ES2758795T3 - Variantes de fitasa termoestables - Google Patents

Abstract

Método para producir una variante de fitasa, donde: a) la variante de fitasa tiene al menos un 80 % de identidad con los aminoácidos 1-413 de la fitasa progenitora de la SEC ID Nº 2, los aminoácidos 1-413 de la fitasa progenitora de la SEC ID Nº 4 y/o los aminoácidos 1-413 de la fitasa progenitora de la SEC ID Nº 6 cuando se alinean con la secuencia de aminoácidos respectiva utilizando el programa Needle con la matriz de sustitución BLOSUM62, una penalización de abertura de gap de 10,0, y una penalización de extensión de gap de 0,5; y b) el método comprende establecer al menos un puente disulfuro en comparación con la SEC ID Nº 2, donde el número de puentes de disulfuro establecido es 1, 2 o 3, donde dicho puente de disulfuro no está entre los cuatro de origen natural en las posiciones 79/110,135/410,180/189 y 384/393 donde el un puente disulfuro está establecido en la posición F) 61C/102C; donde los dos puentes disulfuro establecidos usan las siguientes combinaciones de pares de posición: A+F, B+F, C+F, D+F, E+F y F+G, donde A significa 143C/201C, B significa 33C/179C, C significa 54C/101C, D significa 93C/48C, E significa 33C/178C, F significa 61C/102C y G significa 164C/251C; donde los tres puentes disulfuro establecidos usan las combinaciones siguientes de pares de posiciones: A+B+F, A+C+F, A+D+F, A+E+F, A+F+G, B+C+F, B+D+F, B+E+F, B+F+G, C+D+F, C+E+F, C+F+G, D+E+F, D+F+G y E+F+G, donde A significa 143C/201C, B significa 33C/179C, C significa 54C/101C, D significa 93C/48C, E significa 33C/178C, F significa 61C/102C y G significa 164C/251C, y donde la variante tiene una termoestabilidad mejorada y/0 perfil de temperatura mejorado en comparación con la fitasa progenitora.

Description

DESCRIPCIÓN

Variantes de fitasa termoestables

Referencia al listado de secuencias

[0001] Esta solicitud contiene un listado de secuencias en un formato legible por ordenador.

El formato legible por ordenador se incorpora en este documento mediante referencia.

Campo de la invención

[0002] La presente invención se refiere a un método para producir una variante de fitasa a partir de una fitasa progenitora que tiene al menos un 70 % de identidad con los aminoácidos 1-413 de la SEC ID N° 2, los aminoácidos 1-413 de la SEC ID N° 4 y/o los aminoácidos 1-413 de la SEC ID N° 6 cuando se alinean con la secuencia de aminoácidos respectiva utilizando el programa Needle con la matriz de sustitución BLOSUM62, una penalización de abertura de gap de 10,0, y una penalización de extensión de gap de 0,5, y comprende establecer al menos un puente disulfuro que no está entre los cuatro puentes disulfuro de origen natural en comparación con estos y otras fitasas estrechamente relacionadas (es decir, es una variante de las mismas). La invención también se refiere a las variantes producidas y al ADN que las codifica, así como su uso, por ejemplo, en piensos para animales y aditivos de pienso.

Antecedentes de la invención

Estado de la técnica

[0003] Las fitasas son enzimas bien conocidas, igual que lo son las ventajas de añadirlas a productos alimenticios para animales, incluyendo seres humanos.

Las fitasas han sido aisladas de varias fuentes, incluyendo una multitud de cepas bacterianas y fúngicas.

[0004] Es un objetivo de la presente invención proporcionar polipéptidos alternativos con actividad de fitasa (fitasas) y polinucleótidos que codifican los polipéptidos.

Las variantes de fitasa de la invención exhiben propiedades modificadas o alteradas, preferiblemente mejoradas, en comparación con la fitasa progenitora.

Ejemplos no limitantes de tales propiedades son: la estabilidad (como la estabilidad frente a ácidos, la estabilidad térmica, la estabilidad de vapor, la estabilidad frente a la granulación y/o la estabilidad de proteasa, en particular estabilidad de pepsina), el perfil de temperatura, el perfil de pH, la actividad específica, la especificidad del sustrato, el rendimiento en piensos para animales (como una liberación y/o degradación de fitato mejoradas), la susceptibilidad a la glicación y/o el patrón de glicosilación.

[0005] Tal y como se describe en este documento, la mutagénesis de un polinucleótido progenitor que codifica una fitasa se emplea para preparar variantes de ADN (sintético) que codifican una fitasa con propiedades mejoradas respecto a la fitasa codificada por el polinucleótido progenitor.

[0006] Se conocen varias estructuras tridimensionales de fitasas del tipo fosfato ácido de histidina (HAP). (por ejemplo, Lim et al. Nature struct. biol. 7,108-113 (2000)). A partir de estas se ha descubierto que todas ellas tienen cuatro puentes disulfuro ubicados en los pares de posiciones 77/108, 133/407, 178/187 y 381/390 (según la numeración usada aquí).

Típicamente estos ocupan todas las cisteínas presentes en la molécula.

Buttiauxiella

[0007] WO 2006/043178 describe una fitasa de Buttiauxella P1-29 (depositada como NCIMB 41248) que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° 3 de WO 2006/043178, así como ciertas variantes de la misma. La secuencia de una fitasa de tipo salvaje de Buttiauxella y diversas variantes de la misma han sido introducidas en la base de datos GENESeQp con los siguientes números de acceso: AEH25051, AEH25056, AEH25057, AEH25058, AEH25059, AEH25060, AEH25061, AEH25062, AEH25063, AEH25064, AEH25065, AEH25066, AEH25067, AEH25068, AEH25069, AEH25070, AEH25071, AEH25072, AEH25073, AEH25074, AEH25075 y AEH25076.

Todas estas fitasas tienen un porcentaje de identidad con cualquiera de las SEC ID N° 2, 4 y 6 por encima del 70 %,

[0008] La secuencia de una fitasa de Obesumbacterium proteus se ha introducido en la base de datos UNIPROT con número de acceso Q6U677.

Esta fitasa, que también es descrita por Zinin et al. en FEMS Microbiology Letters, vol. 236, págs. 283-290, 2004, tiene un porcentaje de identidad con las SEC ID N° 2, 4 y 6 por encima del 70 %,

[0009] WO 2008/192901 describe fitasas de Buttiauxella gaviniae DSM18930, Buttiauxella agrestis DSM18931 y Buttiauxella agrestis DSM18932 y diversas variantes de las mismas.

Estas fitasas se proporcionan en la SEC ID N° 2, la SEC ID N° 4 y la SEC ID N° 6 en este documento.

[0010] WO2008097619 describe también variantes de fitasa derivadas de la cepa P 1-29 de Buttiauxella sp especialmente la variante denominada BP-11 y algunas variantes de la misma.

[0011] WO 20091100183 describe otras variantes derivadas de la fitasa P1-29 de Buttiauxella sp o la variante BP-11.

[0012] La WO2008/036916 divulga fitasas termotolerantes.

[0013] La WO2007/112739 divulga variantes de fitasa derivadas de Citrobacter braakii con termoestabilidad mejorada.

[0014] Rodriguez et al (Archives of Biochemistry and Biophysics, Vol382, No.1., pp105-112, 2000) divulga fitasas sin enlaces de disulfuro a C200/C210 en variantes que modulan la eficiencia y termoestabilidad de la enzima.

[0015] Mullaney et al (Biochemical and Biophysical Research Communications, vol. 238, no.2, 11 March 2005, págs. 404-408) divulga la conservación de residuos de cisteína en fitasas de ácido histidina fúngicas de especies Aspergillus y el incremento en la estabilidad y tolerancia al calor.

[0016] Mu X et al (New Biotechnology, vol. 25, Supplement 1, September 2009, pág. S86) divulga la eliminación del enlace de disulfuro (C125S, C263S, C395S, c417S, C446S) en fitasa para reducir la termoestabilidad.

Breve descripción de los dibujos y listado de secuencias

[0017]

La figura 1 muestra un alineamiento múltiple de las partes maduras esperadas de la SEC ID N° 2, la SEC ID N° 4 y la SEC ID N° 6 con las secuencias que tienen los siguientes números de acceso de GENESEQP:

AEH25051, AEH25056, AEH25057, AEH25058, AEH25059, AEH25060, AEH25061, AEH25062, AEH25063,

AEH25064, AEH25065, AEH25066, AEH25067, AEH25068, AEH25069, AEH25070, AEH25071, AEH25072,

AEH25073, AEH25074, AEH25075 y AEH25076.

El alineamiento se hizo utilizando el método Clustal (Higgins, 1989, CABIOS 5: 151-153) usando el software MEGALIGN™ de LASERGENE™ (DNASTAR, Inc., Madison, WI) con una tabla de identidad y los siguientes parámetros de alineamiento múltiple: penalización de gap de 10 y penalización de longitud de gap de 10. Los parámetros de alineamiento por parejas son Ktuple=1, penalización de gap=3, ventanas=5 y diagonales=5.

La figura 2 muestra un alineamiento del número de acceso Q6U677 de UNIPROT con los aminoácidos 1-413 de la SEC ID N° 2.

El alineamiento se hizo utilizando el programa Needle con la matriz BLOSUM62, una penalización de iniciación de gap de 10,0 y una penalización de extensión de gap de 0,5.

[0018] En el listado de secuencias las secuencias se aplican de la siguiente manera:

Resumen de ejemplos

[0019] En la especificación se proporcionan los siguientes ejemplos:

Ejemplo 1: preparación de variantes y determinación de la actividad

Ejemplo 2: actividad específica

Ejemplo 3: termoestabilidad mediante DSC

Ejemplo 4: perfil de temperatura

Ejemplo 5: rendimiento en pienso para animales en un modelo in vitro

Ejemplo 6: rendimiento en un ensayo en cerdos in vivo

Descripción de la invención

[0020] La presente invención se refiere a un método para producir una variante de fitasa, donde

a) la variante fitasa tiene al menos un 80 % identidad con los aminoácidos 1-413 de la fitasa progenitora de la SEC ID N° 2, los aminoácidos 1-413 de la fitasa progenitora de la SEC ID N° 4 y/o los aminoácidos 1-413 de la fitasa progenitora de la SEC ID N° 6 cuando se alinean con la secuencia de aminoácidos respectiva utilizando el programa Needle con la matriz de sustitución BLOSUM62, una penalización de abertura de gap de 10,0, y una penalización de extensión de gap de 0,5; y

b) el método comprende establecer al menos un puente disulfuro en comparación con la SEC ID N° 2, donde el número de puentes disulfuro establecidos es 1, 2 o 3,

donde dicho puente disulfuro no está entre los cuatro de origen natural en las posiciones 79/110,135/410,180/189 y 384/393,

donde el puente disulfuro se establece en la posición F) 61C/102C;

donde los dos puentes disulfuro establecidos usan las siguientes combinaciones de pares de posición: A+F, B+F, C+F, D+F, E+F y F+G, donde A significa 143C/201C, B significa 33C/179C, C significa 54C/101C, D significa 93C/48C, E significa 33C/178C, F significa 61C/102C y G significa 164/251C.;

donde los tres puentes disulfuro establecidos usan las siguientes combinaciones de pares de posición: A+B+F, A+C+F, A+D+F, A+E+F, A+F+G, B+C+F, B+D+F, B+E+F, B+F+G, C+D+F, C+E+F, C+F+G, D+E+F, D+F+G y E+F+G, donde A significa 143C/201C, B significa 33C/179C, C significa 54C/101C, D significa 93C/48C, E significa 33C/178C, F significa 61C/102C y G significa 164C/251C y donde la variante tiene termoestabilidad mejorada y/o un perfil de temperatura mejorado en comparación con la fitasa progenitora. El porcentaje de identidad se determina tal y como se describe en la sección "Polipéptidos de fitasa, porcentaje de identidad".

[0021] Los números de posición se refieren a la numeración de posición de la SEC ID N° 2, tal y como se describe en la sección "Numeración de posición". Las posiciones que corresponden a estos números de posición de la SEC ID N° 2 en otras fitasas se determinan tal y como se describe en la sección "Identificación de los números de posición correspondientes".

[0022] Según el método de la invención, la variante de fitasa puede además comprender al menos una modificación en al menos una posición seleccionada de las siguientes: 1, 9, 10, 18, 22, 25, 26, 37, 38, 66, 71, 81, 89, 92, 94, 109, 111, 119, 120, 121, 131, 134, 141, 142, 144, 152, 155, 160, 164, 171, 176, 178, 188, 190, 192, 193, 206, 207, 209, 211, 214, 215, 219, 222, 239, 235, 243, 245, 248, 253, 255, 256, 257, 260, 261, 268, 270, 277, 283, 285, 287, 288, 293, 296, 303, 306, 307, 308, 314, 318, 328, 337, 345, 350, 364, 371, 372, 396, 399, 406 y/o 413.

[0023] La invención además estipula que las modificaciones anteriores son elegidas específicamente de las modificaciones siguientes: 1S, 91, 101, R18, R22, T25, 26E, 37Y, 38S, 66E, 71K, 81A, 89T, 92E, R94,109Q, 111G, 119N, 120L, 121E, K131,1341, 134V, 141R, 142L, T144,152M, 155E, 160R, 164F, 171I, 176K, 178P, 188N, 190E, 192G, 193Q, N206, 207E, 207T, 209S, 211C, 214V, G215, T219, E222, 239K, 235V, E243,245D, 248E, 248L, 248S, H253,255A, 255T, 256H, 256Y, F257; M260,261E, 268A, 268T, 270K, 277T, 283E, 283D, 285K, 287D, 288V, 288A, 293G, 296S, 303L, 303F, H306, D307, T308,314A, 314S, 318D, D328,337I, 345A, 350I, 364A, 371K, 372E, 396P, 399K, 406E y/o 413P.

