoelemento. El aditivo alimentario puede también contener al menos un macromineral.

[0167] Además, los ingredientes de aditivos de alimento opcionales son agentes colorantes, p.ej. carotenoides tales como betacaroteno, astaxantina, y luteína; compuestos de aroma; estabilizadores; péptidos antimicrobianos; ácidos grasos poliinsaturados; especias generadoras de oxígeno reactivo; y/o por lo menos otro polipéptido seleccionado de entre fitasa (EC 3.1.3.8 o 3.1.3, 6); fosfatasa (EC 3.1.3.1 EC 3.1.3.2 EC 3.1.3.39); xilanasa (EC 3.2.1.8); galactanasa (EC 3.2.1.89); alfa-galactosidasa (EC 3.2.1.22); proteasa (EC 3.4.-.-), fosfolipasa A1 (EC 3.1.1.32); fosfolipasa A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipasa (EC 3.1.1.5); fosfolipasa C (3.1.4.3); fosfolipasa D (EC 3.1.4.4); amilasa tales como, por ejemplo, alfa-amilasa (EC 3.2.1.1); y/o beta-glucanasa (EC 3.2.1.4 o EC 3.2.1.6).

[0168] En una forma de realización particular estos otros polipéptidos están bien definidos (como se ha definido más arriba para preparaciones de fitasa).

[0169] La fitasa de la invención puede también ser combinada con otras fitasas, por ejemplo fitasas de ascomiceto tales como fitasas de Aspergillus, por ejemplo, derivadas de Aspergillus ficuum, Aspergillus niger, o Aspergillus awamori; o fitasas de basidiomiceto, por ejemplo, derivadas de Peniophora lycii, Agrocybe pediades, Trametes pubescens, o Paxillus involutus; o derivados, fragmentos o variantes de los mismos que tienen actividad de fitasa.

[0170] Así, en formas de realización preferidas del uso en el alimento para animales de la invención, y en formas de realización preferidas del aditivo para alimentación animal y el alimento para animales de la invención, la fitasa de la invención se combina con tales fitasas.

[0171] Ejemplos de péptidos antimicrobianos (PAMs) son CAP18, leucocino A, tritrpticina, protegrina-1, tanatina, defensina, lactoferrina, lactoferricina, y ovispirina tales como novispirina (Robert Lehrer, 2000), plectasinas, y estatinas, incluyendo los compuestos y polipéptidos descritos en las publicaciones WO 03/044049 y WO 03/048148, al igual que variantes o fragmentos de los anteriores que retienen actividad antimicrobiana.

[0172] Ejemplos de polipéptidos antifungicidas (PAFs) son el Aspergillus giganteus, y los péptidos Aspergillus niger, así como variantes y fragmentos de los mismos que retienen actividad antifúngica, como se ha descrito en las publicaciones WO 94/01459 y WO 02/090384.

[0173] Ejemplos de ácidos grasos poliinsaturados son los ácidos grasos poliinsaturados C18, C20 y C22, tales como ácido araquidónico, ácido docosahexaenoico, ácido eicosapentanoico y ácido gamma-linoleico.

[0174] Ejemplos de especies generadoras de oxígeno reactivo son sustancias químicas tales como perborato, persulfato, o percarbonato; y polipéptidos tales como una oxidasa, una oxigenasa o una sintetasa.

[0175] Por lo general, las vitaminas grasas e hidrosolubles, así como los oligoelementos forman parte de una premezcla destinada para la adición al alimento, mientras que los macrominerales se añaden al alimento normalmente por separado. Cualquiera de estos tipos de composición, cuando se enriquece con un polipéptido de la invención, es un aditivo para alimentación animal de la invención.

[0176] En una forma de realización particular, el aditivo para alimentación animal de la invención está destinado a ser incluido (o prescrito como que debe ser incluido) en dietas o alimento para animales a niveles de 0,01 a 10,0%; más particularmente 0,05 a 5,0%; o 0,2 a 1,0% (% significa g de aditivos por 100 g de alimento). Esto es así en particular para premezclas.

[0177] Lo siguiente son listas no exclusivas de ejemplos de estos componentes:

[0178] Ejemplos de vitaminas liposolubles son vitamina A, vitamina D3, vitamina E, y vitamina K, p. ej., vitamina K3.

[0179] Ejemplos de vitaminas hidrosolubles son vitamina B12, biotina y colina, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, niacina, ácido fólico y pantotenato, p.ej. pantotenato Ca-D.

[0180] Ejemplos de oligoelementos son manganeso, zinc, hierro, cobre, yodo, selenio, y cobalto.

[0181] Ejemplos de macrominerales son calcio, fósforo y sodio.

[0182] Los requisitos nutritivos de estos componentes (ejemplificados con aves de corral y lechones/cerdos) están listados en la tabla A de la publicación WO 01/58275. Requisito nutritivo significa que estos componentes deberían proporcionarse en la dieta en las concentraciones indicadas.

[0183] En la alternativa, el aditivo para alimentación animal de la invención comprende al menos uno de los componentes individuales especificados en la Tabla A de la publicación WO 01/58275. Al menos uno significa cualquiera de, uno o más de, uno, o dos, o tres, o cuatro y así sucesivamente hasta todos los trece, o hasta todos los quince componentes individuales. Más específicamente, este al menos un componente individual se incluye en el aditivo de la invención en una cantidad tal para proporcionar una concentración en alimento en el intervalo indicado en la columna cuatro, o en la columna cinco, o en la columna seis de la Tabla A.

[0184] La presente invención también se refiere a composiciones de alimento para animales. Las composiciones de alimento para animales o dietas tienen un contenido relativamente alto de proteína. Las dietas de aves de corral y cerdos se pueden caracterizar como se indica en la Tabla B de la publicación WO 01/58275, columnas 2-3. Las dietas de peces se pueden caracterizar como se indica en la columna 4 de esta Tabla B. Además tales dietas de peces tienen normalmente un contenido de grasa cruda de 200-310 g/kg.

[0185] La publicación WO 01/58275 corresponde a la publicación US 09/779334, que se incorpora aquí por referencia.

[0186] Una composición de alimento para animales según la invención tiene un contenido bruto de proteína de 50800 g/kg, y comprende además al menos un polipéptido como se reivindica en este documento.

[0187] Además, o en la alternativa (al contenido bruto de proteína indicado anteriormente), la composición alimentaria para animales de la invención tiene un contenido de energía metabolizable de 10-30 MJ/kg; y/o un contenido de calcio de 0,1-200 g/kg; y/o un contenido de fósforo disponible de 0,1-200 g/kg; y/o un contenido de metionina de 0,1-100 g/kg; y/o un contenido de metionina más cisteína de 0,1-150 g/kg; y/o un contenido de lisina de 0,5-50 g/kg.

[0188] En formas de realización particulares, el contenido de energía metabolizable, proteína cruda, calcio, fósforo, 5 metionina, metionina más cisteína, y/o lisina está dentro de uno cualquiera de los intervalos 2, 3, 4 o 5 en la Tabla B de la publicación WO 01/58275 (R. 2-5).

[0189] La proteína cruda se calcula como nitrógeno (N) multiplicada por un factor 6,25, es decir, proteína cruda (g/kg)= N (g/kg) x 6,25. El contenido de nitrógeno se determina por el método Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Official

10 Methods of Analysis 14th ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC).

[0190] La energía metabolizable puede ser calculada basándose en la publicación del NRC sobre los requisitos de nutrientes en los cerdos, novena edición revisada 1988, subcomisión para porcinos, comité de nutrición animal, consejo de agricultura, consejo nacional de investigación. National Academy Press, Washington, D.C., págs. 2-6, y

15 la Tabla europea de valores energéticos de los alimentos para las aves, centro Spelderholt para la investigación de aves y extensión, 7361 DA Beekbergen, Países Bajos. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN 9071463-12-5.

