DE60115602T2

DE60115602T2 - Verwendung von säurestabilen subtilisinproteasen in tierfutter

Info

Publication number: DE60115602T2
Application number: DE60115602T
Authority: DE
Inventors: Rahbek Peter OESTERGAARD; Carsten Sjoeholm; Anna-Marie Kluenter
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2000-02-08
Filing date: 2001-02-05
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2021-02-06
Also published as: JP2003521907A; AU3544601A; KR20020077421A; PL203212B1; JP4933013B2; EP1257175B1; CN101238853A; AU777210B2; EP1642506A2; CN100429990C; JP4777573B2; AU4236601A; BR0108164B1; JP2003521908A; TWI259759B; AU781415B2; DE60133802T2; CN1293191C; DE60115602D1; BR0108164A

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von säurestabilen Serinproteasen der Subtilisinfamilie in Tierfutter (in vivo) und die Verwendung solcher Proteasen zum Behandeln pflanzlicher Proteine (in vitro).
Proteine sind essentielle Nahrungsfaktoren für Tiere und Menschen. Der größte Teil des Viehbestands und viele Menschen erhalten die notwendigen Proteine aus pflanzlichen Proteinquellen. Wichtige pflanzliche Proteinquellen sind z. B. Ölsaaten, Hülsenfrüchte und Getreide.
Wenn z. B. Sojabohnenmehl in das Futter von monogastrischen Tieren wie z. B. Schweinen und Geflügel eingeschlossen ist, wird ein signifikanter Anteil der Feststoffe des Sojabohnenmehls nicht verdaut. Zum Beispiel beträgt die apparente ileale Proteinverdaubarkeit bei Ferkeln und Schweinen im Wachstum nur ungefähr 80 %.
Der Magen von monogastrischen Tieren und vielen Fischen zeigt einen stark sauren pH. Allerdings tritt der Hauptteil der Proteinverdauung im Dünndarm auf. Es besteht daher ein Bedarf an säurestabilen Proteasen, die die Passage durch den Magen überleben können.
Stand der Technik
Die Verwendung von Proteasen im Tierfutter oder zum Behandeln von pflanzlichen Proteinen ist aus den folgenden Dokumenten bekannt:
WO 95/28850 offenbart u. a. einen Tierfuttermittelzusatz enthaltend eine Phytase und ein proteolytisches Enzym. Verschiedene proteolytische Enzyme sind auf S. 7 spezifiziert.
WO 96/05739 offenbart einen Enzymfuttermittelzusatz enthaltend Xylanase und eine Protease. Geeignete Proteasen sind auf S. 25 aufgeführt.
WO 95/02044 offenbart u. a. sowohl Proteasen, die aus Aspergillus aculeatus stammen, als auch die Verwendung in Tierfuttermitteln.
US 3966971 offenbart ein Verfahren zum Erhalten eines Proteins aus einer pflanzlichen Proteinquelle durch Behandeln mit einer sauren Phytase und ggf. einem proteolytischen Enzym. Geeignete Proteasen sind in Spalte 2 spezifiziert.
US 4073884 , US 5047240 , US 3868448 , US 3823072 und US 3683069 beschreiben Proteasezubereitungen, die aus verschiedenen Stämmen von Streptomyces stammen, und ihre Verwendung in Tierfuttermittel.
Diese Proteasen sind allerdings nicht säurestabil und/oder keine Proteasen der Subtilisinfamilie.
In "Animal Feed Science and Technology", Band 71, 1998, S. 177-183, offenbaren Caine et al. die Verwendung von Subtilisinprotease bei der Behandlung von Sojabohnenmehl zur Verwendung als Tierfuttermittel. Es gibt keinen Hinweis auf die Säurestabilität der verwendeten Protease und obwohl saure Inkubations-pH-Werte beschrieben sind (vgl. Tabelle 1), wird erwartet, dass der tatsächliche pH-Wert der Kulturröhrchen aufgrund der Pufferkapazität des zugegebenen Sojabohnenmehls höher ist.
WO 95/21540 offenbart die Verwendung von Proteasen in Tierfuttermitteln, um die Genießbarkeit zu verbessern. Die verwendeten Proteasen sind nicht säurestabil.
WO 99153038 offenbart eine Subtilisinprotease, die in einigen Anwendungen, einschließlich der Herstellung von Tierfutter, verwendet werden kann. Es gibt keinen Hinweis auf Säurestabilität. Die pH-Werte sollten allerdings nicht niedriger als 6,5 sein.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Einige Proteasen wurden nun identifiziert, von denen gefunden wurde, dass sie säurestabil sind, und von denen erwartet wird, dass sie eine verbesserte Funktion im Tierfutter besitzen. Diese Proteasen gehören zu der Gruppe der Proteasen, die als Subtilisine bekannt sind.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die vorliegende Erfindung wird weiter durch Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen illustriert, in denen:
1 zeigt pH-Stabilitäts-Kurven, nämlich die Restproteaseaktivität von vier Proteasen (einer säurestabilen Protease der Subtilisinfamilie, die aus Bacillus sp. NCIMB 40484 (PD 498) stammt, und drei Referenzproteasen (Sub.Novo und Sub.Novo (Y217L), die beide aus Bacillus amyloliquefaciens stammen, und SAVINASE^TM) nach zweistündiger Inkubation bei einer Temperatur von 37 °C und bei pH-Werten im Bereich von pH 2 bis pH 11; die Aktivität bezieht sich auf die Restaktivität nach einer zweistündigen Inkubation bei pH 9,0 und 5 °C;
2 zeigt pH-Aktivitäts-Kurven, nämlich die Proteaseaktivität zwischen pH 3 und pH 11 bezüglich der Proteaseaktivität bei optimalem pH der gleichen vier Proteasen;
3 zeigt Temperatur-Aktivitäts-Kurven bei pH 9,0, nämlich die Proteaseaktivität bei pH 9,0 zwischen 15 °C und 80 °C bezüglich der Proteaseaktivität bei optimaler Temperatur der gleichen vier Proteasen;
4 zeigt pH-Stabilitäts-Kurven ähnlich zu 1, aber für sechs andere säurestabile Proteasen der Subtilisinfamilie, die aus Bacillus alcalophilus NCIMB 10438, Fusarium oxysporum IFO 4471, Paecilomyces lilacinus CBS 102449, Aspergillus sp. CBS 102448, Acremonium chrysogenum ATCC 48272, Acremonium kiliense ATCC 20338 stammen;
5 zeigt pH-Aktivitäts-Kurven ähnlich zu 2, aber für die gleichen Proteasen wie in 4 und
6 zeigt Temperatur-Aktivitäts-Kurven bei pH 9,0 ähnlich zu 3, aber für die gleichen Proteasen wie in 4.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Der Begriff Protease, wie er hierin verwendet wird, ist ein Enzym, das Peptidbindungen hydrolysiert (Proteaseaktivität besitzt). Proteasen werden z. B. auch bezeichnet mit Peptidasen, Proteinasen, Peptidhydrolasen oder proteolytische Enzyme.
Bevorzugte Proteasen zur erfindungsgemäßen Verwendung sind solche vom Endotyp, die innerhalb einer Polypeptidkette wirken (Endopeptidasen). Endopeptidasen zeigen Aktivität auf N- und C-terminal blockierte Peptidsubstrate, die für die Spezifität der fraglichen Protease relevant sind.
Eingeschlossen in die obige Definition der Protease sind alle Enzyme, die zu der Enzymgruppe EC 3.4 (einschließlich jeder der 13 Unterunterklassen hiervon) der EC-Aufstellung (Enzyme Nomenclature 1992 von NC-IUBMB, 1992), wie sie regelmäßig ergänzt und aktualisiert wird, siehe z. B. im World Wide Web (www) unter http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html, gehört.
Die Proteasen werden auf Grundlage ihrer katalytischen Mechanismen in die folgenden Gruppierungen klassifiziert: Serinproteasen (S), Cysteinproteasen (C), Aspartylproteasen (A), Metalloproteasen (M) und unbekannte oder bisher noch nicht klassifizierte Proteasen (U), siehe „Handbook of Proteolytic Enzymes", A.J.Barrett, N.D.Rawlings, J.F.Woessner (Hersg.), Academic Press (1998), insbesondere der allgemeine Einleitungsteil.
Der Begriff Serinprotease bezieht sich auf Serinpeptidasen und ihre wie in vorstehend genanntem Handbuch beschriebenen Familien. In der Ausgabe dieses Handbuchs von 1998 werden die Serinpeptidasen und ihre Familie in den Kapiteln 1 bis 175 behandelt.
In einer besonderen Ausführungsform sind die Serinproteasen Peptidasen, in welchen der katalytische Mechanismus von der Hydroxylgruppe eines Serinrests abhängt, der als ein Nukleophil wirkt, das die Peptidbindung angreift.
Die Begriffe Subtilisine oder Subtilisinfamilie, wie sie hierin verwendet werden, sind beabsichtigt, alle SB-Serinproteasen der Familie, insbesondere ihre Familie S8, einzuschließen (die Familie SB wird in Kapitel 93 des oben genannten Handbuchs behandelt). Bei den Subtilisinen ist die Reihenfolge der katalytischen Triade Asp-His-Ser. Die Tertiärstruktur schließt sowohl alpha-Helices als auch beta-Blätter ein. Die Familie SB schließt sowohl Endopeptidasen als auch Exopeptidasen ein. Diese Peptidasen sind aus Bakterien, Archae-Bakterien und Eukaryoten, bekannt; es gibt einen einzigen Repräsentanten aus einem DNA-Virus.
Zum Bestimmen, ob eine gegebene Protease ein Subtilisin ist oder nicht, wird auf das oben genannte Handbuch und die darin angegebenen Prinzipien verwiesen. Eine solche Bestimmung kann für alle Typen von Proteasen durchgeführt werden, sowohl als natürlich vorkommende oder Wildtyp-Proteasen oder gentechnisch veränderte oder synthetische Proteasen.
Als Alternative hierzu können Inhibitionsstudien mit SSI (dem Subtilisin-Inhibitor aus Streptomyces) durchgeführt werden und ein Subtilisin ist definiert als eine Protease mit bis zu 10 % Restaktivität bei Inkubation mit einem molaren Überschuss an SSI. Dieser Test kann wie in Beispiel 8 beschrieben durchgeführt werden. In einer besonderen Ausführungsform dieser Definition hat das Subtilisin bis zu 8 %, bis zu 6 % oder bis zu 5 % Restaktivität. Der Ausdruck „bis zu" wird als gleichbedeutend mit dem Ausdruck „weniger als oder gleich" betrachtet.
Die Proteaseaktivität kann unter Verwendung eines jeden Tests gemessen werden, in welchem ein Substrat eingesetzt wird, das Peptidbindungen, die für die Spezifität der fraglichen Protease relevant sind, einschließt. Der Test-pH und die Testtemperatur sind gleichermaßen an die in Frage stehende Protease anzupassen. Beispiele von Test-pH-Werten sind pH 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder 11. Beispiele von Testtemperaturen sind 25, 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65 oder 70 °C.
Beispiele von Proteasesubstraten sind Casein und pNA-Substrate wie z. B. Suc-AAPF-pNA (erhältlich z. B. von Sigma 5-7388). Die Großbuchstaben in diesen pNA-Substraten beziehen sich auf den Einbuchstabencode für Aminosäuren. Ein anderes Beispiel ist Protazyme AK (mit Azurin-gefärbtes kreuzvernetztes Casein, hergestellt als Tabletten von Megazyme T- PRAK). Für pH-Aktivitäts- und pH-Stabilitäts-Studien ist das pNA-Substrat bevorzugt, wohingegen für Temperatur-Aktivitäts-Studien das Protazyme AK Substrat bevorzugt ist.
Beispiele von Proteasetests sind in dem experimentellen Teil beschrieben.
Es gibt keine Beschränkung hinsichtlich des Ursprungs der Protease für die erfindungsgemäße Verwendung. Daher schließt der Begriff Protease nicht nur natürliche oder Wildtyp-Proteasen, sondern auch jede Mutante, Variante, Fragmente etc. hiervon, die Proteaseaktivität zeigen, wie auch synthetische Proteasen wie zum Beispiel Shuffled-Proteasen und Konsensus-Proteasen, ein. Solche gentechnisch veränderten Proteasen können, wie allgemein im Stand der Technik bekannt, hergestellt werden zum Beispiel durch ortgerichtete Mutagenese, durch PCR (unter Verwendung eines PCR-Fragments, das die gewünschte Mutation als einen der Primer der PCR-Reaktionen enthält) oder durch zufällige Mutagenese. Die Herstellung von Konsensus-Proteinen ist z. B. in EP 897985 beschrieben.
Beispiele von säurestabilen Proteasen der Subtilisinfamilie zur erfindungsgemäßen Verwendung sind:

(i) die Proteasen, die vom Bacillus sp. NCIMB 40484, Bacillus alcalophilus NCIMB 10438; Fusarium oxysporum IFO 4471; Paecilomyces lilacinus CBS 102449, Aspergillus sp. CBS 102448, Acremonium chrysogenum ATCC 48272 und Acremonium kiliense ATCC 20338 stammen;
(ii) Proteasen mit mindestens 70, 75, 80, 85, 90 oder mindestens 95 % Aminosäureidentität zu jeder beliebigen der Proteasen von (i);
(iii) Proteasen mit mindestens 74, 75, 84, 85, 94 oder mindestens 95 % Identität zu jeder beliebigen der SEQ ID Nr.: 1, SEQ ID Nr.: 2, SEQ ID Nr.: 3 oder SEQ ID Nr.: 4;
(iv) Proteasen mit mindestens 70, 75, 80, 85, 90 oder mindestens 95 % Aminosäureidentität zu jeder beliebigen der SEQ ID Nr.: 5 (der Gesamtsequenz 1 bis 397 oder deren Fragmente 28 bis 397 oder 118 bis 397), SEQ ID Nr.: 6 (der Gesamtsequenz 1 bis 367 oder deren Fragmente 70 bis 367 oder 84 bis 367) oder SEQ ID Nr.: 7.