[0024] En otras realizaciones específicas del método de la invención otras modificaciones específicas son: N1S, S1N, I9V, V9I, V10I, K26E, N37Y, T38S, S38T, E66Q, Q66E, K71Q, Q71K, T81A, A81T, A89T, D92E, E109Q, H111G, D119N, I120L, K121E, T134I, T134V, R141Q, Q141R, V142L, L142V, T144I, T152M, M152T, E155D, D155E, H160R, S164F, F164S, T171I, T176K, A178P, S188N, D190E, A192G, G192A, L193Q, K207E, K207T, A209S, D211C, I214V, V214I, A235V, K239N, N239K, E245D, D245E, E248S, E248L, S248L, S248E, A255T, T255A, V255A, V255T, Q256H, Q256Y, A261E, R268A, R268T, A268R, A268T, T268A, T268R, N270K, A277T, T277A, D283N, D283E, E283N, E283D, N283D, N283E, N285K, K285N, D287T, T287D, A288E, A288V, V288E, V288A, E288A, E288V, D293G, P296S, S296P, I303L, I303F, L303F, F303L, L303I, S314A, A314S, N318D, I337V, V337I, S345A, A345S, V350I, I350V, A364S, A364S, S364A, K371N, N371K, E372Q, E372Q, Q372E, P396S, S396P, T399K, K399T, E406V, V406E, P413Q y/o Q413P y/o de las siguientes combinaciones D92E/H160R, A261E/N270K, T134I/K207T, D190E/K207E/N318D, T134I/K207T/A261E/N270K, T134I/K207E/A209S/A261E/N270K,A89T/T134I/F164S/T176K/A178P/K207E/A261 E/N270K, A89T/T134I/F164S/T176K/A178P/K207E/A209S/S248L/Q256Y/A261E/N270K, A89T/D92E/H160R/F164S/T176K/A178P/S188N/G192A/K207E/A261E/N270K, D92E/T134I/H160R/F164S/T170I/T176K/A188P/K207E/A235V/Q256H/A261 E/N270K, A89T/T134I/H160R/F164S/T170I/T176K/A188P/K207E/A235V/Q256H/A261E/N270K/I303F y/o N37Y/D92E/T134I/H160R/F164S/T171I/T176K/A188P/K207E/A235V/Q256H/A261E/N270K.

[0025] El método de la invención se puede utilizar para crear una variante de parte de la parte madura de la fitasa de la SEC ID N° 2, la SEC ID N° 4 o la SEC ID N° 6, o una parte madura de cualquiera las siguientes secuencias de GENESEQP: AEH25051, AEH25056, AEH25057, AEH25058, AEH25059, AEH25060, AEH25061, AEH25062, AEH25063, AEH25064, AEH25065, AEH25066, AEH25067, AEH25068, AEH25069, AEH25070, AEH25071, AEH25072, AEH25073, AEH25074, AEH25075 o AEH25076 que se usa como un progenitor/esqueleto para producir una variante de fitasa.

[0026] El método de la invención proporciona una variante de fitasa con termoestabilidad mejorada y/o perfil de temperatura mejorado en comparación con la fitasa progenitora y puede proporcionar propiedades mejoradas tales como estabilidad calorífica, estabilidad de vapor, estabilidad frente a la granulación, estabilidad frente a ácidos, perfil de pH y/o estabilidad de proteasa, en particular estabilidad de pepsina, actividad específica, especificidad de sustrato, rendimiento en piensos para animales (como una liberación y/o degradación de fitato mejoradas), susceptibilidad a la glicación y/o patrón de glicosilación.

Las variantes proporcionadas por la invención exhiben propiedades térmicas especialmente mejoradas tales como termoestabilidad, estabilidad térmica, estabilidad de vapor, perfil de temperatura, estabilidad frente a la granulación o rendimiento mejorado en piensos para animales.

[0027] El método de la invención, de este modo, se refiere a variantes de fitasa con propiedades térmicas mejoradas, tales como termoestabilidad, estabilidad calorífica, estabilidad de vapor, perfil de temperatura y/o estabilidad frente a la granulación.

[0028] El método de la invención, de este modo, se refiere a variantes de fitasa con termoestabilidad mejorada.

[0029] El método de la invención, de este modo, se refiere a variantes de fitasa con estabilidad calorífica mejorada.

[0030] El método de la invención, de este modo, se refiere a variantes de fitasa con estabilidad de vapor mejorada.

[0031] El método de la invención, de este modo, se refiere a variantes de fitasa con perfil de temperatura mejorado.

[0032] El método de la invención, de este modo, se refiere a variantes de fitasa con estabilidad frente a la granulación mejorada.

[0033] El método de la invención, de este modo, se refiere a variantes de fitasa con estabilidad frente a ácidos mejorada.

[0034] El método de la invención, de este modo, se refiere a variantes de fitasa con perfil de pH mejorado.

[0035] El método de la invención, de este modo, se refiere a variantes de fitasa con estabilidad de proteasa mejorada, en particular estabilidad de pepsina.

[0036] El método de la invención, de este modo, se refiere a variantes de fitasa con actividad específica mejorada.

[0037] El método de la invención, de este modo, se refiere a variantes de fitasa con especificidad de sustrato mejorada.

[0038] El método de la invención, de este modo, se refiere a variantes de fitasa con rendimiento mejorado en piensos para animales (como una liberación y/o degradación de fitato mejoradas).

[0039] El método de la invención, de este modo, se refiere a variantes de fitasa con susceptibilidad a la glicación mejorada.

[0040] El método de la invención, de este modo, se refiere a variantes de fitasa con patrón mejorado y/o de glicosilación.

[0041] La invención se refiere además a polinucleótidos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican las variantes de fitasa producidas por el método; constructos de ácidos nucleicos que comprenden los polinucleótidos operativamente enlazados a una o varias secuencias de control, que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión; vectores de expresión recombinantes que comprenden tales constructos de ácidos nucleicos; y células huésped recombinantes que comprenden un constructo de ácidos nucleicos y/o un vector de expresión.

[0042] La invención se refiere además a métodos para producir variantes de fitasa tal como se proporciona que comprenden

(a) cultivar una célula huésped para producir un sobrenadante que comprenda la fitasa; y

(b) recuperar la fitasa.

[0043] La invención se refiere además a plantas o partes de planta transgénicas capaces de expresar las variantes de fitasa, composiciones que comprenden al menos una variante de fitasa, y (a) al menos una vitamina liposoluble; (b) al menos una vitamina hidrosoluble; y/o (c) al menos un oligoelemento.

Tales composiciones pueden además comprender al menos una enzima seleccionada del siguiente grupo de enzimas: amilasa, fitasa, fosfatasa, xilanasa, galactanasa, alfa-galactosidasa, proteasa, fosfolipasa y/o betaglucanasa. Las composiciones pueden ser aditivos de piensos para animales que pueden tener un contenido bruto de proteína de 50 a 800 g/kg y que comprenden una variante de fitasa de la invención.

[0044] La invención se refiere además a métodos para mejorar el valor nutricional de un pienso para animales, añadiendo una variante de fitasa de la invención al pienso, procesos para reducir los niveles de fitato en abono animal alimentando un animal con una cantidad eficaz de pienso, métodos para el tratamiento de proteínas vegetales, que comprenden el paso de añadir una variante de fitasa por lo menos a una proteína vegetal, y el uso de una variante de fitasa de una composición de la invención.

[0045] La invención también proporciona un método para producir un producto de fermentación tal como, por ejemplo, etanol, cerveza y vino, que comprende fermentar un material de carbohidratos en presencia de una variante de fitasa, un método para producir etanol que comprende fermentar un material de carbohidratos en presencia de una variante de fitasa, y producir etanol.

Polipéptidos de fitasa, porcentaje de identidad

[0046] En el presente contexto una fitasa es un polipéptido con actividad de fitasa, es decir una enzima que cataliza la hidrólisis de fitato (mioinositol hexaquisfosfato) hacia (1) mioinositol y/o (2) mono-, di-, tri-, tetra- y/o pentafosfatos del mismo y (3) fosfato inorgánico.

[0047] En el presente contexto, el término “sustrato de fitasa” abarca, entre otros, ácido fítico y cualquier fitato (sal de ácido fítico), así como los fosfatos enumerados en (2) anteriormente.

[0048] La página ENZYME en internet (http://www.expasy.ch/enzyme/) es un repositorio de información relativa a la nomenclatura de enzimas.

Está basado principalmente en las recomendaciones del Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUB-MB) y describe cada tipo de enzima caracterizada para el que se haya proporcionado un número EC (comisión enzimática) (Bairoch A. The ENZYME database, 2000, Nucleic Acids Res 28:304-305).

Ver también el manual Enzyme Nomenclature de NC-IUBBM, 1992).

[0049] Según la página ENZYME, se conocen tres tipos diferentes de fitasas: la llamada 3-fitasa (nombre alternativo 1-fitasa; una mioinositol hexafosfato 3-fosfohidrolasa, EC 3.1.3.8), la llamada 4-fitasa (nombre alternativo 6-fitasa, nombre basado en sistema de numeración 1L y no en el 1D, EC 3.1.3.26) y la llamada 5-fitasa (EC 3.1.3.72).

A efectos de la presente invención, los tres tipos se incluyen en la definición de fitasa.

[0050] Las fitasas de la invención pertenecen a la familia de las fosfatasas ácidas de histidina, que incluyen la fosfatasa ácida pH 2,5 de Escherichia coli (gen appA) así como fitasas fúngicas tales como fitasas A y B de Aspergillus awamorii (EC: 3.1.3.8) (genes phyA y phyB).

Las fosfatasas ácidas de histidina comparten dos regiones de similitud de secuencia, cada una centrada alrededor de un residuo conservado de histidina.

Estas dos histidinas parecen estar involucradas en el mecanismo catalítico de las enzimas.

La primera histidina se ubica en la sección N-terminal y forma un intermedio de fosfo-histidina mientras que la segunda se ubica en la sección C-terminal y posiblemente actúa como donante de protones.

[0051] Las fitasas de la invención tienen un motivo de sitio activo conservado, a saber, R-H-G-X-R-X-P, donde X designa cualquier aminoácido (ver los aminoácidos 16 a 22 de las SEC ID N° 2, 3, 4, 6 y los aminoácidos 38-44 de la SEC ID N° 9).

El motivo de sitio activo conservado es R-H-G-V-R-A-P, es decir, los aminoácidos 16-22 (en referencia a la SEC ID N° 2) son RHGVRAP.

[0052] Para los fines de la presente invención la actividad de fitasa se determina en unidades FYT, siendo un FYT la cantidad de enzima que libera 1 micromol de ortofosfato inorgánico por minuto bajo las condiciones siguientes: pH 5,5; temperatura 37°C; sustrato: fitato de sodio (C⁶ H⁶ܲ⁴P⁶ Na^) en una concentración de 0,0050 mol/l.

Ensayos de fitasa adecuados son los ensayos FYT y FTU descritos en ejemplo 1 de WO 00/20569.

FTU es para determinar la actividad de fitasa en piensos y premezclas.

La actividad de fitasa también se puede determinar utilizando los ensayos del ejemplo 1 ("Determinación de la actividad de fosfatasa” o "Determinación de la actividad de fitasa").

[0053] En una realización particular la fitasa de la invención está aislada.

El término "aislada" tal y como se utiliza en este documento se refiere a un polipéptido que es al menos un 20 % puro, preferiblemente al menos un 40 % puro, más preferiblemente al menos un 60 % puro, aún más preferiblemente al menos un 80 % puro, de la forma más preferible al menos un 90 % puro, e incluso de la forma más preferible al menos un 95% puro, según se determina mediante SDS-PAGE. En particular, se prefiere que los polipéptidos estén en "forma esencialmente pura", es decir, que el preparado polipeptídico está esencialmente libre de otro material polipeptídico con el cual está originalmente asociado.

Esto se puede conseguir, por ejemplo, preparando el polipéptido mediante métodos recombinantes bien conocidos o por métodos de purificación tradicionales.

[0054] La relación entre dos secuencias de aminoácidos se describe mediante el parámetro "identidad". Para los fines de la presente invención, el alineamiento de dos secuencias de aminoácidos se determina usando el programa Needle del paquete EMBOSS (http://emboss.org) versión 2.8.0.

El programa Needle implementa el algoritmo de alineamiento global descrito en Needleman, S. B. Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48,443-453.

La matriz de sustitución usada es BLOSUM62, la penalización de abertura de gap es 10 y la penalización de extensión de gap es 0,5.

[0055] El grado de identidad entre una secuencia de aminoácidos de la presente invención ("secuencia de la invención") y la secuencia de aminoácidos referida en las reivindicaciones (SEC ID N° 2) se calcula como el número de coincidencias exactas en un alineamiento de las dos secuencias, dividido por la longitud de la "secuencia de la invención" o por la longitud de la SEC ID N° 2, la que sea más corta.

El resultado se expresa en porcentaje de identidad.

[0056] Una correspondencia exacta ocurre cuando la "secuencia de la invención" y la SEC ID N° 2 tienen residuos de aminoácidos idénticos en las mismas posiciones del solapamiento (en el ejemplo de alineamiento siguiente esto se representa mediante "I"). La longitud de una secuencia es el número de residuos de aminoácidos en la secuencia (por ejemplo, la longitud de los aminoácidos 1-411 de la SEC ID N° 2 es 411).

[0057] En el siguiente ejemplo de alineamiento puramente hipotético, el solapamiento es la secuencia de aminoácidos "HTWGER-NL" de la secuencia 1; o la secuencia de aminoácidos "HGWGEDANL" de la secuencia 2. En el ejemplo se indica un espacio mediante un "-".

Ejemplo de alineamiento hipotético:

Secuencia 1: ACMSHTWGER-NL

Secuencia 2: HGWGEDANLAMNPS

[0059] En una realización particular, el porcentaje de identidad de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido con la SEC ID N° 2 se determina, i) alineando las dos secuencias de aminoácidos utilizando el programa Needle, con la matriz de sustitución BLOSUM62, una penalización de abertura de gap de 10 y una penalización de extensión de gap de 0,5; ii) contando el número de coincidencias exactas en el alineamiento; iii) dividiendo el número de coincidencias exactas por la longitud de la más corta de las dos secuencias de aminoácidos; y iv) convirtiendo el resultado de la división iii) a porcentaje.