[0191] El contenido dietético de calcio, fósforo disponible y aminoácidos en dietas completas para animales se

20 calcula basándose en tablas de alimentos tales como Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7.

[0192] En una forma de realización particular, la composición de alimento para animales de la invención contiene al

25 menos una proteína. La proteína puede ser una proteína animal, tales como harina de carne y huesos, y/o harina de pescado; o puede ser una proteína vegetal. El término proteínas vegetales como se utiliza en este documento se refiere a cualquier compuesto, composición, preparación o mezcla que incluya al menos una proteína derivada u originada a partir de un vegetal, incluyendo proteínas modificadas y derivados de proteína. En formas de realización particulares, el contenido de proteína de las proteínas vegetales es de al menos un 10, 20, 30, 40, 50, o un 60%

30 (porcentaje en peso).

[0193] Las proteínas vegetales pueden estar derivadas de fuentes de proteína vegetal, tales como legumbres y cereales, por ejemplo materiales de plantas de las familias Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae, y Poaceae, tales como harina de soja, harina de lupino y harina de semilla de colza.

35 [0194] En una forma de realización particular, la fuente de proteína vegetal es material de una o más plantas de la familia Fabaceae, p.ej. semilla de soja, altramuz, guisante, o alubia.

[0195] En otra forma de realización particular, la fuente de proteína vegetal es material de una o más plantas de la 40 familia Chenopodiaceae, por ejemplo, remolacha, remolacha azucarera, espinaca o quinua.

[0196] Otros ejemplos de fuentes de proteína vegetal son la semilla de colza, semilla de girasol, semilla de algodón, y repollo.

45 [0197] La semilla de soja es una fuente de proteína vegetal preferida.

[0198] Otros ejemplos de fuentes de proteína vegetal son los cereales tales como cebada, trigo, centeno, avena, maíz (mazorca), arroz, triticale, y sorgo.

50 [0199] En todavía más formas de realización particulares, la composición de alimento para animales de la invención contiene un 0-80% de maíz; y/o un 0-80% de sorgo; y/o un 0-70% de trigo; y/o un 0-70% de cebada; y/o un 0-30% de avena; y/o un 0-40% de harina de soja; y/o un 0-25% de harina de pescado; y/o un 0-25% de harina de carne y hueso; y/o un 0-20% de lactosuero.

55 [0200] Las dietas para animales pueden p.ej. producirse como pienso en harina (no granulado) o pienso en gránulos. Típicamente, se mezclan los materiales alimenticios triturados se agregan cantidades suficientes de vitaminas esenciales y minerales según las especificaciones para las especies en cuestión. Los polipéptidos se pueden agregar como formulaciones de polipéptido sólidas o líquidas. Por ejemplo, una formulación de polipéptido sólida se agrega típicamente antes o durante la etapa de mezclado; y una preparación de polipéptido líquida se agrega

60 típicamente después de la etapa de granulación. El polipéptido se puede también incorporar en forma de aditivo alimentario o premezcla.

[0201] La concentración de polipéptidos final en la dieta está en el intervalo de 0,01-200 mg de proteína de polipéptido por kg de dieta, por ejemplo en el intervalo de 5-30 mg de proteína de polipéptido por kg de dieta animal.

[0202] La fitasa de la invención debería por supuesto añadirse en una cantidad eficaz, es decir, en una cantidad adecuada para mejorar la solubilización y/o mejorar el valor nutricional del alimento. Actualmente se contempla que el polipéptido se administra en una o más de las cantidades siguientes (intervalos de dosificación): 0,01-200; 0,01100; 0,5-100; 1-50; 5-100; 10-100; 0,05-50 ó 0,10-10 - siendo todos estos intervalos en mg de proteína de polipéptido de fitasa por kg de alimento (ppm).

[0203] Para determinar los mg de proteína de polipéptido de fitasa por kg de alimento, la fitasa se purifica a partir de la composición alimentaria, y la actividad específica de la fitasa purificada se determina usando un ensayo pertinente. La actividad de fitasa de la composición alimentaria como tal se determina también usando el mismo ensayo, y basándose en estas dos determinaciones, se calcula la dosificación en mg de proteína de fitasa por kg de alimento.

[0204] Los mismos principios se aplican para determinar los mg de proteína de polipéptido de fitasa en aditivos alimenticios. Por supuesto, si hay una muestra disponible de la fitasa usada para la preparación del aditivo para alimentación animal o el alimento, la actividad específica se determina a partir de esta muestra (sin necesidad de purificar la fitasa de la composición alimentaria o el aditivo).

Ejemplos

[0205] Los productos químicos usados fueron productos comerciales de al menos grado reactivo.

Ejemplo 1: Preparación de variantes, y prueba de termoestabilidad y perfil de pH

Preparación de variantes de fitasa

[0206] El ADN que codifica una variante de la fitasa con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2 se genera mediante métodos conocidos en la técnica, y los constructos se fusionan por RCP al ADN que codifica el péptido señal descrito por Takami et al. in Biosci. Biotechnol. Biochem. 56:1455 (1992) y se integran por recombinación homóloga en el genoma de una célula huésped Bacillus subtilis (véase Diderichsen et al. (1990), J. Bacteriol., 172, 4315-4321) usando técnicas estándar. Los genes se expresan bajo el control de un sistema promotor triple (como se describe en la publicación WO 99/43835) y las proteínas de fitasa resultantes purificadas usando métodos convencionales.

Determinación de estabilidad de temperatura

[0207] La estabilidad de temperatura de una variante de fitasa se puede determinar de la siguiente manera: 500 microlitros de solución de proteína de la variante y de la proteína de referencia (SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, SEC ID NO:4, y/o SEC ID NO:6) teniendo aproximadamente 10 microgramos de proteína por ml, y siendo disuelto en 0.1 M de tampón de Na-acetato, pH 5.5, se divide en dos partes, una parte se incuba a una temperatura deseada elevada (p.ej. 50°C, 55°C, 60°C, 65°C, 70°C, 75°C, 80°C, o 85°C) en contenedores plásticos, el otro se almacena a 5°C. Después de 30 minutos de incubación a la temperatura elevada las soluciones de proteína se transfieren a un baño de hielo y la actividad del enfriado al igual que la muestra calentada se mide por el ensayo de fosfatasa descrito más abajo (tampón ciego sustraído). La actividad residual se define como la actividad después del tratamiento de calor dividida por la actividad de la muestra enfriada (en %). Una variante se considera que es más estable a la temperatura (termoestable) si la actividad residual en el ensayo de la fosfatasa, o fitasa, es más elevada, en comparación con la referencia.

Determinación de actividad de fosfatasa

[0208] 75 microlitros de solución enzimática con fitasa se dispensan en un pocillo de placa de microtitulación, p.ej. NUNC 269620 y se añaden 75 microlitros de sustrato (para preparar el sustrato, se disuelven dos comprimidos de 5 mg de fosfato de p-nitrofenilo (Sigma, Cat.No. N-9389) en 10 ml 0,1 M de tampón de Na-acetato, pH 5,5). La placa se sella e se incuba 15 min., agitada a 750 r.p.m. a 37°C. Después del tiempo de incubación se añaden 75 microlitros de reactivo de parada (el reactivo de parada es 0,1 M de tetraborato de sodio en agua) y la absorbancia a 405 nm se mide en un espectrofotómetro de placa de microtitulación. Una unidad de fosfatasa se define como la actividad enzimática que libera 1 micromol de fosfato/min bajo las condiciones de reacción dadas (tampón ciego sustraído). La absorbancia de 1 micromol de p-nitrofenol se determina que es 56 AU (AU= unidades de absorbancia) bajo condiciones de ensayo.