Zum Berechnen der prozentualen Identität kann jedes im Stand der Technik bekannte Computerprogramm verwendet werden, wie z. B. GAP, das in dem GCG Version 8 Programmpaket (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. und Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453) bereitgestellt wird, wobei GAP mit den folgenden Einstellungen für Polypeptid-Sequenz-Vergleich verwendet wird: GAP creation penalty von 5,0 und GAP extension penalty von 0,3.
In einer besonderen Ausführungsform ist die Protease zur erfindungsgemäßen Verwendung eine mikrobielle Protease, wobei der Begriff mikrobiell anzeigt, dass die Protease von einem Mikroorganismus abgeleitet ist oder von diesem stammt oder ein Analog, ein Fragment, eine Variante, eine Mutante oder eine synthetische Protease ist, die von einem Mikroorganismus abgeleitet ist. Sie kann in dem ursprünglichen mikrobiellen Wildtypstamm, in einen anderen mikrobiellen Stamm oder in einer Pflanze hergestellt oder exprimiert werden; d. h. der Begriff deckt die Expression von Wildtyp, natürlich vorkommenden Proteasen wie auch die Expression von rekombinanten, gentechnisch veränderten oder synthetischen Proteasen in jedem beliebigen Wirt ab.
Der Begriff Mikroorganismus, wie er hierin verwendet wird, schließt Archae-Bakterien, Bakterien, Pilze, Viren etc. ein.
Beispiele von Mikroorganismus sind Bakterien wie z. B. Bakterien des Genus Bacillus, z. B. Bacillus sp. NCIMB Nr. 40484; Bacillus alcalophilus NCIMB 10438 oder Mutanten oder Varianten hiervon, die Proteaseaktivität zeigen.
Andere Beispiele von Mikroorganismen sind Pilze, wie z. B. Hefe oder filamentöse Pilze, z. B. ausgewählt aus den Genera Paecilomyces, z. B. Paecilomyces lilacinus CBS 102449, Aspergillus, z. B. Aspergillus sp. CBS 102448, Acremonium, z. B. Acremonium chrysogenum ATCC 48272, Acremonium kiliense ATCC 20338 oder Fusarium, z. B. Fusarium oxysporum IFO 4471; oder Mutanten oder Varianten hiervon, die Proteaseaktivität zeigen.
In einer anderen Ausführungsform ist die Protease eine Pflanzenprotease. Ein Beispiel einer Protease pflanzlichen Ursprungs ist die Protease aus dem Sarcocarp der Melone (Kaneda et al, J.Biochem. 78, 1287-1296 (1975).
Der Begriff Tiere schließt alle Tiere, einschließlich des Menschen, ein. Beispiele von Tieren sind Nichtwiederkäuer und Wiederkäuer wie z. B. Kühe, Schafe und Pferde. In einer besonderen Ausführungsform ist das Tier ein nicht wiederkäuendes Tier. Nicht wiederkäuende Tiere schließen monogastrische Tiere z. B. Schweine (pigs) oder Schwein (swine) (einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Ferkel, Schweine im Wachstum und Säue), Geflügel wie z. B. Truthahn oder Hühnchen (einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein Hähnchen, Legehühner), junge Kälber und Fisch (einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Lachs) ein.
Der Begriff Futtermittel oder Futtermittelzusammensetzung meint jede Verbindung, Zubereitung, Mischung oder Zusammensetzung, die für die Aufnahme durch ein Tier geeignet oder beabsichtigt ist.
In der erfindungsgemäßen Verwendung kann die Protease an ein Tier vor, nach oder gleichzeitig mit der Kost erfolgen. Das Letztere ist bevorzugt.
In dem vorliegenden Zusammenhang meint der Begriff säurestabil, dass die Proteaseaktivität des reinen Proteaseenzyms in einer Verdünnung einem A₂₈₀ = 1,0 entspricht und nach einer Inkubation von 2 Stunden bei 37 °C in dem folgenden Puffer:
100 mM Bernsteinsäure, 100 mM HEPES, 100 mM CHES, 100 mM CABS,
1 mM CaCl₂, 150 mM KCl, 0,01 % Triton^® X-100, pH 3,5
mindestens 40 % der Referenzaktivität beträgt, was unter Verwendung des hierin in Beispiel 2C beschriebenen Test gemessen wird (Substrat: Suc-AAPF-pNA, pH 9,0, 25 °C).
In besonderen Ausführungsformen der obigen Definition für Säurestabilität ist die Proteaseaktivität mindestens 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 oder mindestens 90 % der Referenzaktivität.
Der Begriff Referenzaktivität bezieht sich auf die Proteaseaktivität der gleichen Protease nach Inkubation in reiner Form in einer Verdünnung, die einer A₂₈₀ = 1,0 entspricht, für 2 Stunden bei 5 °C in dem folgenden Puffer: 100 mM Bernsteinsäure, 100 mM HEPES, 100 mM CHES, 100 mM CABS, 1 mM CaCl₂, 150 mM KCl, 0,01 % Triton^® X-100, pH 9,0, wobei die Aktivität wie oben beschrieben bestimmt wird.
Mit anderen Worten umfasst das Verfahren zum Bestimmen der Säurestabilität die folgenden Schritte:

a) Die zu testende Proteaseprobe (in reiner Form A₂₈₀= 1,0) wird in zwei Aliquots (I und II) aufgeteilt;
b) Aliquot I wird für 2 Stunden bei 37 °C und pH 3,5 inkubiert;
c) die Restaktivität von Aliquot I wird gemessen (pH 9,0 und 25 °C);
d) Aliquot II wird für 2 Stunden bei 5 °C und pH 9,0 inkubiert;
e) die Restaktivität von Aliquot II wird gemessen (pH 9,0 und 25 °C);
f) die prozentuale Restaktivität von Aliquot I in Bezug auf die Restaktivität von Aliquot II wird berechnet.