[0060] En el ejemplo hipotético anterior, el número de coincidencias exactas es 6, la longitud más corta de una de las dos secuencias de aminoácidos es 12; por consiguiente, el porcentaje de identidad es 50 %. La invención está dirigida además a una variante fitasa donde la variante

a) tiene al menos un 80 % de identidad con aminoácidos 1-413 de la fitasa progenitora de la SEC ID N° 2, aminoácidos 1-413 de la fitasa progenitora de la SEC ID N° 4 y/o aminoácidos 1-413 de la SEC ID la fitasa progenitora N° 6, cuando se alinea a una secuencia de aminoácido respectiva usando el programa Needle con la matriz de sustitución BLOSUM62, una penalización de abertura de gap de 10.0 y una penalización de abertura de gap de 0.5; y

b) comprende 1, 2 o 3 puentes de disulfuro establecidos en comparación con la SEC ID N° 2, donde dicho puente de disulfuro no está entre los cuatro de origen natural en posiciones 79/110, 135/410, 180/189 y 384/393,

donde el puente de disulfuro establecido está en la posición F) 61C/102C, donde los dos puentes de disulfuro establecidos usan las siguientes combinaciones de pares de posición: A+F, B+F, C+F, D+F, E+F y F+G, donde A significa 143C/201C, B significa 33C/179C, C significa 54C/101C, D significa 93C/48C, E significa 33C/178C, F significa 61C/102C y G significa 164C/251C.; donde los tres puentes de disulfuro establecidos usan las siguientes combinaciones de pares de posición: A+B+F, A+C+F, A+D+F, A+E+F, A+F+G, B+C+F, B+D+F, B+E+F, B+F+G, C+D+F, C+E+F, C+F+G, D+E+F, D+F+G y E+F+G, donde A significa 143C/201C, B significa 33C/179C, C significa 54C/101C, D significa 93C/48C, E significa 33C/178C, F significa 61C/102C y G significa 164C/251C; y donde la variante tiene una termoestabilidad mejorada y/o un perfil de temperatura o en comparación con la fitasa progenitora.

[0061] Todavía en una forma de realización particular, la fitasa de la invención tiene no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o no más de 10 modificaciones en comparación con la SEC ID N° 2, SEC ID N° 4 y/o la SEC ID N° 6 o cualquier otra fitasa progenitora; no más de 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o no más de 20 modificaciones en comparación con la S^eC ID N° 2; no más de 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o no más de 30 modificaciones en comparación con la SEC ID N° 2; no más de 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o no más de 40 modificaciones en comparación con la SEC ID N° 2, la SEC ID N° 4 y/o la SEC ID N° 6 o cualquier otra fitasa progenitora; no más de 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o no más de 50 modificaciones en comparación con la SEC ID N° 2, la SEC ID N° 4 y/o la SEC ID N° 6 o cualquier otra fitasa progenitora; no más de 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 o no más de 60 modificaciones en comparación con la SEC ID N° 2, la SEC ID N° 4 y/o la SEC ID N° 6 o cualquier otra fitasa progenitora; no más de 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 o no más de 70 modificaciones en comparación con la SEC ID N° 2, la SEC ID N° 4 y/o la SEC ID N° 6 o cualquier otra fitasa progenitora; no más de 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 o no más de 80 modificaciones en comparación con la SEC ID N° 2, la SEC ID N° 4 y/o la SEC ID N° 6 o cualquier otra fitasa progenitora; no más de 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 o no más de 90 modificaciones en comparación con la SEC ID N° 2, la SEC ID N° 4 y/o la SEC ID N° 6 o cualquier otra fitasa progenitora; no más de 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o no más de 100 modificaciones en comparación con la SEC ID N° 2, la SEC ID N° 4 y/o la SEC ID N° 6 o cualquier otra fitasa progenitora; no más de 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 o no más de 110 modificaciones en comparación con la SEC ID N° 2, la SEC ID N° 4 y/o la SEC ID N° 6 o cualquier otra fitasa progenitora; no más de 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119 o no más de 120 modificaciones en comparación con la SEC ID N° 2, la SEC ID N° 4 y/o la SEC ID N° 6 o cualquier otra fitasa progenitora; o no más de 121, 122, 123 o 124 modificaciones en comparación con la SEC ID N° 2, la SEC ID N° 4 y/o la SEC ID N° 6 o cualquier otra fitasa progenitora.

Numeración de posición

[0062] La nomenclatura que se usa en este documento para definir las posiciones de los aminoácidos se basa en la secuencia de aminoácidos de la fitasa madura de Buttiauxella gaviniae DSM 18930 que se da en el listado de secuencias como SEC ID N° 2 (aminoácidos 1-413 de la SEC ID N° 2).

Por consiguiente, en el presente contexto, la base para numerar las posiciones es la SEC ID N° 2 empezando con N1 y terminando con Q413. (SEC ID N° 2) como estándar para la numeración de posición y, así, también para la nomenclatura.

[0063] Cuando se usa en este documento, el término parte (o secuencia) "madura" se refiere a esa parte del polipéptido que es segregada por una célula que contiene, como parte de su equipamiento genético, un polinucleótido que codifica el polipéptido.

En otras palabras, la parte de polipéptido maduro se refiere a la parte del polipéptido que permanece después de que la parte de péptido señal, así como una parte de propéptido, si lo hay, haya sido dividida.

La parte de péptido señal puede ser predicha por programas conocidos en la técnica (por ejemplo, SignalP). Generalmente, el primer aminoácido de la parte madura de una enzima se puede determinar mediante secuenciación del N-terminal de la enzima purificada.

Cualquier diferencia entre la parte de péptido señal y la parte madura debe ser debida entonces a la presencia de un propéptido.

Modificaciones tales como sustituciones, deleciones e inserciones

[0064] Una variante de fitasa puede comprender varios tipos de modificaciones con respecto a una plantilla (es decir, una secuencia de aminoácidos de referencia o de comparación tal como la SEC Id N° 2): un aminoácido puede ser sustituido por otro aminoácido; un aminoácido puede ser eliminado; un aminoácido puede ser insertado; así como cualquier combinación de cualquier número de tales modificaciones.

En el presente contexto el término "inserción" pretende incluir también las extensiones N- y/o C-terminal.

[0065] La nomenclatura general que se usa en este documento para una única modificación es la siguiente: XDcY, donde "X" e "Y" designan de manera independiente un código de aminoácido de una sola letra, o un "*" (deleción de un aminoácido), "D" designa un número y "c" designa un contador alfabético (a, b, c, etcétera), que está solo presente en inserciones.

Se hace referencia a Tabla 1 a continuación que describe ejemplos puramente hipotéticos de la aplicación de esta nomenclatura a varios tipos de modificaciones.

Tabla 1

Tipo Descripción Ejemplo

[0066] Como se explica anteriormente, el número de posición ("D") se cuenta desde el primer residuo de aminoácido de la SEC ID N° 2.

[0067] Diferentes modificaciones en la misma secuencia están separadas por "/" (barra oblicua), por ejemplo, la designación "1*/2*/3*" significa que los aminoácidos en las posiciones número 1, 2, y 3 se eliminan todos, y la designación "104A/105F" significa que el aminoácido en la posición número 104 se sustituye por A, y el aminoácido en la posición número 105 se sustituye por F.

[0068] Las modificaciones alternativas están separadas por "," (coma), por ejemplo, la designación "119R,K" significa que el aminoácido en la posición 119 se sustituye por R o K.

[0069] Las comas usadas en este documento en otras enumeraciones de posibilidades significan lo que habitualmente significan gramáticamente, a saber, frecuentemente y/o.

Por ejemplo, la primera coma en el listado "53V,Q, 121D, y/o 167Q" denota una alternativa (V o Q), mientras que las dos comas siguientes deberían ser interpretadas como y/o: 53 V o Q, y/o 121D, y/o 167Q.

[0070] En el presente contexto, "al menos una" (por ejemplo, modificación) significa una o varias, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 modificaciones; o 12, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 24, 25, 28 o 30 modificaciones; y así sucesivamente, hasta un número máximo de modificaciones de 125, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o de 200. Las variantes de fitasa de la invención, sin embargo, todavía tienen que ser al menos un 70 % idénticas a la SEC ID N° 2. Este porcentaje se determina como se ha descrito anteriormente.

[0071] Una sustitución o extensión sin alguna indicación de qué sustituir o extender se refiere a la inserción de cualquier aminoácido natural o no natural, excepto el que ocupa esta posición en la plantilla.

Identificación de los números de posición correspondientes

[0072] Como se ha explicado anteriormente, la secuencia madura de aminoácidos de la fitasa madura de Buttiauxella gaviniae DSM 18930 (SEC ID N° 2) se usa como estándar para la numeración de posición y, de este modo, también para la nomenclatura.

[0073] Para otra fitasa, en particular una variante de fitasa de la invención, la posición que corresponde a la posición D en la SEC ID N° 2 se encuentra mediante el alineamiento de las dos secuencias tal y como se específica anteriormente en la sección titulada "Polipéptidos de fitasa, porcentaje de identidad". A partir del alineamiento, la posición en la secuencia de la invención que corresponde a la posición D de la SEC ID N° 2 se puede identificar claramente y sin ambigüedad (las dos posiciones una encima de la otra en el alineamiento).

[0074] Más adelante se incluyen ejemplos adicionales, puramente hipotéticos, que se derivan de la tabla 1 anterior en cuya tercera columna incluye varios alineamientos de dos secuencias:

Considerar la tercera celda de la primera fila de la tabla 1: la secuencia superior es la plantilla, la inferior la variante. La posición número 80 se refiere al residuo de aminoácido G en la plantilla. El aminoácido A ocupa la posición correspondiente en la variante. Por consiguiente, esta sustitución se designa G80A.

[0075] Considerar ahora la tercera celda de la segunda fila de la tabla 1: la secuencia superior es otra vez la plantilla y la inferior la variante.

La posición número 80 nuevamente se refiere al residuo de aminoácido G en la plantilla.

La variante tiene dos inserciones, a saber, TY después de G80 y antes de V81 en la plantilla.

Mientras que el T y el Y por supuesto tendrían su propio número de posición "real" en la variante de la secuencia de aminoácidos, para los fines presentes nos referimos siempre a los números de posición de la plantilla, y por consiguiente se dice que el T y el Y están en las posiciones número 80a y 80b, respectivamente.

[0076] Finalmente, considerar la tercera celda de la última fila de la tabla 1: la posición número 275 se refiere al último aminoácido de la plantilla.

Se dice que una extensión del C-terminal de ST está en las posiciones número 275a y 275b, respectivamente, aunque, nuevamente, por supuesto tienen su propio número de posición "real" en la variante de la secuencia de aminoácidos.

Propiedades modificadas, fitasa de referencia

[0077] La fitasa de la invención tiene una termoestabilidad mejorada y/o un perfil de temperatura mejorado en comparación con la fitasa progenitora. Los términos "modificado" y "mejorado" implican una comparación con la fitasa progenitora.

[0078] Otros ejemplos no limitivos de propiedades que son modificadas, preferiblemente mejoradas, son los siguientes: perfil de pH, actividad específica, rendimiento en piensos para animales, estabilidad frente a la granulación, sensibilidad de proteasa y/o patrón de glicosilación. Las variantes de fitasa producidas por el método de la invención exhiben termoestabilidad mejorada y tienen un perfil de temperatura mejorado, y/o pueden incorporar un cambio de un sitio potencial de división de proteasa.

Rendimiento térmico

Termoestabilidad

[0079] La termoestabilidad se puede determinar como se describe en el ejemplo 3, es decir, usando mediciones de DSC para determinar la temperatura de desnaturalización, Td, de la proteína fitasa purificada.

La Td es indicativa de la termoestabilidad de la proteína: cuanto mayor es la Td, mayor es la termoestabilidad. Por consiguiente, en una realización preferida, la fitasa de la invención tiene una Td que es superior a la Td de una fitasa de referencia, donde la Td se determina en muestras de fitasa purificadas (preferiblemente con una pureza de al menos un 90 % o 95 %, determinada mediante SDS-PAGE).

[0080] La termoestabilidad también se puede determinar de la siguiente manera. Por consiguiente, en una realización preferida la fitasa de la invención, tras la incubación durante 60 minutos a 70°C y pH 4,0, tiene una actividad residual mejorada en comparación con la actividad residual de una fitasa de referencia tratada de la misma manera, calculando la actividad residual para cada fitasa con respecto a la actividad encontrada antes la incubación (a 0 minutos).

La actividad residual se mide preferiblemente en fitato de sodio a pH 5,5 y 37°C. La incubación preferiblemente es en acetato de sodio 0,1 M a pH 4,0.

La fitasa preferiblemente está purificada, más preferiblemente a una pureza de al menos un 95 %, determinada mediante SDS-PAGE. Un tampón de ensayo de actividad de fitasa preferido es acetato de sodio 0,25 M a pH 5,5.

Usando este método, la actividad residual de la fitasa de la invención es preferiblemente al menos un 105 % de la actividad residual de la fitasa de referencia, más preferiblemente al menos un 110 %, 115 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 % o al menos un 200 %.

En la alternativa, la actividad residual respecto a la actividad a los 0 minutos es preferiblemente al menos un 31 % o al menos un 32 %.

Se prefieren las siguientes sustituciones que proporcionan termoestabilidad mejorada (ver tabla 9): 273L, 46E, 362R y/o 53V.

[0081] En una realización particular, la variante de fitasa de la invención es más termoestable que la fitasa de referencia, donde la termoestabilidad se determina utilizando cualquiera de las cuatro pruebas mencionadas anteriormente (basadas en los ejemplos).

Estabilidad calorífica

[0082] La estabilidad calorífica se puede determinar como se describe en el ejemplo 4 determinando el perfil de temperatura/actividad de las variantes de fitasa.

Perfil de temperatura/estabilidad de temperatura

[0083] Se puede determinar según se describe en el ejemplo 4 si una fitasa de la invención tiene un perfil de temperatura modificado comparado con una fitasa de referencia. Por consiguiente, en una realización particular, la fitasa de la invención tiene un perfil de temperatura modificado comparado con una fitasa de referencia, donde el perfil de temperatura se determina como la actividad de fitasa como función de la temperatura en fitato de sodio a pH 5,5 en el intervalo de temperaturas de 20-90°C (en pasos de10°C).