Mediciones de calorimetría diferencial de barrido

[0209] La calorimetría diferencial de barrido (DSC) se puede realizar a varios valores de pH usando el calorímetro VP-ITC de Micro Cal. Los barridos se realizan a una escala de barrido constante de 1,5°C/min de 20-90°C. Antes de ejecutar la calorimetría por análisis diferencial, se desalan las fitasas usando columnas NAP-5 (farmacia) equilibradas en los tampones apropiados (p.ej. 0,1M de glicina-HCl, pH 2,5 o 3,0, 20mM de acetato sódico pH 4.0,

0,1 M de acetato sódico, pH 5,5; 0,1M Tris-HCl, pH 7,0). La manipulación de datos se realiza usando el software MicroCal Origin (versión 4.10), y la temperatura de desnaturalización, Td (también llamada la temperatura de fusión, Tm) se define como la temperatura en el ápice del valor máximo en el termograma.

5 Perfil de pH modificado: determinación de pH 3,5/5,5 de índice de actividad

[0210] Una enmienda del perfil de pH de una variante de fitasa se puede determinar de la siguiente manera: la actividad se mide a pH 3,5 (0,1 M de tampón de acetato, pH 3,5) y a pH 5,5 (0,1 M de tampón deacetato, pH 5,5), 10 en ambos casos se sustrae el tampón ciego. La actividad determinada a pH 3.5 se divide por la actividad determinada a pH 5,5, es decir, las dos mediciones de absorbancia se dividen (véase más abajo). Para medir la actividad, se diluyen los sobrenadantes de las variantes y referencias (p.ej. 1:5000) de manera apropiada en el tampón respectivo. Se dispensan 75 microlitros de la respectiva solución enzimática en un pocillo de placa de microtitulación, p.ej. NUNC 269620 y se añaden 75 microlitros de sustrato con el correspondiente pH (el sustrato se

15 prepara disolviendo dos comprimidos de 5 mg de p-nitrofenil fosfato (Sigma, Cat.No. N-9389) en 10 ml 0,1 M de tampón de Na-acetato, pH 5,5 y 10 ml 0,1 M de tampón de acetato, pH 3,5, respectivamente). La placa se sella y se incuba 15 min., agitada con 750 r.p.m. a 37°C. Después de la parada del tiempo de incubación de 75 microlitros.

[0211] Se añade el reactivo (0,1 M de tetraborato de sodio en el agua) y la absorbancia a 405 nm se mide en un 20 espectrofotómetro de placa de microtitulación.

Determinación de la actividad de fitasa

25 [0212] 75 microlitos de solución enzimática con fitasa, diluidos apropiadamente (p.ej. en 0,25M de acetato sódico, 0,005% (p/v) Tween-20. pH5,5), se dispensan en un pocillo de placa de microtitulación, p.ej. NUNC 269620, y se añaden 75 microlitros de sustrato (preparados disolviendo 100 mg de fitato de sodio de arroz (Aldrich Cat.No. 274321) en 10 ml 0,25 M de tampón de Na-acetato, pH 5,5). La placa se sella y se incuba 15 min. agitada a 750

r.p.m. a 37°C. Después del tiempo de incubación se añaden 75 microlitros de reactivo de parada (el reactivo de

30 parada se prepara mezclando 10 ml de solución de molibdato (10% (p/v) de hepta-molibdato de amonio en 0,25% (p/v) de solución de amoníaco); 10 ml de vanadato de amonio (0,24% producto comercial de Bie&Berntsen, Cat.No. LAB17650) y 21,7 % (p/v) de ácido nítrico) la absorbancia a 405 nm se mide en un espectrofotómetro de placa de microtitulación. La actividad de fitasa se expresa en la unidad de FYT, siendo un FYT la cantidad de enzima que libera 1 microml de ortofosfato inorgánico por min. bajo las condiciones anteriores. Un valor absoluto para la

35 actividad de fitasa medida se obtiene por referencia a una curva estándar obtenida a partir de diluciones apropiadas de fosfato inorgánico o a una curva estándar hecha de diluciones de preparación de enzima de fitasa con actividad conocida (tal preparación enzimática estándar con una actividad conocida está disponible a petición de Novozymes A/S, Krogshoejvej 36; DK-2880 Bagsvaerd).

40 Ejemplo 2: Influencia de huésped de expresión / glicosilación en la termoestabilidad

Expresión en Bacillus

[0213] La fitasa de la SEC ID NO:2 fue expresada en Bacillus subtilis como se describe en el ejemplo 1, y purificada

45 usando métodos convencionales: centrifugado, filtración de germen, precipitación de sulfato de amonio (80% saturación de sulfato de amonio), centrifugado, resuspensión de gránulos en el tampón A (50 mM de acetato sódico,

1.5 M de sulfato de amonio pH 4.5), filtración, cromatografía de interacción hidrofóbica (toyopearl de fenilo, cargando con tampón A, eluciendo con tampón B (50 mM de acetato sódico pH 4.5)), y cromatografía de intercambio de catión (SP-sefarosa, cargando con 10 mM de citrato sódico pH 4.0, eluciendo con un gradiente de sal lineal (10 mM de

50 citrato sódico pH 4.0 + 1 M NaCl).

Expresión en Pichia

[0214] Aún más, la fitasa de la SEC ID NO:2 fue expresada en Pichia pastoris como se describe generalmente por

55 Rodríguez et al. en Archivos de Bioquímica y Biofísica, vol. 382, n°. 1, 2000, págs. 105-112. La fitasa fue purificada a partir del sobrenadante del caldo de fermentación de la siguiente manera: precipitación con sulfato de amonio (80% de saturación), redisolución en 10 ml 25mM de tampón de acetato sódico pH 4,5, diálisis contra el mismo tampón, y filtración a través de un filtro de 0,45 mm. 150ml de esta solución fueron aplicados a una columna SP-Sepharose FF de 40 ml (Pharmacia) equilibrada con el mismo tampón pH 4.5, y la proteína se eluyó con un gradiente lineal de

60 NaCl (0-0,5M). Las fracciones de la columna fueron analizadas para actividad de fitasa. Las fracciones con actividad de fitasa fueron controladas por SDS-PAGE y las fracciones puras fueron agrupadas. La concentración de proteína fue medida usando el kit BCA (Pierce).

65 Termoestabilidad por DSC [0215] Las fitasas expresadas en Pichia y Bacillus de la SEC ID NO:2 fueron sometidas a mediciones de termoestabilidad por calorimetría diferencial de barrido (DSC).

Preparación de la muestra:

5 [0216] Las muestras (menos de 3 ml en volumen) fueron dializadas en una cámara fría (aprox. 5 grados centígrados) durante un mínimo de 1 hora contra 500 ml de 20 mM de tampón de acetato sódico pH 4.0. La muestra fue transferida a 500 ml de preparación de tampón frío, fresco, y preparada para dializar durante toda la noche. Las muestras fueron filtradas usando un filtro de jeringa de 0,45 micrometros, el volumen ajustado a aprox. 1,5 ml

10 usando el tampón de diálisis, y registrado a A280 (absorbancia a 280nm). El tampón de diálisis fue usado como referencia en la calorimetría de barrido diferencial. Las muestras fueron desgasificadas aplicando succión al vacío y agitación durante aprox. 10 minutos.

