BR112012023822B1 - métodos para produzir um variante de fitase, para melhorar o valor nutricional de uma ração animal, para o tratamento de proteínas vegetais, para sintetizar um produto de fermentação, e para produzir etanol, variante de fitase, polinucleotídeo, construto de ácido nucleico, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira recombinante, planta transgênica ou parte da planta, composição, processo para reduzir os níveis de fitase no esterco animal, e, uso do variante de fitase ou da composição na ração animal - Google Patents

Abstract

métodos para produzir um variante de fitase, para melhorar o valor nutricional de uma ração animal, para o tratamento de proteínas vegetais, para sintetizar um produto de fermentação, e para produzir etanol, variante de fitase, polinucleotídeo, construto de ácido nucleico, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira recombinante, planta transgênica ou parte a planta, composição, processo para reduzir os níveis de fitase no esterco animal, e, uso do variante de fitase ou da composição na ração animal a presente invenção refere-se a um método para produzir variantes de fitase que apresentam pelo menos 70% de identidade com uma fitase derivada de buttiauxella, e compreendem pelo menos uma ligação dissulfeto adicional comparado a esta fitase. estes variantes de fitase modificaram, preferivelmente melhoraram, propriedades tais como termoestabilidade, perfil de temperatura, perfil de ph, atividade específica, desempenho na ração animal, menor sensibilidade à protease e/ou um padrão de glicosilação modificado. a invenção também se refere aos variantes produzidos, dna que codifica estas fitases, métodos de sua produção, bem como o uso destes, por exemplo, na ração animal e em aditivos de ração animal.

Description

“MÉTODOS PARA PRODUZIR UM VARIANTE DE FITASE, PARA MELHORAR O VALOR NUTRICIONAL DE UMA RAÇÃO ANIMAL, PARA PRODUZIR UM PRODUTO DE FERMENTAÇÃO E PARA PRODUZIR ETANOL, VARIANTE DE FITASE, COMPOSIÇÃO, E, USO DO VARIANTE DE FITASE OU DE UMA COMPOSIÇÃO”

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

Este pedido contém uma listagem de sequência na forma legível em computador. A forma legível em computador é aqui incorporada pela referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a um método para produzir um variante de fitase a partir de uma fitase parental, que apresenta pelo menos 70 % de identidade com aminoácidos 1-413 de SEQ ID NO:2, aminoácidos 1-413 de SEQ ID NO:4 e/ou aminoácidos 1-413 de SEQ ID NO:6, quando alinhado à respectiva sequência de aminoácidos usando o programa Needle, com a matriz de substituição BLOSUM62, uma penalidade de abertura de intervalo de 10,0 e uma penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e compreende o estabelecimento de pelo menos uma ponte dissulfeto que não está entre as quatro pontes dissulfeto de ocorrência natural, comparado a este e a fitases muito relacionadas (isto é, é um variante desta). A invenção também se refere aos variantes produzidos e DNA que codificam estes, bem como o uso destes, por exemplo, na ração animal e aditivos de ração animal.

Petição 870200007787, de 16/01/2020, pág. 7/10

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Fundamentos da técnica

As fitases são enzimas bem conhecidas, uma vez que é vantajoso a adição das mesmas aos produtos alimentícios para animais, incluindo humanos. As fitases foram isoladas de várias fontes, incluindo inúmeras cepas fúngicas e bacterianas.

E um objetivo da presente invenção fornecer polipeptídeos alternativos com atividade de fitase (fitases) e polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos. Os variantes de fitase da invenção exibem propriedades modificadas ou alteradas, preferivelmente melhoradas, comparados à fitase parental. Exemplos não limitantes de tais propriedades são: Estabilidade (tais como estabilidade ao ácido, estabilidade ao calor, estabilidade ao vapor, estabilidade à pelotização e/ou estabilidade à protease, em particular estabilidade à pepsina), perfil de temperatura, perfil de pH, atividade específica, especificidade ao substrato, desempenho na ração animal (tal como uma melhor liberação e/ou degradação de fitase), susceptibilidade à glicação e/ou padrão de glicosilação.

Da maneira aqui descrita, a mutagênese de um polinucleotídeo parental que codifica uma fitase é empregada para preparar DNAs variantes (sintéticos) que codificam uma fitase com melhores propriedades com relação à fitase codificada pelo polinucleotídeo parental.

Inúmeras estruturas tridimensionais de fitases do tipo fosfato de histidina ácida (HAP) são conhecidas, (por exemplo Lim et al. Nature struct, biol. 7, 108-113 (2000)). A partir destas, observa-se que todas apresentam quatro pontes dissulfeto localizadas nos pares de posição 77/108 133/407 178/187 381/390 (de acordo com a numeração aqui usada). Tipicamente, estas ocupam todas as cisteínas presentes na molécula. Buttiauxella

WO 2006/043178 revela uma fitase de Buttiauxella PI-29 (depositada como NCI MB 41248) que apresenta a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:3 em WO 2006/043178, bem como certos variantes desta. A sequência de uma fitase tipo selvagem de Buttiauxella e de inúmeros variantes desta foram submetidos à base de dados GENESEQP com os seguintes números de acesso: AEH25051, AEH25056, AEH25057, AEH25058, AEH25059, AEH25060, AEH25061, AEH25062, AEH25O63, AEH25064, AEH25065, AEH25066, AEH25067, AEH25068, AEH25069, AEH25070, AEH25071, AEH25072, AEH25073, AEH25074, AEH25075 e AEH25076. Estas fitases apresenta todas um percentual de identidade com qualquer uma de SEQ ID Nos:2, 4 e 6 acima de 70 %.

A sequência de uma fitase de Obesumbacterium proteus foi submetida à base de dados UNIPROT com o número de acesso Q6U677. Esta fitase, que também é descrita por Zinin et al., em FEMS Microbiology Fetters, vol. 236, pp. 283-290, 2004, apresenta um percentual de identidade com SEQ ID Nos:2, 4 e 6 acima de 70 %.

WO 2008/192901 revela as fitases de Buttiauxella gaviniae DSM18930, Buttiauxella agrestis DSM18931 e Buttiauxella agrestis DSM18932, e inúmeros variantes destas. Estas fitases são fornecidas em SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:6 aqui.

W02008097619 revela também variantes de fitase derivados de Buttiauxella sp cepa P 1-29, especialmente o variante determinado BP-11 e alguns variantes deste.

WO 20091100183 revela mais variantes derivados da fitase de Buttiauxella sp PI-29 ou do variante BP-11.

Descrição Resumida dos Desenhos e Listagem De Sequência

A figura 1 mostra um alinhamento múltiplo da parte madura esperada de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:6, junto com as sequências com os seguintes números de acesso de GENESEQP: AEH25051, AEH25056, AEH25057, AEH25058, AEH25059, AEH25060, AEH25061,

AEH25062, AEH25063, AEH25064, AEH25065, AEH25066, AEH25067, AEH25068, AEH25069, AEH25070, AEH25071, AEH25072, AEH25073, AEH25074, AEH25075 e AEH25076. O alinhamento foi realizado usando o método Clustal método (Higgins, 1989, CABIOS 5: 151-153), usando o software LASERGENE™ MEGALIGN™ (DNASTAR, Inc., Madison, WI) com uma tabela de identidade e os seguintes parâmetros de alinhamento múltiplo: penalidade de intervalo 10 e penalidade de tamanho de intervalo de 10. Os parâmetros de alinhamento aos pares são Ktuplo=l, penalidade de intervalo =3, janelas=5 e diagonais=5.

A figura 2 mostra um alinhamento do número de acesso de Q6U677 da UNIPROT com aminoácidos 1- 413 de SEQ ID NO:2. O alinhamento foi realizado usando o programa needle, com a matriz BLOSUM62, uma penalidade de início de intervalo de 10,0 e uma penalidade de extensão de intervalo de 0,5.

Na listagem de sequência, são aplicadas as sequências a seguir:

SEQ ID NO:1	Buttiauxella gaviniae DSM18930
SEQ ID NO:2	Buttiauxella gaviniae DSM18930
SEQ ID NO:3	Buttiauxella agrestis DSM18931
SEQ ID NO:4	Buttiauxella agrestis DSM18931
SEQ ID NO:5	Buttiauxella agrestis DSM18932
SEQ ID NO:6	Buttiauxella agrestis DSM18932

SUMÁRIO DE EXEMPLOS

Na especificação, os seguintes exemplos são fornecidos:

Exemplo 1: Preparação de variantes e determinação da atividade.

Exemplo 2: Atividade específica.

Exemplo 3: Termoestabilidade por DSC.

Exemplo 4: Perfil de temperatura.

Exemplo 5: Desempenho na ração animal em um modelo in vitro.

Exemplo 6: Desempenho em um teste com porco in vivo.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a um método para produzir um variante de fitase a partir de uma fitase parental que:

a) apresenta pelo menos 70 % de identidade com aminoácidos 1-413 de SEQ ID NO:2, aminoácidos 1-413 de SEQ ID NO:4, e/ou aminoácidos 1-413 de SEQ ID NO:6 quando alinhado à respectiva sequência de aminoácidos, usando o programa Needle com a matriz de substituição BLOSUM62, uma penalidade de abertura de intervalo de 10,0 e uma penalidade de extensão de intervalo de 0,5; e

b) compreende o estabelecimento de pelo menos uma ponte dissulfeto comparado à SEQ ID NO:2, em que a dita ponte dissulfeto não está entre aquelas quatro de ocorrência natural nas posições 79/110, 135/410, 180/189 e 384/393.

O percentual de identidade é determinado da maneira descrita na seção Polipeptídeos de fitase, percentual de identidade.

Os números da posição referem-se à numeração da posição de SEQ ID NO:2, da maneira descrita na seção Numeração da posição. As posições que correspondem a estes números da posição de SEQ ID NO:2 em outras fitases são determinadas da maneira descrita na seção Identificação de números da posição correspondente.

A pelo menos uma ponte dissulfeto é estabelecida em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste nos pares de posição: A) 143C/201 C, B) 33C/179C, C) 54C/101 C, D) 93C/48C, E) 33C/178C, F) 61 C/102CeG) 164C/251C.

De acordo com a invenção, uma primeira ponte dissulfeto é preferivelmente estabelecida no par da posição A, entre os resíduos nas posições 143 e 201, e uma segunda ponte dissulfeto é estabelecida no par da posição B, entre os resíduos nas posições 33 e 179.

Em certas modalidades, o número de pontes dissulfeto estabelecido é 2, 3, 4, 5, 6 e/ou 7.

Quando o número de pontes dissulfeto estabelecido é dois, as seguintes combinações de pares de posição podem ser criadas: A+B, A+C, A+D, A+E, A+F, A+G, B+C, B+D, B+E, B+F, B+G, C+D, C+E, C+F, C+G, D+E, D+F, D+G, E+F, E+G e F+G.

Quando o número de pontes dissulfeto estabelecido é três, as seguintes combinações de pares de posição podem ser criadas: A+B+C, A+B+D, A+B+E, A+B+F, A+B+G, A+C+D, A+C+E, A+C+F, A+C+G,

A+D+E, A+D+F, A+D+G, A+E+F, A+E+G, A+F+G, B+C+D, B+C+E,

B+C+F, B+C+G, B+D+E, B+D+F, B+D+G, B+E+F, B+E+G, B+F+G,

C+D+E, C+D+F, C+D+G, C+E+F, C+E+G, C+F+G, D+E+F, D+E+G,

D+F+G e E+F+G.

Quando o número de pontes dissulfeto estabelecido é quatro, as seguintes combinações de pares de posição podem ser criadas: A+B+C+D, A+B+C+E, A+B+C+F, A+B+C+G, A+B+D+E, A+B+D+F, A+B+D+G, A+B+E+F, A+B+E+G, A+B+F+G, A+C+D+E, A+C+D+F, A+C+D+G, A+C+E+F, A+C+E+G, A+C+E+H, A+C+F+G, A+D+E+F, A+D+E+G, A+D+F+G, A+E+F+G, B+C+D+E, B+C+D+F, B+C+D+G, B+C+E+F, B+C+E+G, B+C+F+G, B+D+E+F, B+D+E+G, B+ D+ F+ G, B+ E+ F+G, C+ D+ E+ F, C+ D+ E+ G, C+ D+ F+G, C+ E+ F+G, C+ E+ F+ H e D+E+F+G.

Quando o número de pontes dissulfeto estabelecido é cinco, as seguintes combinações de pares de posição podem ser criadas: A+B+C+D+E, A+B+C+D+F, A+B+C+D+G, A+B+C+E+F, A+B + C + E + G,A+B + C + F + G, A+ B + D + E + F, A+ B + D + E + G, A+ B + D + F + G, A+ B + E + F + G, A+ B + F + G + H, A+C + D + E + F, A+C + D + E + G, A+C + D + F + G, A+C + E + F + G, A+D + E + F + G, B+C+D+E+F, B+C+D+E+G, B+C+D+F+G, B+C+E+F+G, B+D+E+F+G e C+D+E+F+G.

Quando o número de pontes dissulfeto estabelecido é seis, as seguintes combinações de pares de posição podem ser criadas: A+B+C+D+E+F, A+B+C+D+E+G, A+B+C+D+F+G, A+B+C+E+F+G, A+B+D+E+F+G, A+C+D+E+F+G e B+C+D+E+F+G.

Quando o número de pontes dissulfeto estabelecido é sete, a seguinte combinação de pares de posição pode ser criada: A+B+C+D+E+F+G.

Em todas as combinações anteriores, A significa 143C/201C, B significa 33C/179C, C significa 54C/101C, D significa 93C/48C, E significa 33C/178C, F significa 61C/102C e G significa 164C/251C.

