CN109153981A

CN109153981A - 具有α-半乳糖苷酶活性的多肽以及编码其的多核苷酸

Info

Publication number: CN109153981A
Application number: CN201780031700.9A
Authority: CN
Inventors: L·卡斯滕森; N·斯波茨博格; M·耶蒙森; J·萨洛蒙; K·B·R·M·克罗
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2016-05-24
Filing date: 2017-05-24
Publication date: 2019-01-04
Also published as: WO2017202966A1; MX2018014234A; US10808268B2; AU2017269498A1; US20190144902A1; BR112018073875A2; US20200399669A1; US20200399668A1; EP3464581A1

Abstract

本发明涉及使用具有α‑半乳糖苷酶活性的多肽从豆科作物中释放半乳糖的方法。本发明还涉及具有α‑半乳糖苷酶活性的多肽、编码这些多肽的多核苷酸、包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞连同5产生这些多肽的方法。本发明还涉及包含本发明多肽的组合物以及这些多肽在动物饲料中的用途。

Description

具有α-半乳糖苷酶活性的多肽以及编码其的多核苷酸

对序列表的引用

本申请含有处于计算机可读形式的序列表，将其通过援引并入本文。

发明背景

技术领域

本发明涉及使用具有α-半乳糖苷酶活性的多肽从豆科作物中释放半乳糖的方法。本发明还涉及具有α-半乳糖苷酶活性的多肽、编码这些多肽的多核苷酸、包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞连同产生这些多肽的方法。本发明还涉及包含本发明多肽的组合物以及这些多肽在动物饲料中的用途。

背景技术

α-半乳糖苷酶是一种糖苷水解酶，其从存在于豆科作物、蔬菜、谷粒、谷物等中的糖脂和糖蛋白的末端水解α-半乳糖基部分。α-半乳糖苷酶是通过各种微生物、植物和动物制备的，但哺乳动物缺乏肠道α-半乳糖苷酶产生，因此无法分解自己摄入的α-半乳糖苷。相反，摄入的α-半乳糖苷被肠道内存在的微生物分解。

大豆是东亚特有的豆科作物，是全球第二大饲料作物，也是动物饲料中使用的最大的蛋白质来源。可以对大豆进行加工(脱脂)以产生大豆粉(SBM)，且SBM是一个重要且廉价的动物饲料优质蛋白质来源。其他常见的豆科作物有鹰嘴豆、羽扇豆、小扁豆、花生、豆类或豌豆，也可加工并用作动物饲料。豆科作物，例如大豆，含有大量的棉子糖寡糖，其需要α-半乳糖苷酶存在以释放半乳糖。

高达70％的农民开支来自动物饲料的成本。因此，农民总是有兴趣通过减少饲养来降低饲料成本，或者通过使用相同数量的饲料来改进动物生长。实现这一目标的一种方法是通过使用酶，例如α-半乳糖苷酶，从饲料中释放尽可能多的能量。然而，酶也是一项费用，因此α-半乳糖苷酶应该在成本有效的剂量下起效。

GH36α-半乳糖苷酶是现有技术中已知，例如披露于WO 2009/108941(SEQ ID NO:597，AXR38459)。然而，如实例13所示，与现有技术α-半乳糖苷酶接近的类似物在从大豆粉中释放半乳糖方面不是很有效。因此，本发明的目的是提供α-半乳糖苷酶，其比已知的α-半乳糖苷酶更有效地从豆科作物释放半乳糖。

发明内容

本发明涉及一种从基于植物的材料中释放半乳糖的方法，该方法包括用一种或多种具有α-半乳糖苷酶活性的GH36多肽处理该基于植物的材料，其中该具有α-半乳糖苷酶活性的GH36多肽选自下组，该组由以下组成：

(a)与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:19的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；

(b)多肽的变体，该选自由以下组成的组：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:19，其中该变体具有α-半乳糖苷酶活性并且包含在1至50个位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；