Un tampón preferido está en un tampón de acetato de sodio 0,25 M a 5,5 pH.

La actividad a cada temperatura se indica preferiblemente como la actividad relativa (en %) normalizada al valor a temperatura óptima.

La temperatura óptima es aquella temperatura dentro de las temperaturas ensayadas (es decir, aquellas con saltos de 5-10°C) donde la actividad es máxima.

Perfil de pH

[0084] Se puede determinar según se describe en los ejemplos si una fitasa de la invención tiene un perfil de pH modificado comparado con una fitasa de referencia.

Por consiguiente, en una realización particular, la fitasa de la invención tiene un perfil de pH modificado en comparación con una fitasa de referencia, donde el perfil de pH se determina como la actividad de fitasa como función del pH en fitato de sodio a 37°C en el intervalo de pH de 2,0 a 7,5 (en pasos de 0,5 unidades de pH). Un tampón preferido es un cóctel de glicina 50 mM, ácido acético 50 mM y Bis-Tris 50 mM.

Otro tampón preferido es acetato sódico 0,25 M.

La actividad a cada pH se indica preferiblemente como la actividad relativa (en %) normalizada al valor a pH óptimo.

[0085] Un ejemplo de un perfil de pH modificado es donde la curva de pH (actividad relativa como función de pH) se desplaza hacia pH más alto o más bajo.

[0086] Otro ejemplo de un perfil de pH modificado es donde se cambia el pH óptimo, en la dirección ascendente o descendente

Un perfil de pH modificado también se puede determinar comparando la actividad de fosfatasa a pH 3,5 y 5,5. Alternativamente, la actividad a pH 3,5 se puede comparar con la actividad a pH 4,0, 4,5 o 5,0.

En otra realización alternativa, se comparan las actividades de fitasa en vez de las actividades de fosfatasa.

[0087] En una realización particular, la fitasa de la invención tiene un perfil de pH modificado en comparación con una fitasa de referencia.

Más particularmente, el perfil de pH es modificado en el intervalo de pH 3,5-5,5.

Aún más particularmente, la actividad a pH 4,0, 4,5, 5,0 y/o 5,5 está a un nivel de al menos un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o al menos un 95 % de la actividad a pH óptimo.

Actividad específica

[0088] En una realización particular, la fitasa de la invención tiene una actividad específica mejorada con respecto a una fitasa de referencia.

Más particularmente, la actividad específica de una fitasa de la invención es al menos un 105 % respecto a la actividad específica de una fitasa de referencia determinada por el mismo procedimiento.

En otras realizaciones particulares, la actividad específica relativa es al menos un 110, 115, 120, 125, 130, 140, 145, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 350 o incluso un 400 % respecto a la actividad específica de la fitasa de referencia según se determina mediante el mismo procedimiento.

[0089] En la alternativa, el término “alta actividad específica” se refiere a una actividad específica de al menos 200 FYT/mg de proteína enzimática (PE). En realizaciones particulares, la actividad específica es al menos 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 o 3000 FYT/mg de PE.

[0090] La actividad específica se mide en muestras altamente purificadas (un gel de poliacrilamida con SDS debería mostrar la presencia de un solo componente).

La concentración de proteína enzimática se puede determinar mediante el análisis de aminoácidos, y la actividad de fitasa en unidades de FYT, se determina como se describe en los ejemplos.

La actividad específica es una característica de la variante de fitasa específica en cuestión y se calcula como la actividad de fitasa medida en unidades FYT por mg de proteína enzimática de la variante de fitasa.

Rendimiento en piensos para animales

[0091] En una realización particular, la fitasa de la invención tiene un rendimiento mejorado en piensos para animales en comparación con una fitasa de referencia. El rendimiento en piensos para animales se puede determinar mediante un modelo in vitro del ejemplo 5. Por consiguiente, en una realización preferida, la fitasa de la invención tiene un rendimiento mejorado en piensos para animales, donde el rendimiento se determina en un modelo in vitro, preparando muestras de pienso compuestas por un 30 % de harina de soja y un 70 % de harina de maíz con CaCl² añadido hasta una concentración de 5 g de calcio por kg de pienso; preicubándolas a 40°C y pH 3,0 durante 30 minutos añadiendo después pepsina (3000 U/g de pienso) y fitasa; incubando las muestras a 40°C y pH 3,0 durante 60 minutos y a continuación a pH 4,0 durante 30 minutos; parando las reacciones; extrayendo ácido fítico y fosfatos de inositol mediante la adición de HCl hasta una concentración final de 0,5M y la incubación a 40°C durante 2 horas, seguida de un ciclo de congelación-descongelación y una hora de incubación a 40°C; separando el ácido fítico y los fosfatos de inositol mediante cromatografía de iones de alto rendimiento; determinando la cantidad de fósforo del fitato (IP6-P) residual; calculando la diferencia de IP6-P residual entre la muestra en blanco de la fitasa tratada y la de una fitasa no tratada (esta diferencia es IP6-P degradado); y expresando el IP6-P degradado de la fitasa de la invención en relación con el IP6-P degradado de la fitasa de referencia (por ejemplo, las fitasas que tienen la SEC ID N° 3 y 4).

[0092] La fitasa de la invención y la fitasa de referencia están, por supuesto, dosificadas en la misma cantidad, preferiblemente basada en unidades de actividad de fitasa (FYT). Una dosis preferida es 125 FTU/kg de pienso. Otra dosis preferida es 250 FTU/kg de pienso. Las fitasas se pueden dosificar en forma de fitasas purificadas o en forma de sobrenadantes de fermentación.

Las fitasas purificadas preferiblemente tienen una pureza de al menos un 95 %, tal como se determina mediante SDS-PAGE.

[0093] En realizaciones preferidas, el valor de IP6-P degradado de la fitasa purificada de la invención, en relación con el valor de IP6-P degradado de la fitasa de referencia, es al menos un 101 % o al menos un 102 %, 103 %, 104 %, 105 %, 110 %, 115 % o al menos un 120 %.

En otras realizaciones preferidas, el valor de IP6-P degradado de la fitasa purificada de la invención, en relación con el valor de IP6-P degradado de la fitasa de referencia, es al menos un 125 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 % o al menos un 200 %.

Preferiblemente, el valor de IP6-P degradado de la fitasa de la invención, en relación con el valor de IP6-P degradado de la fitasa de la SEC ID N° 2, es al menos un 105 %, 110 %, 113 %, 115 %, 120 %, 125 % o al menos un 130 %.

[0094] El rendimiento relativo de una fitasa de la invención también se puede calcular como el porcentaje de fósforo liberado por la fitasa de referencia.

[0095] En otra realización particular, el rendimiento relativo de la fitasa de la invención se puede calcular como el porcentaje de fósforo liberado por la fitasa de la invención en relación con la cantidad de fósforo liberada por la fitasa de referencia.

[0096] En otras realizaciones particulares, el rendimiento relativo de la fitasa de la invención es al menos un 105 %, preferiblemente al menos un 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o al menos un 200 %.

Secuencias y constructos de ácidos nucleicos

[0097] La presente invención también se refiere a secuencias de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una variante de fitasa de la invención.

[0098] El término "secuencia de ácidos nucleicos aislada" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que está esencialmente libre de otras secuencias de ácidos nucleicos, por ejemplo, al menos aproximadamente un 20 % pura, preferiblemente al menos aproximadamente un 40 % pura, más preferiblemente al menos aproximadamente un 60 % pura, aún más preferiblemente al menos aproximadamente un 80 % pura y de la forma más preferible al menos aproximadamente un 90% pura tal y como se determina mediante electroforesis de agarosa.

Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos aislada se puede obtener mediante procedimientos estándar de clonación usados en ingeniería genética para recolocar la secuencia de ácidos nucleicos desde su ubicación natural a un sitio diferente donde se reproducirá.

Los procedimientos de clonación pueden implicar la escisión y el aislamiento de un fragmento de ácido nucleico deseado que comprende la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido, la inserción del fragmento en una molécula vector y la incorporación del vector recombinante en una célula huésped donde se replicarán múltiples copias o clones de la secuencia de ácidos nucleicos.

La secuencia de ácidos nucleicos puede ser de origen genómico, de ADNc, de ARN, semisintético, sintético o cualquier combinación de los mismos.

[0099] Las secuencias de ácidos nucleicos de la invención se pueden preparar introduciendo al menos una mutación en una plantilla de secuencia codificante de fitasa o una subsecuencia de la misma, donde la secuencia de ácidos nucleicos mutante codifica una variante de fitasa.

La introducción de una mutación en la secuencia de ácidos nucleicos para intercambiar un nucleótido por otro nucleótido se puede realizar mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida, mediante mutagénesis aleatoria o mediante mutagénesis aleatoria, dopada, enriquecida o localizada.

[0100] La mutagénesis aleatoria se realiza adecuadamente como mutagénesis aleatoria tanto localizada como específica de la región en al menos tres partes del gen que se traduce a la secuencia de aminoácidos mostrada en cuestión o en el gen entero.

Cuando la mutagénesis se realiza mediante el uso de un oligonucleótido, el oligonucleótido se puede dopar o enriquecer con los tres nucleótidos no progenitores durante la síntesis del oligonucleótido en las posiciones que se van a cambiar.

El dopaje o el enriquecimiento se pueden realizar de modo que se eviten los codones para aminoácidos no deseados.

El oligonucleótido dopado o enriquecido se puede incorporar al ADN que codifica la enzima fitasa mediante cualquier técnica, usando, por ejemplo, PCR, LCR o cualquier ADN polimerasa y ADN ligasa como se considere apropiado.

[0101] Preferiblemente, el dopaje se lleva a cabo usando un "dopaje aleatorio constante", en el que el porcentaje de tipo salvaje y mutación en cada posición está predefinido. Además, el dopaje se puede orientar hacia una preferencia por introducir ciertos nucleótidos y, de este modo, una preferencia por introducir uno o varios residuos específicos de aminoácidos.

El dopaje se puede hacer, por ejemplo, para permitir la introducción de un 90 % de tipo salvaje y un 10 % de mutaciones en cada posición.

Una consideración adicional en la elección de un esquema de dopaje se basa en restricciones genéticas, así como en restricciones estructurales proteínicas.

[0102] La mutagénesis aleatoria puede ser ventajosamente localizada a una parte de la fitasa progenitora en cuestión.

Esto puede, por ejemplo, ser beneficioso cuando se ha identificado que ciertas regiones de la enzima son de particular importancia para una propiedad dada de la enzima.

[0103] Los métodos alternativos para proporcionar variantes de la invención incluyen el barajado de genes, por ejemplo, como se describe en WO 95/22625 o en WO 96/00343, y el proceso de derivación de consenso como se describe en EP 897985.

Constructos de ácidos nucleicos

[0104] Un constructo de ácidos nucleicos comprende una secuencia de ácidos nucleicos de la presente invención operativamente enlazada a uno o varias secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula huésped adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control.

Se entenderá que la expresión incluye cualquier paso involucrado en la producción del polipéptido incluyendo, pero sin limitarse a, transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional y secreción.

[0105] El término "constructo de ácidos nucleicos" tal como se utiliza en este documento se refiere a una molécula de ácido nucleico, tanto monocatenaria como bicatenaria, que se aísla de un gen de origen natural o que se modifica para contener segmentos de ácidos nucleicos de una manera que de otro modo no existirían en la naturaleza.

El término constructo de ácidos nucleicos es sinónimo del término "casete de expresión" cuando el constructo de ácidos nucleicos contiene las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia codificante de la presente invención.

[0106] El término "secuencias de control" se define en este documento para incluir todos componentes que son necesarios o ventajosos para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención.

Cada secuencia de control puede ser nativa o extranjera a la secuencia de nucleótidos que codifican el polipéptido.

Tales secuencias de control incluyen, pero no se limitan a, un líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia de propéptido, un promotor, una secuencia de péptido señal y un terminador de transcripción.

Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de parada transcripcional y traduccional.

Se pueden proporcionar enlazadores a las secuencias de control con el fin de introducir sitios de restricción específicos que faciliten la unión de las secuencias de control con la región codificante de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido.

[0107] El término "operativamente enlazado" denota en este documento una configuración en la que una secuencia de control se coloca apropiadamente en una posición relativa a la secuencia codificante de la secuencia de polinucleótidos de manera que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia codificante de un polipéptido.

[0108] Cuando se usa en este documento, el término "secuencia codificante" (CDS) significa una secuencia de nucleótidos que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de su producto proteínico.

Los límites de la secuencia codificante están generalmente determinados por un marco de lectura abierto, que empieza normalmente con el codón de inicio ATG o codones de inicio alternativos tales como GTG y TTG. La secuencia codificante puede ser ADN, ADNc o una secuencia recombinante de nucleótidos.

Vector de expresión

[0109] El término "expresión" incluye cualquier paso implicado en la producción del polipéptido incluyendo, pero sin limitarse a, transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional y secreción.

[0110] El término "vector de expresión" se define en este documento como una molécula lineal o circular de ADN que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de la invención y que está operativamente enlazado a nucleótidos adicionales que se encargan de su expresión.

[0111] Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una variante de fitasa de la invención se puede expresar utilizando un vector de expresión que incluye típicamente secuencias de control que codifican un promotor, un operador, un sitio de unión al ribosoma, una señal de inicio de traducción y, opcionalmente, un gen represor o varios genes activadores.

[0112] El vector de expresión recombinante que porta la secuencia de ADN que codifica una variante de fitasa de la invención puede ser cualquier vector que pueda ser convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector dependerá frecuentemente de la célula huésped en la que va a ser introducido.

El vector puede ser uno que, cuando se introduce en una célula huésped, se integra en el genoma de la célula huésped y se replica con el(los) cromosoma(s) en los que se ha integrado.

[0113] La variante de fitasa también se puede coexpresar junto con al menos otra enzima de interés para piensos para animales, como fitasa, fosfatasa, xilanasa, galactanasa, alfa-galactosidasa, proteasa, fosfolipasa, amilasa y/o beta-glucanasa.