De acordo com o método da invenção, o variante de fitase pode compreender adicionalmente pelo menos uma modificação em pelo menos uma posição selecionada a partir do seguinte: 1,9, 10, 18, 22, 25, 26, 37, 38, 66, 71, 81, 89, 92, 94, 109, 111, 119, 120, 121, 131, 134, 141, 142,

144, 152, 155, 160, 164, 171, 176, 178, 188, 190, 192, 193, 206, 207,209,

211, 214, 215, 219, 222, 239, 235, 243, 245, 248, 253, 255, 256, 257,260,

261, 268, 270, 277, 283, 285, 287, 288, 293, 296, 303, 306, 307, 308,314,

318, 328, 337, 345, 350, 364, 371, 372, 396, 399, 406 e/ou 413.

A invenção fornece adicionalmente que as modificações anteriores são escolhidas especificamente a partir das seguintes modificações: IS, 91, 101, RI8, R22, T25, 26E, 37Y, 38S, 66E, 71K, 81 A, 89T, 92E, R94, 109Q, 111G, 119N, 120L, 121 E, K131, 1341, 134V, 141R, 142L, T144,

152M, 155E, 160R, 164F, 1711, 176K, 178P, 188N, 190E, 192G,193Q,

N206, 207E, 207T, 209S, 211C, 214V, G215, T219, E222, 239K,235V,

E243, 245D, 248E, 248L, 248S, H253, 255A, 255T, 256H, 256Y,F257,

M260, 261 E, 268A, 268T, 270K, 277T, 283E, 283D, 285K, 287D, 288V, 288A, 293G, 296S, 303L, 303F, H306, D307, T308, 314A, 314S, 318D, D328, 3371, 345A, 3501, 364A, 371K, 372E, 396P, 399K, 406E e/ou 413P.

Em modalidades específicas da invenção, as pontes dissulfeto adicionais são selecionadas do grupo que compreende: Q143C/I201C,

D33C/W179C, E54C/A101C, Q93C/Y48C, D33C/A178C, G61C/F102C e F164C/K251C.

Em modalidades específicas adicionais do método da invenção, as modificações específicas adicionais são: N1S, SIN, I9V, V9I, V10I, K26E, N37Y, T38S, S38T, E66Q, Q66E, K71Q, Q71K, T81A, A81T, A89T, D92E, E109Q, H111G, D119N, I120L, K121E, T134I, T134V, R141Q, Q141R, V142L, L142V, Tl441, T152M, M152T, E155D, D155E, H160R, S164F, F164S, T171I, T176K, A178P, S188N, D190E, A192G, G192A, L193Q, K207E, K207T, A209S, D211C, 1214V, V214I, A235V, K239N, N239K, E245D, D245E, E248S, E248L, S248L, S248E, A255T, T255A, V255A, V255T, Q256H, Q256Y, A261E, R268A, R268T, A268R, A268T, T268A, T268R, N270K, A277T, T277A, D283N, D283E, E283N, E283D, N283D, N283E, N285K, K285N, D287T, T287D, A288E, A288V, V288E, V288A, E288A, E288V, D293G, P296S, S296P, I303L, I303F, L303F, F303L, L303I, S314A, A314S, N318D, I337V, V337I, S345A, A345S, V350I, I350V, A364S, A364S, S364A, K371N, N371K, E372Q, E372Q, Q372E, P396S, S396P, T399K, K399T, E406V, V406E, P413Q, e/ou Q413P, e/ou a partir das seguintes combinações D92E/H160R, A261E/N270K, T134I/K207T, D190E/K207E/N318D,

T134I/K207T/A261E/N270K, T134I/K207E/A209S/A261E/N270K,

A89T/T134I/F164S/T176K/A178P/K207E/A261E/N270K,

A89T/T134I/F164S/T176K/A178P/K207E/A209S/S248L/Q256Y/A261E/N2 70K, A89T/D92E/H160R/F164S/T176K/A178P/S188N/G192A/K207E/A261 E/N270K,

D92E/T134I/H160R/F164S/T170I/T176K/A188P/K207E/A23 5V/Q256H/A2 61E/N270K,

A89T/T134I/H160R/F164S/T170I/T176K/A188P/K207E/A235V/Q256H/A2 61E/N270K/I303F, e/ou

N37Y/D92E/T134I/H160R/F164S/T1711/T176K/A188P/K207E/A235V/Q25

6H/A261 E/N270K.

O método da invenção pode ser usado para criar um variante de qualquer fitase tipo selvagem ou variante. Em modalidades particulares, produz um variante da parte madura da fitase de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, ou SEQ ID NO:6, ou uma parte madura de qualquer uma das seguintes sequências de GENESEQP: AEH25051, AEH25056, AEH25057, AEH25058, AEH25059, AEH25060, AEH25061, AEH25062, AEH25063, AEH25064, AEH25065, AEH25066, AEH25067, AEH25068, AEH25069, AEH25070, AEH25071, AEH25072, AEH25073, AEH25074, AEH25075, ou AEH25076, que é usada como um parental/parte principal para produzir um variante de fitase.

O método da invenção pode fornecer um variante de fitase com melhores propriedades, tais como termoestabilidade, estabilidade ao calor, estabilidade ao vapor, perfil de temperatura, estabilidade à pelotização, estabilidade ao ácido, perfil de pH e/ou estabilidade à protease, em particular estabilidade à pepsina, atividade específica, especificidade ao substrato, desempenho na ração animal (tal como uma melhor liberação e/ou degradação de fitase), susceptibilidade à glicação e/ou padrão de glicosilação. Os variantes fornecidos pela invenção exibem especialmente melhores propriedades térmicas, tais como termoestabilidade, estabilidade ao calor, estabilidade ao vapor, perfil de temperatura, estabilidade à pelotização ou melhor desempenho na ração animal.

O método da invenção se refere , assim, aos variantes de fitase com melhores propriedades térmicas, tais como termoestabilidade, estabilidade ao calor, estabilidade ao vapor, perfil de temperatura e/ou estabilidade à pelotização.

O método da invenção se refere , assim, aos variantes de fitase com melhor termoestabilidade.

O método da invenção se refere , assim, aos variantes de fitase com melhor estabilidade ao calor.

O método da invenção se refere , assim, aos variantes de fitase com melhor estabilidade ao vapor.

O método da invenção se refere , assim, aos variantes de fitase com melhor perfil de temperatura.

O método da invenção se refere , assim, aos variantes de fitase com melhor estabilidade à pelotização.

O método da invenção se refere , assim, aos variantes de fitase com melhor estabilidade ao ácido.

O método da invenção se refere , assim, aos variantes de fitase com melhor perfil de pH.

O método da invenção se refere , assim, aos variantes de fitase com melhor estabilidade à protease, em particular estabilidade à pepsina.

O método da invenção se refere , assim, aos variantes de fitase com melhor atividade específica.

O método da invenção se refere , assim, aos variantes de fitase com melhor especificidade ao substrato.

O método da invenção se refere , assim, aos variantes de fitase com melhor desempenho na ração animal (tal como uma melhor liberação e/ou degradação de fitase).

O método da invenção se refere , assim, aos variantes de fitase com melhor susceptibilidade à glicação.

O método da invenção se refere , assim, aos variantes de fitase com melhor e/ou padrão de glicosilação.

A invenção se refere adicionalmente a polinucleotídeo que compreende sequências de nucleotídeos que codificam os variantes de fitase produzidos pelo método, construtos de ácido nucleico compreendendo os polinucleotídeos operavelmente ligados a uma ou mais sequências controle que direcionam a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão, vetores de expressão recombinante compreendendo tais construtos de ácido nucleico e células hospedeiras recombinantes compreendendo um construto de ácido nucleico e/ou um vetor de expressão.

A invenção se refere adicionalmente a métodos para produzir variantes de fitase, da maneira fornecida, compreendendo:

(a) cultivar uma célula hospedeira para produzir um sobrenadante compreendendo a fitase; e (b) recuperar a fitase.

A invenção se refere adicionalmente a plantas transgênicas, ou parte da planta, capaz de expressar os variantes de fitase, composições compreendendo pelo menos um variante de fitase e (a) pelo menos uma vitamina solúvel em gordura; (b) pelo menos uma vitamina solúvel em água; e/ou (c) pelo menos um mineral traço. Tais composições podem compreender adicionalmente pelo menos uma enzima selecionada dos seguintes grupos de enzimas: amilase, fitase, fosfatase, xilanase, galactanase, alfa-galactosidase, protease, fosfolipase e/ou beta-glucanase. As composições podem ser aditivos de ração animal, que podem apresentar um teor bruto de proteína de 50 a 800 g/kg, e compreendem um variante de fitase da invenção.

A invenção se refere adicionalmente a métodos para melhorar o valor nutricional de uma ração animal, adicionando um variante de fitase da invenção à ração, processos para reduzir os níveis de fitase no esterco animal alimentando um animal com uma quantidade eficiente da ração, métodos para o tratamento de proteínas vegetais, compreendendo a etapa de adicionar um variante de fitase em pelo menos uma proteína vegetal e o uso de um variante de fitase de uma composição da invenção.

A invenção também fornece um método para sintetizar um produto de fermentação tais como, por exemplo, etanol, cerveja, vinho, compreendendo fermentar um material com carboidrato na presença de um variante de fitase, um método para produzir etanol compreendendo fermentar um material com carboidrato na presença de um variante de fitase e produzir etanol.

Polipeptídeos de fitase, percentual de identidade

No presente contexto, uma fitase é um polipeptideo com atividade de fitase, isto é, uma enzima que catalisa a hidrólise de fitase (mioinositol hexaquisfosfato) em (1 ) mio-inositol e/ou (2) mono-, di-, tri-, tetrae/ou pentafosfatos deste, e (3) fosfato inorgânico.

No presente contexto, o termo um substrato de fitase inclui, i.a., ácido fitico e qualquer fitase (sal de ácido fítico), bem como os fosfatos listados anteriormente em (2).

O site ENZYME na internet (http://www.expasy.ch/enzyme/) é um depósito de informação com relação à nomenclatura de enzimas. Baseiase principalmente nas recomendações do Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUB-MB), e e descreve cada tipo de enzima caracterizada, para a qual um número EC (comissão de enzima) foi fornecido (Bairoch A. The ENZYME database, 2000, Nucleic Acids Res 28:304-305). Ver também o manual Enzyme Nomenclature da NC-IUBMB, 1992).

De acordo com o site ENZYME, três tipos diferentes de fitases são conhecidas: uma assim denominada 3-fitase (nome alternativo 1-fitase; um mio-inositol hexafosfato 3-fosfoidrolase, EC 3.1.3.8), uma assim denominada 4-fitase (nome alternativo 6-fitase, nome baseado no sistema de numeração 1L e não na numeração ID, EC 3.1.3.26) e uma assim denominada 5-fitase (EC 3.1.3.72). Com os propósitos da presente invenção, todos os três tipos são incluídos na definição de fitase.

Em uma modalidade particular, as fitases da invenção pertencem à família de fosfatases de histidina ácida, que inclui a fosfatase ácida de Escherichia coli pH 2,5 (gene appA), bem como fitases fungicas tais como as fitases de Aspergillus awamorii A e B (EC: 3.1.3.8) (gene phyA e phyB). As fosfatases de histidina ácida compartilham dias regiões de similaridade de sequência, cada qual centralizada em tomo de um resíduo de histidina conservado. Estas duas histidinas parecem estar envolvidas no mecanismo catalítico das enzimas. A primeira histidina está localizada na seção N-terminal e forma um intermediário de fósforo-histidina, enquanto a segunda está localizada na seção C-terminal e age possivelmente como doador de prótons.

Em uma modalidade particular adicional, as fitases da invenção apresentam um motivo de sítio ativo conservado, ou seja, R-H-G-XR-X-P, em que X determina qualquer aminoácido (ver aminoácidos 16 a 22 de SEQ ID Nos: 2, 3, 4, 6 e aminoácidos 38-44 de SEQ ID NO:9). Em uma modalidade preferida, o motivo de sítio ativo conservado é R-H-G-V-R-A-P, isto é, aminoácidos 16-22 (por referência a SEQ ID NO:2) são RHGVRAP.

Com os propósitos da presente invenção, a atividade de fitase é determinada na unidade de FYT, uma FYT sendo a quantidade de enzima que libera 1 micromol de ortofosfato inorgânico por minuto, nas seguintes condições: pH 5,5; temperatura 37 °C; substrato: fitato de sódio (CgHgC^PóNaiz) em uma concentração de 0,0050 mol/L. Os ensaios de fitase adequados são os ensaios FYT e FTU, descritos no exemplo 1 de WO 00/20569. FTU é para determinar atividade de fitase na ração e pré-mistura. A atividade de fitase também pode ser determinada usando os ensaios do exemplo 1 (Determinação da atividade da fosfatase ou Determinação da atividade de fitase).

Em uma modalidade particular, a fitase da invenção é isolada. O termo “isolado”, da maneira aqui usada, refere-se a um polipeptídeo que é pelo menos 20 % puro, preferivelmente pelo menos 40 % puro, mais preferivelmente pelo menos 60 % puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 80 % puro, acima de tudo preferivelmente pelo menos 90 % puro e ainda acima de tudo preferivelmente pelo menos 95 % puro, da maneira determinada por SDS-PAGE. Em particular, é preferível que os polipeptídeos estejam na forma essencialmente pura, isto é, que a preparação de polipeptídeo seja essencialmente livre de outro material com polipeptídeo com o qual está naturalmente associado. Isto pode ser realizado, por exemplo, preparando o polipeptídeo por meio de métodos recombinantes bem conhecidos ou por métodos de purificação clássica.