[0217] Durante la preparación de la muestra de la fitasa expresada en Pichia (diálisis contra 20 mM de acetato

15 sódico (NaAc) pH 4,0) se formó un precipitado. El sobrenadante fue usado para un primer experimento. Después, la parte restante de la solución madre purificada fue dializada contra 20 mM de NaAc pH 4,0 y esto permitió la precipitación de algunas impurezas de PM bajo presentes en el lote. Este lote fue usado para un segundo experimento que reveló una Tm muy similar a la del primer experimento (54 vs. 55°C).

20 Experimento de calorimetría diferencial de barrido:

[0218] Ajustes experimentales usando un instrumento VP-DSC de MicroCal™: tasa de barrido: 90 K/h. Intervalo de barrido: 20 - 90 grados centígrados. Modo de retroalimentación: ninguno. Periodo de filtración: 16 s.

25 [0219] Las concentraciones enzimáticas de las muestras fueron aprox. 1 – 1,5 mg/ml como se estimaron por A280 y un coeficiente de extinción calculado teóricamente en 280 nm (Vector NTI versión 9.0.0). La temperatura de despliegue térmico (Td) fue evaluada usando el software MicroCal Origin (versión 4.10) y la temperatura de desnaturalización determinada como la temperatura en el vértice en el termograma.

30 [0220] Los resultados se resumen en la Tabla 2 a continuación.

Tabla 2

Célula huésped

Tampón Velocidad de barrido ( C/h) Intervalo de barrido ( C) Td ( C) A280

B. subtilis

20 mM NaAc pH 4,0 90 20 - 90 62 1,6

P. pastoris

20 mM NaAc pH 4,0 90 20 - 90 55 1,9

35 [0221] A partir de la Tabla 2 se deduce claramente que la fitasa expresada en Pichia es mucho menos termoestable que la fitasa expresada en Bacillus.

[0222] La fitasa expresada en Pichia fue glicosilada fuertemente, como se visualiza mediante una amplia gama de masas moleculares usando espectometría de masa (Maldi-TOF), mientras que la fitasa expresada en Bacillus no fue 40 glicosilada.

Ejemplo 3: Variante de fitasa R339D

[0223] Una variante de proteína de la fitasa creada genéticamente de la SEC ID NO:2 con la sustitución R339D fue

45 preparada y expresada en Aspergillus oryzae usando métodos conocidos en la técnica. Su temperatura de desnaturalización, Td, fue determinada a 62,5°C (20 mM de acetato sódico, pH 4,0), usando calorimetría diferencial de barrido como se describe en el Ejemplo 2.

[0224] La sustitución R339D sirve además para eliminar un sitio de escisión de proteasa Kex2 de relevancia 50 potencial para la expresión en Aspergillus.

Ejemplo 4: Alimento para animales y aditivos de alimento que comprenden una variante de fitasa

Aditivo para alimentación animal

55 [0225] Una formulación de variante de fitasa R339D de la SEC ID NO:2 con 0,15 g de proteína de enzima de fitasa se añade a la premezcla siguiente (por kilo de premezcla): 5000000

IE Vitamina A 1000000 IE Vitamina D3 13333 mg Vitamina E 1000 mg Vitamina K3 750 mg Vitamina B1 2500 mg Vitamina B2 1500 mg Vitamina B6 7666 mcg Vitamina B12 12333 mg Niacina 33333 mcg Biotina 300 mg Ácido fólico 3000 mg Ca-D-pantotenato 1666 mg Cu 16666 mg Fe 16666 mg Zn 23333 mg Mn 133 mg Co 66 mgI 66 mgSe 5,8 % Calcio 25 % Sodio

Alimento para animales

5 [0226] Este es un ejemplo de un alimento para animales (alimentación de pollos de engorde) que comprende 1,5 mg/kg (1.5 ppm) de variante de fitasa R339D de la SEC ID NO:2 (calculado como proteína de enzima de fitasa):

62,55 % de maíz 33,8% de harina de soja (50% proteína cruda, PC)

10 1,0% de aceite de soja 0,2% de DL-metionina 0,22% de DCP (fosfato dicálcico) 0,76% de CaCO3 (carbonato cálcico) 0,32% de arena

15 0,15% de NaCl (cloruro sódico) 1 % de la premezcla anterior

[0227] Los ingredientes se mezclan, y el alimento se granula a la temperatura deseada, p.ej. 60, 65, 75, 80, 85, 90 o incluso 95°C. 20

Ejemplo 5: Determinación de estabilidad de temperatura

[0228] Ocho variantes de la SEC ID NO:2 (las alteraciones en comparación con la SEC ID NO:2 se muestran en la Tabla 3 abajo) fueron preparadas como se describe en el ejemplo 1. Las dos fitasas de referencia con la SEC ID 25 NO:2 y la SEC ID NO:3 fueron preparadas de la misma manera.

[0229] La estabilidad de temperatura fue determinada de la siguiente manera:

[0230] 200 microlitros de sobrenadantes de cada una de las variantes y las proteínas de referencia fueron divididas 30 en dos partes, una parte fue incubada a 50°C en contenedores plásticos, la otra fue almacenada a 5°C. Después de 30 minutos de incubación a 50°C las soluciones de proteína fueron transferidas a un baño de hielo. Después de

diluir 1:100 en 0,1 M de tampón de Na-acetato, pH 5,5 la actividad de la muestra calentada y enfriada se midió mediante el ensayo de la fosfatasa del Ejemplo 1 ("Determinación de la actividad de fosfatasa), tampón ciego sustraído. Los resultados se muestran en la Tabla 3 de abajo como actividad enzimática (en las unidades de absorción (AU)) tras la incubación durante 30 minutos a 5°C y 50°C, respectivamente, y la actividad residual (RA) se calcula como actividad de la muestra termotratada (50°C de incubación) dividida por la actividad de la muestra enfriada (5°C de incubación), en %.

Tabla 3: Variantes de fitasa con termoestabilidad mejorada

Fitasa

5 C (AU) 50°C (AU) RA (%)

SEC ID NO:2

0,210 0,070 33

SEC ID NO:3

1,052 0,027 3

N4P de la SEC ID NO:2

0,513 0,313 61

G5P de la SEC ID NO:2

0,576 0,287 50

Q111P de la SEC ID NO:2

1,053 0,577 55

E1* de la SEC ID NO:2

0,909 0,401 44

E1*/E2* de la SEC ID NO:2

0,322 0,159 50

E1*/E2*/Q3* de la SEC ID NO:2

0,101 0,051 51

M273L de la SEC ID NO:2

1,599 0,897 56

N286Q de la SEC ID NO:2

0,062 0,024 39

Ejemplo 6: Rendimiento en el alimento para animales en un modelo in vitro

[0231] El rendimiento en el alimento para animales de una variante de fitasa es comparada, en un modelo in vitro, al rendimiento de una proteína de referencia tales como SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, SEC ID NO:4, y/o SEC ID NO:6. El modelo in vitro simula condiciones gastrointestinales en un animal monogástrico y correlaciona bien con resultados obtenidos en los ensayos in vivo en animales. La comparación se realiza de la siguiente manera:

[0232] La actividad de fitasa en la muestra variante se determina como se describe en el Ejemplo 1 bajo "Determinación de la actividad de fitasa".

[0233] Las muestras de alimento compuestas por un 30% de harina de soja y un 70% de harina de maíz con CaCl2 añadido a una concentración de 5 g de calcio por kg de alimento se preparan y preincuban luego a 40°C y pH 3,0 durante 30 minutos seguidos por la adición de pepsina (3000 U/g de alimento) y dosificaciones adecuadas de las fitasas (se usan dosificaciones idénticas para todas las fitasas que serán evaluadas para permitir la comparación), por ejemplo, entre 0,25 hasta 0,75 unidades de fitasa FYT/g de alimento. Una forma preliminar sin actividad de fitasa se incluye también como referencia. Luego se incuban las muestras a 40°C y pH 3.0 durante 60 minutos seguidos de pH 4.0 durante 30 minutos.