(c)多肽，该多肽包含(a)或(b)的多肽以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；

(d)多肽，该多肽包含(a)或(b)的多肽以及多至10个氨基酸的N-末端和/或C-末端延伸；和

(e)(a)或(b)的多肽的片段，该片段具有α-半乳糖苷酶活性并且具有该成熟多肽的至少90％的长度。

本发明还涉及如权利要求中定义的分离的具有α-半乳糖苷酶活性的多肽，编码本发明的多肽的多核苷酸；核酸构建体；表达载体；包含这些多核苷酸的重组宿主细胞；以及制备这些多肽的方法。本发明还涉及包含本发明的多肽的组合物(例如颗粒、液体配制品、动物饲料或动物饲料添加剂)及其用途；改进动物性能的方法；制备动物饲料的方法和用于改进动物饲料的营养价值的方法；

序列表概述

SEQ ID NO:1是如分离自脱支芽孢杆菌的GH36α-半乳糖苷酶的基因序列。

SEQ ID NO:2是如从SEQ ID NO:1推导的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3是具有His-标签的SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

SEQ ID NO:4是如分离自嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌的GH36α-半乳糖苷酶的基因序列。

SEQ ID NO:5是如从SEQ ID NO:4推导的氨基酸序列。

SEQ ID NO:6是具有His-标签的SEQ ID NO:5的氨基酸序列。

SEQ ID NO:7是如分离自Anoxybacillus bogrovensis的GH36α-半乳糖苷酶的基因序列。

SEQ ID NO:8是如从SEQ ID NO:7推导的氨基酸序列。

SEQ ID NO:9是具有His-标签的SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

SEQ ID NO:10是如分离自聚多曲霉的GH36α-半乳糖苷酶的基因序列。

SEQ ID NO:11是如从SEQ ID NO:10推导的氨基酸序列。

SEQ ID NO:12是来自聚多曲霉的成熟GH36α-半乳糖苷酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:13是如分离自芽孢杆菌属物种-19140的GH36α-半乳糖苷酶的cDNA序列。

SEQ ID NO:14是如从SEQ ID NO:10推导的氨基酸序列。

SEQ ID NO:15是具有His-标签的SEQ ID NO:14的氨基酸序列。

SEQ ID NO:16是如WO1994/23022中披露的α-半乳糖苷酶的校正的氨基酸序列。

SEQ ID NO:17是如分离自红紫曲霉(Aspergillus puniceus)的GH36α-半乳糖苷酶的cDNA序列。

SEQ ID NO:18是如从SEQ ID NO:17推导的氨基酸序列。

SEQ ID NO:19是来自红紫曲霉(Aspergillus puniceus)的成熟GH36α-半乳糖苷酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:20是来自Parageobacillus thermoglucosidans的成熟GH36α-半乳糖苷酶的氨基酸序列。

定义

等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占用同一染色体基因座的基因的两个或更多个替代形式中任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

α-半乳糖苷酶：术语“α-半乳糖苷酶”，也称为α-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(E.C.3.2.1.22)，意指可以催化α-D-半乳糖苷(例如半乳糖寡糖、半乳糖甘露聚糖和半乳糖脂)中末端非还原性α-D-半乳糖残基水解的酶。可以使用4-硝基苯基α-D-半乳吡喃糖苷(可从麦格酶国际有限公司(Megazyme International)，布雷，威克洛郡，爱尔兰(Bray,Co.Wicklow,Ireland)获得)作为底物在室温下在100mM MES(西格玛公司)缓冲液pH 7.0±0.05确定α-半乳糖苷酶活性。将酶稀释于2-倍稀释液并将4-硝基苯基α-D-半乳吡喃糖苷底物溶解于含有酶的溶液中。α-半乳糖苷酶活性在缓冲液中通过测量作为时间的函数在405nm时释放的pNP的吸光度直接进行跟踪。详细的测定可在本文所述的α-半乳糖苷酶测定中找到。在一个方面中，本发明的多肽具有SEQ ID NO:12的多肽的至少60％、例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％的α-半乳糖苷酶活性。