A relação entre duas sequências de aminoácidos é descrito pelo parâmetro identidade. Com propósitos da presente invenção, o alinhamento de duas sequências de aminoácidos é determinado usando o programa Needle do pacote EMBOSS (http://emboss.org) versão 2.8.0. O programa Needle implementa o algoritmo de alinhamento global descrito em Needleman, S. B. e Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453. A matriz de substituição usada é BLOSUM62, penalidade de abertura de intervalo é 10 e penalidade de extensão de intervalo é 0,5.

O grau de identidade entre uma sequência de aminoácidos da presente invenção (“sequência da invenção”), e a sequência de aminoácidos referida nas reivindicações (SEQ ID NO:2), é calculado como o número de combinações exatas em um alinhamento das duas sequências, dividido pelo tamanho da sequência da invenção, ou o tamanho da SEQ ID NO:2, não importando qual é a mais curta. O resultado é expresso em identidade percentual.

Uma combinação exata ocorre quando a sequência da invenção e SEQ ID NO:2 apresenta resíduos de aminoácidos idênticos nas mesmas posições da sobreposição (no exemplo de alinhamento a seguir disto é representado por |). O tamanho de uma sequência é o número de resíduos de aminoácidos na sequência (por exemplo, o tamanho de aminoácidos 1-411 de SEQ IDN0:2 é 411).

Em um exemplo de alinhamento puramente hipotético a seguir, a sobreposição é a sequência de aminoácidos HTWGER-NL da sequência 1; ou a sequência de aminoácidos HGWGEDANL da sequência 2. No exemplo, um intervalo é indicado por um exemplo de alinhamento hipotético:

Sequência 1: acmshtwger-nl

Sequência 2: hgwgedAnlamnps

Em uma modalidade particular, o percentual de identidade de uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo com a SEQ ID NO:2, ou nesta, é determinado i) alinhando as duas sequências de aminoácidos usando o programa Needle, com a matriz de substituição BLOSUM62, uma penalidade de abertura de intervalo de 10 e uma penalidade de extensão de intervalo de 0,5; ii) contando o número de combinações exatas no alinhamento; iii) dividindo o número de combinações exatas pelo tamanho das duas sequências de aminoácidos mais curtas e iv) convertendo o resultado da divisão de iii) em percentual.

No exemplo hipotético anterior, o número de combinações exatas é 6, o tamanho menor de uma das duas sequências de aminoácidos é 12; dessa maneira, o percentual de identidade é 50 %.

Em modalidades particulares da fitase da invenção, o grau de identidade com SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 e/ou SEQ ID NO:6 é pelo menos 70 %, 71%, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou pelo menos 99 %. Ainda em modalidades particulares adicionais, o grau de identidade é pelo menos 98,0 %, 98,2 %, 98,4 %, 98,6 %, 98,8 %, 99,0 %, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 99,4 %, 99,5 %, 99,6 %, 99,7 %, 99,8 %, ou pelo menos 99,9 %. Em modalidades alternativas, o grau de identidade é pelo menos 70 %, 71 %, 72 %, ou pelo menos 73 %.

Ainda em modalidades particulares adicionais, a fitase da invenção apresenta não mais que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou não mais que 10 modificações comparadas à SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 e/ou SEQ ID NO:6 ou qualquer outra fitase parental; não mais que 11, 12, 13, 14, 15, 16, 1 7, 18, 19, ou não mais que 20 modificações comparadas à SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 e/ou SEQ ID NO:6 ou qualquer outra fitase parental; não mais que 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou não mais que 30 modificações comparadas à SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 e/ou SEQ ID NO:6 ou qualquer outra fitase parental; não mais que 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ou não mais que 40 modificações comparadas à SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 e/ou SEQ ID NO:6 ou qualquer outra fitase parental; não mais que 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ou não mais que 50 modificações comparadas à SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 e/ou SEQ ID NO:6 ou qualquer outra fitase parental; não mais que 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, ou não mais que 60 modificações comparadas à SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 e/ou SEQ ID NO:6 ou qualquer outra fitase parental; não mais que 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, ou não mais que 70 modificações comparadas à SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 e/ou SEQ ID NO:6 ou qualquer outra fitase parental; não mais que 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, ou não mais que 80 modificações comparadas à SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 e/ou SEQ ID NO:6 ou qualquer outra fitase parental; não mais que 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, ou não mais que 90 modificações comparadas à SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 e/ou SEQ ID NO:6 ou qualquer outra fitase parental; não mais que 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou não mais que 100 modificações comparadas à SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 e/ou SEQ ID NO:6 ou qualquer outra fitase parental; não mais que 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, ou não mais que 110 modificações comparadas à SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 e/ou SEQ ID NO:6 ou qualquer outra fitase parental; não mais que 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, ou não mais que 120 modificações comparadas à SEQ ID NO:2 ou qualquer outra fitase parental; ou não mais que 121, 122, 123, ou 124 modificações comparadas à

SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 e/ou SEQ ID NO:6 ou qualquer outra fitase parental.

Numeração da posição

A nomenclatura aqui usada para definir posições de aminoácido baseia-se na sequência de aminoácidos da fitase madura de Buttiauxella gaviniae DSM 18930, que é fornecida na listagem de sequência como SEQ ID NO:2 (aminoácidos 1-413 de SEQ ID NO:2). Dessa maneira, no presente contexto, a base para numerar posições é SEQ ID NO:2, começando com NI e terminando com Q413. (SEQ ID NO:2) como o padrão para numerar a posição e, por meio disso, também para a nomenclatura.

Quando aqui usado, o termo parte “madura” (ou sequência) refere-se àquela parte do polipeptídeo que é secretada por uma célula que contém, como parte de seu equipamento genético, um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Em outras palavras, a parte madura do polipeptídeo refere-se àquela parte do polipeptídeo que permanece após a parte do peptideo sinal, bem como uma parte de pró-peptídeo, se nenhuma fora clivada. A parte do peptideo sinal pode ser prevista por programas conhecidos na técnica (por exemplo, SignalP). Em geral, o primeiro aminoácido da parte madura de uma enzima pode ser determinado por sequenciamento N-terminal da enzima purificada. Qualquer diferença entre a parte do peptideo sinal e a parte madura tem que ser em virtude da presença de um pró-peptídeo.

Modificações, tais como substituições, eliminações e inserções

Um variante de fitase pode compreender vários tipos de modificações com relação a um molde (isto é, uma referência ou sequência comparativa de aminoácidos tal como SEQ ID NO:2): Um aminoácido pode ser substituído por um outro aminoácido; um aminoácido pode ser eliminado; um aminoácido pode ser inserido; bem como qualquer combinação de quaisquer inúmeras tais modificações. No presente contexto, o termo inserção é pretendido para abranger também extensões N e/ou C-terminais.

A nomenclatura geral aqui usada para uma modificação simples é a seguinte: XDcY, onde X e Y determinam independentemente um código de aminoácido de uma letra, ou uma (eliminação de um aminoácido), D determina um número e c determina um contador 5 alfabético (a, b, c e assim por diante), que está presente apenas nas inserções.

E feita referência à tabela 1 a seguir, que descreve exemplos puramente hipotéticos de aplicar esta nomenclatura a vários tipos de modificações.

Tabela 1

Tipo	Descrição	Exemplo
Substituição	X= aminoácido no molde D= posição no molde C=vazio Y= aminoácido no variante	G80A 80 . ' ·'·'. . AALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSG llllllhllllllllllilllllllllll . AALN NSIAVLGVAPSAELYAVKVLGASGSG
Inserção	44$?? D= posição no molde C= “a” para a primeira inserção nesta posição, “b” para a próxima, etc.	*80aT *80bY *85aS . 80 85' ' . . AALNNSIG..VLGVA.PSAELYAVKVLGASG IM llliHIIIIIMII ... AALNNSIGTYVLGVASPSAELYAVKVLGAS G
Eliminação	X= aminoácido no molde D= posição no molde C= vazio Y_ 44$??	V81* ' 80 'Aalnnsigvlgvapsaelyavkvlgasgsg llllllll llllllllllllllllllill ... AALNNSIG.LGVAPSAELYAVKVLGASGSG
Extensão N-terminal	Inserções na posição “0”	*OaA*0bT*0cG 1 ..‘AQSVPWGISRVQ ‘ llllllilllll ATGÁQSVPWGISRVQ-
Extensão C-terminal	Inserções após o aminoácido Nterminal	*275aS*275bT 270 275 : ATSLGSTN LYGSGLVNAÈAATR.. IIIIIIIIIIIIIIIIÍIIIII · ATSLGSTNLYGSGLVNAEAATRST

Da maneira explicada anteriormente, o número da posição (D) é contado a partir do primeiro resíduo de aminoácido de SEQ ID NO:2.

Varias modificações na mesma sequência são separadas por (barra), por exemplo, a determinação l*/2*/3* significa que os aminoácidos no número da posição 1, 2 e 3 são todos eliminados, e a determinação 104A/105F significa que o aminoácido no número da posição 15 104 é substituído por A e o aminoácido no número da posição 105 é substituído por F.

Modificações alternativas são separadas por (vírgula), por exemplo, a determinação 119R,K significa que o aminoácido na posição 119 é substituído por R ou K.

As vírgulas aqui usadas em várias outras enumerações e possibilidades significam que são usadas em geral gramaticalmente, ou seja, frequentemente e/ou. Por exemplo, a primeira vírgula na listagem 53V,Q, 121D e/ou 167Q determina uma alternativa (V ou Q), ao passo que as duas próximas vírgulas podem ser interpretadas como opções e/ou: 53 V ou Q, e/ou 121D, e/ou 167Q.

No presente contexto, pelo menos uma (por exemplo, modificação) significa uma ou mais, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 modificações; ou 1 2, 1 4, 1 5, 16, 1 8, 20, 22, 24, 25, 28, ou 30 modificações, e assim por diante, até um número máximo de modificações de 125, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, ou de 200. Os variantes de fitase da invenção, entretanto, ainda devem ser pelo menos 74 % idênticos a SEQ ID NO:2, este percentual sendo determinado da maneira descrita anteriormente.

Uma substituição ou extensão, sem qualquer indicação do que substituir ou se estender, refere-se à inserção de qualquer aminoácido natural ou não natural, exceto aquele que ocupa esta posição no molde.

Identificação de números da posição correspondente

Da maneira explicada anteriormente, a sequência madura dos aminoácidos da fitase madura de Buttiauxella gaviniae DSM 18930 (SEQ ID NO:2) é usada como o padrão para numerar a posição e, por meio disso, também para a nomenclatura.

Para uma outra fitase, em particular um variante de fitase da invenção, a posição que corresponde à posição D em SEQ ID NO:2 é encontrada alinhado as duas sequências especificadas anteriormente na seção intitulada Polipeptídeos de fitase, percentual de identidade. A partir do alinhamento, a posição na sequência da invenção que corresponde à posição D de SEQ ID NO:2 pode ser clara e inequivocamente identificada (as duas posições na parte superior uma da outra no alinhamento).

A seguir, alguns exemplos adicionais, puramente hipotéticos, que são incluídos são derivados da tabela 1 anterior, que na terceira coluna inclui inúmeros alinhamentos das duas sequências:

Considere a terceira célula na primeira fileira da tabela 1: A sequência superior é o molde, a inferior o variante. O número da posição 80 refere-se ao resíduo de aminoácido G no molde. O aminoácido A ocupa a posição correspondente no variante. Dessa maneira, esta substituição é determinada G80A.

Considere agora a terceira célula na segunda fileira da tabela 1: A sequência superior é novamente o molde e a inferior o variante. O número da posição 80 refere-se novamente ao resíduo de aminoácido G no molde. O variante apresenta duas inserções, ou seja, TY, após G80 e antes de V81 no molde. Ao passo que o T e Y podem apresentar, certamente, seu próprio número “real” da posição na sequência de aminoácido variante, com os presentes propósitos, nos referimos sempre aos números da posição molde e, dessa maneira, o T e o Y são ditos para estar no número da posição 80a e 80b, respectivamente.

Finalmente, considere a terceira célula a última fileira da tabela 1: o número da posição 275 refere-se ao último aminoácido do molde. Uma extensão C-terminal de ST é dita para estar no número da posição 275a e 275b, respectivamente, embora novamente apresentem certamente seu próprio número “real” da posição na sequência de aminoácido variante.

Propriedades modificadas, fitase de referência

Em uma modalidade particular, a fitase da invenção apresenta propriedades modificadas, preferivelmente melhoradas. Os termos modificado e melhorado implicam em uma comparação com uma outra fitase. Exemplos de tais outras fitases, de referência ou comparativas, são: SEQ ID NO:4 e/ou SEQ ID NO:6. Exemplos ainda adicionais de fitases de referências podem ser as sequências de GENESEQP: AEH25051, AEH25056, AEH25057, AEH25058, AEH25059, AEH25060, AEH25061, AEH25062, AEH25063, AEH25064; AEH25065, AEH25066, AEH25067, AE H25068, AEH25069, AEH25070, AEH25071, AEH25072, AEH25073, AE H25074, AEH25075, ou AEH25076 reveladas na figura 1.

Exemplos não limitantes de propriedades que são modificadas, preferivelmente melhoradas, são os seguintes: Termoestabilidade, perfil de pH, atividade específica, desempenho na ração animal, estabilidade à pelotização, sensibilidade à protease e/ou padrão de glicosilação. Os variantes de fitase produzidos pelo método da invenção exibem melhor termoestabilidade e também podem apresentar um perfil de temperatura modificado, preferivelmente melhorado, e/ou podem incorporar uma mudança de um sítio de divagem de protease potencial.