[0234] Las reacciones se detienen y el ácido fítico y los inositol fosfatos se extraen mediante adición de HCl a una concentración final de 0,5 M e incubación a 40°C durante 2 horas, seguido de un ciclo de congelacióndescongelación y 1 hora de incubación a 40°C.

[0235] El ácido fítico y los inositol fosfatos se separan por cromatografía iónica de alto rendimiento como es descrito por Chen et al. en el Journal of Chromatography A (2003) vol. 1018, págs. 41-52 y cuantificado como se describe por Skoglund et al. en J. Agric. Food Chem. (1997), vol. 45, págs. 431-436.

[0236] El fósforo liberado es calculado luego como la diferencia en el fósforo ligado al inositol fosfato (IP-P) entre la fitasa tratada y las muestras no tratadas. El rendimiento relativo de la variante se calcula como el porcentaje del fósforo liberado por la fitasa de referencia.

[0237] El rendimiento in vitro de varias variantes de fitasa de la SEC ID NO:2 fue determinado como se ha descrito anteriormente, en una dosificación de 125 FYT/kg de alimento.

[0238] Los resultados se muestran en las Tablas 4A y 4B de abajo, para sobrenadantes y fitasas purificadas, respectivamente. El residual IP6-P designa la cantidad de IP6-P (fósforo de fitato) restante después de la incubación in vitro y se indica en mg/g MS (materia seca). El IP6-P degradado se determina como la diferencia entre el residual IP6-P de la forma preliminar y el residual IP6-P de la muestra respectiva. Finalmente, en la última columna el IP6-P 5 degradado se indica relativamente a la fitasa con la SEC ID NO:2. En la Tabla 4A la forma preliminar y los valores de referencia (SEC ID NO:2) son promedios de varias determinaciones independientes, mientras que los otros valores se basan en determinaciones únicas. En la Tabla 4B el valor de la forma preliminar es un promedio de varias determinaciones independientes, donde los otros valores se basan en determinaciones únicas.

10 Tabla 4A. Rendimiento in vitro de sobrenadantes de variante de fitasa [0239] Las variantes 015, 016, 018, 040, 041, 042, 044, y 050 parecen tener un rendimiento in vitro que es al menos tan bueno o mejor que las fitasas de la SEC ID NO:2 y 3.

Variante No. / (modificación en comparación con la SEC ID NO:2)

IP6-P residual mg/g MS IP6-P degradado mg/g MS IP6-P degradado (%)

Forma preliminar

2,462

026 (SEC ID NO:3)

0,106 2,356 99

000 (SEC ID NO:2)

0,071 2,391 100

008 (G52C/A99C)

0,387 2,075 87

009 (G59C/F100C)

0,272 2,190 92

010 (K141C/V199C)

0,207 2,255 94

015 (N4P)

0,064 2,387 100

016 (G5P)

0,099 2,351 98

018(Q111P)

0,100 2,350 98

020 (T137P)

0,370 2,092 87

021 (L154P)

0,382 2,080 87

022 (S161 P)

0,235 2,227 93

023 (K240P)

0,581 1,881 79

024 (T355P)

0,744 1,718 72

028 (G52E)

0,716 1,746 73

030 (E57Y)

0,666 1,796 75

032 (A84Y)

0,667 1,795 75

034(L104A)

0,709 1,753 73

035 (A105E)

0,553 1,908 80

036 (K107D)

0,767 1,695 71

037 (K107G)

0,450 2,012 84

040 (E1*)

0,069 2,381 100

041 (E1*/E2*)

0,095 2,367 99

042 (E1*/E2*/Q3*)

0,084 2,366 99

043 (N121T)

0,423 2,039 85

044 (M273L)

0,107 2,355 98

048 (E285G)

0,553 1,909 80

050 (N286Q)

0,068 2,382 100

051 (G289P)

0,560 1,902 80

052 (V294T)

0,746 1,716 72

053 (I299L)

0,848 1,614 67

056 (I362K)

0,699 1,763 74

059 (K107E)

0,537 1,925 80

Tabla 4B: Rendimiento in vitro de variantes de fitasa purificadas

Variante Nº / (modificado en comparación con SEC ID NO:2)

IP6-P residual mg/g MS IP6-P degradado mg/g MS IP6-P (%) degradado

Forma preliminar

2,412

026 (SEC ID NO:3)

0,630 1,782 112

102 (SEC ID NO:4)

0,717 1,695 106

000 (SEC ID NO:2)

0,816 1,596 100

101 (SEC ID NO:9)

0,631 1,781 112

018 (Q111P)

0,843 1,569 98

030 (E57Y)

0,318 2,094 131

031 (T76G)

0,384 2,028 127

037 (K107G)

0,657 1,755 110

041 (E1*/E2*)

0,858 1,553 97

044 (M273L)

0,943 1,469 92

050 (N286Q)

0,865 1,546 97

056 (I362K)

0,425 1,987 125

072 (I362R)

0,430 1,982 124

085 (N121D)

0,555 1,856 116

087 (E196Q)

0,547 1,865 117

089 (T200K)

0,405 2,007 126

090 (D202N)

0,586 1,826 114

091 (E218Q)

1,264 1,148 72

095 (D314N)

0,696 1,716 107

098 (E406A)

0,515 1,897 119

125 (Y114T/Q115Q/K116A/D117D/E118T/E119S/K120S/N121 P/D122D/P123P/L124L)

0,753 1,658 104

127 (Y114T/Q115Q/K116T/D117D/E118T/E119S/K120S/N121 P/D122D/P123P/L124L)

0,861 1,550 97

[0240] Las variantes 030, 031, 037, 056, 072, 085, 087, 089, 090, 095, 098, y 125 parecen rendir al menos tan bien 10 in vitro como la fitasa de la SEC ID NO:3.

Ejemplo 7: Actividad específica

[0241] La actividad específica de una variante de fitasa se determina en muestras altamente purificadas dializadas contra 250 mM de acetato sódico, pH 5,5. La pureza se controla previamente en un gel de poliacrilamida SDS que muestra la presencia de sólo un componente.

[0242] La concentración de proteína se determina mediante el análisis de aminoácidos de la siguiente manera: una alícuota de la muestra es hidrolizada en 6N HCl, 0,1 % de fenol durante 16 h a 110°C en un tubo de vidrio evacuado. Los aminoácidos resultantes son cuantificados usando un sistema de análisis de aminoácidos Applied Biosystems 420A accionado según las instrucciones del fabricante. A partir de las cantidades de los aminoácidos se puede calcular la masa -y por lo tanto también la concentración-de proteína en la alícuota hidrolizada.

[0243] La actividad de fitasa se determina en las unidades de FYT como se describe en El ejemplo 1 ("Determinación de la actividad de fitasa"), y la actividad específica se calcula como la actividad de fitasa medida en unidades de FYT por mg de proteína enzimática de variante de fitasa.

[0244] La actividad específica para la fitasa de la SEC ID NO:2 y variante 072 (I362R de la SEC ID NO:2) fue determinada como se ha descrito anteriormente. La actividad específica de variante 072 fue un 86% de la actividad específica de la fitasa de la SEC ID NO:2. La incertidumbre (desviación típica) se estima en aproximadamente un 10%, que es principalmente debido al ensayo de actividad de fitasa basado en un sustrato complejo.