Las enzimas pueden ser coexpresadas a partir de vectores distintos, a partir de un vector o utilizando una mezcla de ambas técnicas.

Cuando se usan vectores diferentes, los vectores pueden tener marcadores seleccionables diferentes y orígenes de replicación diferentes.

Cuando se usa un solo vector, los genes pueden ser expresados a partir de uno o varios promotores.

Si se clonan bajo la regulación de un promotor (di- o multicistrónico), el orden en el que los genes son clonados puede afectar a los niveles de expresión de las proteínas.

La variante de fitasa también se puede expresar como una proteína de fusión, es decir, que el gen que codifica la variante de fitasa se ha fusionado dentro del marco al gen que codifica otra proteína.

Esta proteína puede ser otra enzima o un dominio funcional de otra enzima.

Células huésped

[0114] El término "célula huésped", tal como se utiliza en este documento, incluye cualquier tipo de célula susceptible a transformación, transfección, transducción y similares con un constructo de ácidos nucleicos que comprende un polinucleótido de la presente invención.

[0115] La presente invención también se refiere a células huésped recombinantes, que comprenden un polinucleótido de la presente invención, que son ventajosamente usadas en la producción recombinante de los polipéptidos.

Un vector que comprende un polinucleótido de la presente invención se introduce en una célula huésped de modo que el vector se mantiene como integrante cromosómico o como vector extracromosómico autorreplicante según se ha descrito anteriormente.

El término "célula huésped" abarca cualquier descendiente de una célula madre que no es idéntico a la célula madre debido a mutaciones que ocurren durante replicación.

La elección de una célula huésped dependerá en gran medida del gen que codifica el polipéptido y su fuente.

[0116] La célula huésped puede ser un microorganismo unicelular, por ejemplo, un procariota; o un microorganismo no unicelular, por ejemplo, un eucariota.

[0117] Los microorganismos unicelulares útiles son células bacterianas tales como bacterias gram positivas incluyendo, pero sin limitarse a, una célula de Bacillus, por ejemplo, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis y Bacillus thuringiensis; o una célula de Streptomyces, por ejemplo, Streptomyces lividans y Streptomyces murinus; o bacterias gram negativas tales como E. coli y Pseudomonas sp. en un aspecto preferido, la célula huésped bacteriana es una célula de Bacillus, lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus o Bacillus subtilis. En otro aspecto preferido, la célula de Bacillus es un bacillus alcalofílico.

[0118] La introducción de un vector en una célula huésped bacteriana puede, por ejemplo, estar afectada por la transformación de protoplastos (ver, por ejemplo, Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), usando células competentes (ver, por ejemplo, Young and Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, o Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), electroporación (ver, por ejemplo, Shigekawa and Dower, 1988 Biotechniques 6: 742-751) o conjugación (ver, por ejemplo, Koehler and Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278).

[0119] La célula huésped también puede ser un eucariota, como una célula de mamífero, insecto, planta o fúngica.

[0120] En un aspecto preferido, la célula huésped es una célula fúngica. "Hongos" tal como se utiliza en este documento incluye los fila Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota y zygomycota (según la definición de Hawkswort et al., In, Ainswort and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8a edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido) así como los Oomycota (según se cita en Hawkswort et al., 1995, supra, página 171) y todos hongos mitospóricos (Hawkswort et al., 1995, supra).

[0121] En un aspecto más preferido, la célula huésped fúngica es una célula de levadura. "Levadura" tal como se utiliza en este caso incluye levadura ascoesporógena (Endomycetales), levadura basidioesporogénea y levadura de los Fungi Imperfecti (Blastomicetos). Ya que la clasificación de levadura puede cambiar en el futuro, para los fines de esta invención, la levadura debe ser definida como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., and Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series n°. 9, 1980).

[0122] En un aspecto aún más preferido, la célula huésped de levadura es una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia.

[0123] En un aspecto más preferido, la célula huésped de levadura es una célula de Pichia pastoris, Pichia methanolica, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis. En otro aspecto más preferido, la célula huésped de levadura es una célula de Kluyveromyces lactis.

En otro aspecto más preferido, la célula huésped de levadura es una célula de Yarrowia lipolytica.

[0124] En otro aspecto más preferido, la célula huésped fúngica es una célula fúngica filamentosa. "Fúngica filamentosa" incluye todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (según la definición de Hawkswort et al., 1995, supra).

Los hongos filamentosos se caracterizan generalmente por una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano y otros polisacáridos complejos.

El crecimiento vegetativo es mediante alargamiento hifal y el catabolismo de carbono es estrictamente aeróbico. En cambio, el crecimiento vegetativo por levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae es mediante injerto de un talo unicelular y el catabolismo de carbono puede ser fermentativo.

[0125] En un aspecto aún más preferido, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filobasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromices, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes o Trichoderma.

[0126] En un aspecto más preferido, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae.

En otro aspecto más preferido, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides o Fusarium venenatum.

En otro aspecto más preferido, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de cepas de Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa o Ceriporiopsis subvermispora, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride.

[0127] Las células fúngicas se pueden transformar mediante un proceso que implica formación de protoplastos, transformación de los protoplastos y regeneración de la pared celular de una manera conocida per se. Procedimientos adecuados para la transformación de células huésped de Aspergillus y Trichoderma se describen en EP 238023 y Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470­ 1474. Métodos Adecuados para transformar especies de Fusarium son descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 y WO 96/00787. La levadura se puede transformar utilizando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, In Abelson, J.N. y Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, volumen 194, págs 182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; y Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920. Métodos de producción

[0128] La presente invención también se refiere a métodos para producir una fitasa de la presente invención que comprenden (a) cultivar una célula huésped bajo condiciones propicias para la producción de la fitasa; y (b) recuperar la fitasa.

[0129] En los métodos de producción de la presente invención, las células se cultivan en un medio nutritivo adecuado para la producción del polipéptido usando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula se puede cultivar mediante cultivo en matraz de agitación y mediante fermentación a pequeña escala o a gran escala (incluyendo fermentación continua, por lote, lote alimentado o de estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales realizados en un medio adecuado y bajo condiciones que permitan al polipéptido ser expresado y/o aislado.

El cultivo tiene lugar en un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de nitrógeno y carbono y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados están disponibles en proveedores comerciales o se pueden preparar según composiciones publicadas (por ejemplo, en los catálogos de la American Type Culture Collection).

Si el polipéptido se segrega en el medio nutritivo, el polipéptido puede ser recuperado directamente del medio. Si el polipéptido no se segrega, puede ser recuperado de lisados celulares.

[0130] El polipéptido resultante se puede recuperar usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido se puede recuperar del medio nutritivo por procedimientos convencionales que incluyen, pero no se limitan a, centrifugado, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación o precipitación.

[0131] Los polipéptidos de la presente invención pueden ser purificados mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad, hidrofóbica, de cromatoenfoque y de exclusión de tamaño), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, isoelectroenfoque preparativo), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación de sulfato amónico), SDS-PAGE o extracción (ver, por ejemplo, Protein Purification, J.-C. Janson y Lars Ryden, Editores, VCH Publishers, Nueva York, 1989).

Plantas transgénicas

[0132] La presente invención se refiere también a una planta transgénica, parte de planta o célula vegetal que ha sido transformada con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad de fitasa de la presente invención para expresar y producir el polipéptido en cantidades recuperables.

El polipéptido se puede recuperar de la planta o de la parte de planta.

Alternativamente, la planta o parte de planta que contiene el polipéptido recombinante se puede utilizar como tal para mejorar la calidad de un alimento o pienso, por ejemplo, mejorando el valor nutricional, la palatabilidad y las propiedades reológicas o para destruir un factor antinutricional.

[0133] En una realización particular, el polipéptido está dirigido a las vacuolas de almacenamiento del endospermo en semillas.

Esto se puede obtener sintetizándolo como un precursor con un péptido señal adecuado, ver Horvath et al. en PNAS, Feb. 15, 2000, vol. 97, n° 4, p. 1914-1919.

[0134] La planta transgénica puede ser dicotiledónea o monocotiledónea o variantes diseñadas de las mismas. Ejemplos de plantas monocotiledóneas son hierbas tales como poa de los prados (poa pratense, poa), hierbas forrajeras tales como festuca, lolium, hierbas templadas tales como agrostis, y cereales, por ejemplo, trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo, triticale (híbrido estabilizado de trigo (triticum) y centeno (secale)) y maíz.

Ejemplos de plantas dicotiledóneas son tabaco, leguminosas, tales como girasol (helianthus), algodón (gossypium), lupinos, patata, remolacha azucarera, guisante, judía y semilla de soja, y plantas crucíferas (familia Brassicaceae), como coliflor, semilla de colza y el organismo modelo estrechamente relacionado de Arabidopsis thaliana.

Plantas bajas en fitato como las descritas, por ejemplo, en la patente de EEUU n° 5,689,054 y la patente de EEUU n° 6,111,168 son ejemplos de plantas diseñadas.

[0135] Ejemplos de partes de planta son tallo, callo, hojas, raíz, frutos, semillas y tubérculos, así como los tejidos individuales que comprenden estas partes, por ejemplo, epidermis, mesófilo, parénquima, tejidos vasculares y meristemas.

Compartimentos celulares específicos de la planta, tales como cloroplastos, apoplastos, mitocondrias, vacuolas, peroxisomas y citoplasma se consideran también una parte de planta.

Además, cualquier célula vegetal, cualquiera que sea el origen del tejido, se considera que es parte de la planta. Asimismo, partes de planta tales como tejidos específicos y células aisladas para facilitar la utilización de la invención se consideran también partes de planta, por ejemplo: embriones, endospermos, aleurona y tegumentos.

[0136] También se incluyen dentro del campo de la presente invención los descendientes de tales plantas, partes de planta y células vegetales.

[0137] La planta o la célula vegetal transgénicas que expresan un polipéptido de la presente invención se pueden construir conforme a métodos conocidos en la técnica. En definitiva, la planta o la célula vegetal se construyen incorporando uno o varios constructos de expresión que codifican un polipéptido de la presente invención en el genoma huésped de la planta y propagando la planta o la célula vegetal modificadas resultantes a una planta o una célula vegetal transgénica.

[0138] Convenientemente, el constructo de expresión es un constructo de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de la presente invención operativamente enlazado a secuencias reguladoras apropiadas requeridas para la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos en la planta o parte de planta elegida.

Además, el constructo de expresión puede comprender un marcador seleccionable, útil para identificar células huésped en las que el constructo de expresión ha sido integrado, y secuencias de ADN necesarias para introducir el constructo en la planta en cuestión (esto último depende del método usado para introducir el ADN).

[0139] La elección de las secuencias reguladoras, tales como secuencias promotoras y terminadoras y, opcionalmente, secuencias de señal o tránsito, se determina, por ejemplo, basándose en cuándo, dónde y cómo se desea que el polipéptido se exprese.

Por ejemplo, la expresión del gen que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser constitutiva o inducible, o puede ser específica de desarrollo, fase o tejido, y el producto genético puede ser dirigido a un compartimento celular, tejido o parte de planta específicos tales como semillas u hojas.

Las secuencias reguladoras son, por ejemplo, descritas por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.

[0140] Para la expresión constitutiva se pueden usar los promotores siguientes: el promotor 35S-CaMV, la ubiquitina 1 del maíz (Christensen AH, Sharrock RA and Quail 1992. Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation) o el promotor de actina 1 del arroz (Plant Mo. Biol. 18, 675-689.; Zhang W, McElroy D. and Wu R 1991,

Analysis of rice Act1 5' region activity in transgenic rice plants. Plant Cell 3, 1155-1165).

Los promotores específicos de un órgano pueden ser, por ejemplo, un promotor de tejidos sumidero de almacenamiento tales como semillas, tubérculos de patata y frutos (Edwards & Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet.

24: 275-303), o de tejidos sumidero metabólicos tales como meristemas (Ito et al., 1994, Plant. Mol. Biol. 24: 863­ 878), un promotor específico de semilla como el promotor de glutelina, prolamina, globulina o albúmina del arroz (Wu et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 885-889), un promotor de Vicia faba de la legúmina B4 y el gen desconocido de proteína de semilla de Vicia faba (Conrad et al., 1998, Journal of Plant Physiology 152: 708-711), un promotor de una proteína de cuerpo aceitoso de semillas (Chen et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 935-941), el promotor del napA de proteínas de almacenamiento de Brassica napus o cualquier otro promotor específico de semilla conocido en la técnica, por ejemplo, como se describe en WO 91/14772. Además, el promotor puede ser un promotor específico de hoja tal como el promotor del rbcs del arroz o el tomate (Kiozuka et al., 1993, Plant Physiology 102: 991-1000), el promotor del gen de adenina metiltransferasa del virus chlorella (Mitra and Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93) o el promotor del gen aldP del arroz (Kagaya et al., 1995, Molecular and General Genetics 248: 668-674), o un promotor inducible por herida tal como el promotor del pin2 de la patata (Xu et al., 1993, Plant Molecular Biology 22: 573-588).

Asimismo, el promotor puede ser inducible mediante tratamientos abióticos tales como temperatura, sequía o alteraciones en la salinidad; o inducible mediante sustancias aplicadas exógenamente que activan el promotor, por ejemplo: etanol, estrógenos, hormonas de planta tipo etileno, ácido abscísico, ácido giberélico y/o metales pesados.

[0141] Un elemento intensificador del promotor se puede usar también para conseguir una expresión mayor del polipéptido en la planta.

Por ejemplo, el elemento intensificador del promotor puede ser un intrón que se coloca entre el promotor y la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención.

Por ejemplo, Xu et al., 1993, supra, describen el uso del primer intrón del gen de actina 1 del arroz para mejorar su expresión.

[0142] Aún más, el uso de codón se puede optimizar para las especies de la planta en cuestión para mejorar su expresión (ver Horvath et al. referido anteriormente).

[0143] El gen marcador seleccionable y cualquiera de las otras partes del constructo de expresión se pueden elegir a partir de aquellos disponibles en la técnica.

[0144] El constructo de ácidos nucleicos se incorpora al genoma de la planta según técnicas convencionales conocidas en la técnica, incluyendo transformación mediada por Agrobacterium, transformación mediada por virus, microinyección, bombardeo de partículas, transformación biolística y electroporación (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).