Alternativ kann in der obigen Definition der Säurestabilität der pH-Wert des Puffers in Schritt b) 2,0, 2,5, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3 oder 3,4 betragen.
In anderen alternativen Ausführungsformen der obigen Definition der Säurestabilität, betreffend die obigen alternativen pH-Werte des Puffers in Schritt b), ist die Restproteaseaktivität im Vergleich zur Referenz mindestens 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder mindestens 50 %.
In alternativen Ausführungsformen können pH-Werte von 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0 oder 8,5 für den Puffer in Schritt d) angewendet werden.
In der obigen Definition für Säurestabilität meint der Begriff A₂₈₀ = 1,0 eine solche Konzentration (Verdünnung) dieser reinen Protease, welche eine Absorption von 1,0 bei 280 nm in einer Küvette mit 1 cm Weglänge relativ zu einer Pufferleerprobe verursacht.
Und in der obigen Definition für Säurestabilität bezieht sich der Begriff reine Protease auf eine Probe mit einem A₂₈₀/A₂₆₀-Verhältnis über oder gleich 1,70 (siehe Beispiel 2E) und von der mittels eines Scans eines Coomassie-gefärbten SDS-PAGE-Gels gemessen wurde, dass sie mindestens 95 % ihrer Scanintensität in der Bande, die dieser Protease entspricht, besitzt (siehe Beispiel 2A). Alternativ ist das A₂₈₀/A₂₆₀-Verhältnis über oder gleich 1,50, 1,60, 1,65, 1,70, 1,75, 1,80, 1,85 oder über oder gleich 1,90.
Allerdings muss für die erfindungsgemäßen Verwendungen die Protease nicht so rein sein; sie kann z. B. andere Enzyme, sogar andere Proteasen, einschließen. In diesem Fall könnte sie als Proteasezubereitung bezeichnet werden. Trotzdem ist eine gut definierte Proteasezubereitung vorteilhaft. Zum Beispiel ist es viel einfacher, eine Protease, die im Wesentlichen frei von störenden oder kontaminierenden anderen Proteasen ist, korrekt zu einem Futtermittel hinzu zu dosieren. Der Begriff korrekt dosieren bezieht sich insbesondere auf das Ziel, konsistente und konstante Ergebnisse zu erzielen und die Fähigkeit, die Dosierung auf Grundlage der gewünschten Wirkung zu optimieren.
In einer besonderen Ausführungsform ist die Protease in der Form, in der sie zu dem Futtermittel zugegeben wird, oder wenn sie in einem Futtermittelzusatz eingeschlossen wird, gut definiert. Gut definiert meint, dass die Proteasezubereitung mindestens zu 50 % rein ist, was durch Größenausschluss-Chromatographie bestimmt wird (siehe Beispiel 12).
In anderen besonderen Ausführungsformen ist die Proteasezubereitung zu mindestens 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94 oder zu mindestens 95 % rein, was durch dieses Verfahren bestimmt wird.
Alternativ meint der Begriff gut definiert, dass eine Fraktionierung der Proteasezubereitung auf einer geeigneten Größenausschluss-Säule nur eine Hauptprotease-Komponente ergibt.
Der Fachmann wird wissen, wie eine geeignete Größenausschluss-Chromatographiesäule auszuwählen ist. Er könnte beginnen, indem er die Zubereitung auf z. B. einer HiLoad26/60 Superdex75pg-Säule von Amersham Pharmacia Biotech (siehe Beispiel 12) fraktioniert. Wenn der Peak nicht klar getrennt ist, würde er verschiedene Säulen ausprobieren (z. B. mit einer geänderten Säulenpartikelgröße und/oder Säulenlänge) und/oder er würde das Probenvolumen ändern. Durch ein einfaches und übliches "trial-and-error"-Verfahren würde er dadurch zu einer Säule mit einer ausreichenden Auflösung (klare Trennung von Peaks) kommen, auf deren Basis die Reinheitsberechnung, wie in Beispiel 12 beschrieben, durchgeführt wird.
Die Proteasezubereitung kann (a) direkt zu dem Futtermittel zugegeben werden (oder direkt in dem Behandlungsverfahren des pflanzlichen Proteins verwendet werden), oder (b) es kann bei der Herstellung einer oder mehrerer intermediärer Zusammensetzungen wie z. B. Futtermittelzusätzen oder Vormischungen (premixes) verwendet werden, die anschließend zu dem Futtermittel zugegeben werden (oder in einem Behandlungsverfahren verwendet werden).
Der oben beschriebene Reinheitsgrad bezieht sich auf die Reinheit der ursprünglichen Proteasezubereitungen, egal ob sie nach vorstehend (a) oder (b) verwendet wird.
Die Proteasezubereitungen mit Reinheiten dieser Größenordnung sind insbesondere unter Verwendung von rekombinanten Herstellungsverfahren erhältlich, wohingegen sie nicht so leicht erhalten werden und auch Gegenstand von viel höheren Abweichungen von Charge zu Charge sind, wenn die Protease durch traditionelle Fermentationsverfahren hergestellt wird.
Eine solche Proteasezubereitung kann natürlich mit anderen Enzymen gemischt werden.
In einer besonderen Ausführungsform hat die Protease zur erfindungsgemäßen Verwendung, neben der Tatsache, dass sie säurestabil ist, auch ein pH-Aktivitäts-Optimum nahe am Neutralen.
Der Begriff pH-Aktivitäts-Optimum nahe am Neutralen bedeutet eines oder mehrere der Folgenden: dass das pH-Optimum in dem Intervall von pH 6,0 bis 11,0 oder pH 7,0 bis 11,0 oder pH 6,0 bis 10,0 oder pH 7,0 bis 10,0 oder pH 8,0 bis 11,0 oder pH 8,0 bis 10,0 liegt (siehe Beispiele 2B und 7 und 2 und 5 hierin).
In einer anderen besonderen Ausführungsform ist die Protease zur erfindungsgemäßen Verwendung, neben der Tatsache, dass sie säurestabil ist, auch thermostabil.
Der Begriff thermostabil meint eines oder mehrere der Folgenden: dass das Temperaturoptimum mindestens 50 °C, 52 °C, 54 °C, 56 °C, 58 °C, 60 °C, 62 °C, 64 °C, 66 °C, 68 °C oder mindestens 70 °C beträgt, wobei Bezug auf die Beispiele 2D und 7 und die 3 und 6 hierin genommen wird.
In einer weiteren besonderen Ausführungsform ist die Protease zur erfindungsgemäßen Verwendung in der Lage, pflanzliche Proteine gemäß dem in vitro-Modell von Beispiel 4 hierin zu solubilisieren.
Der Begriff pflanzliche Proteine, wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf jede Verbindung, Zusammensetzung, Zubereitung oder Mischung, die mindestens ein Protein einschließt, das von einer Pflanze abgeleitet ist oder stammt, einschließlich modifizierter Proteine und Proteinderivate.
In besonderen Ausführungsformen ist der Proteingehalt der pflanzlichen Proteine mindestens 10, 20, 30, 40, 50 oder 60 % (Gew./Gew.).
Pflanzliche Proteine können aus pflanzlichen Proteinquellen stammen wie z. B. Hülsenfrüchten und Getreide, z. B. Materialien aus Pflanzen der Familie Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae und Poaceae wie z. B. Sojabohnenmehl, Lupinenmehl und Rapsmehl.
In einer besonderen Ausführungsform ist die pflanzliche Proteinquelle Material aus einer oder mehrerer Pflanzen der Familie Fabaceae, z. B. Sojabohne, Lupine, Erbse oder Bohne.
In einer anderen besonderen Ausführungsform ist die pflanzliche Proteinquelle Material aus einer oder mehrerer Pflanzen der Familie Chenopodiaceae, z. B. Runkelrübe, Zuckerrübe, Spinat oder Quinoa.
Andere Beispiele pflanzlicher Proteinquellen sind Raps und Kohl.
Sojabohne ist eine bevorzugte pflanzliche Proteinquelle.
Andere Beispiele von pflanzlichen Proteinquellen sind Getreide wie z. B. Gerste, Weizen, Roggen, Hafer, Mais (Korn), Reis und Sorgho.
Die erfindungsgemäße Behandlung des pflanzlichen Proteins mit mindestens einer säurestabilen Protease der Subtilisinfamilie resultiert in einer erhöhten Löslichkeit der pflanzlichen Proteine.
Es folgen Beispiele von in % gelöstem Protein, dase unter Verwendung der erfindungsgemäßen Proteasen erhältlich sind: mindestens 76,8 %, 77,0 %, 77,2 %, 77,4 %, 77,6 %, 77,8 %, 78,0 %, 78,2 %, 78,4 %, 78,6 % oder mindestens 78,8 %, wobei auf das in vitro-Modell von Beispiel 4 hierin Bezug genommen wird.
Der Begriff Löslichkeit von Proteinen meint im Grunde genommen das Inlösungbringen eines/von Proteins/Proteinen. Eine solche Löslichkeit kann in der Protease-vermittelten Freisetzung von Protein aus anderen Bestandteilen der für gewöhnlich komplexen natürlichen Zusammensetzungen wie z. B. Futtermittel begründet sein. Löslichkeit kann als ein Anstieg der Menge des gelösten Proteins durch Bezugnahme auf eine Probe ohne Proteasebehandlung (siehe Beispiel 4 hierin) gemessen werden.
In einer besonderen Ausführungsform eines Behandlungsverfahrens ist/sind die fragliche(n) Protease(n) ihren sobulisierenden Einfluss auf die pflanzlichen Proteine oder Proteinquellen bewirkend (oder wirkend oder ausübend). Um dies zu erreichen, wird das pflanzliche Protein oder die pflanzliche Proteinquelle typischerweise in einem Lösungsmittel, z. B. einem wässerigen Lösungsmittel wie z. B. Wasser, suspendiert und der pH-Wert und die Temperatur werden im Hinblick auf die Eigenschaften des fraglichen Enzyms eingestellt. Zum Beispiel kann die Behandlung bei einem pH-Wert stattfinden, bei welchem die relative Aktivität der tatsächlichen Protease mindestens 50 oder 60 oder 70 oder 80 oder 90 % ist. Gleichermaßen kann die Behandlung zum Beispiel bei einer Temperatur stattfinden, bei welcher die relative Aktivität der tatsächlichen Protease mindestens 50 oder 60 oder 70 oder 80 oder 90 % beträgt (diese relativen Aktivitäten sind wie hierin in Beispiel 2 definiert). Die enzymatische Reaktion wird fortgesetzt, bis das gewünschte Ergebnis erreicht wird, wonach sie durch Inaktivierung des Enzyms, z. B. durch einen Hitzebehandlungsschnitt, gestoppt werden kann oder nicht.
In einer anderen besonderen Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Behandlungsverfahrens ist die Proteasewirkung anhaltend, was bedeutet, dass die Protease zu den pflanzlichen Proteinen oder Proteinquellen zugegeben wird, aber ihr solubilisierender Einfluss wird sozusagen bis zu einem späteren Zeitpunkt nicht angeschalten, an dem dies gewünscht wird, sobald geeignete solubilisierende Bedingungen sind oder sobald irgendwelche Enzyminhibitoren inaktiviert sind oder was auch immer für andere Mittel eingesetzt worden sein könnten, um die Wirkung des Enzyms hinauszuschieben.
In einer Ausführungsform ist die Behandlung eine Vorbehandlung des Tierfuttermittels oder der pflanzlichen Proteine zur Verwendung in einem Tierfuttermittel, das heißt, die Proteine sind vor der Aufnahme in gelöster Form.
Der Begriff Verbessern des Nährwerts des Tierfuttermittels bedeutet Verbessern der Verfügbarkeit der Proteine, wodurch eine erhöhte Proteinextraktion, höhere Proteinerträge und/oder verbesserte Proteinverwertbarkeit erreicht wird. Der Nährwert des Futters ist daher erhöht und die Wachstumsgeschwindigkeit und/oder die Gewichtszunahme und/oder die Futterumwandlung (d. h. das Gewicht des aufgenommenen Futters in Relation zur Gewichtszunahme) des Tiers ist/sind verbessert.
In besonderen Ausführungsformen ist die Gewichtszunahme mindestens 101 %, 102 %, 103 %, 104 %, 105 %, 106 % oder mindestens 106,6 % der Kontrolle, wobei auf Beispiel 10 hierin Bezug genommen wird.
In weiteren besonderen Ausführungsformen ist die Futterumwandlung höchstens (oder nicht mehr als) 99 %, 98 %, 97,5 %, 97 % oder höchstens 96,6 %. Dies entspricht einer Futterumwandlung bis zu 99 %, 98 %, 97,5 %, 97 % oder bis zu 96,6 %. Wiederum wird auf Beispiel 10 hierin Bezug genommen, bei dem mit der Kontrolle verglichen wird.
Die Protease kann zu dem Futter in jeder Form zugegeben werden, entweder als eine relativ reine Protease oder in Beimischung mit anderen Bestandteilen, die zur Zugabe zu Tierfuttermitteln beabsichtigt sind, d. h. in Form eines Tierfuttermittelzusatzes wie z. B. sog. „Pre-mixes" für Tierfuttermittel.
Tierfuttermittelzusätze
Abgesehen von der säurestabilen Protease der Subtilisinfamilie enthalten die erfindungsgemäßen Tierfuttermittelzusätze mindestens ein fettlösliches Vitamin und/oder mindestens ein wasserlösliches Vitamin und/oder mindestens ein Spurenelement und/oder mindestens einen Makromineralstoff.
Weitere, optionale Bestandteile von Futtermittelzusatzstoffen sind Farbstoffe, Aromen, Stabilisatoren und/oder mindestens ein anderes Enzym, ausgewählt aus Phytasen EC 3.1.3.8 oder 3.1.3.26; Xylanasen EC 3.2.1.8; Galactanasen EC 3.2.1.89 und/oder beta-Glucanasen EC 3.2.1.4 (EC bezieht sich auf die Enzymklassen gemäß „Enzyme Nomenclature 1992" von NC-IUBMB, 1992), siehe auch das World Wide Web (www) unter http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzymelindex.html.
In einer besonderen Ausführungsform sind diese anderen Enzyme gut definiert (wie definiert und beispielhaft oben für Proteasezubereitungen unter anderem durch Bezugnahme auf Beispiel 12 erläutert).
Verwendbare fett- und wasserlösliche Vitamine wie auch Spurenelemente bilden einen Teil eines sog. „Premix", das zur Zugabe zu dem Futtermittel beabsichtigt ist, wohingegen Makromineralstoffe für gewöhnlich getrennt zu dem Futter zugegeben werden. Jede dieser Arten von Zusammensetzungen ist ein erfindungsgemäßer Tierfuttermittelzusatzstoff, wenn er mit einem erfindungsgemäßen säurestabilen Subtilisin angereichert ist.
In einer besonderen Ausführungsform ist der erfindungsgemäße Tierfuttermittelzusatzstoff zur Aufnahme in die Tierkost oder das Futter in Spiegeln von 0,01 bis 10,0 %, weiter bevorzugt 0,05 bis 5,0 % oder 0,2 bis 1,0 % (% bedeutet g Zusatz pro 100 g Futtermittel) beabsichtigt (oder verschrieben, um aufgenommen zu werden). Dies gilt so insbesondere für „Premixes".
Folglich können die Konzentrationen der einzelnen Bestandteile in dem Tierfuttermittelzusatzstoff, z. B. dem „Premix" durch Multiplizieren der Endkonzentration des selben Bestandteils im Futter mit 10 bis 10000, 20 bis 2000 bzw. 100 bis 500 gefunden werden (Bezug nehmend auf die obigen drei prozentualen Einschlussintervalle).
Richtlinien für gewünschte Endkonzentrationen, d. h. Konzentrationen im Futter, solcher einzelner Futtermittel- und Futtermittelzusatzbestandteile sind unten in Tabelle A angegeben.
Es folgen nicht beschränkende Listen von Beispielen dieser Bestandteile:
Beispiele von fettlöslichen Vitaminen sind Vitamin A, Vitamin D3, Vitamin E und Vitamin K, z. B. Vitamin K3.
Beispiele von wasserlöslichen Vitaminen sind Vitamin B12, Biotin und Cholin, Vitamin B1, Vitamin B2, Vitamin B6, Niacin, Folsäure und Panthothenat, z. B. Ca-D-Panthothenat.
Beispiele von Spurenelementen sind Mangan, Zink, Eisen, Kupfer, Jod, Selen und Kobalt.
Beispiele von Makromineralstoffen sind Calcium, Phosphor und Natrium.
Die Erfordernisse dieser Bestandteile an Nährstoffe – beispielhaft erläutert für Geflügel und Ferkel/Schweine – sind unten in Tabelle A ausgeführt. Erfordernisse an Nährstoffe meint, dass diese Bestandteile in der Kost in den angegebenen Konzentrationen bereitgestellt werden sollten. Diese Daten sind zusammengestellt aus:
NRC, Nutrient requirements in swine, neunte überarbeitete Auflage 1988, subcommittee on swine nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, national research council. National Academy Press, Washington, D.C. 1988; und
NRC, Nutrient requirements of poultry, neunte überarbeitete Auflage 1994, subcommittee on poultry nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, national research council. National Academy Press, Washington, D.C. 1994.
Alternativ umfasst der erfindungsgemäße Tierfuttermittelzusatzstoff mindestens einen der einzelnen Bestandteile, die in Tabelle A spezifiziert sind. Mindestens einen meint entweder einen oder mehrere von eins oder zwei oder drei oder vier usw. bis zu allen 13 oder bis zu allen 15 einzelnen Bestandteilen.
Genauer gesagt ist dieser mindestens eine einzelne Bestandteil in dem erfindungsgemäßen Zusatzstoff in einer solchen Menge eingeschlossen, um eine Konzentration im Futter in dem Bereich, der in Spalte 4 oder Spalte 5 oder Spalte 6 von Tabelle A angegeben ist, bereitzustellen.
Wie oben erklärt, können entsprechende Futtermittelzusatzstoffkonzentrationen durch Multiplizieren der Intervallgrenzen dieser Bereiche mit 10 bis 10000, 20 bis 2000 oder 100 bis 500 gefunden werden. Beispielsweise würde bei der Überlegung, welcher „Premix"-Gehalt von Vitamin A einen Futtermittelgehalt von 10 bis 10000 IU/kg entsprechend würde, dies zu den folgenden Intervallen führen: 100 bis 10⁸ IU oder 200 bis 2 × 10⁷ IU oder 1000 bis 5 × 10⁶IU pro kg Zusatzstoff.