Desempenho térmico

T ermoestabilidade

A termoestabilidade pode ser determinada da maneira descrita no exemplo 3, isto é, usando medições de DSC para determinar a temperatura de desnaturação, Td, da proteína fitase purificada. A Td é indicativa da termoestabilidade da proteína: Quanto maior a Td, maior a termoestabilidade. Dessa maneira, em uma modalidade preferida, a fitase da invenção apresenta uma Td que é maior que a Td de uma fitase de referência, em que Td é determinada em amostras de fitase purificada (preferivelmente com uma pureza de pelo menos 90 % ou 95 %, determinada por SDS-PAGE).

A termoestabilidade também pode ser determinada da maneira a seguir. Dessa maneira, em uma modalidade preferida, a fitase da invenção após incubação por 60 minutos a 70 °C e pH 4,0 apresenta uma melhor atividade residual, comparada à atividade residual de uma fitase de referência tratada da mesma maneira, a atividade residual sendo calculada para cada fitase com relação à atividade observada antes da incubação (em 0 minutos).

A atividade residual é medida preferivelmente em fitato de sódio em pH 5,5 e 37 °C. A incubação é preferivelmente em acetato de sódio 0,1 M pH 4,0. A fitase é preferivelmente purificada, mais preferivelmente com uma pureza de pelo menos 95 %, determinada por SDS-PAGE. Um tampão de ensaio de atividade de fitase preferido é acetato de sódio 0,25 M pH 5,5. Usando este método, a atividade residual da fitase da invenção é preferivelmente pelo menos 105 % da atividade residual da fitase de referência, mais preferivelmente pelo menos 110 %, 115 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 %, ou pelo menos 200 %. Em alternativa, a atividade residual com relação à atividade em 0 minutos é preferivelmente pelo menos 31 %, ou pelo menos 32 %. As seguintes substituições que fornecem melhor termoestabilidade são preferidas (ver tabela 9): 273L, 46E, 362R e/ou 53V.

Em uma modalidade particular, o variante de fitase da invenção é mais termoestável do que a fitase de referência, em que a termoestabilidade é determinada usando qualquer dos quatro testes anteriormente mencionados (com base nos exemplos).

Estabilidade ao calor

A estabilidade ao calor pode ser determinada da maneira descrita no exemplo 4, determinando o perfil da temperatura/atividade dos variantes de fitase.

Perfil de temperatura/estabilidade à temperatura

Se uma fitase da invenção apresentar ou não um perfil de temperatura modificado, comparada a uma fitase de referência, esta pode ser determinada da maneira descrita no exemplo 4. Dessa maneira, em uma modalidade particular, a fitase da invenção apresenta um perfil de temperatura modificado, comparada a uma fitase de referência, em que o perfil de temperatura é determinado como a atividade de fitase como uma função de temperatura em fitato de sódio em pH 5,5, na faixa de temperatura de 20-90 °C (em etapas de 10 °C). Um tampão preferido está em tampão de acetato de sódio 0,25 M pH 5,5. A atividade em cada temperatura é preferivelmente indicada como atividade relativa (em %), normalizada em valor em temperatura ideal. A temperatura ideal é aquela temperatura nas temperaturas testadas (isto é, aquelas com saltos de 5-10 °C) onde a atividade é mais elevada.

Perfil de pH

Se uma fitase da invenção apresentar ou não um perfil de pH modificado, comparado a uma fitase de referência, este pode ser determinado da maneira descrita nos exemplos. Dessa maneira, em uma modalidade particular, a fitase da invenção apresenta um perfil de pH modificado comparado a uma fitase de referência, em que o perfil de pH é determinado como a atividade de fitase como uma função de pH em fitato de sódio a 37 °C, na faixa de pH de 2,0 a 7,5 (em etapas de unidade de pH 0,5). Um tampão preferido é um coquetel de glicina 50mM, ácido acético 50mM e Bis-Tris 50mM. Um outro tampão preferido é acetato de sódio 0,25 Μ. A atividade em cada pH é preferivelmente indicada como atividade relativa (em %) normalizada no valor em pH ideal.

Um exemplo de um perfil de pH modificado é onde a curva de pH (atividade relativa como uma função de pH) é deslocada para pH mais elevado ou mais baixo.

Um outro exemplo de um perfil de pH modificado é onde o pH ideal é alterado, na direção à montante ou à jusante.

Um perfil de pH modificado também pode ser determinado comparando a atividade de fosfatase em pH 3,5 e 5,5. Altemativamente, a atividade em pH 3,5 pode ser comparada com a atividade em pH 4,0, 4,5, ou 5,0. Ainda em uma adicionalmente alternativa, as atividades de fitase são comparadas em vez das atividades de fosfatase.

Em uma modalidade particular, a fitase da invenção apresenta um perfil de pH modificado comparado a uma fitase de referência. Mais em particular, o perfil de pH é modificado na faixa de pH de 3,5-5,5. Ainda mais em particular, a atividade em pH 4,0, 4,5, 5,0 e/ou 5,5 está em nível de pelo menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, ou pelo menos 95 % da atividade no pH ideal.

Atividade específica

Em uma modalidade particular, a fitase da invenção apresenta uma melhor atividade específica com relação a uma fitase de referência. Mais em particular, a atividade específica de uma fitase da invenção é pelo menos 105 %, com relação à atividade específica de uma fitase de referência determinada pelo mesmo procedimento. Ainda em modalidades particulares adicionais, a atividade relativa específica é pelo menos 110, 115, 120, 125, 130, 140, 145, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 350 ou mesmo 400 %, ainda com relação à atividade específica da fitase de referência, da maneira determinada pelo mesmo procedimento.

Na alternativa, o termo atividade específica elevada refere-se a uma atividade específica de pelo menos 200 FYT/de proteína enzimática (EP). Em modalidades particulares, a atividade específica é pelo menos 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900, 2000, 2.100, 2.200, 2.300, 2.400, 2.500, 2.600, 2.700, 2.800, 2.900 ou 3.000 FYT/mg de EP.

A atividade específica é medida em amostras altamente purificadas (um gel de SDS poliacrilamida pode mostrar a presença de apenas um componente). A concentração de proteína enzimática pode ser determinada por análise de aminoácido e pela atividade de fitase nas unidades de FYT, determinadas da maneira descrita nos exemplos. A atividade específica é uma característica do variante de fitase específico em questão, e é calculado como a atividade de fitase medida em unidades de FYT por mg de proteína enzimática variante de fitase.

Desempenho na ração animal

Em uma modalidade particular, a fitase da invenção apresenta um melhor desempenho na ração animal comparado a uma fitase de referência. O desempenho na ração animal pode ser determinado por um modelo in vitro do exemplo 5. Dessa maneira, em uma modalidade preferida, a fitase da invenção apresenta um melhor desempenho na ração animal, em que o desempenho é determinado em um modelo in vitro, preparando amostras de ração compostas de 30 % de farelo de soja e 70 % de farinha de milho com CaC12 adicionado em uma concentração de 5 g de cálcio per kg de ração; pré-incubando-as em 40 °C e pEE 3,0 por 30 minutos, seguido pela adição de pepsina (3000 U/g de ração) e fitase; incubando as amostras a 40 °C e pH 3,0 por 60 minutos, seguido por pH 4,0 por 30 minutos; parando as reações; extraindo o ácido fítico e inositol-fosfatos pela adição de HCL em uma concentração final de 0,5M e incubação a 40 °C por 2 horas, seguido por um ciclo de congelamento-descongelamento e 1 hora de incubação a 40 °C; separando ácido fítico e inositol-fosfatos por cromatografia iônica de alto desempenho; determinando a quantidade de fósforo de fitato residual (IP6-P); calculando a diferença em IP6-P residual entre a fitase tratada e uma amostra branco com fitase não tratada (esta diferença é ο IP6-P degradado); e expressando ο IP6-P degradado da fitase da invenção com relação ao IP6-P degradado da fitase de referência (por exemplo, as fitases com SEQ ID NO: 3 e 4).

A fitase da invenção e a fitase de referência são certamente dosadas na mesma quantidade, preferivelmente com base na unidade de atividade de fitase (FYT). Uma dosagem preferida é 125 FYT/kg de ração. Uma outra dosagem preferida é 250 FYT/kg de ração. As fitases podem ser dosadas na forma de fitases purificadas, ou na forma de sobrenadantes de fermentação. As fitases purificadas apresentam preferivelmente uma pureza de pelo menos 95 %, da maneira determinada por SDS-PAGE.

Em modalidades preferidas, o valor do IP6-P degradado da fitase purificada da invenção, com relação ao valor de IP6-P degradado da fitase de referência, é pelo menos 101 %, ou pelo menos 102 %, 103 %, 104 %, 105 %, 110 %, 115 %, ou pelo menos 120 %. Ainda em modalidades adicionais preferidas, o valor de IP6-P degradado da fitase purificada da invenção, com relação ao valor de IP6-P degradado da fitase de referência, é pelo menos 125 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 %, ou pelo menos 200 %. Preferivelmente, o valor de IP6-P degradado da fitase da invenção, com relação ao valor de IP6-P degradado da fitase de SEQ ID NO:2, é pelo menos 105 %, 110 %, 113 %, 115 %, 120 %, 125 %, ou pelo menos 130 %.

O desempenho relativo de uma fitase da invenção também pode ser calculado como o percentual do fósforo liberado pela fitase de referência.

Em ainda em uma modalidade particular adicional, o desempenho relativo da fitase da invenção pode ser calculado como o percentual do fósforo liberado pela fitase da invenção, com relação à quantidade de fósforo liberado pela fitase de referência.

Ainda em modalidades particulares adicionais, o desempenho relativo da fitase da invenção é pelo menos 105 %, preferivelmente pelo menos 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, ou pelo menos 200 %. Sequências de ácidos nucleicos e construtos

A presente invenção também se refere às sequências de ácidos nucleicos compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um variante de fitase da invenção.

O termo sequência de ácidos nucleicos isolados refere-se a uma sequência de ácidos nucleicos que seja essencialmente livre de outras sequências de ácidos nucleicos, por exemplo, pelo menos cerca de 20 % puro, preferivelmente pelo menos cerca de 40 % puro, mais preferivelmente pelo menos cerca de 60 % puro, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 80 % puro e acima de tudo preferivelmente pelo menos cerca de 90 % puro da maneira determinada por eletroforese em agarose. Por exemplo, uma sequência de ácidos nucleicos isolados pode ser obtida por procedimentos de clonagem padrão usados em alterações genéticas para transferir a sequência de ácidos nucleicos de seu local natural para um sítio diferente, onde será reproduzida. Os procedimentos de clonagem podem envolver excisão e o isolamento de um fragmento de ácido nucleico desejado, compreendendo a sequência de ácidos nucleicos que codifica o polipeptídeo, inserção do fragmento em uma molécula vetor e incorporação do vetor recombinante em uma célula hospedeira, onde múltiplas cópias ou clones da sequência de ácidos nucleicos serão replicados. A sequência de ácidos nucleicos pode ser de origem genômica, DNAc, RNA, semi-sintética, sintética, ou quaisquer combinações destas.

As sequências de ácidos nucleicos da invenção podem ser preparadas introduzindo pelo menos uma mutação em uma sequência que codifica fitase molde ou uma subsequência desta, em que a sequência mutante de ácidos nucleicos codifica um variante de fitase. A introdução de uma mutação na sequência de ácidos nucleicos para trocar um nucleotídeo por um outro nucleotídeo pode ser realizada por quaisquer dos métodos conhecidos na técnica, por exemplo, por mutagênese sítio-direcionada, por mutagênese aleatória, ou por mutagênese aleatória dopada, reforçada ou localizada.

A mutagênese aleatória é realizada adequadamente tanto como mutagênese aleatória localizada quanto de região específica, em pelo menos três partes do gene que traduz na sequência de aminoácidos mostrada em questão, ou no gene completo. Quando a mutagênese é realizada pelo uso de um oligonucleotídeo, o oligonucleotídeo pode ser dopado ou reforçado com os três nucleotídeos não parentais durante a síntese do oligonucleotídeo nas posições que devem ser trocadas. A dopagem ou reforço pode ser realizado de maneira que os códons para aminoácidos indesejados sejam evitados. O oligonucleotídeo dopado ou reforçado pode ser incorporado no DNA que codifica a enzima fitase por qualquer técnica usando, por exemplo, PCR, LCR ou qualquer DNA polimerase e ligase da maneira considerada apropriada.

Preferivelmente, a dopagem é realizada usando dopagem aleatória constante, em que o percentual de tipo selvagem e mutação em cada posição é pré-definido. Além do mais, a dopagem pode ser direcionado em uma preferência para a introdução de certos nucleotídeos e, por meio disso, uma preferência para a introdução de um ou mais resíduos de aminoácidos específicos. A dopagem pode ser realizado, por exemplo, de maneira a permitir a introdução de 90 % de tipo selvagem e 10 % de mutações em cada posição. Uma consideração adicional na escolha de um esquema de dopagem baseia-se na genética, bem como nas restrições estruturais da proteína.

A mutagênese aleatória pode estar localizada vantajosamente em uma parte da fitase parental em questão. Isto pode ser, por exemplo, vantajoso quando certas regiões da enzima foram identificadas para ser de particular importância para uma dada propriedade da enzima.

Os métodos alternativos para fornecer variantes da invenção incluem embaralhamento de gene, por exemplo, descrito em WO 95/22625 ou em WO 96/00343, e o processo de derivação consensual descrito em EP 897985.

Construtos de ácido nucleico

Um construto de ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos da presente invenção operavelmente ligada a uma ou mais sequências controle, que direcionam a expressão da sequência codificante em uma célula hospedeira adequada em condições compatíveis com as sequências controle. A expressão será entendida para incluir qualquer etapa envolvida na produção do polipeptídeo incluindo, mas sem limitação, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós29 translacional e secreção.