[0145] Actualmente, la transferencia genética mediada por Agrobacterium tumefaciens es el método elegido para generar dicotiledóneas transgénicas (para una reseña, ver Hooykas and Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19: 15-38), y puede también usarse para transformar monocotiledóneas, aunque otros métodos de transformación se usan más frecuentemente para estas plantas.

Actualmente, el método elegido para generar monocotiledóneas transgénicas, que complementa el método de Agrobacterium, es el bombardeo con partículas (partículas microscópicas de oro o tungsteno recubiertas con el ADN transformador) de callos embrionarios o embriones en desarrollo (Christou, 1992, Plant Journal 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Un método alternativo para transformar monocotiledóneas se basa en la transformación de protoplastos según la descripción de Omirulleh et al., 1993, Plant Molecular Biology 21: 415-428.

[0146] Después de la transformación, los transformantes que han incorporado en ellos el constructo de expresión se seleccionan y se regeneran en plantas completas según métodos bien conocido en la técnica. Frecuentemente el procedimiento de transformación se diseña para la eliminación selectiva de genes seleccionables, o bien durante la regeneración, o bien en las siguientes generaciones usando, por ejemplo, cotransformación con dos constructos de ADN-T separados o escisión específica del sitio del gen seleccionable mediante una recombinasa específica.

[0147] La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención que comprende (a) cultivar una planta transgénica o una célula vegetal que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido con actividad de fitasa de la presente invención, bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.

Composiciones y usos

[0148] Aún en otros aspectos, la presente invención se refiere a composiciones que comprenden un polipéptido de la presente invención, así como métodos para usarlas.

[0149] Las composiciones de polipéptido se pueden preparar conforme a métodos conocidos en la técnica y pueden estar en forma de líquido o de composición seca.

Por ejemplo, la composición del polipéptido puede estar en forma de granulados o microgranulados.

El polipéptido que se va a incluir en la composición se puede estabilizar conforme a métodos conocidos en la técnica.

[0150] La fitasa de la invención se puede usar para degradar, en cualquier contexto industrial, por ejemplo, fitato, ácido fítico, y/o los mono-, di-, tri-, tetra- y/o pentafosfatos de mioinositol.

Es bien conocido que las fracciones de fosfato de estos compuestos quelan cationes bivalentes y trivalentes de compuestos tales como iones metálicos, entre otros los iones nutricionalmente esenciales de calcio, hierro, zinc y magnesio, así como los oligoelementos manganeso, cobre y molibdeno.

Además, el ácido fítico, hasta cierto punto, enlaza también proteínas mediante interacción electrostática.

[0151] Por consiguiente, los usos preferidos de los polipéptidos de la invención son como preparados de piensos para animales (incluyendo alimento humano) o como aditivos para este tipo de preparados.

[0152] En una realización particular, el polipéptido de la invención se puede usar para mejorar el valor nutricional de un pienso para animales.

Ejemplos no limitantes de la mejora del valor nutricional de piensos para animales (incluyendo alimento humano), son: mejorar la digestibilidad del pienso; promover el crecimiento del animal; mejorar la utilización del pienso; mejorar la biodisponibilidad de proteínas; incrementar el nivel de fosfato digerible; mejorar la liberación y/o degradación de fitato; mejorar la biodisponibilidad de oligoelementos; mejorar la biodisponibilidad de macrominerales; eliminar la necesidad añadir fosfato, oligoelementos y/o macrominerales adicionales; y/o mejorar la calidad de la cáscara de huevo.

El valor nutricional del pienso, por lo tanto, se incrementa, y la tasa de crecimiento y/o aumento de peso y/o conversión de pienso (es decir, el peso del pienso ingerido con respecto al aumento de peso) del animal se puede mejorar.

[0153] Además, el polipéptido de la invención se puede usar para reducir el nivel de fitato en abonos.

Animales, pienso para animales y aditivos del pienso

[0154] El término animal incluye todos los animales, incluyendo seres humanos.

Ejemplos de animales son los no rumiantes y los rumiantes.

Los animales rumiantes incluyen, por ejemplo, animales tales como ovejas, cabras y ganado, por ejemplo, vacas tales como el ganado bovino para carne y vacas lecheras.

En una realización particular, el animal es un animal no rumiante.

Los animales no rumiantes incluyen animales monogástricos, por ejemplo, cerdos (incluyendo, pero sin limitarse a, lechones, cerdos en crecimiento y cerdas); aves tales como pavos, patos y pollos (incluyendo, pero sin limitarse a, pollos para asar y gallinas ponedoras); pescado (incluyendo, pero sin limitarse a, trucha, tilapia, siluro y carpa); y crustáceos (incluyendo, pero sin limitarse a, gambas y cigalas).

[0155] El término pienso o composición de pienso significa cualquier compuesto, preparado, mezcla o composición adecuado para, o destinado a, ser consumido por un animal.

[0156] En el uso según la invención se puede alimentar al animal con el polipéptido antes, después o simultáneamente a la dieta. Esto último es lo que se prefiere.

[0157] En una realización particular, el polipéptido, en la forma en la que se añade al pienso, o cuando se incluye en un aditivo de pienso, es sustancialmente puro.

En una realización particular está bien definido.

El término "bien definido" significa que el preparado de fitasa es al menos un 50 % puro tal como se determina mediante cromatografía de exclusión de tamaño (véase ejemplo 12 de WO 01/58275).

En otras realizaciones particulares el preparado de fitasa es al menos un 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94 o al menos un 95 % puro como se determina mediante este método.

[0158] Un preparado polipeptídico sustancialmente puro y/o bien definido es ventajoso.

Por ejemplo, es mucho más fácil dosificar correctamente en el pienso un polipéptido que está esencialmente libre de interferir o contaminar a otros polipéptidos.

El término dosificar correctamente se refiere en particular al objetivo de obtener resultados consistentes y constantes, y la capacidad de optimizar la dosificación basándose en el efecto deseado.

[0159] Para el uso en piensos para animales, sin embargo, el polipéptido de fitasa de la invención no necesita ser tan puro; puede, por ejemplo, incluir otros polipéptidos, en cuyo caso podría denominarse preparado de fitasa.

[0160] El preparado de fitasa puede ser (a) añadido directamente al pienso (o usado directamente en un proceso de tratamiento de proteínas), o (b) se puede usar en la producción de una o varias composiciones intermedias tales como aditivos de piensos o premezclas que se añaden al pienso posteriormente (o se usan en un proceso de tratamiento).

El grado de pureza anteriormente descrito se refiere a la pureza del preparado polipeptídico original, si se usa según la (a) o la (b) anteriores.

[0161] Los preparados polipeptídicos con purezas de este orden de magnitud son particularmente obtenibles usando métodos recombinantes de producción, mientras que no son tan fáciles de obtener y también están sujetos a una variación entre lotes mucho más alta cuando el polipéptido se produce por métodos de fermentación tradicionales.

[0162] Tal preparado polipeptídico puede, por supuesto, mezclarse con otros polipéptidos.

[0163] El polipéptido se puede añadir al pienso en cualquier forma, ya sea como un polipéptido relativamente puro, ya sea mezclado con otros componentes destinados a ser añadidos a piensos para animales, es decir, en forma de aditivos de pienso, tales como las llamadas premezclas para piensos para animales.

[0164] En otro aspecto la presente invención se refiere a composiciones para usar en piensos para animales, tales como piensos para animales y aditivos de pienso, por ejemplo, premezclas.

[0165] Aparte del polipéptido de la invención, los aditivos de pienso de la invención contienen al menos una vitamina liposoluble y/o al menos una vitamina hidrosoluble y/o al menos un oligoelemento.

El aditivo de pienso también puede contener al menos un macromineral.

[0166] Además, ingredientes opcionales de aditivos de piensos son agentes colorantes, por ejemplo, carotenoides tales como beta-caroteno, astaxantina y luteína; aromatizantes; estabilizadores; péptidos antimicrobianos; ácidos grasos poliinsaturados; especies reactivas generadoras de oxígeno ; y/o al menos otro polipéptido seleccionado de entre fitasa (EC 3.13.8 o 3.1.3.26); fosfatasa (EC 3.1.3.1; EC 3.1.3.2; EC 3.1.3.39); xilanasa (EC 3.2.1.8); galactanasa (eC 3.2.1.89); alfa-galactosidasa (EC 3.2.1.22); proteasa (EC 3.4.-.-); fosfolipasa A1 (EC 3.1.1.32); fosfolipasa A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipasa (EC 3.1.1.5); fosfolipasa C (3.1.4.3); fosfolipasa D (EC 3.1.4.4); amilasa tal como, por ejemplo, alfa-amilasa (EC 3,2,1,1); y/o beta-glucanasa (EC 3,2,1,4 o EC 3,2,1,6).

[0167] En una realización particular estos otros polipéptidos están bien definidos (como se ha definido anteriormente para preparados de fitasa).

[0168] La fitasa de la invención también se puede combinar con otras fitasas, por ejemplo, fitasas de ascomiceto tales como fitasas de Aspergillus, por ejemplo, derivadas de Aspergillus ficuum, Aspergillus niger o Aspergillus awamorii; o fitasas de basidiomiceto, por ejemplo, derivadas de Peniophora lycii, Agrocybe pediades, Trametes pubescens o Paxillus involutus; o derivadas, fragmentos o variantes de las mismas que tienen actividad de fitasa.

[0169] Así, en realizaciones preferidas del uso de la invención en piensos para animales, y en realizaciones preferidas del aditivo de pienso y del pienso para animales de la invención, la fitasa de la invención se combina con dichas fitasas.

[0170] Ejemplos de péptidos antimicrobianos (PAM) son CAP18, leucocina A, tritrpticina, protegrina-1, Thanatina, defensina, lactoferrina, lactoferricina y ovispirina tal como novispirina (Robert Lehrer, 2000), plectasinas y estatinas, incluyendo los compuestos y polipéptidos descritos en WO 03/044049 y WO 03/048148, así como variantes o fragmentos de ellos que retienen actividad antimicrobiana.

[0171] Ejemplos de polipéptidos antifungicidas (PAF) son los péptidos de Aspergillus giganteus y de Aspergillus niger, así como variantes y fragmentos de los mismos que retienen actividad antifúngica, tal como se describe en WO 94/01459 y WO 02/090384.

[0172] Ejemplos de ácidos grasos poliinsaturados son los ácidos grasos poliinsaturados C18, C20 y C22 tales como el ácido araquidónico, el ácido docosahexaenoico, el ácido eicosapentanoico y el ácido gamma-linolénico.

[0173] Ejemplos de especies reactivas generadoras de oxígeno son productos químicos tales como perborato, persulfato o percarbonato; y polipéptidos tales como oxidasa, oxigenasa o sintetasa.

[0174] Normalmente, las vitaminas liposolubles e hidrosolubles, así como los oligoelementos, forman parte de lo que se llama una premezcla destinada a ser añadida al pienso, mientras que los macrominerales habitualmente se añaden al pienso por separado.

Cualquiera de estos tipos de composición, cuando se enriquece con un polipéptido de la invención, es un aditivo de pienso de la invención.

[0175] En una realización particular, el aditivo de pienso de la invención está destinado a ser incluido (o prescrito para tener que ser incluido) en dietas o piensos para animales o pienso a niveles de un 0,01 a un 10,0 %; más particularmente un 0,05 a un 5,0 %; o un 0,2 a un 1,0 % (% calculado como g aditivo por 100 g pienso).

Esto es así en particular para las premezclas.

[0176] Las siguientes son listas no exclusivas de ejemplos de estos componentes:

Ejemplos de vitaminas liposolubles son vitamina A, vitamina D3, vitamina E y vitamina K, por ejemplo, vitamina K3.

[0177] Ejemplos de vitaminas hidrosolubles son vitamina B12, biotina y colina, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, niacina, ácido fólico y pantotenato, por ejemplo, D-pantotenato de calcio.

[0178] Ejemplos de oligoelementos son manganeso, zinc, hierro, cobre, yodo, selenio y cobalto.

[0179] Ejemplos de macrominerales son calcio, fósforo y sodio.

[0180] Los requisitos nutricionales de estos componentes (ejemplificados con aves y lechones/cerdos) se enumeran en la tabla A de WO 01/58275.

“Requisito nutricional” significa que estos componentes deberían proporcionarse en la dieta en las concentraciones indicadas.

[0181] Alternativamente, el aditivo de pienso de la invención comprende al menos uno de los componentes individuales especificados en la tabla A de WO 01/58275.

“Al menos uno” significa cualquiera entre uno o más de uno, o dos, o tres, o cuatro, etc. hasta los trece o hasta los quince componentes individuales.

Más específicamente, este “al menos un” componente individual se incluye en el aditivo de la invención en una cantidad tal que proporcione una concentración en el pienso dentro del intervalo indicado en la columna cuatro, o columna cinco, o columna seis de la tabla A.

[0182] La presente invención también se refiere a composiciones de pienso para animales.

Las composiciones de pienso o dietas para animales tienen un contenido de proteínas relativamente alto.

Las dietas de las aves y los cerdos se pueden caracterizar como se indica en la tabla B de WO 01/58275, columnas 2-3.

Las dietas del pescado se pueden caracterizar como se indica en la columna 4 de esta tabla B. Además, tales dietas del pescado tienen normalmente un contenido en grasa bruta de 200-310 g/kg.

[0183] Una composición de pienso para animales según la invención tiene un contenido de proteína bruta de 50­ 800 g/kg y comprende además al menos un polipéptido como se reivindica en este documento.

[0184] Además, o alternativamente (al contenido de proteína bruta indicado antes), la composición de pienso para animales de la invención tiene un contenido de energía metabolizable de 10-30 MJ/kg; y/o un contenido de calcio de 0,1-200 g/kg; y/o un contenido de fósforo disponible de 0,1-200 g/kg; y/o un contenido de metionina de 0,1-100 g/kg; y/o un contenido de metionina más cisteína de 0,1-150 g/kg; y/o un contenido de lisina de 0,5-50 g/kg.