动物：术语“动物”是指除人类以外的所有动物。动物的实例为非反刍动物和反刍动物。反刍动物包括例如，动物，如绵羊、山羊、牛(例如，肉牛、奶牛和牛犊)、鹿、yank、骆驼、美洲驼和袋鼠。非反刍动物包括单胃动物，例如，猪(包括但不限于小猪、成长猪、和母猪)；家禽，如火鸡、鸭和鸡(包括但不限于肉仔鸡和蛋鸡)；马(包括但不限于热血马、冷血马和温血马)、小牛；鱼(包括但不限于琥珀鱼、巨滑舌鱼、魮鱼、鲈鱼、蓝鱼、bocachico、鲤科鱼、鲶鱼、cachama、鲤鱼、鲶鱼、卡特拉鱼、遮目鱼、嘉鱼、丽鱼科鱼、军曹鱼、鳕鱼、小翻车鱼、金头鲷、石首鱼、鳗鱼、虾虎鱼、金鱼、丝足鱼、石斑鱼、guapote、大比目鱼、爪哇鱼(java)、野鲮属鱼、莱鱼(lai)、泥鳅、鲭鱼、牛奶鱼、银鲈、泥鱼、鲻鱼、帕高鱼(paco)、pearlspot、pejerrey、河鲈鱼、狗鱼、鲳参鱼、斜齿鳊、鲑鱼、虾米鱼(sampa)、加拿大鰤鲈、黑鲈、海鲤、发光鱼(shiner)、睡鲨(sleeper)、黑鱼、鲷鱼、锯盖鱼、比目鱼、刺足鱼、鲟鱼、翻车鱼、香鱼(sweetfish)、丁鲷、特罗尔鱼(terror)、罗非鱼、鳟鱼、鲔鱼、多宝鱼、白鳟鱼、白斑鱼和白鱼)；和甲壳动物(包括但不限于虾和对虾)。

动物饲料：术语“动物饲料”是指适合于、或打算用于由动物摄入的任何化合物、制剂、或混合物。单胃动物的动物饲料通常包括浓缩物连同维生素、矿物质、酶、直接饲养的微生物、氨基酸和/或其他饲料成分(例如在预混物中)，而反刍动物的动物饲料通常包括草料(包括粗粮和青贮)，并且可以进一步包括浓缩物连同维生素、矿物质、酶、直接饲养的微生物、氨基酸和/或其他饲料成分(例如在预混物中)。

体增重：术语“体增重”是指在给定时间段期间动物的活重增加，例如，从第1天到第21天的体重增加。

cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录物本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列步骤进行加工，包括剪接。

编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由可读框决定，该可读框以起始密码子(例如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

控制序列：术语“控制序列”是指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制性酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。

表达：术语“表达”包括涉及多肽的产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，该DNA分子包含编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。

饲料转化率：术语“饲料转化率”是指用来增加动物的体重一个指定量的喂给动物的饲料量。改进的饲料转化率意指较低的饲料转化率。通过“较低的饲料转化率”或“改进的饲料转化率”，其意味着当饲料不包括所述饲料添加剂组合物时，与以将动物体重增加到相同量所需的饲料量相比，在饲料中使用饲料添加剂组合物导致需要将更少量的饲料喂给动物，以增加动物的体重一个指定量。

饲料效率：术语“饲料效率”是指当动物在一段时间内被任意喂养或喂养指定量的食物时每单位饲料的体重增加量。“增加的饲料效率”是指根据本发明的饲料添加剂组合物在饲料中的使用导致与不用所存在的所述饲料添加剂组合物喂养的动物相比，每单位饲料摄入的增加的增重。

片段：术语“片段”意指具有从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基端缺失的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中该片段具有α-半乳糖苷酶活性。