O termo construto de ácido nucleico, da maneira aqui usada, refere-se a uma molécula de ácido nucleico, tanto de fita única quanto de fita dupla, que é isolada de um gene de ocorrência natural ou que é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de uma maneira que não pode existir de outra forma na natureza. O termo construto de ácido nucleico é sinônimo do termo cassete de expressão quando o construto de ácido nucleico contém as sequências controle exigidas para a expressão de uma sequência codificante da presente invenção.

O termo sequências controle é aqui definido para incluir todos os componentes, que são necessários ou vantajosos para a expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção. Cada sequência controle pode ser natural ou estrangeira à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo. Tais sequências controle incluem, mas sem limitação, uma sequência principal, sequência de poliadenilação, sequência de pró-peptídeo, promotor, sequência de peptídeo sinal e fmalizador de transcrição. No mínimo, as sequências controle incluem um promotor e sinais de parada transcricionais e translacionais. As sequências controle podem ser fornecidas com ligantes com o propósito de introduzir sítios de restrição específicos, que facilitam a ligação das sequências controle com a região codificante da sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo.

O termo operavelmente ligado determina aqui uma configuração na qual uma sequência controle é colocada em uma posição apropriada, com relação à sequência codificante da sequência de polinucleotídeos, de maneira tal que a sequência controle direcione a expressão da sequência codificante de um polipeptídeo.

Quando aqui usado, o termo sequência codificante (CDS) significa uma sequência de nucleotídeos, que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de seu produto proteico. As extremidades da sequência codificante são, em geral, determinadas por um quadro aberto de leitura, que começa geralmente com o códon inicial ATG ou códons iniciais alternativos tais como GTG e TTG. A sequência codificante pode apresentar um DNA, DNAc, ou sequência de nucleotídeos recombinantes

Vetor de expressão

O termo expressão inclui qualquer etapa envolvida na produção do polipeptídeo incluindo, mas sem limitação, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, pós-translational modificação e secreção.

O termo vetor de expressão é aqui definido como uma molécula de DNA linear ou circular, que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da invenção, e que é operavelmente ligada a nucleotídeos adicionais que fornecem sua expressão.

Uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um variante de fitase da invenção pode ser expressa usando um vetor de expressão que inclui tipicamente sequências controle que codificam um promotor, operador, sítio de ligação de ribossomo, sinal de início de tradução e, opcionalmente, um gene repressor ou vários genes ativadores.

O vetor recombinante de expressão que carrega a sequência de DNA que codifica um variante de fitase da invenção pode ser qualquer vetor que pode ser convenientemente submetido aos procedimentos de DNA recombinante, e a escolha do vetor dependerá frequentemente da célula hospedeira na qual deve ser introduzido. O vetor pode ser um que, quando introduzido em uma célula hospedeira, é integrado no genoma da célula hospedeira e replicado junto com o(s) cromossomo(s) no(s) qual(s) foi integrado.

O variante de fitase também pode ser coexpresso junto com pelo menos uma outra enzima de interesse em ração animal, tal como uma fitase, fosfatase, xilanase, galactanase, alfa-galactosidase, protease, fosfolipase, amilase e/ou beta-glucanase. As enzimas podem ser coexpressas a partir de diferentes vetores, de um vetor, ou usando uma mistura de ambas as técnicas. Durante o uso de diferentes vetores, os vetores podem apresentar diferentes marcadores selecionáveis e diferentes origens de replicação. Durante o uso de apenas um vetor, os genes podem ser expressos a partir de um ou mais promotores. Se for clonado abaixo da regulação de um promotor (di ou multicistrônico), a ordem em que os genes são clonados pode afetar os níveis de expressão das proteínas. O variante de fitase também pode ser expresso como uma proteína de fusão, isto é, que o gene que codifica o variante de fitase foi fundido em alinhamento com o gene que codifica uma outra proteína. Esta proteína pode ser uma outra enzima ou um domínio funcional de uma outra enzima.

Células hospedeiras

O termo célula hospedeira, da maneira aqui usada, inclui qualquer tipo de célula que é susceptível a transformação, transfecção, transdução e similares, com um construto de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção.

A presente invenção também se refere a células hospedeiras recombinantes, compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção, que são vantajosamente usados na produção recombinante dos polipeptídeos. Um vetor compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção é introduzido em uma célula hospedeira, de maneira que o vetor seja mantido como um integrante cromossomal ou como um vetor autorreplicante extra cromossômico descrito anteriormente. O termo célula hospedeira inclui qualquer progênie de uma célula parental, que não é idêntica à célula parental em virtude das mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de um célula hospedeira dependerá em grande parte do gene que codifica o polipeptídeo e de sua fonte.

A célula hospedeira pode ser um microrganismo unicelular, por exemplo, um procarioto, ou um microrganismo não unicelular, por exemplo, um eucarioto.

Os microrganismos unicelulares usados são células bacterianas tais como bactérias Gram positivas incluindo, mas sem limitação, uma célula de Bacillus, por exemplo, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis e Bacillus thuringiensis', ou uma célula de Streptomyces, por exemplo, Streptomyces lividans e Streptomyces murinus, ou bactérias Gram negativas tais como E. coli e Pseudomonas sp. Em um aspecto preferido, o célula hospedeira bacteriana é uma célula de Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus ou Bacillus subtilis. Em um outro aspecto preferido, a célula de Bacillus é um Bacillus alcalofílico.

A introdução de um vetor em uma célula hospedeira bacteriana pode ser, por exemplo, realizada por transformação do protoplasto (ver, por exemplo, Chang e Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), usando células competentes (ver, por exemplo, Young e Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), eletroporação (ver, por exemplo, Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), ou conjugação (ver, por exemplo, Koehler e Thome, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771 5278).

A célula hospedeira também pode ser um eucarioto, tal como uma célula de mamífero, inseto, planta ou fungo.

Em um aspecto preferido, a célula hospedeira é uma célula fungica. Fungos, da maneira aqui usada, inclui os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota e Zygomycota (definido por HawksWOrth et al., em, AinsWOrth and Bisby's Dictionary of the Fungi, 8^a edição, 1995,

CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido), bem como ο Oomycota (da maneira citada em HawksWOrth et al., 1995, supra, página 171) e todos os fungos mitospóricos (HawksWOrth et al., 1995, supra).

Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira fungica é uma célula de levedura. Levedura, da maneira aqui usada, inclui levedura com formação de ascosporos (Endomycetales), levedura com formação de basidiosporos e levedura que pertence aos fungos imperfeitos (Blastomycetes). Uma vez que a classificação de levedura pode mudar no futuro, com os propósitos desta invenção, as leveduras podem ser definidas da maneira descrita em Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M. e Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9,1980).

Em um aspecto ainda mais preferido, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia.

Em um aspecto acima de tudo preferido, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Pichia pastoris, Pichia methanolica, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis ou Saccharomyces oviformis. Em um outro aspecto acima de tudo preferido, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Kluyveromyces lactis. Em um outro aspecto acima de tudo preferido, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Yarrowia lipolytica.

Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira fungica é uma célula de fungo filamentoso.

Fungos filamentosos incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (da maneira definida por HawksWOrth et al., 1995, supra). Os fungos filamentosos são caracterizados em geral por uma parede miceliana composta de quitina, celulose, glucano, quitosana, manana e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo é por alongamento de hifas e o catabolismo de carbono é aeróbico obrigatório. Ao contrário, o crescimento vegetativo das leveduras tais como Saccharomyces cerevisiae é por brotamento de um talo unicelular e o catabolismo do carbono pode ser fermentative.

Em um aspecto ainda mais preferido, a célula hospedeira do fungo filamentoso é uma célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filobasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, ou Trichoderma.

Em um aspecto acima de tudo preferido, a célula hospedeira do fungo filamentoso é uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger ou Aspergillus oryzae. Em um outro aspecto acima de tudo preferido, a célula hospedeira do fungo filamentoso é uma célula de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides ou Fusarium venenatum. Em um um outro aspecto acima de tudo preferido, a célula hospedeira do fungo filamentoso é uma célula da cepa de Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, ou Ceriporiopsis subvermispora, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei,

Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolou, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.

As células fungicas podem ser transformadas por um processo que envolve a formação de protoplasto, transformação dos protoplastos e regeneração da parede celular de uma maneira conhecida per se.os procedimentos adequados para transformação de células hospedeiras de Aspergillus e Trichoderma são descritos em EP 238 023 e Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81:1470-1474. Os métodos adequados para transformar espécies de Fusarium são descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 e WO 96/00787. A levedura pode ser transformada usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente, em Abelson, J.N. e Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, páginas 182-187, Academic Press, Inc., Nova Iorque; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920.

Métodos de Produção

A presente invenção também se refere a métodos para produzir uma fitase da presente invenção compreendendo (a) cultivar um célula hospedeira em condições condutivas para a produção da fitase; e (b) recuperar a fitase.

Nos métodos de produção da presente invenção, as células são cultivadas em um meio nutriente adequado para a produção do polipeptídeo usando métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por cultivo em frasco de agitação e fermentação em pequena escala e grande escala (incluindo fermentações contínuas, em lotes, em lotes alimentados ou no estado sólido) em laboratório ou fermentadores industriais, realizada em um meio adequado e em condições que permitem que o polipeptídeo seja expresso e/ou isolado. O cultivo ocorre em um meio nutriente adequado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando os procedimentos conhecidos na técnica. Os meio adequados são disponíveis a partir de fornecedores comerciais, ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (por exemplo, em catálogos do American Type Culture Collection). Se o polipeptídeo for secretado no meio nutriente, o polipeptídeo pode ser recuperado diretamente do meio. Se o polipeptídeo não for secretado, ele pode ser recuperado a partir de lisados celulares.

O polipeptídeo resultante pode ser recuperado usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado a partir do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas sem limitação, centrifugação, filtração, extração, secagem por aspersão, evaporação ou pelotização.

Os polipeptídeos da presente invenção podem ser purificados por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, mas sem limitação, cromatografia (por exemplo, de troca iônica, por afinidade, hidrofóbica, focagem isoelétrica e por exclusão de tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focagem isoelétrica preparatória), solubilidade diferencial (por exemplo, pelotização por sulfato de amônio), SDS-PAGE ou extração (ver, por exemplo, Protein Purification, J.-C. Janson e Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989).

Plantas transgênicas

A presente invenção também se refere a uma planta transgênica, parte da planta, ou célula de planta que foi transformada com uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo com atividade de fitase da presente invenção, de maneira expressar e produzir o polipeptídeo em quantidades recuperáveis. O polipeptídeo pode ser recuperado a partir da planta ou de parte da planta. Altemativamente, a planta ou parte da planta contendo o polipeptídeo recombinante pode ser usada como tal para melhorar a qualidade de um alimento ou ração, por exemplo, melhorar o valor nutricional, palatabilidade e propriedades reológicas, ou para destruir um fator antinutritivo.

Em uma modalidade particular, o polipeptídeo é alvejado nos vacúolos de armazenamento de endosperma nas sementes. Isto pode ser obtido sintetizando-o como um precursor com um peptídeo sinal adequado, ver Horvath et al., em PNAS, Fev. 15, 2000, vol. 97, no. 4, p. 1914-1919.

A planta transgênica pode ser dicotiledônea (um dicotiledônea) ou monocotiledônea (um monocotiledônea) ou variantes geneticamente modificadas destas. Exemplos de plantas monocotiledôneas são gramíneas, tais como grama do prado (grama azul, Poa), gramíneas forrageiras tais como Festuca, Lolium, gramíneas temperadas tais como Agrostis e cereais, por exemplo, trigo, aveias, centeio, cevada, arroz, sorgo, triticale (híbrido estabilizado de trigo (Triticum) e centeio (Secale) e milho (grão de milho). Exemplos de plantas dicotiledôneas são tabaco, legumes tais como girassol (Helianthus), algodão (Gossypium), tremoço, batata, beterraba, ervilha, feijão e seja, e plantas crucíferas (família Brassicaceaé) tais como couve flor, canola e o organismo modelo muito relacionado Arabidopsis thaliana. As plantas com pouca fitase descritas, por exemplo, na patente US 5.689.054 e na patente US 6.111.168 são exemplos de plantas geneticamente modificadas.

Exemplos de partes da planta são caule, calo, folhas, raiz, frutas, sementes e tubérculos, bem como os tecidos individuais compreendendo estas partes, por exemplo, epiderme, mesófilo, parênquima, tecidos vasculares, meristemas. Os compartimentos também específicos de célula de planta, tais como cloroplasto, apoplasto, mitocôndria, vacúolo, peroxissomos e citoplasma são considerados como uma parte da planta. Além do mais, qualquer célula de planta, seja qual for a origem do tecido, é considerada como uma parte da planta. Da mesma forma, partes da planta tais como tecidos específicos e células isoladas para facilitar a utilização da invenção também são consideradas partes da planta, por exemplo, embriões, endospermas, aleurona e revestimentos de semente.

São também incluídas no escopo da presente invenção a progênie de tais plantas, partes da planta e célula de plantas.

A planta transgênica ou célula de planta que expressa um polipeptídeo da presente invenção pode ser construída de acordo com métodos conhecidos na técnica. Resumidamente, a planta ou célula de planta é construída incorporando uma ou mais construtos de expressão que codificam um polipeptídeo da presente invenção no genoma da planta hospedeira, e propagando a planta ou célula de planta modificada resultante em uma planta ou célula de planta transgênica.

De maneira conveniente, o construto de expressão é um construto de ácido nucleico que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo da presente invenção, operavelmente ligado às sequências regulatórias apropriadas e exigidas para a expressão da sequência de ácidos nucleicos na planta ou parte da planta de escolha. Além do mais, o construto de expressão pode compreender um marcador selecionável usado para identificar células hospedeiras, nas quais o construto de expressão foi integrado, e as sequências de DNA necessárias para a introdução do construto na planta em questão (as últimas dependem do método de introdução de DNA a ser usado).