Ejemplo 8: Estabilidad de temperatura

[0245] Varias variantes de la SEC ID NO:2 fueron preparadas como se describe en el Ejemplo 1, y las cepas huésped de Bacillus subtilis cultivadas en 100ml de PS1 medio (100g/L de sacarosa, 40g/L de copos de soja, 10g/L Na2HPO4.12H2O; 0,1ml/L Dowfax 63N10 (Dow)) en frascos de agitación de 500ml durante cuatro días a 30°C a 300

r.p.m.

[0246] Dos fitasas de referencia fueron preparadas de la misma manera, es decir, la fitasa con la SEC ID NO:3 (correspondiente a la variante N31D/Q139K/L197F/N316K de la SEC ID NO:2), y la fitasa con la SEC ID NO:4 (correspondiente a la variante N31D/N121T/K132T/Q139K de

[0247] la SEC ID NO:2).

[0248] También la fitasa con la SEC ID NO:9 fue incluida para comparación (correspondiente a la variante Q3P/N31D/N121T/K132T/Q139K de la SEC ID NO:2).

[0249] La estabilidad de temperatura de las variantes y las fitasas de referencia fue determinada de la siguiente manera:

[0250] Los sobrenadantes fueron diluidos diez veces añadiendo 20ul (microlitros) de sobrenadante a 180ul 0,1 M de tampón de Na-acetato, pH5,5 + 0,005% de Tween-20. Las enzimas diluidas fueron divididas en dos partes, una parte fue incubada a 60°C en recipientes de plástico, y la otra parte fue almacenada a 5°C. Después de 30 minutos de incubación a 60°C las soluciones de proteína fueron transferidas a un baño de hielo. Después de diluir 1:10 en 0,1M de tampón de Na-acetato, pH5,5 y 0,005% de Tween-20, la actividad de la muestra calentada y enfriada fue medida mediante el ensayo de la fosfatasa del ejemplo 1 ("Determinación de la actividad de fosfatasa), el tampón ciego fue sustraído.

[0251] La Tabla 5 es una lista de variantes con estabilidad de temperatura mejorada en comparación con las fitasas de referencia. Para cada variante, la tabla también especifica las alteraciones en comparación con la SEC ID NO:2. La actividad enzimática (en unidades de absorción (UA)) tras la incubación durante 30 minutos a 5°C y 60°C, respectivamente, fue determinada, y la actividad residual (AR) calculada como la actividad de la muestra termotratada (60°C de incubación) dividida por la actividad de la muestra enfriada (5°C de incubación). Después, los resultados de la actividad residual fueron normalizados a la actividad residual de la fitasa de la SEC ID NO:2, habiendo sido expresados y tratados de la misma manera. El Factor de Mejora resultante (FM) se muestra en la Tabla 5. Para la fitasa de la SEC ID NO:2 el FM es 1,0, mientras que las dos fitasas de referencia de la SEC ID NO:3 y 4 fueron menos termoestables que la fitasa de la SEC ID NO:2, lo cual se desprende del hecho de que el FM para estas dos fitasas fue sólo 0,1 y 0,3, respectivamente.

Tabla 5: Variantes de fitasa con termoestabilidad mejorada

Nº

Mutación FM

026

N31D/Q139K/L197F/N316K (SEC ID NO:3) 0,1

Q3P/N31D/N121T/K132T/Q139K

101

(aminoácidos 23-433 de la SEC ID NO:9) 0,3

102

N31D/N121T/K132T/Q139K (SEC ID NO:4) 0,3

078

V409E 0,3

019

N136P 0,3

082

E411K 0,4

058

E331K/V55D 0,4

086

E167Q 0,4

110

K179K/T180T/T181D/E182K/K183L/S184*/T185*/K186* 0,4

059

K107E 0,4

087

E196Q 0,5

070

T276R 0,5

048

E285G 0,5

053

I299L 0,5

089

T200K 0,5

065

E119R 0,6

085

N121D 0,6

036

K107D 0,6

107

K179K/T180E/T181K/E182H/K183Q/S184*/T185*/K186* 0,6

095

D314N 0,7

022

S161P 0,7

079

T410D 0,7

004

K141C 0,7

108

K179K/T180E/T181 K/E182Q/K183Q/S184*/T185*/K186* 0,7

094

E285N 0,7

068

R164E 0,8

081

E411R 0,8

002

G52C 0,8

020

T137P 0,8

096

D314G 0,8

120

E1K 0,9

042

E1*/E2*/Q3* 0,9

043

N121T 0,9

098

E406A 0,9

063

Q82E 0,9

038

Q109A 0,9

Tabla 5: Variantes de fitasa con termoestabilidad mejorada

Nº

Mutación FM

000

SEC ID NO:2 1,0

016

G5P 1,0

030

E57Y 1,0

074

I379R 1,0

041

E1*/E2* 1,0

080

T410E 1,1

040

E1* 1,2

066

E119K 1,2

028

G52E 1,2

015

N4P 1,3

056

I362K 1,3

090

D202N 1,3

071

T276K 1,3

076

N385D 1,3

113

Q111P/E241Q 1,4

005

S162C 1,4

109

K179K/T180E/T181K/E182K/K183V/S184*/T185*/K186* 1,4

093

E241Q 1,4

069

Q223E 1,5

050

N286Q 1,5

037

K107G 1,5

125

Y114T/Q115Q/K116A/D117D/ E118T/E119S/K120S/N121P/D122D/P123P/L124L 1,6

075

I379K 1,6

044

M273L 1,6

006

N31C 1,7

083

E53V 1,8

009

G59C/F100C 1,9

062

W46E 2,2

018

Q111P 2,2

127

Y114T/Q115Q/K116T/D117D/E118T/E119S/K120S/N121P/D122D/P123P /L124L 2,3

031

T76G 2,3

072

I362R 2,7

010

K141CN199C 4,3

008

G52C/A99C 5,2

Ejemplo 9: Termoestabilidad por calorimetría diferencial de barrido

[0252] Varias variantes purificadas de la SEC ID NO:2 fueron preparadas como generalmente se describe en el

5 Ejemplo 1. Dos fitasas de referencia fueron preparadas de la misma manera, es decir, la fitasa con SEC ID NO:3 (variante correspondiente a N31D/Q139K/L197F/N316K de la SEC ID NO:2), y la fitasa con SEC ID NO:4 (variante correspondiente a N31D/N121T/K132T/Q139K de la SEC ID NO:2). También la fitasa con SEC ID NO:9 fue incluida para comparación (correspondiente a la variante Q3P/N31D/N121T/K132T/Q139K de la SEC ID NO:2

10 [0253] Las alícuotas de las muestras de proteína fueron dializadas contra 2 x 500ml 20mM de Na-acetato, pH4,0 a 4°C en un siguiente paso de 2-3h seguido por un paso durante la noche. Cada muestra fue de 0,45um filtrada y diluida con tampón para aprox. 2 unidades A280. Los valores de absorbancia exactos medidos se dan en la tabla de resultados. La calorimetría diferencial de barrido fue realizada en un calorímetro VP-DSC de MicroCal a 90°C/h velocidad de barrido de 20-90°C en 20 mM de tampón de Na-acetato, pH 4,0.

15 [0254] Las temperaturas de desnaturalización resultantes (Td) se muestran en la Tabla 6 de abajo, que resume los resultados de tres experimentos diferentes.