Nährstoffbedarf – und bevorzugte Bereiche Tabelle A
Tierfuttermittelzusammensetzungen
Tierfuttermittelzusammensetzungen oder -Kost haben einen relativ hohen Proteingehalt. Gemäß den oben zitierten Veröffentlichungen des „National Research Council" (NRC) kann die Kost von Geflügel und Schwein wie in Tabelle B unten, Spalten 2 bis 3, angegeben charakterisiert werden. Die Kost für Fische kann wie in Spalte 4 von Tabelle angegeben charakterisiert werden. Darüber hinaus hat eine solche Kost für Fische für gewöhnlich einen Gehalt an rohem Fett von 200 bis 310 g/kg. Diese Kost für Fische ist beispielhaft anhand von Kost für Salmoniden erläutert und wurde auf Grundlage von „Aquaculture, principles and practices", Hersg. T.V.R. Pillay, Blackwell Scientific Publications Ltd. 1990; "Fish nutrition", 2. Aufl., Hersg. John E. Halver, Academic Press Inc. 1989, entwickelt.
Eine erfindungsgemäße Tierfuttermittelzusammensetzung hat einen Rohproteingehalt von 50 bis 800 g/kg und umfasst darüber hinaus mindestens eine wie hierin beanspruchte Protease.
Darüber hinaus oder alternativ (zu dem oben angegebenen Rohproteingehalt) hat die erfindungsgemäße Tierfuttermittelzusammensetzung einen Gehalt an metabolisierbarer Energie von 10 bis 30 MJ/kg und/oder einen Gehalt an Calcium von 0,1 bis 200 g/kg und/oder einen Gehalt an verfügbarem Phosphor von 0,1 bis 200 g/kg und/oder einen Gehalt an Methionin von 0,1 bis 100 g/kg und/oder einen Gehalt an Methionin plus Cystein von 0,1 bis 150 g/kg oder/oder einen Gehalt an Lysin von 0,5 bis 50 g/kg.
In besonderen Ausführungsformen ist der Gehalt an metabolisierbarer Energie, Rohprotein, Calcium, Phosphor, Methionin, Methionin plus Cystein und/oder Lysin innerhalb eines beliebigen der Bereiche 2, 3, 4 oder 5 von Tabelle B unten (B. 2 bis 5).
Das Rohprotein wird berechnet als Stickstoff (N) multipliziert mit einem Faktor 6,25, d. h. Rohprotein (g/kg) = N (g/kg) × 6,25, wie in „Animal Nutrition", 4. Aufl., Kapitel 13 (Hersg. P. McDonald, R. A. Edwards und J. F. D. Greenhalgh, Longman Scientific and Technical, 1988, ISBN 0-582-40903-9) angegeben. Der Stickstoffgehalt wird durch das Kjeldahl-Verfahren (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis, 14. Aufl., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC) bestimmt.
Die metabolisierbare Energie kann auf Grundlage der NRC-Veröffentlichung „Nutrient Requirements of Swine" (1988), S. 2-6, und der „European Table of Energy Values for Poultry Feedstuffs, Spelderholt centre for poultry research and extension", 7361 DA Beekbergen, Niederlande. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN 90-71463-12-5, berechnet werden.
Der Gehalt der Kost an Calcium, verfügbarem Phosphor und Aminosäuren in der kompletten Tierkost wird auf Grundlage von Futtermitteltabellen wie z. B. Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7, berechnet.
In einer besonderen Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße Tierfuttermittelzusammensetzung mindestens ein pflanzliches Protein oder eine pflanzliche Proteinquelle, das/die wie oben definiert ist.
In noch weiteren besonderen Ausführungsformen enthält die erfindungsgemäße Tierfuttermittelzusammensetzung 0 bis 80 % Mais und/oder 0 bis 80 % Sorgho und/oder 0 bis 70 % Weizen und/oder 0 bis 70 % Gerste und/oder 0 bis 30 % Hafer und/oder 0 bis 40 % Sojabohnenmehl und/oder 0 bis 10 % Fischmehl und/oder 0 bis 20 % Molke.
Die Kost für Tiere kann als Futtermittelbrei (nicht in Form von Pellets) oder als Futtermittel in Pelletform hergestellt werden. Typischerweise werden gemahlene Futtermittel gemischt und ausreichende Mengen essentieller Vitamine und Mineralstoffe nach den Spezifikationen für die fragliche Spezies hinzugefügt. Enzyme können als feste oder lösliche Enzymformulierungen hinzugefügt werden. Zum Beispiel wird eine feste Enzymformulierung typischerweise vor oder während des Mischungsschritts zugefügt; und eine flüssige Enzymzubereitung wird typischerweise nach dem Pelletbildungsschritt zugefügt. Das Enzym kann auch in einen Futtermittelzusatzstoff oder ein „Premix" aufgenommen werden. Die Enzymendkonzentration in der Kost liegt im Bereich von 0,01 bis 200 mg Enzymprotein pro kg Kost, zum Beispiel im Bereich von 5 bis 30 mg Enzymprotein pro kg Tierkost.
Beispiele von Tierfuttermittelzusammensetzungen sind in Beispiel 11 gezeigt.
Tabelle B Bereichsangaben für Energie, Protein und Mineralien in Tierkost
In besonderen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Behandeln pflanzlicher Proteine ist auch ein weiterer Schritt des Zugebens von Phytase eingeschlossen. Und in weiteren besonderen Ausführungsformen können zusätzlich zu der kombinierten Behandlung mit Phytase und Protease auch weitere Enzyme zugefügt werden, wobei diese Enzyme ausgewählt sind aus der Gruppe enthaltend andere Proteasen, Phytasen, lipolytische Enzyme und Glucosidase/Carbohydrase-Enzyme. Beispiele solcher Enzyme sind in WO 95/28850 angegeben.
Die Protease sollte natürlich in einer wirksamen Menge angewandt werden, d. h. in einer Menge, die zur Verbesserung der Löslichkeit und/oder zur Verbesserung des Nährwerts des Futtermittels adäquat ist. Es wird gegenwärtig in Erwägung gezogen, dass das Enzym in einer oder mehreren der folgenden Mengen (Dosierungsbereiche) verabreicht wird: 0,01 bis 200 oder 0,01 bis 100 oder 0,05 bis 100 oder 0,05 bis 50 oder 0,10 bis 10 – alle diese Bereiche sind mg Proteaseprotein pro kg Futtermittel (ppm).
Zum Bestimmen der mg Proteaseprotein pro kg Futtermittel wird die Protease aus der Futtermittelzusammensetzung gereinigt und die spezifische Aktivität der gereinigten Protease unter Verwendung eines entsprechenden Tests (siehe unter Proteaseaktivität, Substrate und Tests) bestimmt. Die Proteaseaktivität der Futtermittelzusammensetzung als solche wird unter Verwendung des gleichen Tests bestimmt und auf Grundlage dieser beiden Bestimmungen wird die Dosierung in mg Proteaseprotein pro kg Futtermittel errechnet.
Die gleichen Prinzipien gelten auch für die Bestimmung der mg Proteaseprotein in Futtermittelzusätzen.
Wenn eine Probe der zur Herstellung des Futtermittelzusatzstoffes oder des Futtermittels verwendeten Protease verfügbar ist, wird die spezifische Aktivität einer Protease natürlich in der Probe bestimmt (kein Bedarf zur Aufreinigung der Protease aus der Futtermittelzusammensetzung oder dem Zusatz).
Viele Pflanzen enthalten antinutritive Faktoren wie z. B. Lektine und Trypsin-Inhibitoren. Die wichtigsten antinutritiven Faktoren der Sojabohne sind das Lektin-Sojabohnen-Agglutinin (SBA) und der Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor (STI).
Lektine sind Proteine, die spezifisch kohlenhydrathaltige Moleküle mit beachtlicher Spezifität binden, und wenn sie aufgenommen werden, werden sie an das intestinale Epithelium gebunden. Dies kann zu einer reduzierten Lebensfähigkeit der Epithelzellen und einer reduzierten Absorption von Nährstoffen führen.
SBA ist ein glycosyliertes, tetrameres Lektin mit einem Molekulargewicht der Untereinheiten von ungefähr 30 kDa und einer hohen Affinität für N-Acetylgalactosamin.
Trypsin-Inhibitoren beeinflussen die intestinale Proteolyse, was die Verdaubarkeit von Proteinen reduziert, und erhöhen auch die Sekretion von Verdauungsenzymen aus dem Pankreas, was zu einem Verlust von Aminosäuren in Form von Verdauungsenzymen führt. Ein Beispiel eines Trypsin-Inhibitors ist der Bowman-Birk-Inhibitor, der ein Molekulargewicht von ungefähr 8 kDa besitzt, 7 Disulfidbrücken enthält und zwei Inhibitor-Loops besitzt, die spezifisch für Trypsin-artige und Chymotrypsin-artige Proteasen sind. Andere Beispiele sind sog. Kunitz-Inhibitoren von Faktoren (z. B. dem Sojabohnen-Kunitz-Trypsin-Inhibitor, der eine Bindungsstelle für Trypsin-artige Proteasen enthält und ein Molekulargewicht von ungefähr 20 kDa besitzt).
Von den Proteasen für die erfindungsgemäße Verwendung wurde gezeigt, dass sie antinutritive Faktoren wie SBA-Lektin und die Trypsin-Inhibitoren Bowman-Birk-Inhibitor und den Sojabohnen-Kunitz-Faktor hydrolisieren. Siehe experimentellen Teil, Beispiel 5.
Folglich betrifft die Erfindung auch die Verwendung von säurestabilen Serinproteasen zum Hydrolisieren oder Reduzieren der Menge an antinutritiven Faktoren, z. B. SBA-Lektin und Trypsin-Inhibitoren, z. B. Bowman-Birk-Inhibitor, und Kunitz-Faktoren, wie z. B. den Sojabohnen-Kunitz-Faktor.
Beispiel 1
Screening auf säurestabile Proteasen
Eine große Anzahl von Proteasen wurde auf die Stabilität bei pH 3 mit dem Ziel analysiert, Proteasen zu identifizieren, die die notwendige Stabilität zur Passage durch den sauren Magen von monogastrischen Tieren besitzen.
Die Proteasen wurden durch konventionelle, chromatographische Verfahren wie z. B. Ionenaustausch-Chromatographie, Chromatographie über hydrophobe Wechselwirkung und Größenausschluss-Chromatographie gereinigt (siehe z. B. „Protein Purification, Principles, High Resolution Methods and Applications", Hersg.: Jan-Christer Janson, Lars Rydén, VCH Publishers, 1989).
Die Proteaseaktivität wurde wie folgt bestimmt: Die Protease wurde mit 1,67 % Hammarsten-Casein bei 25 °C, pH 9,5 für 30 Minuten inkubiert und dann wurde TCA (Trichloressigsäure) auf eine Endkonzentration von 2 % (Gew./Gew.) zugegeben, die Mischung wurde zur Entfernung des Sediments filtriert und das Filtrat wurde auf freie primäre Aminogruppen analysiert (bestimmt in einem colorimetrischen Test auf Grundlage von OPA (o-Phthaldialdehyd), indem das Absorptionsvermögen bei 340 nm unter Verwendung eines Serinstandards (Biochemisches Taschenbuch Teil II, Springer-Verlag (1964), S. 93 und S. 102) gemessen wurde. Eine Casein-Protease-Einheit (CPU; Casein Protease Unit) ist definiert als die Menge Enzym, die 1 mmol TCA-lösliche primäre Aminogruppen pro Minute unter Standardbedingungen, d. h. 25 °C und pH 9,5, freisetzt.
Die Proteasen wurden auf eine Aktivität von 0,6 CPU/l in Wasser verdünnt, in zwei Aliquots aufgeteilt und jedes Aliquot wurde dann weiter auf 0,3 CPU/l mit 100 mM Citratpuffer, pH 3 bzw. 100 mM Phosphatpuffer, pH 7 verdünnt. Die verdünnten Proben wurden bei 37 °C für eine Stunde inkubiert und mit 20 μl der Proben in Löcher in 1 %igen Agaroseplatten, enthaltend 1 % Magermilch, aufgetragen. Die Platten (pH 7,0) wurden bei 37 °C über Nacht inkubiert und die Zonen, die klar geworden waren, wurden gemessen.
42 Proteasen zeigten in diesem Test ein gutes Ergebnis. Eine Reihe dieser wurde charakterisiert, siehe Beispiele 2, 6, 7 und 8. Diese Proteasen gehören alle zur Subtilisinfamilie von Serinproteasen.
Beispiel 2
Charakterisierung und Vergleichsstudie der Subtilisin-Protease die aus Bacillus sp. NCIMB 40484 stammt
Die Protease, die aus Bacillus sp. NCIMB 40484 stammt, wurde, wie in Beispiel 1 von WO 93/24623 beschrieben, hergestellt.
Der Zweck dieser Charakterisierung war es, ihre pH-Stabilitäts-, pH-Aktivitäts- und Temperatur-Aktivitäts-Profile im Vergleich zu Sub.Novo, Sub.Novo (Y217L) und SAVINASE^TM zu studieren.
Sub.Novo ist Subtilisin aus Bacillus amyloliquefaciens und Sub.Novo (Y217L) ist eine Mutante hiervon, die in WO 96/05739 offenbart ist. Sub.Novo wurde aus einer Kultur des Wildtypstamms unter Verwendung konventioneller Verfahren hergestellt und gereinigt, wohingegen die Mutante, wie in den Beispielen 1 bis 2 und 15 bis 16 von EP 130756 beschrieben, hergestellt wurde.
SAVINASE^TM ist ein Subtilisin, das aus Bacillus clausii (vormals Bacillus lentus NCIB 10309) stammt und kommerziell von Novozymes A/S, Krogshoejvej, DK-2880 Bagsvaerd, Dänemark, erhältlich ist. Ihre Herstellung ist im US-Patent Nummer 3723250 beschrieben.
Beispiel 2A
Bestimmung der SDS-PAGE-Reinheit von Proteaseproben
Die SDS-PAGE-Reinheit von Proteaseproben wurde nach der folgenden Vorgehensweise bestimmt:
40 μl Proteaselösung (A₂₈₀-Konzentration = 0,025) wurden mit 10 μl 50 % (Gew./Vol.) TCA (Trichloressigsäure) in einem Eppendorfgefäß auf Eis gemischt. Nach einer halben Stunde auf Eis wurde das Gefäß zentrifugiert (5 Minuten, 0 °C, 14.000 × g) und der Überstand vorsichtig entfernt. 20 μl SDS-PAGE-Probenpuffer (200 μl Tris-Glycin-SDS-Probenpuffer (2 x) (125 mM Tris/HCl, pH 6,8, 4 % (Gew./Vol.) SDS, 50 ppm Bromphenol-Blau, 20 % (Vol./Vol.) Glycerin, LC2676 von NOVEX^TM) + 160 μl destilliertes Wasser + 20 μl β-Mercaptoethanol + 20 μl 3 M nicht gepufferte Tris-Base (Sigma T-1503) wurden zu dem Präzipitat zugegeben und das Gefäß für 3 Minuten gekocht. Das Gefäß wurde kurz zentrifugiert und 10 μl Probe auf ein vorgefertigtes Gel mit 4 bis 20 % Gradienten Tris-Glycin von NOVEX^TM (Polyacrylamid-Gradienten-Gel auf Basis von Laemmli-Chemie aber ohne SDS im Gel (Laemmli, U.K., (1970) Nature, Band 227, S. 680-685, EC60255) aufgetragen. Die Elektrophorese wurde mit Tris-Glycin-Laufpuffer (2,9 g Tris-Base, 14,4 g Glycin, 1,0 g SDS, destilliertes Wasser auf 1 Liter) in beiden Pufferbehältnissen bei 150 V konstanter Spannung durchgeführt, bis der Bromphenol-Blau-Nachweisfarbstoff den Boden des Gels erreicht hatte. Nach der Elektrophorese wurde das Gel dreimal jeweils 5 Minuten lang mit 100 ml destilliertem Wasser unter sanftem Schütteln gewaschen. Das Gel wurde dann sanft mit „Gelcode^® Blue Stain Reagent" (kolloidales Coomassie G-250 Produkt von PIERCE, PIERCE Katalog Nummer 24592) für eine Stunde gespült und durch sanftes Schütteln für 8 bis 16 Stunden mit destilliertem Wasser mit mehrfachem Austausch des destillierten Wassers gewaschen. Schließlich wurde das Gel zwischen zwei Zellophanstücken getrocknet. Die getrockneten Gele wurden mit einem "Arcus II-Scanner" von AGFA, der mit der "Fotolook 95 v2.08"-Software ausgestattet war, gescannt und in die Bildauswertungssoftware "CREAM^TM" für Windows (Katalognummern 990001 und 990005, Kem-En-Tec, Dänemark) durch den Befehl File/Acquire mit den folgenden Einstellungen (für Fotolook 95 v2.08) importiert: Original=Reflective, Mode=Color RGB, Scan resolution=240 ppi, Output resolution=120 lpi, Scale factor = 100 %, Range=Histogram with Global selection und Min. = 0 und Max. = 215, ToneCurve=None, Sharpness=None, Descreen=None und Flavor=None, wodurch ein *.img Bildfile des SDS-PAGE-Gels hergestellt wurde, das für die Evaluierung in "CREAM^TM" verwendet wurde. Das *.img Bildfile wurde mit dem Menübefehl Analysis/1-D evaluiert. Zwei Scanlinien wurden auf das *.img Bildfile mit dem "Lane Place Tool" platziert: eine Probenscanlinie und eine Hintergrundscanlinie. Die Probenscanlinie wurde in die Mitte der Probenlinie (mit der fraglichen Protease) von unmittelbar unter der Auftragungstasche bis unmittelbar über die Position des Bromphenol-Blau-Nachweisfarbstoffs platziert. Die Scanlinie für den Hintergrund wurde parallel zu der Probenscanlinie platziert, aber in einer Position in dem Bild des SDS-PAGE-Gels, in der keine Probe aufgetragen wurde. Die Start- und Endpunkte der Scanlinie für den Hintergrund waren lotrecht zu den Start- und Endpunkten der Probenscanlinie. Die Scanlinie für den Hintergrund stellt den wahren Hintergrund des Gels dar. Die Breite und Form der Scanlinien wurden nicht angepasst. Die Intensität entlang der Scanlinien wurde nun mit dem 1-D/Scan Menübefehl mit Medium-Sensitivität aufgezeichnet. Der Hintergrundscan wurde unter Verwendung des Menübefehls 1-D/Editor von dem Probenscan subtrahiert. Dann wurde der Menübefehl 1-D/Results ausgewählt und die Fläche % des Proteasepeaks, wie sie von der "CREAM^TM"-Software berechnet wurde, wurde als die SDS-PAGE-Reinheit der Proteasen verwendet.
Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:
Beispiel 2B
pH-Aktivitäts-Test