A escolha de sequências regulatórias, tais como sequências promotoras e finalizadoras e, opcionalmente, sequências sinal ou de trânsito, é determinada, por exemplo, com base em quando, onde e como o polipeptídeo é desejado para ser expresso. Por exemplo, a expressão do gene que codifica um polipeptídeo da presente invenção pode ser constitutiva ou indutível, ou pode ser específica do desenvolvimento, estágio ou tecido, e o produto de gene pode ser alvejado em um compartimento celular específico, tecido ou parte da planta, tais como sementes ou folhas. As sequências regulatórias são, por exemplo, descritas por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.

Para a expressão constitutiva, os seguintes promotores podem ser usados: O promotor 35S-CaMV (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294), o promotor de ubiquitina 1 de milho (Christensen AH, Sharrock RA e Quail 1992. Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation), ou o promotor actina 1 de arroz (Plant Mo. Biol. 18, 675-689.; Zhang W, McElroy D. e Wu R 1991, Analysis of rice Actl 5' region activity in transgenic rice plants. Plant Cell 3, 1155-1165). Os promotores específicos de órgão podem ser, por exemplo, um promotor de tecidos de armazenamento perecível tais como sementes, tubérculos de batata e frutas (Edwards & Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303), ou de tecidos metabólicos perecíveis tais como meristemas (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), um promotor específico de semente tal como o promotor glutelina, prolamina, globulina, ou albumina de arroz (Wu et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 885-889), um promotor de Vicia faba da legumin B4 e o gene de proteína de semente desconhecida de Vicia faba (Conrad et al., 1998, Journal of Plant Physiology 152: 708-711), um promotor de uma proteína de corpo oleoso de semente (Chen et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 935-941), o promotora napA da proteína de armazenamento de Brassica napus, ou qualquer outro promotor específico de semente conhecido na técnica, por exemplo, descrito em WO 91/14772. Além do mais, o promotor pode ser um promotor específico de folha, tal como o promotor rbcs de arroz ou tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiology 102: 9911.000, o promotor do gene de adenina metiltransferase do virus Chlorella (Mitra e Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93), ou o promotor do gene aldP de arroz (Kagaya et al., 1995, Molecular and General Genetics 248: 668-674), ou um promotor indutível de ferida, tal como o promotor pin2 de batata (Xu et al., 1993, Plant Molecular Biology 22: 573-588). Da mesma forma, o promotor pode ser indutível pelos tratamentos abióticos, tais como temperatura, aridez ou modificações em salinidade, ou indutível por substâncias aplicadas exogenamente que ativam o promotor, por exemplo, etanol, estrogênio, hormônios de planta como etileno, ácido abscísico, ácido giberélico e/ou metais pesados.

Um elemento melhorador do promotor também pode ser usado para atingir maior expressão do polipeptídeo na planta. Por exemplo, o elemento melhorador de promotor pode ser um intron, que é colocado entre o promotor e a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo da presente invenção. Por exemplo, Xu et al., 1993 supra, revelam o uso do primeiro intron do gene de actina 1 do arroz para melhorar a expressão.

Ainda adicionalmente, o uso do códon pode ser otimizado para as espécies de planta em questão para melhorar a expressão (ver Horvath et al., referenciado anteriormente).

O gene marcador selecionável e quaisquer outras partes do construto de expressão podem ser escolhidos a partir daqueles disponíveis na técnica.

O construto de ácido nucleico é incorporado no genoma da planta de acordo com técnicas convencionais conhecidas na tecnologia, incluindo transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por vírus, microinjeção, bombardeamento de partícula, transformação biolística e eletroporação (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).

Atualmente, a transferência de gene mediada por Agrobacterium tumefaciens é o método de escolha para gerar dicotiledôneas transgênicas (para uma revisão, ver Hooykas e Schilperoort, 1992, Plant

Molecular Biology 19: 15-38), e pode ser usado também para transformar monocotiledôneas, embora outros métodos de transformação sejam mais frequentemente usados para estas plantas. Atualmente, o método de escolha para gerar monocotiledôneas transgênicas, que suplementam a abordagem de Agrobacterium, é bombardeamento de partícula (partículas microscópicas de ouro ou tungstênio revestidas com o DNA transformante) de calos embrionários ou embriões em desenvolvimento (Christou, 1992, Plant Journal 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Um método alternativo para a transformação de monocotiledôneas baseia-se na transformação de protoplasto descrita por Omirulleh et al., 1993, Plant Molecular Biology 21: 415-428.

Após a transformação, os transformantes que incorporaram a partir daqui o construto de expressão são selecionados e regenerados em plantas completas de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Frequentemente, o procedimento de transformação é determinado para a eliminação seletiva de genes de seleção, tanto durante a regeneração quanto nas gerações a seguir, por exemplo, usando co-transformação com dois construtos de DNA-T separados, ou excisão específica de sítio do gene de seleção por uma recombinase específica.

A presente invenção também se refere a métodos para produzir um polipeptídeo da presente invenção, compreendendo (a) cultivar uma planta transgênica ou uma célula de planta compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos, que codifica um polipeptídeo com atividade de fitase da presente invenção, em condições condutivas para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

Composições e usos

Ainda em aspectos adicionais, a presente invenção se refere a composições compreendendo um polipeptídeo da presente invenção, bem como métodos de usar estes.

As composições de polipeptídeo podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de uma composição líquida ou seca. Por exemplo, a composição de polipeptídeo pode estar na forma de granulados ou microgranulados. O polipeptídeo a ser incluído na composição pode ser estabilizado de acordo com métodos conhecidos na técnica.

A fitase da invenção pode ser usada para a degradação, em qualquer contexto industrial, por exemplo, de fitase, ácido fítico e/ou os mono, di, tri, tetra e/ou pentafosfatos de mio-inositol. Sabe-se bem que as frações de fosfato destes compostos quelam cátions divalentes e trivalentes, tais como íons metálicos, inter alia, os íons nutricionalmente essenciais de cálcio, ferro, zinco e magnésio, bem como os minerais traço manganês, cobre e molibdênio. Apesar disso, o ácido fítico também e liga, em um certo grau, às proteínas por interação eletrostática.

Dessa maneira, os usos preferidos dos polipeptídeos da invenção são nas preparações de ração animal (incluindo alimento humano) ou em aditivos para tais preparações.

Em uma modalidade particular, o polipeptídeo da invenção pode ser usado para melhorar o valor nutricional de uma ração animal. Exemplos não limitantes de melhorar o valor nutricional de ração animal (incluindo alimento humano) são: melhorar a digestibilidade da ração; promover o crescimento do animal; melhora a utilização da ração; melhorar a biodisponibilidade de proteínas; aumentar o nível de fosfato digestível; melhorar a liberação e/ou degradação de fitase; melhorar a biodisponibilidade de minerais traço; melhorar a biodisponibilidade de macro minerais; eliminar a necessidade de adicionar fosfato suplementar, minerais traço e/ou macro minerais; e/ou melhorar a qualidade da casca do ovo. O valor nutricional da ração é, portanto, maior e a taxa de crescimento e/ou ganho de peso e/ou conversão da ração (isto é o peso de ração ingerida com relação a ganho de peso) do animal podem ser melhorados.

Além do mais, o polipeptídeo da invenção pode ser usado para reduzir o nível de fitase do esterco.

Animais, ração animal e aditivos de ração animal

O termo animal inclui todos os animais, incluindo seres humanos. Exemplos de animais são não ruminantes e ruminantes. Os animais ruminantes incluem, por exemplo, animais tais como ovelhas, cabras e gado, por exemplo, vaca tal como vacas de corte e vacas de leite. Em uma modalidade particular, o animal é um animal não ruminante. Os animais não ruminantes incluem animais monogástricos, por exemplo, porcos ou suínos (incluindo, mas sem limitação, leitões, porcos em crescimento e leitoas); aves tais como perus, patos e galinhas (incluindo, mas sem limitação, frangos, poedeiras); peixe (incluindo, mas sem limitação, salmão, truta, tilápia, bagre e carpa); e crustáceos (incluindo, mas sem limitação, camarão e pitu).

O termo ração ou composição de ração significa qualquer composto, preparação, mistura, ou composição adequada ou pretendida para ingestão por um animal.

No uso de acordo com a invenção, o polipeptídeo pode ser oferecido ao animal antes, após, ou simultaneamente com a dieta. A última é preferida.

Em uma modalidade particular, o polipeptídeo, na foram em que é adicionado à ração, ou quando está incluído em um aditivo de ração, é substancialmente puro. Em uma modalidade particular, é bem definido. O termo bem definido significa que a preparação de fitase é pelo menos 50 % pura, da maneira determinada por cromatografia de exclusão por tamanho (ver o exemplo 12 de WO 01/58275). Em outras modalidades particulares, a preparação de fitase é pelo menos 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94, ou pelo menos 95 % pura, da maneira determinada por este método.

Uma preparação de polipeptideo substancialmente pura e/ou bem definida é vantajosa. Por exemplo, é muito mais fácil dosar corretamente na ração um polipeptideo que é essencialmente livre de outros polipeptídeos de interferência ou contaminantes. O termo dosar corretamente refere-se em particular ao objetivo de obter resultados consistentes e constantes, e à capacidade de otimizar a dosagem com base no efeito desejado.

Para uso na ração animal, entretanto, o polipeptideo de fitase da invenção não precisa ser este puro; por exemplo, pode incluir outros polipeptídeos, que no caso podem ser finalizados em uma preparação de fitase.

A preparação de fitase pode ser (a) adicionada diretamente na ração (ou usada diretamente em um processo de tratamento de proteínas), ou (b) pode ser usado na produção de uma ou mais composições intermediárias, tais como aditivos de ração ou pré-misturas que são subsequentemente adicionadas na ração (ou usadas em um processo de tratamento). O grau de pureza descrito anteriormente refere-se à pureza da preparação de polipeptideo original, quer seja usado de acordo com (a) ou (b) anterior.

As preparações de polipeptideo com purezas desta ordem de magnitude são obtidas, em particular, usando métodos recombinantes de produção, ao passo que não são tão facilmente obtidas e se submetem também a uma variação lote-a-lote muito maior quando o polipeptideo é produzido por métodos de fermentação tradicionais.

Tal preparação de polipeptideo pode ser certamente misturada com outros polipeptídeos.

O polipeptideo pode ser adicionado à ração em qualquer forma, ser como um polipeptideo relativamente puro, ou em mistura com outros componentes pretendidos para adição na ração animal, isto é, na forma de aditivos de ração animal, tais como as assim denominadas pré-misturas para ração animal.

Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a composições para uso na ração animal, tais como ração animal e aditivos de ração animal, por exemplo, pré-misturas.

Além do polipeptídeo da invenção, os aditivos de ração animal da invenção contêm pelo menos uma vitamina solúvel em gordura, e/ou pelo menos uma vitamina solúvel em água, e/ou pelo menos um mineral traço. O aditivo de ração também pode conter pelo menos um macro mineral.

Adicionalmente, os ingredientes aditivos de ração opcionais são agentes de coloração, por exemplo, carotenóides tais como beta-caroteno, astaxantina e luteína; compostos aromáticos; estabilizantes; peptídeos antimicrobianos; ácidos graxos poli-insaturados; espécies geradoras de oxigênio reativo e/ou pelo menos um outro polipeptídeo selecionado entre fitase (EC 3.1.3.8 ou 3.1.3.26); fosfatase (EC 3.1.3.1; EC 3.1.3.2; EC 3.1.3.39); xilanase (EC 3.2.1.8); galactanase (EC 3.2.1.89); alfa-galactosidase (EC 3.2.1.22); protease (EC 3.4.-.-), fosfolipase Al (EC 3.1.1.32); fosfolipase A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipase (EC 3.1.1.5); fosfolipase C (3.1.4.3); fosfolipase D (EC 3.1.4.4); amilase tal como, por exemplo, alfa-amilase (EC 3.2.1.1); e/ou beta-glucanoase (EC 3.2.1.4 ou EC 3.2.1.6).

Em uma modalidade particular, estes outros polipeptídeos são bem definidos (da maneira definida anteriormente para preparações de fitase).

A fitase da invenção também pode ser combinada com outras fitases, por exemplo, fitases de ascomicetos tais como fitases de Aspergillus, por exemplo, derivadas de Aspergillus ficuum, Aspergillus niger, ou Aspergillus awamori; ou fitases de basidiomicetos, por exemplo, derivadas de Peniophora lycii, Agrocybe pediades, Trametes pubescens, ou Paxillus involutus’, ou derivados, fragmentos ou variantes destes que apresentam atividade de fitase.

Assim, em modalidades preferidas do uso na ração animal da invenção, e em modalidades preferidas do aditivo da ração animal e da ração animal da invenção, a fitase da invenção é combinada com tais fitases.

Exemplos de peptideos antimicrobianos (AMP's) são CAP 18, leucocina A, tripticina, protegrina-1, tanatina, defensina, lactoferrina, lactoferricina e ovispirina tal como novispirina (Robert Lehrer, 2000), plectasinas e estatinas, incluindo os compostos e polipeptídeos revelados em WO 03/044049 e WO 03/048148, bem como os variantes ou fragmentos do anterior, que mantêm a atividade antimicrobiana.

Exemplos de polipeptídeos antifungicos (AFP's) são os peptideos de Aspergillus giganteus e Aspergillus niger, bem como os variantes e fragmentos destes, que mantêm a atividade antifungica, da maneira revelada em WO 94/01459 e WO 02/090384.

Exemplos de ácidos graxos poli-insaturados são os ácidos graxos poli-insaturados Cl8, C20 e C22, tais como o ácido araquidônico, ácido docosahexanóico, ácido eicosapentanóico e ácido gama-linoléico.