在一个方面，该片段包含成熟多肽的至少90％的长度，例如SEQ ID NO:2的至少655个氨基酸、SEQ ID NO:3的至少660个氨基酸、SEQ ID NO:5的至少657个氨基酸、SEQ IDNO:6的至少663个氨基酸、SEQ ID NO:8的至少658个氨基酸、SEQ ID NO:9的至少664个氨基酸、SEQ ID NO:11的至少647个氨基酸、SEQ ID NO:12的至少647个氨基酸、SEQ ID NO:14的至少657个氨基酸、SEQ ID NO:15的至少663个氨基酸、SEQ ID NO:18的至少661个氨基酸或SEQ ID NO:19的至少661个氨基酸。

在一个方面，该片段包含成熟多肽的至少92％的长度，例如SEQ ID NO:2的至少669个氨基酸、SEQ ID NO:3的至少675个氨基酸、SEQ ID NO:5的至少672个氨基酸、SEQ IDNO:6的至少678个氨基酸、SEQ ID NO:8的至少673个氨基酸、SEQ ID NO:9的至少678个氨基酸、SEQ ID NO:11的至少661个氨基酸、SEQ ID NO:12的至少661个氨基酸、SEQ ID NO:14的至少672个氨基酸、SEQ ID NO:15的至少678个氨基酸、SEQ ID NO:18的至少676个氨基酸或SEQ ID NO:19的至少676个氨基酸。

在一个方面，该片段包含成熟多肽的至少94％的长度，例如SEQ ID NO:2的至少684个氨基酸、SEQ ID NO:3的至少689个氨基酸、SEQ ID NO:5的至少687个氨基酸、SEQ IDNO:6的至少692个氨基酸、SEQ ID NO:8的至少688个氨基酸、SEQ ID NO:9的至少693个氨基酸、SEQ ID NO:11的至少675个氨基酸、SEQ ID NO:12的至少675个氨基酸、SEQ ID NO:14的至少687个氨基酸、SEQ ID NO:15的至少692个氨基酸、SEQ ID NO:18的至少690个氨基酸或SEQ ID NO:19的至少690个氨基酸。

在一个方面，该片段包含成熟多肽的至少96％的长度，例如SEQ ID NO:2的至少698个氨基酸、SEQ ID NO:3的至少704个氨基酸、SEQ ID NO:5的至少701个氨基酸、SEQ IDNO:6的至少707个氨基酸、SEQ ID NO:8的至少702个氨基酸、SEQ ID NO:9的至少708个氨基酸、SEQ ID NO:11的至少690个氨基酸、SEQ ID NO:12的至少690个氨基酸、SEQ ID NO:14的至少701个氨基酸、SEQ ID NO:15的至少707个氨基酸、SEQ ID NO:18的至少705个氨基酸或SEQ ID NO:19的至少705个氨基酸。

在一个方面，该片段包含成熟多肽的至少98％的长度，例如SEQ ID NO:2的至少713个氨基酸、SEQ ID NO:3的至少719个氨基酸、SEQ ID NO:5的至少716个氨基酸、SEQ IDNO:6的至少722个氨基酸、SEQ ID NO:8的至少717个氨基酸、SEQ ID NO:9的至少723个氨基酸、SEQ ID NO:11的至少704个氨基酸、SEQ ID NO:12的至少704个氨基酸、SEQ ID NO:14的至少716个氨基酸、SEQ ID NO:15的至少722个氨基酸、SEQ ID NO:18的至少720个氨基酸或SEQ ID NO:19的至少720个氨基酸。

在一个方面，该片段包含成熟多肽的至少99％的长度，例如SEQ ID NO:2的至少720个氨基酸、SEQ ID NO:3的至少726个氨基酸、SEQ ID NO:5的至少723个氨基酸、SEQ IDNO:6的至少729个氨基酸、SEQ ID NO:8的至少724个氨基酸、SEQ ID NO:9的至少730个氨基酸、SEQ ID NO:11的至少711个氨基酸、SEQ ID NO:12的至少711个氨基酸、SEQ ID NO:14的至少723个氨基酸、SEQ ID NO:15的至少729个氨基酸、SEQ ID NO:18的至少727个氨基酸或SEQ ID NO:19的至少727个氨基酸。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。