Suc-AAPF-pNA (Sigma^® 5-7388) wurde zum Erhalten von pH-Aktivitäts-Profilen verwendet.
Testpuffer: 100 mM Bernsteinsäure (Merck 1.00682), 100 mM HEPES (Sigma H-3375), 100 mM CHES (Sigma C-2885), 100 mM CABS (Sigma C-5580), 1 mM CaCl₂, 150 mM KCl, 0,01 % Triton^® X-100, eingestellt auf die pH-Werte 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 oder 11,0 mit HCl oder NaOH.
Testtemperatur: 25 °C.

Eine Proteaseprobe von 300 μl (verdünnt in 0,01 % Triton^® X-100) wurde mit 1,5 ml Testpuffer mit dem entsprechenden pH-Wert gemischt, wodurch der pH der Mischung auf den pH des Testpuffers gebracht wurde. Die Reaktion wurde durch Zugeben von 1,5 ml pNA-Substrat (50 mg gelöst in 1,0 ml DMSO und 45 x weiter verdünnt mit 0,01 % Triton^® X-100) gestartet und nach Mischen der Anstieg der A₄₀₅ mittels eines Spektrophotometers als ein Maß der Proteaseaktivität bei dem fraglichen pH kontrolliert. Der Test wurde mit dem Testpuffer bei anderen pH-Werten wiederholt und die Messwerte als relative Aktivität gegen den pH-Wert aufgetragen. Die relativen Aktivitäten wurden mit der höchsten Aktivität (pH-Optimum) normalisiert, d. h. die Aktivität bei dem pH-Optimum wurde auf 1 oder auf 100 % gesetzt. Die Proteaseproben wurden verdünnt, um zu gewährleisten, dass alle Aktivitätsmessungen in den linearen Teil der Dosis-Antwort-Kurve für den Test fielen.
Beispiel 2C
pH-Stabilitäts-Test

Suc-AAPF-pNA (Sigma^® 5-7388) wurde zum Erhalten der pH-Stabilitäts-Profile verwendet.
Testpuffer: 100 mM Bernsteinsäure, 100 mM HEPES, 100 mM CHES, 100 mM CABS, 1 mM CaCl₂, 150 mM KCl, 0,01 % Triton X-100, eingestellt auf die pH-Werte 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 oder 11,0 mit HCl oder NaOH.

Jede Proteaseprobe (in 1 mM Bernsteinsäure, 2 mM CaCl₂, 100 mM NaCl, pH 6,0 und mit einer A₂₈₀-Absorption > 10) wurde in dem Testpuffer bei jedem getesteten pH-Wert auf A₂₈₀ = 1,0 verdünnt. Die verdünnten Proteaseproben wurden für 2 Stunden bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Proteaseproben in 100 mM Bernsteinsäure, 100 mM HEPES, 100 mM CHES, 100 mM CABS, 1 mM CaCl₂, 150 mM KCl, 0,01 % Triton^® X-100, pH 9,0 verdünnt, wodurch der pH-Wert aller Proben auf pH 9,0 gebracht wurde.
Bei der folgenden Aktivitätsmessung betrug die Temperatur 25 °C.
300 μl verdünnte Proteaseprobe wurde mit 1,5 ml des pH 9,0 Testpuffers gemischt und die Aktivitätsreaktion durch Zugeben von 1,5 ml pNA-Substrat (50 mg gelöst in 1,0 ml DMSO und weiter 45 x verdünnt mit 0,01 % Triton^® X-100) gestartet und nach Mischen wurde der Anstieg der A₄₀₅ durch ein Spektrophotometer als ein Maß der (Rest-)Proteaseaktivität kontrolliert. Die Inkubation bei 37 °C wurde bei den verschiedenen pH-Werten durchgeführt und die Aktivitätsmesswerte wurden als Restaktivität gegen den pH aufgetragen. Die Restaktivitäten wurden mit der Aktivität einer parallelen Inkubation (Kontrolle) normalisiert, wobei die Protease in dem Testpuffer bei pH 9,0 auf A₂₈₀ = 1,0 verdünnt war und für 2 Stunden bei 5 °C vor der Aktivitätsmessung wie die anderen Inkubationen inkubiert wurde. Die Proteaseproben wurden vor der Aktivitätsmessung verdünnt, um zu gewährleisten, dass alle Aktivitätsmessungen in den linearen Teil der Dosis-Antwort-Kurve für den Test fielen.
Beispiel 2D
Temperatur-Aktivitäts-Test
Protazyme AK Tabletten wurden zum Erhalten von Temperatur-Profilen verwendet. Protazyme AK Tabletten sind Azurin-gefärbtes kreuzvernetztes Casein, das als Tabletten von Megazyme hergestellt wurde.

Testpuffer: 100 mM Bernsteinsäure, 100 mM HEPES, 100 mM CHES, 100 mM CABS, 1 mM CaCl₂, 150 mM KCl, 0,01 % Triton^® X-100, eingestellt auf pH 9,0 mit NaOH.

Eine Protazyme AK Tablette wurde in 2,0 ml 0,01 % Triton^® X-100 durch vorsichtiges Rühren suspendiert. 500 μl dieser Suspension und 500 μl Testpuffer wurden in einem Eppendorf=Gefäß gemischt und auf Eis platziert. 20 μl Proteaseprobe (verdünnt in 0,01 % Triton^® X-100) wurden zugefügt. Der Test wurde durch Überführen des Eppendorf-Gefäßes in einen Eppendorf-Thermomischer begonnen, der auf die Testtemperatur eingestellt war. Das Gefäß wurde für 15 Minuten auf dem Eppendorf-Thermomischer bei der höchsten Schüttelgeschwindigkeit inkubiert. Durch Überführen des Gefäßes zurück in das Eisbad wurde die Testinkubation gestoppt. Das Gefäß wurde in einer eiskalten Zentrifuge für wenige Minuten zentrifugiert und die A₆₅₀ des Überstands mittels eines Spektrophotometers abgelesen. Eine Pufferblindprobe (anstatt Enzym) wurde in den Test eingeschlossen. A₆₅₀ (Protease) – A₆₅₀ (Blindprobe) war ein Maß für die Proteaseaktivität. Der Test wurde bei verschiedenen Temperaturen durchgeführt und die Aktivitätsmesswerte wurden als relative Aktivitäten gegen die Inkubationstemperatur aufgetragen. Die relativen Aktivitäten wurden mit der höchsten Aktivität (Temperaturoptimum) normalisiert. Die Proteaseproben wurden verdünnt, um zu gewährleisten, dass alle Aktivitätsmessungen in den nahezu linearen Teil der Dosis-Antwort-Kurve des Tests fielen.
Ein Überblick über die Aktivitätsoptima (pH- und Temperatur-Aktivität) ist in Tabelle 1 zu sehen. Die pH-Stabilitäts-, pH-Aktivitäts- und Temperatur-Aktivitäts-Profile sind in den 1 bis 3 zu sehen und ein ausführlicher Vergleich der pH-Stabilitätsdaten für die Proteasen bei sauren pH-Werten ist in Tabelle 2 zu sehen.
Tabelle 1 pH- und Temperaturoptima verschiedener Proteasen
Tabelle 2 pH-Stabilität verschiedener Proteasen zwischen pH 2,0 und 5,0
Beispiel 2E
Absorptionsreinheit gereinigter Proteaseproben
Bestimmung des Verhältnisses von A₂₈₀/A₂₆₀
Das Verhältnis A₂₈₀/A₂₆₀ gereinigter Proteaseproben wird wie folgt bestimmt.
A₂₆₀ bedeutet die Absorption einer Proteaseprobe bei 260 nm in einer Küvette mit 1 cm Weglänge relativ zu einer Pufferleerprobe. A₂₈₀ bedeutet die Absorption der gleichen Proteaseprobe bei 280 nm in einer Küvette mit 1 cm Weglänge relativ zu einer Pufferleerprobe.
Proben der gereinigten Proteasen aus den Beispielen 2 und 6 wurden in Puffer verdünnt, bis der abgelesene Messwert des Spektrophotometers innerhalb des linearen Teils ihrer Antwortkurve lag. Das Verhältnis A₂₈₀/A₂₆₀ wurde aus den abgelesenen Messwerten bestimmt.
Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:
Beispiel 3
Fähigkeit der aus Bacillus sp NCIMB 40484 stammenden Protease, unlösliche Anteile von Soiabohnenmehl (SBM; Soy Bean Meal) abzubauen
Die Protease aus Bacillus sp. NCIMB 40484 wurde auf ihre Fähigkeit getestet, unlösliche/unverdaubare Anteile von SBM, Verdauungsenzymen und/oder zugegebenen exogenen Enzymen zugänglich zu machen.
Ihre Leistung wurde mit zwei Aspartat-Proteasen, Protease I und Protease II, die, wie in WO 95/02044 beschrieben, hergestellt waren, verglichen. Dieses Dokument offenbart auch ihre Verwendung in Futtermittel. Die Protease I ist eine Protease vom Aspergillopepsin II Typ und die Protease II ist eine Protease vom Aspergillopepsin I Typ (beide Aspartat-Proteasen, d. h. Nichtsubtilisin-Proteasen) aus Aspergillus aculeatus (es wird auf „Handbook of Proteolytic Enzymes", auf das oben Bezug genommen wurde, Bezug genommen).
Das Testsubstrat, das so genannte Sojaremnant, wurde in einem Verfahren hergestellt, das den Verdauungstrakt von monogastrischen Tieren, einschließlich einer Pepsinbehandlung bei pH 2 und einer Pankreatinbehandlung bei pH 7, imitiert, In dem Pankreatinbehandlungsschritt wird eine Reihe kommerzieller Enzyme in hohen Dosierungen hinzugefügt, um die SBM-Bestandteile abzubauen, die existierenden kommerziellen Enzymen zugänglich sind.
Die folgenden Enzyme, alle kommerziell erhältlich von Novozymes A/S, Dänemark, wurden zugefügt: ALCALASE^TM 2,4L, NEUTRASE^TM 0,5L, FLAVOURZYME^TM 1000L, ENERGEX^TM L, BIOFEED^TM Plus L, PHYTASE NOVO^TM L. Das verwendete SBM war ein Standard 48 % Protein-SBM für Futtermittel, das zu Pellets geformt worden war.
Nach der Behandlung waren in dem resultierenden Sojaremnant nur 5 % des Gesamtproteins übrig.
FITC-Markierungsprotokoll
Das Remnant wurde anschließend mit FITC (Molecular Probes, F-143) wie folgt markiert: Sojaremnant (25 g feucht, ~ 5 g trocken) wurde in 100 ml 0,1 M Carbonatpuffer, pH 9, suspendiert und eine Stunde lang bei 40 °C gerührt. Die Suspension wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und mit Fluorescein-S-Isothiocyanat (FITC) über Nacht im Dunkeln behandelt. Die nicht gekoppelte Probe wurde durch Ultrafiltration (10.000 MW Cut-Off) entfernt.
FITC-Test
Das FITC-markierte Sojaremnant wurde verwendet, um die Fähigkeit der Proteasen zum Abbau des Sojaremnants unter Verwendung des folgenden Tests zu testen: 0,4 ml Proteaseprobe (mit A₂₈₀ = 0,1) wurde mit 0,4 ml FITC-Sojaremnant (Suspension von 10 mg/ml in 0,2 M Natriumphosphat-Puffer pH 6,5) bei 37 °C gemischt und die relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU 485/535 nm; Anregungs-/Kontroll-Wellenlänge) nach 0 Stunden und nach 22-stündiger Inkubation gemessen. Vor der Bestimmung der RFU wurden die Proben für 1 Minute bei 20.000 × g zentrifugiert und 250 Mikroliter Überstand wurden in ein schwarzes Mikroliter-Tray überführt. Die Messungen wurden unter Verwendung eines „VICTOR 1420 Multilabel-Counters" (In vitro, Dänemark) durchgeführt. RFU ist im Allgemeinen beschrieben von Iain D. Johnson in: Introduction to Fluorescence Techniques, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Richard P. Haugland, 6. Auflage, 1996 (ISBN 0-9652240-0-7).
Die Blindprobe wurde durch Hinzufügen von 0,4 ml Puffer anstelle der Enzymprobe hergestellt. RFUProbe = ΔRFUProbe – ΔRFUblind, wobei ΔRFU = RFU (22 Stunden) – RFU (0 Stunden)
Die resultierenden FITC-Werte (RFU_Probe-Werte) sind unten in Tabelle 3 gezeigt. Die FITC-Werte sind im Allgemeinen mit einem Fehlerbereich von +/- 20.000. Im Gegensatz zu Protease I und Protease II baute die aus Bacillus sp. NCIMB 40484 stammende Protease das Sojaremnant in einem signifikanten Ausmaß ab.
Tabelle 3 Fähigkeit von Proteasen Sojaremnant abzubauen
Beispiel 4
In vitro-Testen der aus Bacillus sp. NCIMB 40484 stammenden Protease
Die aus Bacillus sp. NCIMB 40484 stammende Protease wurde zusammen mit anderen Subtilisin-Proteasen wie z. B. SubNovo, SubNovo (Y217L), SAVINASE^TM und ALCALASE^TM auf ihre Fähigkeit getestet, Mais-SBM- (Mais-Sojabohnenmehl)-Proteine in einem automatisierten in vitro-Verdauungssystem (welches die Verdauung in monogastrischen Tieren simuliert) zu lösen. Für die Leerprobenbehandlungen wurde das Mais-SBM in Abwesenheit von exogenen Subtilisin-artigen Proteasen inkubiert.
Das in vitro-System bestand aus 30 Flaschen, in welchen das Mais-SBM-Substrat anfänglich mit HCl/Pepsin – was die Verdauung im Magen simuliert – und anschließend mit Pankreatin – was die Verdauung im Darm imitiert – inkubiert. Am Ende der gastrischen Inkubationsdauer wurden die Proben der in vitro-Digesta entfernt und aufgelöste Proteine analysiert.
Substrate
10 g Mais-SBM-Kost mit einem Mais-SBM-Verhältnis von 6:4 (Gew./Gew.) wurde verwendet. Der Proteingehalt betrug 43 % (Gew./Gew.) in SBM und 8,2 % (Gew./Gew.) in Maismehl. Die Gesamtmenge an Protein in 10 g Mais-SBM-Kost betrug 2,21 g.
Verdauungsenzyme
Pepsin (Sigma P-7000; 539 U/mg, fest), Pankreatin (Sigma P-7545; 8 × U.S.P. (US Pharmacopeia)).
Überblick über die in vitro-Verdauungs-Vorgehensweise
Enzymproteinbestimmungen
Die Menge an Proteaseenzymprotein wird auf Grundlage der A₂₈₀-Werte und der Aminosäuresequenzen (Aminosäurezusammensetzungen) unter Verwendung der in S.C.Gill & P.H. von Hippel, Analytical Biochemistry 182, 319-326, (1989) ausgeführten Prinzipien berechnet.
Experimentelle Vorgehensweise für das In Vitro-Modell