Tabla 6: Mediciones Td mediante DSC

Fitasa

A280 Td ( C) Comentarios

Nº 102 (SEC ID NO:4)

2,0 61,5

Nº 000 (SEC ID NO:2)

2,4 61,2

Nº 101 (aminoácidos 23-433 de la SEC ID NO:9)

2,3 61,0

Nº 031 (T76/G de la SEC ID NO:2)

2,0 61,3

Nº 056 (I362K de la SEC ID NO:2)

2,4 62,1

Nº 072 (I362R de la SEC ID NO:2)

2,4 61,6 Precipitación menor

Nº 000 (SEC ID NO:2)

2,29 61

Nº 018 (Q111P de la SEC ID NO:2)

1,97 62

YC044 (M273L de la SEC ID NO:2)

2,15 62

Nº 000 (SEC ID NO:2, fermentación piloto)

1,35 62

Nº 026 (SEC ID NO:3)

1,99 57 Se ejecutó dos veces con el mismo resultado

20

Ejemplo 10: Purificación y perfil de temperatura

32

[0255] Las variantes de fitasa y las fitasas de referencia y comparativas usadas en este documento fueron purificadas de la siguiente manera: el sobrenadante de fermentación con la fitasa fue primero centrifugado a 7200

r.p.m. y 5°C durante una hora y filtrado a través de un sándwich de cuatro filtros de microfibra de vidrio de Whatman (2,7; 1,6; 1,2 y 0,7 micrómetros). Después de esto, la solución fue filtrada de manera estéril (bien a través de un filtro

5 superior de botellas PES con un corte de 0,221m o a través de un filtro de profundidad Seitz-EKS usando presión). A la solución se añadió sulfato amónico sólido dando una concentración final de 1,5M y el pH se ajustó a 6,0 usando 6M de HCl.

[0256] La solución con fitasa fue aplicada a una columna Butil sefarosa, aproximadamente 50ml en una columna

10 XK26, usando como tampón A 25mM de bis-tris (Bis-(2-hidroxietil)imino-tris(hidroximetil)metano)) + 1,5M de sulfato amónico pH 6,0, y como tampón B 25mM de bis-tris pH 6,0. Las fracciones de la columna fueron analizadas por actividad usando el ensayo de la fosfatasa (véase el Ejemplo 1, "Determinación de la actividad de fosfatasa" ) y se agruparon las fracciones con actividad. Las fracciones agrupadas fueron dializadas extensivamente contra 10mM de acetato sódico pH 4,5. A continuación, la solución con fitasa fue purificada por cromatografía en S sefarosa,

15 aproximadamente 75ml en una columna XK26, usando como tampón A 50mM de acetato sódico pH 4,5, y como tampón B 50mM de acetato sódico + 1M de NaCl pH 4,5. De nuevo las fracciones de la columna fueron analizadas por actividad y se agruparon las fracciones con actividad. Finalmente, la solución con la fitasa purificada fue concentrada usando un dispositivo de filtración Amicon ultra-15 con una membrana de corte de 10kDa.

20 [0257] El peso molecular, como se estima a partir de SDS-PAGE, fue aproximadamente de 40kDa para todas las fitasas y la pureza fue en todos los casos > 95%.

[0258] El perfil de temperatura (actividad de fitasa como una función de temperatura) de las variantes fue determinado en el intervalo de temperatura de 20-90°C esencialmente como se describe en el Ejemplo 1 25 ("Determinación de la actividad de fitasa"), sin embargo, las reacciones enzimáticas (100 microlitros de solución enzimática con fitasa + 100 microlitros de sustrato) fueron realizadas en tubos PCR en vez de en placas de microtitulación. Después de un periodo de reacción de 15 minutos a temperatura deseada los tubos fueron enfriados a 20°C durante 20 segundos y 150 microlitros de la mezcla reactiva fueron transferidos a una placa de microtitulación. 75 microlitros de reactivo de parada fueron añadidos y la absorbancia a 405 nm fue medida en un

30 espectrofotómetro de placa de microtitulación. Los resultados se resumen en la Tabla 7 de abajo. Los números dados para cada temperatura (20-90 °C en pasos de 10°C) son actividad relativa (en %) normalizados al valor en condiciones óptimas.

Tabla 7: Perfiles de temperatura

093 E241Q de la SEC ID NO:2

37 59 83 100 20 10 3

[0259] Las variantes 030, 031, 037, 044, 056, 062, 072, 083, y 093 tienen una actividad relativa más elevada a 70°C en comparación con las fitasas de referencia 026 y 102. 5

[0260] Los perfiles de pH (actividad de fitasa como una función de pH) de varias variantes y la misma referencia y fitasas comparativas como se usan en los ejemplos anteriores fueron determinados a 37°C en el intervalo pH de 2,0

10 a 7,5 (en pasos de 0,5 unidades de pH) como se describe en el ejemplo 1 ("Determinación de la actividad de fitasa"), exceptuando que se usó un cóctel de tampón (50mM de glicina, 50mM de ácido acético y 50mM de bis-tris en vez del tampón de 0,25M de acetato sódico pH 5,5. Los resultados se resumen en la Tabla 8 de abajo. Los números dados para cada pH (2,0-7,5) son la actividad relativa (en %) normalizada al valor óptimo.

15 Tabla 8: Perfiles de pH la SEC ID NO:2

[0261] Para YC062 y YC091 la curva de pH (actividad relativa como una función de pH) parece haberse desplazado 0,5 unidades de pH hacia un pH superior.

5 [0262] Además, mientras que para la mayoría de las fitasas de la Tabla 8 (incluyendo las fitasas de referencia 026 y 102) las condiciones óptmas se encuentran en pH3,5-pH4,0, se observa un pH óptimo de 3,5 para los N°. 062, 085, y 089, y un pH óptimo de 4,0 se observa para los N°. 091 y 093.

Ejemplo 12: Estabilidad de temperatura

10 [0263] La estabilidad de temperatura de varias variantes purificadas y la misma referencia y fitasas comparativas como en los ejemplos anteriores fue determinada midiendo la actividad de fitasa residual después de la incubación a 70°C y pH 4.0 (0.1 M de acetato de sodio). Las fitasas fueron incubadas y las muestras fueron retiradas después de 0, 10, 30 y 60 minutos y enfriadas en hielo. La actividad residual a pH 5.5 fue determinada usando el método

15 descrito en el ejemplo 1 ("Determinación de la actividad de fitasa"). Los resultados, normalizados a la actividad encontrada a 0 minutos, se muestran en la tabla 9 de abajo.

Tabla 9: Estabilidad de temperatura

Nº

Fitasa Estabilidad de temperatura % después de 60 min.

026

SEC ID NO:3 26

102

SEC ID NO:4 30

000

SEC ID NO:2 46

101

Aminoácidos 23-433 de la SEC ID NO:9 29

018

Q111P de la SEC ID NO:2 25

044

M273L de la SEC ID NO:2 31

050

N286Q de la SEC ID NO:2 19

056

I362K de la SEC ID NO:2 26

062

W46E de la SEC ID NO:2 31

072

I362R de la SEC ID NO:2 32

083

E53V de la SEC ID NO:2 31

093

E241Q de la SEC ID NO:2 29

20 [0264] Los resultados anteriores indican que los Nº. 044, 062, 072, y 083 pueden ser más estables bajo estas condiciones (70°C y pH 4) que las fitasas de referencia (aunque en este experimento se observó una gran variación para el N°. 000).

25 Ejemplo 13: Cálculo del porcentaje de identidad e identificación de las posiciones correspondientes

[0265] La SEC ID NO:9 fue alineada con la SEC ID NO:2 usando el programa Needle del paquete EMBOSS de la versión 2.8.0. La matriz de sustitución usada fue BLOSUM62, la penalización por abertura de gap fue 10,0 y la penalización por extensión de gap fue 0,5.

30 [0266] La alineación resultante se muestra en la Fig. 2.