Exemplos de espécies geradoras de oxigênio reativo são produtos químicos tais como perborato, persulfato ou percarbonato; e polipeptídeos tal como uma oxidase, uma oxigenase ou uma sintetase.

Em geral, as vitaminas solúveis em gordura e água, bem como minerais traço, formam parte de uma assim denominada pré-mistura pretendida para a adição à ração, ao passo que macro minerais são em geral adicionados separadamente à ração. Cada um destes tipos de composição, quando enriquecido com um polipeptídeo da invenção, é um aditivo de ração animal da invenção.

Em uma modalidade particular, pretende-se que o aditivo de ração animal da invenção seja incluído (ou prescrito como aquele que deve ser incluído) em dietas ou ração de animais em níveis de 0,01 a 10,0 %; mais particularmente 0,05 a 5,0 %; ou 0,2 a 1,0 % (% significando g de aditivo por 100 g de ração). Isto é assim, em particular, para as pré-misturas.

As listas a seguir não são exclusivas dos exemplos destes componentes:

Exemplos de vitaminas solúveis em gordura são vitamina A, vitamina D3, vitamina E e vitamina K, por exemplo, vitamina K3.

Exemplos de vitaminas solúveis em água são vitamina BI2, biotina e colina, vitamina Bl, vitamina B2, vitamina B6, niacina, ácido fílico e pantotenato, por exemplo, Ca-D-pantotenato.

Exemplos de minerais traço são manganês, zinco, ferro, cobre, iodo, selênio e cobalto.

Exemplos de macro minerais são cálcio, fósforo e sódio.

As exigências nutricionais destes componentes (exemplificados com aves e letões/porcos) são listadas na tabela A de WO 01/58275. A exigência nutricional significa que estes componentes podem ser fornecidos na dieta nas concentrações indicadas.

Em alternativa, o aditivo de ração animal da invenção compreende pelo menos um dos componentes individuais especificados na tabela A de WO 01/58275. Pelo menos um significa qualquer um, de um ou mais de, um, ou dois, ou três, ou quatro e assim por diante até treze, ou até todos os quinze componentes individuais. Mais especificamente, este pelo menos um componente individual está incluído no aditivo da invenção em uma quantidade como esta, para fornecer uma concentração na ração na faixa indicada na coluna quatro, ou coluna cinco, ou coluna seis da tabela A.

A presente invenção também se refere às composições de ração animal. As composições de ração animal ou dietas apresentam um teor relativamente alto de proteína. As dietas de aves e porcos podem ser caracterizadas da maneira indicada na tabela B de WO 01/58275, colunas 2-3. As dietas de peixe podem ser caracterizadas da maneira indicada na coluna 4 desta tabela B. Além do mais, tais dietas de peixe apresentam em geral um teor de gordura bruto de 200-310 g/kg.

WO 01/58275 corresponde à US 09/779334, que é aqui incorporada pela referência.

Uma composição de ração animal de acordo com a invenção apresenta um teor bruto de proteína de 50-800 g/kg e, além do mais, compreende pelo menos um polipeptídeo aqui reivindicado.

Além do mais ou em alternativa (para o teor bruto de proteína indicado anteriormente), a composição de ração animal da invenção apresenta um teor de energia metabolizável de 10-30 MJ/kg; e/ou um teor de cálcio de 0,1 -200 g/kg; e/ou um teor de fósforo disponível de 0,1 -200 g/kg; e/ou um teor de metionina de 0,1-100 g/kg; e/ou um teor de metionina e cisteína de 0,1 -150 g/kg; e/ou um teor de lisina de 0,5-50 g/kg.

Em modalidades particulares, o teor de energia metabolizável, proteína bruta, cálcio, fósforo, metionina, metionina e cisteína e/ou lisina está em qualquer uma das faixas 2, 3, 4 ou 5 na tabela B de WO 01/58275 (R. 25)·

A proteína bruta é calculada como nitrogênio (N) multiplicado por um fator 6,25, isto é, proteína bruta (g/kg)= N (g/kg) x 6,25. O teor de nitrogênio é determinado pelo método Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis 14^a edição, Association of Official Analytical Chemists, Washington DC).

A energia metabolizável pode ser calculada com base na NRC publication Nutrient requirements in swine, nona edição revisada 1988, subcommittee on swine nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, national research council. National Academy Press, Washington, D.C., pp. 2-6 e no European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs, Spelderholt centre for poultry research and extension, 7361 DA Beekbergen, Holanda. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN 9071463-12-5.

O teor de cálcio na dieta, fósforo disponível e aminoácidos em dietas animais completas, são calculados com base nas tabelas de ração tais como Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pkLelystad. ISBN 90-72839-13-7.

Em uma modalidade particular, a composição da ração animal da invenção contém pelo menos uma proteína. A proteína pode ser uma proteína animal, tal como came e farinha de osso, e/ou farinha de peixe; ou pode ser uma proteína vegetal. O termo proteínas vegetais, da maneira aqui usada, refere-se a qualquer composto, composição, preparação ou mistura que inclui pelo menos uma proteína derivada ou originada de um vegetal, incluindo proteínas modificadas e derivados de proteína. Em modalidades particulares, o teor de proteína das proteínas vegetais é pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, ou 60 % (p/p).

As proteínas vegetais podem ser derivadas de fontes de proteína vegetal, tais como legumes e cereais, por exemplo, materiais de plantas das famílias Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae e Poaceae, tais como farelo de soja, farinha de tremoço e farinha de canola.

Em uma modalidade particular, a fonte da proteína vegetal é o material de uma ou mais plantas da família Fabaceae, por exemplo soja, tremoço, ervilha ou feijão.

Em uma outra modalidade particular, a fonte de proteína vegetal é o material de uma ou mais plantas da família Chenopodiaceae, por exemplo, beterraba, espinafre ou quinoa.

Outros exemplos de fontes de proteína vegetal são semente de canola, semente de girassol, semente de algodão e repolho.

A soja é uma fonte de proteína vegetal preferida.

Outros exemplos de fontes de proteína vegetal são cereais tais como cevada, trigo, centeio, aveia, milho (grão de milho), arroz, triticale e sorgo.

Ainda em modalidades particulares adicionais, a composição da ração animal da invenção contém 0-80 % de milho; e/ou 0-80 % de sorgo; e/ou 0-70 % de trigo; e/ou 0-70 % de cevada; e/ou 0-30 % de aveias; e/ou 040 % de farelo de soja; e/ou 0-25 % de farinha de peixe; e/ou 0-25 % de carne e farinha de osso; e/ou 0-20 % de soro de leite.

As dietas de animal podem ser, por exemplo, fabricadas as ração moída (não pelotizada) ou ração pelotizada. Tipicamente, os produtos alimentícios moídos são misturados e quantidades suficientes de vitaminas e minerais essenciais são adicionadas de acordo com as especificações para a espécie em questão. Os polipeptídeos podem ser adicionados como formulações sólidas ou líquidas de polipeptídeo. Por exemplo, uma formulação sólida de polipeptídeo é adicionada tipicamente antes ou durante a etapa de mistura; e uma preparação líquida de polipeptídeo é adicionada tipicamente após a etapa de pelotização. O polipeptídeo também pode ser incorporado em um aditivo de ração ou pré-mistura.

A concentração final de polipeptídeo na dieta está na faixa de 0,01 -200 mg de proteína de polipeptídeo por kg de dieta, por exemplo, na faixa de 5-30 mg de proteína de polipeptídeo por kg de dieta animal.

A fitase da invenção pode ser aplicada certamente em uma quantidade eficiente, isto é, em uma quantidade adequada para melhorar a solubilização e/ou melhorar o valor nutricional da ração. Contempla-se atualmente que o polipeptídeo é administrado em uma ou mais das quantidades a seguir (faixas de dosagem): 0,01 -200; 0,01 -100; 0,5-100; 1 50; 5-100; 10-100; 0,05-50; ou 0,10-10, todas estas faixas estando em mg de proteína de polipeptídeo de fitase por kg de ração (ppm).

Para determinar mg de proteína de polipeptídeo de fitase por kg de ração, a fitase é purificada a partir da composição de ração, e a atividade específica da fitase purificada é determinada usando um ensaio relevante. A atividade de fitase da composição de ração como tal também é determinada usando o mesmo ensaio, e com base nestas duas determinações, a dosagem em mg de proteína de fitase por kg de ração é calculada.

Os mesmos princípios se aplicam para determinar mg de proteína de polipeptídeo de fitase em aditivos de ração. Certamente, se uma amostra for disponível da fitase usada para preparar o aditivo de ração ou a ração, a atividade específica é determinada a partir desta amostra (sem necessidade de purificar a fitase da composição de ração ou do aditivo).

Métodos para sintetizar produtos de fermentação

Ainda um outro aspecto da presente invenção se refere aos métodos para sintetizar um produto de fermentação tais como, por exemplo, etanol, cerveja, vinho, grãos de destilação secos (DDG), em que a fermentação é realizada na presença de uma fitase produzida pela presente invenção.

Exemplos de processos de fermentação incluem, por exemplo, os processos descrito em WO 01/62947. A fermentação é realizada usando um microrganismo fermentador tal como levedura.

Em uma modalidade particular, a presente invenção fornece métodos para sintetizar produto de fermentação, compreendendo (a) fermentar (usando um microrganismo fermentador, tal como levedura) um material contendo carboidrato (por exemplo, amido) na presença de uma fitase da presente invenção, e (b) sintetizar o produto de fermentação a partir do material contendo carboidrato fermentado.

Em uma modalidade particular, a presente invenção fornece métodos para produzir etanol, compreendendo fermentar (usando um microrganismo fermentador, tal como levedura) um material contendo carboidrato (por exemplo, amido) na presença de uma fitase da presente invenção, e produzir ou recuperar etanol a partir do material contendo carboidrato fermentado.

Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece métodos para produzir etanol compreendendo a) hidrolisar amido, por exemplo, por um processo de liquefação e/ou sacarificação, um processo de hidrólise de amido bruto, b) fermentar o amido resultante na presença de uma fitase da presente invenção e c) produzir etanol.

A fitase pode ser adicionada ao processo de fermentação em qualquer estágio adequado e em qualquer composição adequada, incluindo sozinha ou em combinação com outra enzimas, tais como uma ou mais alfaamilases, glucoamilases, proteases e/ou celulases.

Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece métodos para produzir etanol compreendendo hidrolisar a biomassa e fermentar (usando um microrganismo fermentador, tal como levedura) a biomassa resultante na presença de uma fitase da presente invenção.

A invenção aqui descrita e reivindicada não deve ser limitada no escopo pelas modalidades específicas aqui reveladas, uma vez que estas modalidades são pretendidas como ilustrações de vários aspectos da invenção. Pretende-se que qualquer das modalidades equivalentes estejam no escopo desta invenção. De fato, várias modificações da invenção, além daquelas aqui mostradas e descritas, se tomarão evidentes aos versados na técnica a partir da descrição precedente. Tais modificações também são pretendidas para estar no escopo das reivindicações em anexo. No caso de conflito, a presente revelação que inclui as definições prevalecerá.

Várias referências são aqui citadas, cujas revelações são incorporadas pela referência na sua íntegra.

Exemplos

Os produtos químicos usados são produtos comerciais de pelo menos grau reagente.

Exemplo 1: Preparação de variantes e determinação da atividade

Preparação de variantes de fitase

Expressão de variantes de fitase em Aspergillus oryzae

Os construtos compreendendo os genes de variante de fitase de Buttiauxella são usados para construir vetores de expressão para Aspergillus. Os vetores de expressão de Aspergillus podem consistir em um cassete de expressão baseado no promotor de amilase II neutra de Aspergillus niger, fundido à sequência principal não traduzida de triose fosfato isomerase (Pna2/tpi) de Aspergillus nidulans e ao finalizador de amiloglicosidase (Tamg)de Aspergillus niger. O marcador seletivo pyrG Aspergillus, de Aspergillus nidulans que possibilita o crescimento em meios mínimos para um Aspergillus e que não apresenta pyrG, também pode estar presente no plasmídeo. Os plasmídeos de expressão para variantes de fitase são transformados em Aspergillus, da maneira descrita em Lassen et al. (2001), Applied and Environmental Micorbiology, 67, 4701-4707. Para cada um dos construtos, 4-6 cepas podem ser isoladas, purificadas e cultivadas em placas de microtitulação. A expressão é determinada usando um substrato de pnitrofenil fosfato. A cepa de melhor produção pode ser fermentada em frascos de agitação.

Purificação de variantes de fitase de Buttiauxella

O sobrenadante da fermentação com o variante de fitase foi filtrado por meio de um filtro na tampa da garrafa Fast PES com um corte de 0,22 pm. A solução resultante foi diluída com água para dobrar o volume, e o pH foi ajustado para 4,5 com ácido acético. Ocasionalmente, a solução se tomou um pouco turva e isto foi removido por filtração, através de um filtro na tampa da garrafa Fast PES com um corte de 0,22 pm.

Após o pré-tratamento, o variante de fitase é purificado por cromatografia em S Sepharose, aproximadamente 30 mL em uma coluna XK26, usando como tampão A acetato de sódio 50 mM pH 4,5, e como tampão B acetato de sódio 50 mM + NaCl IM pH 4,5. As frações da coluna foram analisadas com relação à atividade usando o ensaio de fosfatase (ver a seguir), e as frações com atividade são agrupadas.

Em alguns casos, a solução contendo o variante de fitase purificado é concentrada usando um dispositivo de filtração Amicon ultra-15, com uma membrana com corte de 30 kDa.