1. 10 g Substrat wird in eine 100 ml Flasche eingewogen.
2. Zum Zeitpunkt 0 Min. werden 46 ml HCl (0,1 M) enthaltend Pepsin (3000 U/g Kost) und 1 ml Protease (0,1 mg Enzymprotein/g Kost) zu der Flasche unter Mischen zugegeben. Die Flasche wird bei 40 °C inkubiert.
3. Zum Zeitpunkt 30 Min. wird der pH-Wert gemessen.
4. Zum Zeitpunkt 45 Min. werden 16 ml H₂O zugegeben.
5. Zum Zeitpunkt 60 Min. werden 7 ml NaOH (0,39 M) zugegeben.
6. Zum Zeitpunkt 90 Min. werden 5 ml NaHCO₃ (1 M) enthaltend Pankreatin (8,0 mg/g Kost) zugegeben.
7. Zum Zeitpunkt 120 Min. wird der pH gemessen.
8. Zum Zeitpunkt 300 Min. wird der pH gemessen.
9. Zum Zeitpunkt 330 Min. werden Proben von 30 ml entfernt und vor der Zentrifugation (10000 × g, 10 Min., 4 °C) auf Eis gestellt. Die Überstände werden entfernt und bei –20 °C gelagert.

Schätzung des gelösten Proteins durch Gelfiltrations-HPLC
Der Gehalt an gelöstem Protein aus den Überständen aus den in vitro verdauten Proben wurde durch Quantifizieren des Rohproteins (CP; crude protein) unter Verwendung von Gelfiltrations-HPLC geschätzt. Die Überstände wurden aufgetaut, durch 0,45 μm Polycarbonatfilter (Sartorius) filtriert und mit Wasser verdünnt (1:50, Vol./Vol.). Die verdünnten Proben wurden mittels HPLC und Verwendung einer Superdex "Peptide PE"-(7,5 × 300 mm)-Gelfiltrationssäule (Global) chromatographiert. Der zur isokratischen Elution verwendete Eluent war 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) enthaltend 150 mM NaCl. Das Gesamtvolumen des Eluenten pro Lauf betrug 26 ml und die Fließgeschwindigkeit betrug 0,4 ml/Min. Die Elutionsprofile wurden bei 214 nm aufgenommen und die Gesamtfläche unter den Profilen wurde durch Integration bestimmt. Um den Proteingehalt aus den integrierten Flächen zu schätzen, wurde eine Kalibrierungskurve (R² = 0,9993) aus den Verdünnungsreihen einer in vitro verdaute Referenz-Mais-SBM-Probe mit einem bekannten Gesamtproteingehalt hergestellt. Die Proteinbestimmung in dieser Referenzprobe wurde durch das Kjeldahl-Verfahren (Bestimmung an % Stickstoff; A.O.A.C. (1984) Official Methods of Analysis, 14. Aufl., Washington D.C.) durchgeführt.
Ergebnisse
Die Ergebnisse, d. h. die Wirkung der verschiedenen Proteasen auf die Proteinlöslichkeit in vitro, sind unten in Tabelle 4 gezeigt.
Die Berechnung der relativen Menge an gelöstem Protein basiert auf der Gesamtmenge Protein in 10 g Mais-SBM-Kost (2,21 g Protein), gelöst in einem Gesamtvolumen von 75 ml während der in vitro-Verdauungsreaktion. Unter der Annahme einer vollständigen Proteinlösung (100 %) beträgt der Proteingehalt in den Überstanden 2,95 Gew.-% pro Volumen.
Die Ergebnisse wurden mittels einfaktorieller Varianzanalyse analysiert: P = 0,0001; SD = Standardabweichung; n = Zahl der Messwiederholer pro Behandlung (n = 5).
Die aus Bacillus sp. NCIMB 40484 stammende Protease hat im Vergleich zu den anderen Proteasen eine signifikant bessere Wirkung auf die Lösung von Proteinen. Tabelle 4

A, B, C: Werte, die keine gemeinsamen indizierten Buchstaben teilen, unterscheiden sich signifikant (P < 0,05)

Beispiel 5 Abbau des Lektin-SBA und der Sojabohnen-Bowman-Birk- und -Kunitz-Inhibitoren
Die Fähigkeit der Protease aus Bacillus sp. NCIMB 40484 zur Hydrolyse von Sojabohnenagglutinin (SBA) und den Soja-Bowman-Birk- und -Kunitz-Trypsin-Inhibitoren wurde getestet.
Reines SBA (Fluka 61763); Bowman-Birk-Inhibitor (Sigma T-9777) oder Kunitz-Inhibitor (Trypsin-Inhibitor aus Sojabohne, Boehringer Mannheim 109886) wurde mit der Protease für 2 Stunden, 37 °C, bei pH 6,5 inkubiert (Protease: anti-nutritiver Faktor = 1:10, auf Grundlage von A₂₈₀). Inkubationspuffer: 50 mM Dimethylglutarsäure, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, 0,01 % Triton X-100, pH 6,5.
Die Fähigkeit der Protease zum Abbau von SBA und den Proteaseinhibitoren wurde durch das Verschwinden von nativen SBA- oder Trypsin-Inhibitor-Banden und das Auftreten Abbauprodukte mit niedrigem Molekulargewicht auf SDS-PAGE-Gelen abgeschätzt. Die Gele wurden mit Coomassie-Blau gefärbt und die Intensität der Banden durch Scannen bestimmt.
Die Ergebnisse, als % des abgebauten anti-nutritiven Faktors, sind unten in Tabelle 5 gezeigt.
Es wird in Erwägung gezogen, dass die Fähigkeit zum Abbau anti-nutritiver Faktoren in Soja auch durch Anwendung von Western-Techniken mit Antikörpern gegen SBA, Bowman-Birk-Inhibitor oder Kunitz-Inhibitor nach Inkubation von Sojabohnenmehl mit Kandidatenproteasen abgeschätzt werden kann (siehe WO 98/56260).
Tabelle 5
Beispiel 6
Herstellung von weiteren säurestabilen Subtilisinen
Herstellung der Protease aus Bacillus alcalophilus
Bacillus alcalophilus NCIMB 10438 wurde mit einer gefriergetrockneten Kultur in Schüttelflaschen inokuliert, von denen jede 100 ml BPX-Medium der folgenden Zusammensetzung enthielt: Kartoffelstärke 100 g/l, Gerstenmehl 50 g/l, BAN 800 MG (erhältlich von Novozymes A/S) 0,05 g/l, Natriumcaseinat 10 g/l, Sojamehl 20 g/l, Dinatriumphosphat 9 g/l, Pluronic PE 6100 0,1 ml/l in Leitungswasser. Der pH wurde auf 9,7 mit 10 ml 1 M Natriumsesquicarbonat vor der Inokulation in jeder Schüttelflasche eingestellt. Der Stamm wurde für 4 Tage bei 30 Grad C und 300 Upm fermentiert. Mit dieser Kultur wurden neue Schüttelflaschen, enthaltend 100 ml BPX-Medium, inokuliert und für 3 Tage fermentiert.
Reinigung
Die Kulturbrühe wurde bei 10000 × g für 30 Minuten in einen 1-Liter-Becher zentrifugiert. Die Überstände wurden vereint und mittels Filtration durch eine Seitz K-250 Tiefenfilterplatte geklärt. Das klare Filtrat wurde durch Ultrafiltration auf einer Polyether-Sulfon-Kassette mit 3 kDa Cut-Off (Filtron) konzentriert. Das konzentrierte Enzym wurde in einem 50 mM H₃BO₃, 5 mM 3,3'-Dimethylglutarsäure, 1 mM CaCl₂, pH 7 (Puffer A) auf eine G25 Sephadex-Säule (Amersham Pharmacia Biotech) übertragen und auf eine Bacitracin-Agarose-Säule (Upfront Chromatography A/S), die in Puffer A äquilibriert war, aufgetragen. Nach dem Waschen der Bacitracin-Säule mit Puffer, um das gebundene Protein zu entfernen, wurde die Protease von der Säule unter Verwendung von Puffer A, der mit 25 % 2-Propanol und 1 M Natriumchlorid supplementiert war, eluiert. Die Fraktionen aus der Bacitracin-Säule mit Proteaseaktivität wurden gepoolt und in 20 mM CH₃COOH/NaOH, 1 mM CaCl₂, pH 5 (Puffer B) durch G25 Sephadex-Chromatographie übertragen. Der Proteasepool mit Pufferwechsel wurde auf eine SOURCE 30S-Säule (Amersham Pharmacia Biotech), die mit Puffer B äquilibriert war, aufgetragen. Nach Waschen der SOURCE 30S-Säule mit Puffer B wurde die Protease mit einem steigenden linearen NaCl-Gradienten (0 bis 0,5 M) in Puffer B eluiert. Fraktionen aus der Säule wurden auf Proteaseaktivität getestet und die Protease-enthaltenden Fraktionen wurden durch SDS-PAGE analysiert. Reine Fraktionen wurden gepoolt und für die weitere Charakterisierung verwendet.
Herstellung anderer säurestabiler Subtilisine
Die Proteasen aus Fusarium oxysporum IFO 4471, Bacillus alcalophilus NCIMB 10438, Paecilomyces lilacinus CBS 102449, Aspergillus sp. CBS 102448, Acremonium chrysogenum ATCC 48272 und Acremonium kiliense ATCC 20388 wurden unter Verwendung üblicher Verfahren, wie sie allgemein oben für die Protease von Bacillus alcalophilus NCIMB 10438 beschrieben sind, hergestellt.
Sequenzen
Die folgenden Aminosäureteilsequenzen wurden bestimmt:
SEQ ID NR.: 1

N-terminal von der Protease, die aus Acremonium chrysogenum ATCC 48272 stammt: ALVTQNGAPWGLGTISHRQPGSTSYIY;

SEQ ID NR.: 2

N-terminal von der Protease, die aus Bacillus alcalophilus NCIMB 10438 stammt: NQVTPWGITRVQAPTAW;

SEQ ID NR.: 3

N-terminal von der Protease, die aus Paecilomyces lilacinus CBS 102449 stammt: AYTQQPGAPWGLGRISH;

SEQ ID NR.: 4

N-terminal von der Protease, die aus Fusarium oxysporum IFO 4471 stammt: ALTTQSGATWGLGTVSHRSRGS.