[0267] El grado de identidad entre la SEC ID NO:9 y la SEC ID NO:2 se calcula de la siguiente manera: el número de correspondencias exactas es 406 (todas ellas con un trazo vertical). La longitud de la secuencia más corta es 411

35 (SEC ID NO:2). El porcentaje de identidad es 406/411 x 100% = 98,8%.

[0268] La alineación de la Fig. 2 también se usa para que derivar posiciones correspondientes de la siguiente manera: los aminoácidos unos encima de los otros en esta alineación se encuentran en posiciones correspondientes. P.ej., el aminoácido Q en la posición 3 de la SEC ID NO:2 corresponde al aminoácido P en el número de posición 25 de la SEC ID NO:9. Para los fines presentes se hace referencia al número de posición de la SEC ID NO:2. Por lo tanto, la SEC ID NO:9 se puede considerar una variante de la SEC ID NO:2 la cual comprende la sustitución Q3P.

5 [0269] Otras diferencias en forma de sustituciones en la coincidencia de la alineación se encuentran en las posiciones 31, 121, 132, y 139, a saber, N31D, N121T, K132T, y Q139K.

[0270] Las diferencias adicionales se encuentran en el N-término, donde la SEC ID NO:9 tiene una extensión de 22 aminoácidos en comparación con la SEC ID NO:2.

10 [0271] En general, la SEC ID NO:9 puede, por lo tanto, ser considerada la siguiente variante de la SEC ID NO:2: *0aM/*0bS/*0cT/*0dF/*0eI/*0fI/*0gR/*0hL/*0iL/*0jF/*0kF/*0mS/*0nL/*0oL/*0pC/*0qG/*0rS/*0s F/*0tS/*0uI/*0vH/*0wA/Q3P/N31D/N121T/K132T/Q139K.

15 LISTADO DE SECUENCIAS

[0272]

20 <110> Novozymes A/S

<120> Variantes de fitasa

<130> 10945.204-WO 25

<160> 9

<170> PatentIn versión 3.4

30 <210> 1

<211> 1233

<212> ADN

<213> Citrobacter braakii ATCC 51113

35 <220>

<221> mat_péptido

<222> (1)..(1233)

<220> 40 <221> CDS

<222> (1)..(1233)

<400> 1

<210> 2

<211> 411

<212> PRT

<213> Citrobacter braakii ATCC 51113

<400> 2

<210> 3

<211> 411 5 <212> PRT

<213> Citrobacter braakii YH-15

<220>

<221> mat_péptido 10 <222> (1)..(411)

<400> 3

<210> 4

<211> 411 5 <212> PRT

<213> Citrobacter freundii

<220>

<221> mat_péptido 10 <222> (1)..(411)

<400> 4

<210> 5

<211> 1236

<212> ADN

<213> Variante de la SEC ID NO:2

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1233)

5 <220>

<221> mat_péptido

<222> (1)..(1233)

<400> 5 10

<210> 6

<211> 411 5 <212> PRT

<213> Variante de la SEC ID NO:2

<220>

<221>

misc_feature 10 <222> (18)..(18)

<223> El 'Xaa' en la ubicación 18 representa Gly.

<220>

<221>

misc_feature 15 <222> (323)..(323)

<223> el ' Xaa' en la ubicación 323 representa Pro.

<400> 6

<210> 7

<211> 66 5 <212> ADN

<213> Citrobacter braakii ATCC 51113

<220>

<221> sig_péptido 10 <222> (1)..(66)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(66) 15

<400> 7

20 <210> 8

<211> 22

<212> PRT

<213> Citrobacter braakii ATCC 51113

25 <400> 8 5 <210> 9

<211> 433

<212> PRT

<213> Citrobacter freundii NCIMB 41247

10 <220>

<221> mat_péptido

<222> (1)..(433)

<400> 9.

Claims (14)

1. Reivindicaciones

   1. Fitasa que tiene una termoestabilidad mejorada indicada como actividad residual determinada dividiendo un sobrenadante en dos partes, una parte se incuba durante 30 minutos a 60°C, y la otra parte durante 30 minutos a 5 5°C, tras lo cual la actividad de ambas se determina en el p-nitrofenil fosfato a 37°C y pH 5,5, donde la actividad residual de la fitasa es la actividad de la muestra que ha sido incubada a 60°C dividida por la actividad de la misma muestra que ha sido incubada a 5°C, donde la actividad residual de la fitasa es al menos un 105% de la actividad residual de la fitasa de referencia SEC ID NO:2, medida en las mismas condiciones, y dicha fitasa comprende al menos una alteración y no más de 4 alteraciones en comparación con la SEC ID NO:2; donde al menos una de

   10 dichas una a cuatro alteraciones se selecciona de las siguientes: 4P, 46E, 107G, 111P, 119K, 162C, 223E, 241Q, 273L, 276K, 379K, 385D, 91C/46C, 52C/99C, 31C/176C, 31C/177C, 59C/100C, 141C/199C, 162C/247C, 111P/241Q, 31C, 119K, 202N, 286Q, y 362K, R.
2. 2. Fitasa según la reivindicación 1, que comprende una alteración seleccionada de las siguientes: 141C/199C, 15 91C/46C, 52C/99C, 31C/176C, 31C/177C, 59C/100C, 162C/247C, y 111P/241Q.
3. 3. Secuencia de ácidos nucleicos aislada que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 1- 2.

   20 4. Constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de ácidos nucleicos según la reivindicación 3 operativamente enlazada a una o más secuencias de control que dirigen la producción de la fitasa en un huésped de expresión adecuado.

4. 5.

   Vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 4. 25

5. 6. Célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 4 y/o el vector de expresión según la reivindicación 5.

6. 7.

   Método para la producción de la fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que comprende 30

   (a) el cultivo de la célula huésped según la reivindicación 6 para producir un sobrenadante que comprende la fitasa; y

   (b) la recuperación de la fitasa. 35
7. 8. Planta transgénica, o parte de planta, que ha sido transformada con un ácido nucleico según la reivindicación 3 o 4, capaz de expresar una fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-2.
8. 9. Composición que comprende al menos una fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, y 40

   (a)

   al menos una vitamina soluble en grasa;

   (b)

   al menos una vitamina soluble en agua; y/o

   45 (c) al menos un oligoelemento.
9. 10. Composición según la reivindicación 9 comprende además al menos una enzima seleccionada del siguiente grupo de enzimas: amilasa, fitasa, fosfatasa, xilanasa, galactanasa, alfa-galactosidasa, proteasa, fosfolipasa, y/o beta-glucanasa.

10. 11.

    Composición según cualquiera de las reivindicaciones 9-10 que es un aditivo para alimentación animal.

11. 12.

    Composición alimentaria para animales con un contenido de proteína cruda de 50 a 800 g/kg y que comprende

    la fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o la composición según cualquiera de las reivindicaciones 9-11. 55
12. 13. Método para mejorar el valor nutricional de un alimento para animales, donde la fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o la composición según cualquiera de las reivindicaciones 9-11 se añade al alimento.
13. 14. Proceso para reducir niveles de fitato en el abono animal que comprende alimentar a un animal con una cantidad 60 eficaz del alimento según la reivindicación 12.
14. 15. Método para el tratamiento de proteínas vegetales, que comprende el paso de añadir la fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o la composición según cualquiera de las reivindicaciones 9-11 a por lo menos una proteína vegetal o fuente de proteína.

    65 16. Uso de la fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 9-11 en alimentos para animales; en la preparación de alimentos para animales; para mejorar el valor nutricional de alimentos para animales; para reducir los niveles de fitato en el abono animal; para el tratamiento de proteínas vegetales; o para liberar fósforo de un sustrato de fitasa.