Determinação da atividade da fosfatase microlitros de solução de enzima contendo fitase são dispensados em um poço de uma placa de microtitulação, por exemplo, NUNC 269620 e 75 microlitros de substrato são adicionados (para preparar o substrato, dois comprimidos de p-nitrofenil fosfato de 5 mg (Sigma, Cat.No. N-9389) são dissolvidos em 10 mL acetato de sódio tampão 0,1 M, pH 5,5). A placa é selada e incubada por 15 minutos, agitada com 750 rpm a 37 °C. Após o período de incubação, 75 microlitros de reagente de finalização são adicionados (o reagente de finalização é tetraborato de dissódio 0,lM em água) e a absorbância a 405 nm é medida em um espectrofotômetro para placa de microtitulação. Uma unidade de fosfatase é definida como a atividade de enzima que libera 1 micromol de fosfato/min nas dadas condições de reação (subtraído do tampão protegido). A absorbância de 1 micromol de pnitrofenol é determinada para ser 56 AU (AU= unidades de absorbância) nas condições do ensaio.

Determinação da atividade de fitase microlitros de solução de enzima contendo fitase, diluída apropriadamente em acetato de sódio 0,25M, Tween-20 a 0,005 % (p/v) pH 5,5, são dispensados em um poço de uma placa de microtitulação, por exemplo, NUNC 269620, e 75 microlitros de substrato são adicionados (preparado dissolvendo 100 mg de fitato de sódio de arroz (Aldrich Cat.No. 274321) em 10 mL acetato de sódio tampão 0,25M, pH 5,5). A placa é selada e incubada por 15 minutos, agitada com 750 rpm a 37 °C. Após incubação, 75 microlitros de reagente de finalização são adicionados (o reagente de finalização que é misturado preparando 10 mL de solução de molibdato (10 % (p/v) de hepta-molibdato de amônio em solução de amônia 0,25 % (p/v)), 10 mL de vanadato de amônio (0,24 % de produto comercial da Bie&Bemtsen, Cat.No. LABÍ7650) e 20 mL de ácido nítrico a 21,7 % (p/v)), e a absorbância a 405nm é medida em um espectrofotômetro para placa de microtitulação. A atividade de fitase é expressa na unidade de FYT, uma FYT sendo a quantidade de enzima que libera 1 micromol de ortofosfato inorgânico por minuto nas condições anteriores. Um valor absoluto para a atividade de fitase medida pode ser obtido por referência a uma curva padrão, preparada a partir de diluições apropriadas de fosfato inorgânico, ou por referência a uma curva padrão realizada a partir de diluições de uma preparação de enzima fitase com atividade conhecida (tal preparação de enzima padrão com uma atividade conhecida é disponível quando requisitada pela Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd).

Exemplo 2: Atividade específica

A atividade específica de um variante de fitase é determinada em amostras altamente purificadas, dialisadas contra acetato de sódio 250 mM, pH 5,5. A pureza é verificada de antemão em um gel de SDS poliacrilamida, mostrando a presença de apenas um componente.

A concentração da proteína é determinada por análise de aminoácido da maneira a seguir: Uma alíquota da amostra é hidrolisada em HCl 6N, fenol a 0,1 %, por 16 horas a 110 °C, em um tubo de vidro de vácuo. Os aminoácidos resultantes são quantificados usando um sistema de análise de aminoácidos da Applied Biosystems 420A, operado de acordo com as instruções do fabricante. A partir das quantidades dos aminoácidos, a massa total, e assim também a concentração, de proteína na alíquota hidrolisada pode ser calculada.

A atividade de fitase é determinada nas unidades de FYT da maneira descrita no exemplo 1 (Determinação da atividade de fitase), e a atividade específica é calculada como a atividade de fitase medida em unidades de FYT por mg de proteína enzimática variante de fitase.

Exemplo 3: Termoestabilidade por DSC

A termoestabilidade da fitase de Buttiauxella (GENESEQP número de acesso AEH25051) e do variante E54C/A101C/Q143C/I201C, ambos purificados da maneira descrita no exemplo 1, foi determinada por calorimetria diferencial de varredura (DSC) usando um instrumento VPcapillary DSC (MicroCai Inc., Piscataway, NJ, USA), equipado com um sistema de auto amostragem. A temperatura de desnaturação térmica, Td (°C), foi obtida como o ponto superior do pico de desnaturação (pico endotérmico principal) em termogramas (Cp vs. T), obtida após aquecer as soluções de fitase em acetato de sódio 50 mM pH 5,0 e Triton X 100 ppm, em uma taxa de aquecimento programada constante.

A amostra e as soluções de referência (aproximadamente 0,5 mL) foram pré-equilibradas termicamente por 10 minutos a 20 °C, e a varredura DSC foi realizada de 20 a 80 °C em uma taxa de varredura de 200 K/hora. O tratamento dos dados é realizado usando o software MicroCal Origin (versão 7.0383). As temperaturas de desnaturação foram determinadas com uma precisão de aproximadamente +/- 0,5 °C.

Tabela 2. Termoestabilidade comparativa de fitases de Buttiauxella

Fitase	Td (°C)
AEH25051	56,5
E54C/A101C/Q143C/I201 C=A/C	63,1

Os experimentos de DSC mostram que o variante E54C/A101C/Q143C/I201C apresenta uma termoestabilidade significativamente melhor, comparado à fitase de referência de Buttiauxella (AEH25051).

Exemplo 4: Perfil de temperatura

O perfil de temperatura (atividade de fitase como uma função de temperatura) foi determinado para a fitase de Buttiauxella (GENESEQP número de acesso AEH25051) e variantes na faixa de temperatura de 20-80 °C, essencialmente da maneira descrita anteriormente (Determinação da atividade de fitase). Entretanto, as reações enzimáticas (100 microlitros de solução de enzima contendo fitase +100 microlitros de substrato) foram realizadas em tubos de PCR em vez de placas de microtitulação. Após um período de reação de 15 minutos em temperatura desejada, os tubos foram resfriados a 10 °C por 30 segundos e 150 microlitros de cada mistura de reação foram transferidos para uma placa de microtitulação. 75 microlitros de reagente de finalização foram adicionados e a absorbância a 405 nm foi medida em um espectrofotômetro para placa de microtitulação. Os resultados são sumarizados na tabela 3 a seguir. Os números fornecidos para cada temperatura são a atividade relativa (em %) normalizada no valor ideal.

Tabela 3: Perfis de temperatura relativa

Variante de fitase	Temperatura (°C)
	20	30	40	50	55	60	63	65	67	70	75	80
AEH25051	27	43	64	84	100	98	68	26	14	9	7	7
D33C/E54C/A101C/W179C=B/C	26	44	66	88	98	100	92	66	38	10	7	5
E54C/A101C/Q143C/I201C=A/C	26	45	66	87	100	96	79	52	32	10	7	6

Para ambos os variantes os perfis de temperatura são deslocados para temperatura mais elevada, comparado ao perfil de temperatura da fitase de referência de Buttiauxella (AEH25051).

Exemplo 5: Desempenho na ração animal em um modelo in vitro

O desempenho na ração animal de inúmeros variantes de fitase da invenção é comparado em um modelo in vitro com o desempenho de uma proteína de referência, tal como SEQ ID NO:2. O modelo in vitro simula as condições gastrointestinais em um animal monogástrico e correlaciona bem com os resultados obtidos em testes com animal in vivo. A versão usada neste exemplo simula o papo e moela de um frango de corte. A comparação é realizada da maneira a seguir:

Atividade de fitase na amostra variante é determinada da maneira descrita no exemplo 1 em Determinação da atividade de fitase.

As pelotas de ração de um teste de alimentação de frango de corte, e com milho, farelo de soja e óleo de soja como os principais constituintes, são pré-incubadas a 40 °C e pH 4,6 por 5 minutos, seguido pela adição de dosagens adequadas das fitases (dosagens idênticas são usadas para todas as fitases a serem testadas para permitir comparação), por exemplo, entre 125 a 1.000 unidades de fitase FYT/kg de ração, ou tampão nas amostras controle. Após 5 minutos de incubação, a pepsina (3.000 U/g de ração) em uma solução de HCl é adicionada e, desta maneira, o pH é reduzido para 3. As amostras são então incubadas a 40 °C por mais 5 minutos.

As reações são finalizadas e ácido fítico e inositol-fosfatos são extraídos pela adição de HCl em uma concentração final de 0,5 M e incubação a 40 °C por 2 horas, seguido por um ciclo de congelamentodescongelamento e 1 hora de incubação a 40 °C.

O ácido fítico e inositol-fosfatos são separados por cromatografia iônica de alto desempenho, descrita por Chen et al., no Journal of Chromatography A (2003) vol. 1018, pp. 41 - 52, e quantificados da maneira descrita por Skoglund et al., em J. Agric. Food Chem. (1997), vol. 45, pp. 431-436.

A degradação de fitase é então calculada como a diferença no inositol-6-fosfato ligado ao fósforo (IP6-P) entre as amostras de fitase tratada e não tratada. O desempenho relativo do variante é calculado como a degradação percentual de fitase pela fitase tipo selvagem.

Exemplo 6: Desempenho em um teste com porco in vivo

Avaliação comparativa dos efeitos de quantidades graduadas da fitase tipo selvagem de Buttiauxella e um variante na digestibilidade fecal e excreção de fósforo e cálcio em porcos em crescimento.

Sessenta e quatro porcos Large White x Landrace com um peso corporal inicial de 43,55 ± 4,35 kg são usados.

Os animais são alojados em gaiolas de chão em um quarto com ambiente controlado. Cada gaiola apresenta um chão soldado revestido de plástico, e é equipada com dois bebedouros de água e quatro comedouros de aço inoxidável individualizados. A temperatura do quarto foi 21-22° Cea umidade percentual foi 50 %.

Os porcos são alimentados com uma dieta basal formulada para fornecer fósforo (P), exclusivamente a partir da origem vegetal, durante um período adaptativo de 14 dias. Após este período, são alocados em 16 grupos iguais de 4 animais cada.

Eles são alimentados por 12 dias com a dieta basal, ou esta dieta suplementada com 1.000 ou 2.000 U/kg de fitase tipo selvagem de Buttiauxella, ou com 500, 1.000 ou 2.000 U/kg do variante determinado 100 com 2 ligações dissulfeto adicionais.

Um investigador indigerível (óxido de cromo) é adicionado em uma concentração de 0,4 % em todas as dietas, permitindo o cálculo da digestibilidade de P e cálcio (Ca). A ração é distribuída ad libitum na forma de papa, com controle do consumo da ração por gaiola e os animais têm livre acesso para beber água. A digestibilidade de Ca não é corrigida para a absorção de Ca com a ingestão de água.

As concentrações fecais de P, Ca e Cr são medidas no 12° dia do segundo período. As fezes foram amostradas individualmente, aproximadamente na mesma quantidade e no mesmo período do dia, durante os últimos 3 dias anteriores desta data. Assim, para cada tratamento alimentar, e para cada critério, um total de 12 determinações individuais é realizada. Todos os minerais são determinados de acordo com métodos padrões da Association of Official Analytical Chemists (1990), usando um espectrômetro Vista-MPX ICP-OES. A digestibilidade aparente (% da absorção) dos minerais é calculada para o período de 3 dias mencionado.

Claims (9)

1. Método para produzir um variante de fitase com uma termoestabilidade melhorada e/ou um perfil de temperatura melhorado quando comparado com a fitase parental, em que a fitase parental tem a SEQ ID NOs: 2 ou 4, a SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 mutadas ou a SEQ ID NO: 6 e em que o variante de fitase é caracterizado pelo fato de que tem duas ou três pontes dissulfeto comparado à SEQ ID NO:2, em que as ditas pontes dissulfetos não estão entre aquelas quatro de ocorrência natural nas posições 79/110, 135/410, 180/189 e 384/393, e em que as pontes dissulfetos são estabelecidas em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste nos pares de posição: A) 143C/201C, B) 33C/179C e C) 54C/101C.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o número de pontes dissulfeto estabelecido é dois, usando as seguintes combinações de pares de posição: A+B, A+C e B+C, em que A significa 143C/201C, B significa 33C/179C e C significa 54C/101C.

3. Variante de fitase, caracterizado pelo fato de que é produzido por um método como definido na reivindicação 1 ou 2, com uma termoestabilidade melhorada e/ou um perfil de temperatura melhorado, em que o variante de fitase:

a) atem a SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, a SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 mutadas ou a SEQ ID NO: 6, a qual tem duas ou três pontes dissulfeto comparado à SEQ ID NO:2, em que as ditas pontes dissulfetos não estão entre aquelas quatro de ocorrência natural nas posições 79/110, 135/410, 180/189 e 384/393, e em que as pontes dissulfetos são estabelecidas em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste nos pares de posição: A) 143C/201C, B) 33C/179C e C) 54C/101C.

4. Composição, caracterizada pelo fato de que contém uma variante de fitase como definido na reivindicação 3, e (a) uma vitamina solúvel em gordura;

Petição 870200007787, de 16/01/2020, pág. 8/10 (b) uma vitamina solúvel em água; e/ou (c) um mineral traço.

5. Composição de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que contém adicionalmente uma enzima selecionada dos

5 seguintes grupos de enzimas: amilase, fitase, fosfatase, xilanase, galactanase, alfa-galactosidase, protease, fosfolipase e/ou beta-glucanoase.

6. Método para melhorar o valor nutricional de uma ração animal, caracterizado pelo fato de que o variante de fitase como definido na reivindicação 3 é adicionado à ração.

10

7. Uso do variante de fitase como definido na reivindicação 3, ou da composição como definida na reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que é na ração animal, ou na preparação de ração animal.

8. Método para produzir um produto de fermentação, caracterizado pelo fato de que compreende fermentar um material com

15 carboidrato na presença do variante de fitase como definido na reivindicação 3.

9. Método para produzir etanol, caracterizado pelo fato de que compreende fermentar um material com carboidrato na presença do variante de fitase como definido na reivindicação 3 e produzir etanol.