Die Aminosäuresequenz der Protease, die von Bacillus sp. NCIMB 40484 stammt, SE ID NR.: 5 hierin, wurde zuvor bestimmt (siehe US-Patent Nr. 5,650,326, SEQ ID Nr.: 4, 6 und 8).
Eine Recherche in öffentlichen Proteindatenbanken nach verwandten Sequenzen ergab das Folgende:
SEQ ID NR.: 6

Genesegp/r65936 (betreffend die Protease von Paecilomyces lilacinus CBS 143.75 von EP 623672 ) – verwandt mit SEQ ID NR.: 3;

SEQ ID NR.: 7

Genesegp/r74334 (betreffend die Protease von Bacillus sp. THS-1001 von JP-07095882) – verwandt mit SEQ ID NR.: 2.

Die Stämme von Paecilomyces lilacinus und Aspergillus sp. wurden gemäß dem Budapester Vertrag über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren bei dem „Centraalbureau voor Schimmelcultures" (CBS), P.O. Box 273, 3740 AG Baarn, Niederlande, wie folgt hinterlegt:

Hinterlegungsdatum: 17. Januar 2000

CBS Nr.: Aspergillus sp. 102448

Hinterlegungsdatum: 17. Januar 2000

CBS Nr.: Paecilomyces lilacinus 102449
Die Hinterlegungen wurden von Novo Nordisk A/S durchgeführt und später auf die Hoffman-La Roche AG übertragen.
Beispiel 7
Charakterisierung und Vergleichsstudie weiterer Subtilisin-Proteasen
Die aus Bacillus alcalophilus NCIMB 10438, Fusarium oxysporum IFO 4471, Paecilomyces lilacinus CBS 102449, Aspergillus sp. CBS 102448, Acremonium chrysogenum ATCC 48272, Acremonium kiliense ATCC 20338 hergestellten Proteasen sind alle Subtilisine.
Die Reinheit der Proteaseproben wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben, bestimmt.
Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:

n. b. = nicht bestimmt

Tests
Die pH-Aktivitäts-, pH-Stabilitäts- und Temperatur-Aktivitäts-Tests sind in Beispiel 2 beschrieben (das pNA-Substrat Suc-AAPF-pNA (Sigma 5-7388) wurde für alle Proteasen für pH-Aktivitäts- und -Stabilitäts-Profile verwendet, wohingegen Protazyme AK Tabletten für die Temperatur-Profile verwendet wurden).
Ein Überblick über die Aktivitätsoptima (pH- und Temperatur-Aktivität) ist in Tabelle 6 zu sehen. pH-Stabilitäts-, pH-Aktivitäts- und Temperatur-Aktivitäts-Profile sind in 4 bis 6 zu sehen und ein ausführlicher Vergleich der pH-Stabilitäts-Daten für die Proteasen bei sauren pH-Werten ist in Tabelle 7 zu sehen.
Tabelle 6 pH- und Temperatur-Optima verschiedener Proteasen
Tabelle 7 pH-Stabilität verschiedener Proteasen zwischen pH 2,0 und 5,0
Beispiel 8
Inhibition von Proteasen mit Subtilisin-Inhibitor (SSI) aus Streptomyces

pNA-Substrat: Suc-AAPF-pNA (Sigma^® 5-7388) wurde zum Messen der Restaktivität nach Inhibition verwendet.
Testpuffer: 100 mM Bernsteinsäure (Merck 1.00682), 100 mM HEPES (Sigma H-3375), 100 mM CHES (Sigma C-2885), 100 mM CABS (Sigma C-5580), 1 mM CaCl₂, 150 mM KCl, 0,01 % Triton^® X-100, pH 9,0.
Testtemperatur: 25 °C.

SSI wurde aus einem Fermentationsüberstand von Streptomyces albogriseolus FERM P-1205 (S-3253) mittels Chromatographie gereinigt. Die verwendete SSI-Zubereitung hatte eine Reinheit von über 95 % – die Reinheit wurde durch die in Beispiel 2A beschriebene Vorgehensweise bestimmt. Alternativ kann SSI von Wako in Japan, Katalog Nr. 303-05201, hergestellt von Daiwa Kasei K.K.
(siehe z. B.: http://search.wako-chem.co.jp/lifedb e/lifedocs e/44834.asp) erhalten werden.
Vor dem unten beschriebenen Inhibitionstest wurde SSI in 0,01 % Triton X-100 auf eine Konzentration von A₂₈₀ = 0,010 verdünnt.
Protease: Die verwendete Protease hatte eine Reinheit von über 95 % – die Reinheit wurde durch die in Beispiel 2A beschriebene Vorgehensweise bestimmt. Vor dem unten beschriebenen Inhibitionstest wurde die Protease in 0,01 % Triton X-100 auf eine Konzentration von A₂₈₀ = 0,010 verdünnt.
Die Inhibition der Proteasen durch den Subtilisin-Inhibitor (SSI) aus Streptomyces wurde durch die folgende Vorgehensweise bestimmt:
Eine 300 μl Proteaseprobe (Konzentration A₂₈₀ = 0,010) wurde mit 300 μl SSI (Konzentration A₂₈₀ = 0,010) und 1,5 ml Testpuffer gemischt. Nach 15-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Restaktivität durch Zugeben von 1,5 ml pNA-Substrat (50 mg gelöst in 1,0 ml DMSO und 45 x weiter verdünnt mit 0,01 % Triton^® X-100) gemessen und nach Mischen wurde der Anstieg von A₄₀₅ durch ein Spektrophotometer kontrolliert. Als eine Kontrolle (kein SSI) wurden 300 μl O,01 % Triton X-100 anstelle von SSI verwendet.
Die Restaktivität wurde mit der Kontrollaktivität (kein SSI) normalisiert, d. h. keine Inhibition durch SSI wird 100 % Restaktivität ergeben und eine vollständige Inhibition durch SSI wird 0 % Restaktivität ergeben.
Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:

* nicht bestimmt

Beispiel 9
Fähigkeit weiterer säurestabiler Subtilisine unlösliche Anteile von Sojabohnenmehl (SBM) abzubauen
Die weiteren säurestabilen Subtilisine, die wie in Beispiel 6 beschrieben hergestellt wurden, wurden, wie in Beispiel 3 beschrieben, auf ihre Fähigkeit getestet, unlösliche/unverdaubare Anteile von SBM Verdauungsenzymen und/oder exogen zugefügten Enzymen zugänglich zu machen.
Die erhaltenen Ergebnisse sind unten in Tabelle 8 gezeigt. Zum Vergleich sind die in Beispiel 3 für die Proteasen I und II erhaltenen Ergebnisse auch in Tabelle 8 eingeschlossen.
Tabelle 8 Fähigkeit weiterer Proteasen Sojaremnant abzubauen
Beispiel 10
Wirkungen von aus Bacillus sp. NCIMB 40484 stammendem säurestabilem Subtilisin auf die Wachstumsleistung von Brathähnchen
Der Versuch wurde im „Roche Research Center for Animal Nutrition" (CRNA, F-68305 Village-Neuf Frankreich) gemäß den behördlichen Vorgaben für Experimente mit lebenden Tieren in Frankreich durchgeführt. Einen Tag alte Brathühnchen ('Ross PM3'), die nach Geschlecht getrennt waren, wurden von einer kommerziellen Brutanstalt bezogen.
Die Hühnchen wurden in Batteriekäfigen mit Drahtboden untergebracht, die in einem hinsichtlich der Umgebung kontrollierten Raum gehalten wurden. Futter und Leitungswasser wurden ad libitum bereitgestellt.
Am Tag 8 wurden die Hühnchen je nach Gewicht in zwei Gruppen von 6 Vögeln eingeteilt, die entweder der Kontrollbehandlung, die experimentelle Kost ohne Enzyme erhielten, oder der Enzymbehandlung, die experimentelle Kost ergänzt mit 100 mg Enzymprotein aus Bacillus sp. NCIMB 40484 Protease pro kg Futtermittel erhielten, zugewiesen wurden.
Jede Behandlung wurde mit 12 Gruppen wiederholt, 6 Gruppen jeden Geschlechts. Die Gruppen wurden an den Tagen 8 und 29 gewogen. Der Futtermittelverbrauch in der dazwischen liegenden Phase wurde bestimmt und die Zunahme des Körpergewichts und die Futtermittelumwandlungsrate wurden berechnet.
Die experimentelle Kost auf Basis von Maisstärke und Sojabohnenmehl (44 % Rohprotein) als Hauptbestandteile (Tabelle 9) wurde in der CRNA hergestellt. Das Futtermittel wurde bei ungefähr 70 °C in Pellets geformt (Konfiguration der Druckgießform: 3 × 20 mm). Eine geeignete Menge der Protease aus Bacillus sp. NCIMB 40484 wurde in einer festgelegten Menge an Wasser verdünnt und auf das Futtermittel in Pelletform gesprüht. Für die Kontrollbehandlung wurden adäquate Mengen an Wasser verwendet, um die Behandlungen in der gleichen Weise durchzuführen.
Für die statistische Beurteilung wurde eine zweifaktorielle Varianzanalyse (Faktoren: Behandlung und Geschlecht) unter Verwendung der GLM-Vorgehensweise des SAS-Pakets (SAS Institute Inc., 1985) durchgeführt. Wo signifikante Behandlungswirkungen (p < 0,05) angezeigt wurden, wurden die Unterschiede zwischen den Mittelwerten der Behandlung mit dem Duncan-Test analysiert. Aufgrund technischer Gründe wurde ein Käfig der Enzymbehandlung aus der statistischen Beurteilung ausgeschlossen.
In Tabelle 2 sind die Ergebnisse der Wachstumsleistung von Brathühnchen vom Tag 8 bis zum Tag 29 aufgeführt. Es gab keine Wechselwirkung zwischen Behandlung und Geschlecht, daher sind die gepoolten Ergebnisse beider Geschlechter dargestellt. Die Ergänzung der experimentellen Kost mit Protease aus Bacillus sp. NCIMB 40484 verbesserte die Gewichtszunahme numerisch um 6,6 %. Die Zugabe der Protease erhöhte die Futtermittelaufnahme leicht um 3,1 %. Die Protease aus Bacillus sp. NCIMB 40484 verbesserte die Futtermittelumwandlung der Brathühnchen signifikant um 3,4 %.
Unter der Berücksichtigung, dass Maisstärke ein hoch verdaubarer Bestandteil ist, kann angenommen werden, dass die beobachteten Wirkungen hauptsächlich auf der Wirkung der Enzyme auf das Sojabohnenmehl beruht. Daher zeigten die Ergebnisse, dass der Nährwert des Sojabohnenmehls durch die Protease aus Bacillus sp. NCIMB 40484 verbessert wurde.
Zusammenfassend zeigte die Studie, dass die Ergänzung des Futtermittels für Brathühnchen, das hohe Mengen an Sojabohnenmehl enthielt, mit Protease aus Bacillus sp. NCIMB 40484 mit 100 mg Enzymprotein pro kg Futtermittel in einen numerischen Anstieg der Gewichtszunahme und einer signifikanten Verbesserung der Futtermittelumwandlung resultierte.
Literaturstellen

EEC (1986): Directive de la Commission du 9 avril 1986 fixant la méthode de calcul de la valeur énérgetique des aliments composés destinés à la volaille. Journal Officiel des Communautés Européennes, L130, 53 – 54
SAS Institute Inc. (1985): SAS^® User's Guide, Version 5. Auflage. Cary NC

Tabelle 9 Zusammensetzung der experimentellen Kost

¹ Analysierter Gehalt: 90,6 % Trockenmasse, 45,3 % Rohprotein, 2,0 % Rohfett, 4,9 % Rohballaststoffe
² entspricht 90 mg Lasatocid-Na/kg Futtermittel als Kokkidiostatikum

³ berechnet auf Grundlage des analysierten Nährstoffgehalts (EC-Gleichung; EEC, 1986) Zulieferer der Futtermittelbestandteile

Maisstäxke:	Roquettes Freres, F-62136 Lestrem, Frankreich
Sojabohnenmehl 44:	Rekasan GmbH, D-07338 Kaulsdorf, Deutschland
Talg:	Fondoirs Gachot SA, F-67100 Straßburg, Frankreich
Sojabohnenöl:	Ewoco Sarl, F-68970 Guemar, Frankreich
DL-Methionin:	Produit Roche SA, F-92521 Neuilly-sur-Seine, Frankreich
MCP:	Brenntag Lorraine, F-54200 Toul, Frankreich
Salz:	Minoterie Moderne, F-68560 Hirsingue, Frankreich
Bindemittel:	Minoterie Moderne, F-68560 Hirsingue, Frankreich
Premix (AM vol chair NS 4231):	Agrobase, F-01007 Bourg-en-Bresse, Frankreich
Avatec:	Produit Roche SA, F-92521 Neuilly-sur-Seine, Frankreich

Tabelle 10
Leistung der Brathühnchen von Tag 8 bis Tag 29
Gepoolte Ergebnisse für beide Geschlechter: Mittelwert ± St. abw.

Mittelwerte in einer Zeile, die keinen gemeinsamen hochgestellten Index teilen, sind signifikant verschieden (p < 0,05)
¹ Aufgrund technischer Gründe wurde ein Käfig von der statistischen Beurteilung ausgeschlossen.