[0185] La proteína bruta se calcula como el nitrógeno (N) multiplicado por un factor 6,25, es decir, proteína bruta (g/kg) = N (g/kg) x 6,25.

El contenido de nitrógeno se determina mediante el método de Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis 14a ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC).

[0186] La energía metabolizable se puede calcular basándose en la publicación del NRC Nutrient requirements in swine, novena edición revisada 1988, subcommittee on swine nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, national research council. National Academy Press, Washington, D.C., págs. 2-6, y la European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs, Spelderholt centre for poultry research and extension, 7361 DA Beekbergen, Países Bajos. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN 90-71463-12-5.

[0187] El contenido dietético de calcio, fósforo disponible y aminoácidos en dietas completas para animales se calcula basándose en tablas de piensos tales como Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid ene voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6,8219 pk lelistad.

ISBN 90-72839-13-7.

[0188] En una realización particular, la composición de pienso para animales de la invención contiene al menos una proteína.

La proteína puede ser una proteína animal, como harina de carne y hueso, y/o harina de pescado; o puede ser una proteína vegetal.

El término proteína vegetal tal como se utiliza en este documento se refiere cualquier compuesto, composición, preparado o mezcla que incluye al menos una proteína derivada de u originada a partir de un vegetal, incluyendo proteínas modificadas y derivados de proteínas.

En realizaciones particulares, el contenido proteico de las proteínas vegetales es al menos un 10, 20, 30, 40, 50 o 60 % (p/p).

[0189] Las proteínas vegetales se pueden derivar de fuentes de proteína vegetal, tales como leguminosas y cereales, por ejemplo, materiales de plantas de las familias Fabaceae (leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae y Poaceae, tales como harina de soja, harina de lupino y harina de semilla de colza.

[0190] En una realización particular la fuente de proteína vegetal es material de una o varias plantas de la familia Fabaceae, por ejemplo, soja, lupinos, guisantes o judías.

[0191] En otra realización particular, la fuente de proteína vegetal es material de una o varias plantas de la familia Chenopodiaceae, por ejemplo, remolacha, remolacha azucarera, espinacas o quinoa.

[0192] Otros ejemplos de fuentes de proteína vegetal son semilla de colza, semilla de girasol, semilla de algodón y repollo.

[0193] La semilla de soja es una fuente de proteína vegetal preferida.

[0194] Otros ejemplos de fuentes de proteína vegetal son cereales tales como cebada, trigo, centeno, avena, maíz, arroz, triticale y sorgo.

[0195] En otras realizaciones particulares, la composición de pienso para animales de la invención contiene un 0­ 80 % de maíz; y/o un 0-80 % de sorgo; y/o un 0-70 % de trigo; y/o un 0-70 % de cebada; y/o un 0-30 % de avena; y/o un 0-40 % de harina de soja; y/o un 0-25 % de harina de pescado; y/o un 0-25 % de harina de carne y hueso; y/o un 0-20 % de suero de leche.

[0196] Las dietas para animales pueden, por ejemplo, fabricarse como pienso triturado (no granulado) o pienso granulado.

Típicamente, los piensos molidos se mezclan y se añaden cantidades suficientes de vitaminas y minerales esenciales según las especificaciones para las especies en cuestión.

Se pueden añadir polipéptidos como formulaciones polipeptídicas sólidas o líquidas.

Por ejemplo, una formulación polipeptídica sólida se añade típicamente antes o durante la etapa de mezclado; y una preparación polipeptídica líquida se añade típicamente después de la etapa de granulación.

El polipéptido también se puede incorporar en un aditivo de pienso o premezcla.

[0197] La concentración final de polipéptido en la dieta está en el intervalo de 0,01-200 mg de proteína polipeptídica por kg dieta, por ejemplo, en el intervalo de 5-30 mg de proteína polipeptídica por kg de dieta animal.

[0198] La fitasa de la invención debería, por supuesto, aplicarse en una cantidad eficaz, es decir, en una cantidad adecuada para mejorar la solubilización y/o el valor nutricional del pienso.

Se contempla actualmente que el polipéptido se administre en una o varias de las siguientes cantidades (intervalos de dosificación): 0,01-200; 0,01-100; 0,5-100; 1-50; 5-100; 10-100; 0,05-50; o 0,10-10, con todos estos intervalos en mg de proteína polipeptídica fitasa por kg de pienso (ppm).

[0199] Para determinar los mg de proteína polipeptídica fitasa por kg de pienso, la fitasa se purifica a partir de la composición de pienso, y la actividad específica de la fitasa purificada se determina usando un ensayo pertinente.

La actividad de fitasa de la composición de pienso como tal también se determina usando el mismo ensayo, y, basándose en estos dos resultados, se calcula la dosificación en mg de proteína fitasa por kg de pienso.

[0200] Los mismos principios se aplican para determinar los mg proteína polipeptídica fitasa en aditivos de pienso.

Por supuesto, si está disponible una muestra de la fitasa usada para preparar el aditivo de pienso o el pienso, la actividad específica se determina a partir de esta muestra (no se necesita purificar la fitasa de la composición de pienso o el aditivo).

Ejemplos

[0201] Los productos químicos usados son productos comerciales de al menos calidad reactiva.

Ejemplo 1: preparación de variantes y determinación de la actividad

Preparación de variantes de fitasa

Expresión de variantes de fitasa en Aspergillus oryzae

[0202] Los constructos que comprenden los genes de la variante de fitasa de Buttiauxella se utilizan para construir vectores de expresión para Aspergillus.

Los vectores de expresión de Aspergillus pueden consistir en un casete de expresión basado en el promotor de amilasa neutra de Aspergillus niger II fusionado con la secuencia líder no traducida de la triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans (Pna2/tpi) y el terminador de amiloglucosidasa de Aspergillus niger (Tamg). El marcador selectivo pyrG de Aspergillus nidulans, que permite el crecimiento en medios mínimos para un Aspergillus que es pyrG-, puede también estar presente en el plásmido.

Los plásmidos de expresión para variantes de fitasa se transforman en Aspergillus según se describe en Lassen et al. (2001), Applied and Environmental Microbiology, 67,4701-4707.

Para cada uno de los constructos 4-6, las cepas deberían ser aisladas, purificadas y cultivadas en placas de microtitulación.

La expresión se determina usando un sustrato de p-nitrofenil fosfato.

La mejor cepa productora se puede fermentar en matraces de agitación.

Purificación de variantes de fitasa de Buttiauxella

[0203] El sobrenadante de fermentación con la variante de fitasa se filtra a través de un filtro superior de botella rápido PES con un límite de 0,22 |jm.

La solución resultante se diluyó con agua hasta el doble de volumen y se ajustó el pH a 4,5 con ácido acético. Ocasionalmente, la solución puede hacerse un poco turbia y esto se quita filtrándola a través de un filtro superior de botella rápido PES con un límite de 0,22 jm.

[0204] Después del pretratamiento la variante de fitasa se purifica mediante cromatografía en S-sefarosa, aproximadamente 30 ml en una columna XK26, que usa como tampón A acetato sódico 50 mM a pH 4,5, y como tampón B acetato sódico 50 mM NaCl 1 M a pH 4,5.

Las fracciones de la columna se analizan en busca de actividad utilizando el ensayo de fosfatasa (ver más adelante) y las fracciones con actividad se agrupan.

[0205] En algunos casos la solución con la variante de fitasa purificada es concentrada utilizando un dispositivo de filtración Amicon ultra-15 con una membrana de límite 30 kDa.

Determinación de la actividad de fosfatasa

[0206] 75 microlitros de solución enzimática con fitasa se depositan en un pocillo de una placa de microtitulación, por ejemplo, G. NUNC 269620, y se añade un sustrato de 75 microlitros (para preparar el sustrato se disuelven dos pastillas de 5 mg de p-nitrofenil fosfato (Sigma, N° de catálogo N-9389) en 10 ml de tampón de Na-acetato 0,1 M, pH 5,5).

La placa se sella e incuba durante 15 min., agitada a 750 r.p.m. a 37°C. Después del período de incubación se añaden 75 microlitros de reactivo de parada (el reactivo de parada es tetraborato de disodio 0,1 M en agua) y la absorbancia a 405 nm se mide en un espectrofotómetro para placas de microtitulación.

Una unidad de fosfatasa se define como la actividad enzimática que libera 1 micromol de fosfato/min bajo las condiciones de reacción dadas (tampón usado como blanco).

Se determina que la absorbancia de 1 micromol de p-nitrofenol es 56 UA (UA = unidades de absorbancia) bajo condiciones de ensayo.

Determinación de la actividad de fitasa

[0207] 75 microlitros de solución enzimática con fitasa, apropiadamente diluidos en acetato sódico 0,25 M, 0,005 % (p/v) de Tween-20, pH5,5, se depositan en un pocillo de una placa de microtitulación, por ejemplo, G. NUNC 269620, y se añade un sustrato de 75 microlitros (preparado disolviendo 100 mg de fitato de sodio de arroz (N° de catálogo de Aldrich 274321) en 10 ml de tampón de acetato sódico 0,25 M, pH5,5).

La placa se sella e incuba durante 15min., agitada a 750 r.p.m. a 37°C. Después de la incubación se añaden 75 microlitros de reactivo de parada (el reactivo de parada se prepara mezclando 10 ml de solución de molibdato (10 % (p/v) de heptamolibdato de amonio en una solución de amoníaco al 0,25 % (p/v)), 10 ml vanadato de amonio (0,24 % del producto comercial de Bie&Berntsen, N° de catálogo LAB17650) y 20 ml de ácido nítrico del 21,7 % (p/v)), y la absorbancia a 405nm se mide en un espectrofotómetro para placas de microtitulación.

La actividad de fitasa se expresa en unidades de FYT, siendo un FYT la cantidad de enzima que libera 1 micromol ortofosfato inorgánico por minuto bajo las condiciones anteriores.

Un valor absoluto para la actividad de fitasa medida se puede obtener mediante referencia a una curva estándar obtenida a partir de diluciones apropiadas de fosfato inorgánico, o mediante referencia a una curva estándar hecha de diluciones de un preparado enzimático de fitasa con actividad conocida (dicho preparado enzimático estándar con actividad conocida está disponible, previa solicitud, en Novozymes A/S, Krogshoejvej 36; DK-2880 Bagsvaerd).

Ejemplo 2: actividad específica

[0208] La actividad específica de una variante de fitasa se determina en muestras altamente purificadas dializadas contra acetato sódico 250 mM a pH 5,5.

La pureza se comprueba de antemano en un gel de poliacrilamida SDS que muestra la presencia de un solo componente.

[0209] La concentración de proteínas se determina mediante el análisis de los aminoácidos de la siguiente manera: se hidroliza una parte alícuota de la muestra en HCl 6N y fenol al 0,1 % durante 16 h a 110°C en un tubo de vidrio evacuado.

Los aminoácidos resultantes son cuantificados utilizando un sistema de análisis de aminoácidos Applied Biosystems 420A operado según las instrucciones del fabricante.

De las cantidades de aminoácidos se puede calcular la masa total - y, por tanto, también la concentración - de proteínas en la parte alícuota hidrolizada.

[0210] La actividad de fitasa se determina en unidades de FYT tal como se describe en el ejemplo 1 ("Determinación de la actividad de fitasa"), y la actividad específica se calcula como la actividad de fitasa medida en unidades FYT por mg proteína enzimática de variante de fitasa.

Ejemplo 3: termoestabilidad mediante DSC

[0211] La termoestabilidad de la fitasa de Buttiauxella (número de acceso AEH25051 en GENESEQP) y de la variante E54C/A101C/Q143C/I201C, ambas purificadas como se describe en el ejemplo 1, se determinaron mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC) usando un instrumento VP-capillary DSC (MicroCal Inc., Piscataway, NJ, EE.UU.) equipado con un automuestreador.

La temperatura de desnaturalización térmica, Td (°C), se tomó como la parte más alta del pico de desnaturalización (pico endotérmico mayor) en los termogramas (Cp vs. T) obtenidos después de calentar las soluciones de fitasa en acetato sódico 50 mM a pH 5,0 y 100 ppm de Tritón X a una tasa de calentamiento programada constante.

[0212] Las soluciones de muestra y de referencia (aprox. 0,5 ml) fueron preequilibradas térmicamente durante 10 minutos a 20 °C y la exploración de DSC se realizó entre 20 y 80 °C a una tasa de barrido de 200 K/hora.

El tratamiento de datos se realiza utilizando el software MicroCal Origin (versión 7.0383).

Las temperaturas de desnaturalización se determinaron con una precisión de aproximadamente /- 0,5°C.

Tabla 2. Termoestabilidad comparativa de las fitasas de Buttiauxella

Los experimentos de DSC muestran que la variante E54C/A101C/Q143C/I201C tiene una termoestabilidad aumentada significativa en comparación con la fitasa de Buttiauxella de referencia (AEH25051).

Ejemplo 4: perfil de temperatura

[0213] El perfil de temperatura (la actividad de fitasa como función de la temperatura) se determinó para la fitasa de Buttiauxella (número de acceso AEH25051 en GENESEQP) y sus variantes en el intervalo de temperaturas de 20-80°C esencialmente como se ha descrito anteriormente ("Determinación de la actividad de fitasa").

Sin embargo, las reacciones enzimáticas (100 microlitros de solución enzimática con contenido de fitasa 100 microlitros de sustrato) se realizaron en tubos PCR en vez de en placas de microtitulación.

Después de un periodo de reacción de 15 minutos a la temperatura deseada, los tubos fueron enfriados a 10°C durante 30 segundos y se transfirieron 150 microlitros de cada mezcla reactiva a una placa de microtitulación. Se añadieron 75 microlitros de reactivo de parada y la absorbancia a 405 nm se midió en un espectrofotómetro para placas de microtitulación.

Los resultados se resumen en la tabla 3. Los números dados para cada temperatura son la actividad relativa (en %) normalizada al valor a óptimo.

Tabla 3: perfiles relativos de temperatura

Para ambas variantes los perfiles de temperatura se desplazan hacia mayores temperaturas en comparación con el perfil de temperatura de la fitasa de referencia de Buttiauxella (AEH25051).