Beispiel 11
Premix und Kost für Truthahn und Salmoniden ergänzt mit säurestabiler Subtilisinprotease
Ein Premix der folgenden Zusammensetzung wurde hergestellt (Gehalt pro kg):
Zu diesem Premix wurde Protease von Bacillus sp. NCIMB 40484, welche wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt war, in einer Menge, die 10 g Proteaseenzymprotein/kg entspricht, zugegeben.
Kost in Form von Pellets für Truthähne am Beginn und im Wachstum mit einer Zusammensetzung wie in der unten aufgeführten Tabelle gezeigt (auf der Grundlage von Leeson und Summers, 1997, aber erneut berechnet ohne Fleischmehl unter Verwendung des AGROSOFT^®-Optimierungsprogramms) und mit 100 mg Proteaseenzymprotein pro kg, werden wie folgt hergestellt:
Gemahlener Mais, Sojabohnenmehl, Fischmehl und pflanzliches Fett werden in einem Kaskadenmischer gemischt. Calciumcarbonat, Calciumphosphat und Salz werden zusammen mit dem obigen Premix in einer Menge von 10 g/kg Kost zugefügt, gefolgt vom Mischen. Die resultierende Mischung wird zu Pellets geformt (Dampfkonditionieren, gefolgt von dem Schritt des Pelletbildens):
Zwei Kostvarianten für Salmoniden wurden auch, wie allgemein oben ausgeführt, hergestellt. Die tatsächlichen Zusammensetzungen sind unten in der Tabelle angegeben (aufgestellt aus „Refstie et al" (1998), Aquaculture, Bd. 162, S. 301-302). Der geschätzte Nährstoffgehalt wurde unter Verwendung des Agrosoft^®-Futtermitteloptimierungsprogramms erneut berechnet.
Die Protease, die aus Bacillus sp. NCIMB 40484 stammt und wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt wurde, wird zu der Kost in einer Menge zugefügt, die 100 mg Proteaseenzymprotein pro kg entspricht.
Beispiel 12
Bestimmung der Reinheit von Protease-enthaltenden Enzymprodukten
Die Reinheit von Protease-enthaltenden Enzymprodukten, z. B. Proteasezubereitungen wie zum Beispiel kommerzielle multikomponentige Enzymprodukte, kann durch ein Verfahren auf Grundlage der Fraktionierung des Protease-enthaltenden Enzymprodukts auf einer Größenausschlusssäule bestimmt werden. Die Größenausschluss-Chromatographie, die auch als Gelfiltrations-Chromatographie bekannt ist, basiert auf einer porösen Gelmatrix (in eine Säule gepackt) mit einer Verteilung von Porengrößen, die mit der Größe der zu trennenden Proteinmoleküle vergleichbar ist. Relativ kleine Proteinmoleküle können aus der umgebenden Lösung in das Gel diffundieren, wohingegen größere Moleküle durch ihre Größe an der Diffusion in das Gel in dem gleichen Ausmaß gehindert werden. Als ein Ergebnis werden die Proteinmoleküle nach ihrer Größe getrennt, wobei größere Moleküle von der Säule vor kleineren eluieren.
Proteinkonzentrationstest
Die Proteinkonzentration in Protease-enthaltenden Enzymprodukten wird mit einem BCA-Protein-Test-Kit von PIERCE (identisch zu PIERCE Katalog Nr. 23225) bestimmt. Das Natriumsalz Bicinchoninsäure (BCA) ist eine stabile, wasserlösliche Verbindung, die in der Lage ist, einen starken violetten Komplex mit Kupferionen (Cu¹⁺) in alkalischer Umgebung zu bilden. Das BCA-Reagenz bildet die Basis für den BCA-Protein-Test-Kit, der in der Lage ist, Kupferionen, die durch die Reaktion von Proteinen mit alkalischem Cu²⁺ (Biuret-Reaktion) produziert wurden, zu überwachen. Die durch diese Reaktion gebildete Farbe ist stabil und steigt in einer proportionalen Weise mit steigender Proteinkonzentration (Smith, P.K., et al. (1985), Analytical Biochemistry, Bd. 150, S. 76-85). Die BCA-Arbeitslösung wird durch Mischen von 50 Teilen Reagenz A mit 1 Teil Reagenz B hergestellt (Reagenz A ist PIERCE Katalog Nr. 23223, enthält BCA und Tartrat in einem alkalischen Carbonatpuffer; Reagenz B ist PIERCE Katalog Nr. 23224, enthält 4 % CuSO₄·5H₂O). 300 μl Probe werden mit 3,0 ml BCA-Arbeitslösung gemischt. Nach 30 Minuten bei 37 °C wird die Probe auf Raumtemperatur abgekühlt und A₄₉₀ als ein Maß für die Proteinkonzentration in der Probe abgelesen. Verdünnungen von bovinem Serumalbumin (PIERCE Kat. Nr. 23209) werden in den Test als ein Standard eingeschlossen.
Probenvorbehandlung
Wenn das Protease-enthaltende Enzymprodukt ein Feststoff ist, wird das Produkt zuerst in 20 Volumina 100 mM H₃BO₃, 10 mM 3,3'-Dimethylglutarsäure, 2 mM CaCl₂, pH 6 (Puffer A) für mindestens 15 Minuten bei 5 °C gelöst/suspendiert, und wenn das Enzym in diesem Zustand eine Suspension ist, wird die Suspension durch einen 0,45 μ Filter filtriert, um eine klare Lösung zu ergeben. Die Lösung wird von diesem Punkt an wie ein flüssiges Protease-enthaltendes Enzymprodukt behandelt.
Wenn das Protease-enthaltende Enzymprodukt eine Flüssigkeit ist, wird das Produkt zuerst in einem SpectraPor-Dialyseschlauch mit einem Cut-Off von 6-8000 Da (Kat. Nr. 132 670 von Spectrum Medical Industries) gegen 100 Volumina Puffer A + 150 mM NaCl (Puffer B) für mindestens 5 Stunden bei 5 °C einer Dialyse unterzogen, um Chemikalien der Formulierung zu entfernen, die eine hohe Viskosität der flüssigen Protease-enthaltenden Enzymprodukte ergeben könnten, was für die Größenausschluss-Chromatographie nachteilig ist.
Das einer Dialyse unterzogene Protease-enthaltende Enzymprodukt wird durch einen 0,45 μ Filter filtriert, wenn während der Dialyse ein Präzipitat gebildet wurde. Die Proteinkonzentration in dem der Dialyse unterzogenen Enzymprodukt wird mit dem oben beschriebenen Proteinkonzentrations-Test bestimmt und das Enzymprodukt wird mit Puffer B verdünnt, um eine Probe zu ergeben, die für die Größenausschluss-Chromatographie mit einer Proteinkonzentration von 5 mg/ml bereit ist. Wenn das Enzymprodukt eine niedrigere Konzentration als 5 mg/ml nach der Dialyse besitzt, wird es so, wie es ist, verwendet.
Grössenausschluss-Chromatographie
Eine 300 ml HiLoad26/60 Superdex75pg Säule (Amersham Pharmacia Biotech) wird in Puffer B äquilibriert (Fluss: 1 ml/Min). 1,0 ml der Protease-enthaltenden Enzymprobe wird auf die Säule aufgetragen und die Säule wird mit Puffer B (Fluss: 1 ml/min) eluiert. 2,0 ml Fraktionen werden aus dem Auslass der Säule gesammelt, bis die gesamte aufgetragene Probe von der Säule eluiert ist. Die gesammelten Fraktionen werden auf den Proteingehalt (siehe oben Proteinkonzentrationstest) und auf Proteaseaktivität durch geeignete Tests analysiert. Ein Beispiel eines geeigneten Tests ist der Suc-AAPF-pNA Test (siehe Beispiel 2B). Andere geeignete Tests sind z. B. der CPU-Test (siehe Beispiel 1) und der Protazyme AK-Test (siehe Beispiel 2D). Die Bedingungen, z. B. pH, für die Proteaseaktivitättests werden eingestellt, um so viele Proteasen wie möglich in der fraktionierten Probe zu messen. Die Bedingungen der Tests, auf die oben Bezug genommen wird, sind Beispiele geeigneter Bedingungen. Andere geeignete Bedingungen sind oben in dem Abschnitt genannt, der sich mit der Messung der Proteaseaktivität beschäftigt. Ein Proteinpeak mit Aktivität in einem oder mehreren Proteasetests wird als ein Proteasepeak definiert. Die Reinheit eines Proteasepeaks wird als die Proteinmenge in dem Peak dividiert durch die Gesamtproteinmenge in allen identifizierten Proteasepeaks berechnet.
Die Reinheit eines Protease-enthaltenden Enzymprodukts wird als die Menge Protein in dem säurestabilen Proteasepeak dividiert durch die Proteinmenge in allen identifizierten Proteasepeaks unter Verwendung der oben genannten Vorgehensweise berechnet.
Sequenzprotokoll

Claims

Verwendung mindestens einer Säure-stabilen Protease in Tierfutter, wobei die Protease (i) zu der Subtilisin-Familie gehört; und/oder (ii) weniger als 10 % Restaktivität besitzt, wenn sie mit SSI inhibiert wird, und wobei (iii) die Restaktivität der Protease nach 2-stündiger Inkubation bei 37 °C und einem pH von 3,5 mindestens 40 % der Restaktivität nach 2-stündiger Inkubation bei 5 °C und einem pH von 9,0 beträgt, wobei die Protease in reiner Form inkubiert wird, A₂₈₀ = 1,0 ist und die Restaktivität auf Suc-AAPF-pNA bei einem pH von 9,0 und 25 °C gemessen wird.
Verwendung mindestens einer Säure-stabilen Protease bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwendung in Tierfutter, wobei die Protease (i) zu der Subtilisin-Familie gehört; und/oder (ii) weniger als 10 % Restaktivität besitzt, wenn sie mit SSI inhibiert wird, und wobei (iii) die Restaktivität der Protease nach 2-stündiger Inkubation bei 37 °C und einem pH von 3,5 mindestens 40 % der Restaktivität nach 2-stündiger Inkubation bei 5 °C und einem pH von 9,0 beträgt, wobei die Protease in reiner Form inkubiert wird, A₂₈₀ = 1,0 ist und die Restaktivität auf Suc-AAPF-pNA bei einem pH von 9,0 und 25 °C gemessen wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Dosierung der Protease 0,01-200 mg Protease-Enzymprotein pro kg Futter beträgt.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die beabsichtigte Dosierung der Protease 0,01-200 mg Protease-Enzymprotein pro kg Futter beträgt.
Verfahren zum Verbessern des Nährstoffgehalts eines Tierfutters, wobei mindestens eine Säure-stabile Protease dem Futter zugesetzt wird, und wobei die Protease (i) zu der Subtilisin-Familie gehört; und/oder (ii) weniger als 10 % Restaktivität besitzt, wenn sie mit SSI inhibiert wird, und wobei (iii) die Restaktivität der Protease nach 2-stündiger Inkubation bei 37 °C und einem pH von 3,5 mindestens 40 % der Restaktivität nach 2-stündiger Inkubation bei 5 °C und einem pH von 9,0 beträgt, wobei die Protease in reiner Form inkubiert wird, A₂₈₀ = 1,0 ist und die Restaktivität auf Suc-AAPF-pNA bei einem pH von 9,0 und 25 °C gemessen wird.
Tierfutterzusatz enthaltend (a) mindestens eine Säure-stabile Protease; und (b) mindestens ein fettlösliches Vitamin, und/oder (c) mindestens ein wasserlösliches Vitamin, und/oder (d) mindestens ein Spurenelement; wobei die Protease (i) zu der Subtilisin-Familie gehört; und/oder (ii) weniger als 10 % Restaktivität besitzt, wenn sie mit SSI inhibiert wird, und wobei (iii) die Restaktivität der Protease nach 2-stündiger Inkubation bei 37 °C und einem pH von 3,5 mindestens 40 % der Restaktivität nach 2-stündiger Inkubation bei 5 °C und einem pH von 9,0 beträgt, wobei die Protease in reiner Form inkubiert wird, A₂₈₀ = 1,0 ist und die Restaktivität auf Suc-AAPF-pNA bei einem pH von 4,0 und 25 °C gemessen wird.
Tierfutterzusatz nach Anspruch 6, wobei die Menge der Protease einer beabsichtigten Zugabe von 0,01-200 mg Proteaseprotein pro kg Futter entspricht.
Tierfutterzusatz nach einem der Ansprüche 6 bis 7, der zusätzlich Phytase, Xylanase, Galactanase und/oder beta-Glucanase enthält.
Tierfutterzusammensetzung mit einem Rohproteingehalt von 50-800 g/kg enthaltend mindestens eine Säure-stabile Protease, wobei die Protease (i) zu der Subtilisin-Familie gehört; und/oder (ii) weniger als 10 % Restaktivität besitzt, wenn sie mit SSI inhibiert wird, und wobei (iii) die Restaktivität der Protease nach 2-stündiger Inkubation bei 37 °C und einem pH von 3,5 mindestens 40 % der Restaktivität nach 2-stündiger Inkubation bei 5 °C und einem pH von 9,0 beträgt, wobei die Protease in reiner Form inkubiert wird, A₂₈₀ = 1,0 ist und die Restaktivität auf Suc-AAPF-pNA bei einem pH von 9,0 und 25 °C gemessen wird.
Tierfutterzusammensetzung nach Anspruch 9, wobei die Menge der Protease 0,01-200 mg Proteaseprotein pro kg Futter beträgt.
Verfahren zur Behandlung von pflanzlichen Proteinen umfassend den Schritt des Zugebens mindestens einer Säure-stabilen Protease zu mindestens einem/r pflanzlichen Protein oder Proteinquelle, wobei die Protease (i) zu der Subtilisin-Familie gehört; und/oder (ii) weniger als 10 % Restaktivität besitzt, wenn sie mit SSI inhibiert wird, und wobei (iii) die Restaktivität der Protease nach 2-stündiger Inkubation bei 37 °C und einem pH von 3,5 mindestens 40 % der Restaktivität nach 2-stündiger Inkubation bei 5 °C und einem pH von 9,0 beträgt, wobei die Protease in reiner Form inkubiert wird, A₂₈₀ = 1,0 ist und die Restaktivität auf Suc-AAPF-pNA bei einem pH von 9,0 und 25 °C gemessen wird.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei Sojabohne in die mindestens eine pflanzliche Proteinquelle eingeschlossen ist.