Ejemplo 5: rendimiento en pienso para animales en un modelo in vitro

[0214] El rendimiento de diferentes variantes de fitasa de la invención en pienso para animales se compara en un modelo in vitro al rendimiento de una proteína de referencia tal como la SEC ID N° 2.

El modelo in vitro simula las condiciones gastro-intestinales en un animal monogástrico y se correlaciona bien con los resultados obtenidos en ensayos animales in vivo.

La versión usada en este ejemplo simula el buche y el estómago de un pollo para consumo.

La comparación se realiza de la siguiente manera:

La actividad de fitasa en la muestra variante se determina tal como se describe en el ejemplo 1 bajo "Determinación de la actividad de fitasa".

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   1. Método para producir una variante de fitasa, donde:

   a) la variante de fitasa tiene al menos un 80 % de identidad con los aminoácidos 1-413 de la fitasa progenitora de la SEC ID N° 2, los aminoácidos 1-413 de la fitasa progenitora de la SEC ID N° 4 y/o los aminoácidos 1-413 de la fitasa progenitora de la SEC ID N° ⁶ cuando se alinean con la secuencia de aminoácidos respectiva utilizando el programa Needle con la matriz de sustitución BLOSUM62, una penalización de abertura de gap de 10,0, y una penalización de extensión de gap de 0,5; y

   b) el método comprende establecer al menos un puente disulfuro en comparación con la SEC ID N° 2, donde el número de puentes de disulfuro establecido es 1, 2 o 3,

   donde dicho puente de disulfuro no está entre los cuatro de origen natural en las posiciones 79/110,135/410,180/189 y 384/393

   donde el un puente disulfuro está establecido en la posición F) 61C/102C;

   donde los dos puentes disulfuro establecidos usan las siguientes combinaciones de pares de posición: A+F, B+F, C+F, D+F, E+F y F+G, donde A significa 143C/201C, B significa 33C/179C, C significa 54C/101C, D significa 93C/48C, E significa 33C/178C, F significa 61C/102C y G significa 164C/251C;

   donde los tres puentes disulfuro establecidos usan las combinaciones siguientes de pares de posiciones:

   A+B+F, A+C+F, A+D+F, A+E+F, A+F+G, B+C+F, B+D+F, B+E+F, B+F+G, C+D+F, C+E+F, C+F+G, D+E+F, D+F+G y E+F+G, donde A significa 143C/201C, B significa 33C/179C, C significa 54C/101C, D significa 93C/48C, E significa 33C/178C, F significa 61C/102C y G significa 164C/251C,

   y donde la variante tiene una termoestabilidad mejorada y^{/ 0} perfil de temperatura mejorado en comparación con la fitasa progenitora.

   2. Método de producción de una variante de fitasa según la reivindicación 1, donde el número de puentes disulfuro establecido es 1 y donde el puente disulfuro está establecido en la posición F) 61C/102C.

   3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 que comprende además una modificación en al menos una posición seleccionada de las siguientes: 1, 9, 10, 18, 22, 25, ^{2 6} , 37, 38, ^{6 6} , 71, 81, 89, 92, 94, 109, 111, 119, 120, 121, 131, 134, 141, 142, 144, 152, 155, 160, 164, 171, 176, 178, 188, 190, 192, 193, 206, 207, 209, 211, 214, 215, 219, 222, 239, 235, 243, 245, 248, 253, 255, 256, 257, 260, 261, 268, 270, 277, 283, 285, 287, 288, 293, 296, 303, 306, 307, 308, 314, 318, 328, 337, 345, 350, 364, 371, 372, 396, 399, 406 y/o 413.

   4. Método según cualquiera la reivindicación 3, que comprende una modificación adicional seleccionada de las siguientes:

   N1S, S1N, I9V, V9I, V10I, K26E, N37Y, T38S, S38T, E^{6 6} Q, Q^{6 6} E, K71Q, Q71K, T81A, A81T, A89T, D92E,

   E109Q, H111G, D119N, I120L, K121E, T134I, T134V, R141Q, Q141R, V142L, L142V, T144I, T152M,

   M152T, E155D, D155E, H160R, S164F, F164S, T171I, T176K, A178P, S188N, D190E, A192G, G192A,

   L193Q, K207E, K207T, A209S, D211C, I214V, V214I, A235V, K239N, N239K, E245D, D245E, E248S,

   E248L, S248L, S248E, A255T, T255A, V255A, V255T, Q256H, Q256Y, A261 E, R268A, R268T, A268R,

   A268T, T268A, T268R, N270K, A277T, T277A, D283N, D283E, E283N, E283D, N283D, N283E, N285K,

   K285N, D287T, T287D, A288E, A288V, V288E, V288A, E288A, E288V, D293G, P296S, S296P, I303L,

   I303F, L303F, F303L, L303I, S314A, A314S, N318D, I337V, V337I, S345A, A345S, V350I, I350V, A364S,

   A364S, S364A, K371N, N371K, E372Q, E372Q, Q372E, P396S, S396P, T399K, K399T, E406V, V406E,

   P413Q y/o Q413P y/o de las siguientes combinaciones D92E/H160R, A261E/N270K, T134I/K207T,

   D190E/K207E/N318D, T134I/K207T/A261 E/N270K, T134I/K207E/A209S/A261 E/N270K,

   A89T/T134I/F164S/T176K/A178P/K207E/A261 E/N270K,

   A89T/T134I/F164S/T176K/A178P/K207E/A209S/S248L/Q256Y/A261E/N270K,

   A89T/D92E/H160R/F164S/T176 K/A178P/S188N/G192A/K207E/A261 E/N270K,

   D92E/T134I/H160R/F164S/T170I/T76K/A188P/K207E/A235V/Q256H/A261E/N270K, A89T/T134I/H160R/F164S/T170I/T76K/A188P/K207E/A235V/Q256H/A261E/N270K/I303F, y/o N37Y/D92E/T134I/H160R/F164S/T171I/T176K/A188P/K207E/A235V/Q256H/A261 E/N270K.

   5. Método según la reivindicación 1, donde la parte madura de la fitasa de la SEC ID N° 2, la SEC ID N° 4 o la SEC ID N° ⁶ , o una parte madura de cualquiera de las siguientes secuencias de GENESEQP: AEH25051(SEC ID N° 7), AEH25056(SEC ID N° ⁸ ), AEH25057(SEC ID N° 9), AEH25058(SEC ID N° 10), AEH25059(SEC ID N° 11), AEH25060(SEC ID N° 12), AEH25061(SEC ID N° 13), AEH25062(SEC ID N° 14), AEH25063(SEC ID N° 15), AEH25064(SEC ID N° 16), AEH25065(SEC ID N° 17), AEH25066(SEC ID N° 18), AEH25067(SEC ID N° 19), AEH25068(SEC ID N° 20), AEH25069(SEC ID N° 21), AEH25070(SEC ID N° 22), AEH25071(SEC ID N° 23), AEH25072(SEC ID N° 24), AEH25073(SEC ID N° 25), AEH25074(SEC ID N° 26), AEH25075(SEC ID N° 27) o AEH25076(SEC ID N° 28) se usa como progenitora/esqueleto para producir una variante de fitasa.

   ⁶. Variante de fitasa, donde la variante

   a) tiene al menos un 80 % de identidad con los aminoácidos 1-413 de la fitasa progenitora SEC ID N° 2, los aminoácidos 1-413 de la fitasa progenitora de la SEC ID N° 4 y/o los aminoácidos 1-413 de la fitasa progenitora de la SEC ID N° ⁶ cuando se alinean con la secuencia de aminoácidos respectiva utilizando el programa Needle con la matriz de sustitución BLOSUM62, una penalización de abertura de gap de 10,0y una penalización de extensión de gap de 0,5;y

   b) comprende 1,2 o 3 puentes disulfuro establecidos en comparación con laSEC ID N° 2, donde dicho puente disulfuro no está entre los cuatro de origen natural en las posiciones 79/110,135/410,180/189 y 384/393,

   donde elpuente disulfuroestablecido está en laposición F)61C/102C,

   donde los dos puentes disulfuro establecidos usan las siguientes combinaciones de pares de posiciones: A+F, B+F, C+F, D+F, E+F y F+G, donde A significa 143C/201C, B significa 33C/179C, C significa 54C/101C, D significa 93C/48C, E significa 33C/178C, F significa 61C/102C y G significa 164C/251C; donde lostres puentes disulfuro establecidos usan lassiguientes combinaciones de pares de posición:A+B+F, A+C+F, A+D+F, A+E+F, A+F+G, B+C+F, B+D+F, B+E+F, B+F+G, C+D+F, C+E+F, C+F+G, D+E+F, D+F+G y E+F+G, donde A significa 143C/201C, B significa 33C/179C, C significa 54C/101C, D significa 93C/48C, E significa 33C/178C, F significa 61C/102C y G significa 164C/251C; y donde la variante tiene una termoestabilidad mejorada y/o el perfil de temperatura mejorado como en comparación con lafitasaprogenitora.

   7. Variante de fitasasegún lareivindicación 6, donde elnúmero de puentes disulfuro establecido es 1y donde el puente disulfuroestá establecido en laposición F)61C/102C.

   8. Variante de fitasa, según la reivindicación 6, comprende además la modificación en al menos una posición seleccionada de las siguientes: 1, 9, 10, 18, 22, 25, 26, 37, 38, 66, 71, 81, 89, 92, 94, 109, 111, 119, 120, 121, 131, 134, 141, 142, 144, 152, 155, 160, 164, 171, 176, 178, 188, 190, 192, 193, 206, 207, 209, 211, 214, 215, 219, 222, 239, 235, 243, 245, 248, 253, 255, 256, 257, 260, 261, 268, 270, 277, 283, 285, 287, 288, 293, 296, 303, 306, 307, 308, 314, 318, 328, 337, 345, 350, 364, 371, 372, 396, 399, 406 y/o413.

   9. Variante de fitasa, según las reivindicaciones 6 a 8, que comprende otra modificación seleccionada de las siguientes:

   N1S, S1N, I9V, V9I, V10I, K26E, N37Y, T38S, S38T, E66Q, Q66E, K71Q, Q71K, T81A, A81T, A89T, D92E, E109Q, H111G, D119N, I120L,K121E,T134I, T134V, R141Q, Q141R, V142L, L142V, T144I, T152M, M152T, E155D, D155E, H160R, S164F,F164S, T171I, T176K, A178P, S188N, D190E, A192G, G192A, L193Q, K207E, K207T, A209S, D211C, I214V, V214I, A235V, K239N, N239K, E245D, D245E,E248S, E248L, S248L, S248E, A255T, T255A, V255A, V255T, Q256H, Q256Y, A261E, R268A, R268T, A268R, A268T, T268A, T268R, N270K, A277T, T277A, D283N, D283E, E283N, E283D, N283D, N283E, N285K, K285N, D287T, T287D, A288E, A288V, V288E, V288A, E288A, E288V, D293G, P296S, S296P, I303L, I303F, L303F, F303L, L303I, S314A, A314S, N318D, I337V, V337I, S345A, A345S, V350I, I350V, A364S, A364S, S364A, K371N, N371K, E372Q, E372Q, Q372E, P396S, S396P, T399K, K399T, E406V, V406E, P413Q y/o Q413P y/o de las siguientes combinaciones D92E/H160R, A261E/N270K, T134I/K207T, D190E/K207E/N318D, T134I/K207T/A261E/N270K, T134I/K207E/A209S/A261E/N270K,

   A89T/T134I/F164S/T176K/A178P/K207E/A261E/N270K, A89T/T134I/F164S/T176K/A178P/K207E/A209S/S248L/Q256Y/A261 E/N270K, A89T/D92E/H160R/F164S/T176K/A178P/S188N/G192A/K207E/A261E/N270K, D92E/T134I/H160R/F164S/T170I/T176K/A188P/K207E/A235V/Q256H/A261 E/N270K, A89T/T134I/H160R/F164S/T170I/T176K/A188P/K207E/A235V/Q256H/A261E/N270K/1303F,y/o N37Y/D92E/T134I/H160R/F164S/T171I/T176K/A188P/K207E/A235V/Q256H/A261E/N270K.

   10. Polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la variante de fitasa según la reivindicación 6.

   11. Constructo de ácido nucleico que comprende el polinucleótido según la reivindicación 10 operativamente enlazado a una o varias secuencias de control que dirige la producción del polipéptido en un huésped de expresión.

   12. Vector de expresión recombinante que comprende elconstructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 11.

   13. Célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 10 y/oelvectorde expresión según lareivindicación 12.

   14. Método para producirlavariante de fitasasegún lareivindicación6,que comprende

   (a) cultivarlacélula huésped según lareivindicación 13 para producir un sobrenadante que comprende lafitasa;y

   (b)recuperarlafitasa.

   15. Composición que comprende almenos una variante de fitasasegún lareivindicación6 y

   (a)almenos una vitamina liposoluble;

   (b)almenos una vitamina hidrosoluble; y/o

   (c)almenos un oligoelemento.

   16. Composición según la reivindicación 15 que comprende además al menos una enzima seleccionada del grupo siguiente de enzimas: amilasa, fitasa, fosfatasa, xilanasa, galactanasa, alfa-galactosidasa, proteasa, fosfolipasay/o beta-glucanasa.

   17. Composición según cualquiera de lasreivindicaciones 15 y 16 que es un aditivode pienso de animales. 18. Método para mejorar el valor nutricional de un pienso para animales, donde lavariante de fitasa según la reivindicación 6 se añade alpienso.

   19. Uso de lavariante de fitasasegún lareivindicación 6 o lacomposición de cualquiera de las reivindicaciones 15-17 en pienso para animales; en la preparación de pienso para animales; para mejorar elvalor nutricional de pienso para animales; para reducir los niveles de fitato en abono animal; para el tratamiento de proteínas vegetales; o para liberarfósforode un sustrato de fitasa.

   20. Método para producir un producto de fermentación que comprende fermentar un material de carbohidratos en presencia de lavariante de fitasasegún lareivindicación 6.

   21. Método para producir etanol que comprende fermentar un material de carbohidratos en presencia de la variante de fitasasegún lareivindicación6 y produciretanol.