分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的一种物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白、肽或辅因子的任何物质，所述物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分增加物质的量而修饰的任何物质(例如，宿主细胞中的重组产生；编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比与编码该物质的基因天然相关的启动子更强的启动子)。

成熟多肽:术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一方面，该成熟多肽是SEQID NO:2的氨基酸1至728。在另一方面，成熟多肽是SEQ ID NO:3的氨基酸1至734。在一方面，成熟多肽是SEQ ID NO:5的氨基酸1至731。在另一个方面，成熟多肽是SEQ ID NO:6的氨基酸1至737。在一方面，成熟多肽是SEQ ID NO:8的氨基酸1至732。在另一个方面，成熟多肽是SEQ ID NO:9的氨基酸1至738。在一方面，成熟多肽是SEQ ID NO:11的氨基酸1至719。在另一个方面，成熟多肽是SEQ ID NO:12的氨基酸1至719。在一方面，成熟多肽是SEQ ID NO:14的氨基酸1至731。在另一个方面，成熟多肽是SEQ ID NO:15的氨基酸1至737。在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:18的氨基酸1至735，并且SEQ ID NO:18的氨基酸-29至-1是信号肽。在另一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:19的氨基酸1至735。

本领域已知，宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。本领域还已知，不同的宿主细胞不同地加工多肽，且因此一个表达多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可产生不同的成熟多肽(例如，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有α-半乳糖苷酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸1至2184。在一方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:4的核苷酸1至2193。在一方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:7的核苷酸1至2196。在一方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:10的核苷酸1至85、核苷酸131至734和核苷酸787至2323的结合序列。在一方面，成熟多肽编码序列是SEQID NO:13的核苷酸1至2193。在一方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:17的核苷酸1至109、核苷酸173至779和核苷酸864至2439的结合序列。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单-链或双链的核酸分子，所述核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或是合成的，所述核酸分子包含一个或多个控制序列。

营养素消化率：术语“营养素消化率”意指从胃肠道或胃肠道的指定区段(例如小肠)处消失的营养素的部分。营养素消化率可测量为所给予至受试者的营养素与受试者粪便中所排出来的营养素之间的差值、或给予至受试者的营养素与保留在胃肠道指定区段(例如回肠)上的消化物中的营养素之间的差值。

如在此使用的，营养素消化率可通过在一段时间期间收集总排泄物，测量所摄入营养素与所排泄的营养素之间的差值；或利用不会被动物吸收，并允许研究者计算整个胃肠道或胃肠道区段中所消失的营养的量的惰性标记物来测量。这种惰性标记物可以是二氧化钛、氧化铬或酸不溶性灰分。消化率可表示为营养素在饲料中的百分比，或表示为可消化的营养素的质量单位/饲料中的营养素的质量单位。如在此使用的，营养素消化率涵盖淀粉消化率、脂肪消化率、蛋白质消化率和氨基酸消化率。

如在此使用的，能量消化率意指所消耗的饲料总能量减去粪便的总能量，或所消耗的饲料总能量减去动物胃肠道指定区段(例如回肠)上的剩余消化物的总能量。如在此使用的，代谢能是指表观代谢能，并且意指所消耗的饲料总能量减去粪便、尿和消化的气体产物中包含的总能量。能量消化率和代谢能可测量为总能量的摄取与粪便中排泄的或胃肠道指定区段中存在的消化物中的总能量之间的差值，其使用与测量营养素消化率相同的方法，针对氮排泄进行适当校正以计算饲料的代谢能。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意思指这样一种配置，在该配置中，一个控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，这样使得该控制序列引导该编码序列的表达。

释放x g半乳糖/kg大豆粉：术语“释放x g半乳糖/kg大豆粉”意指在大豆粉与酶孵育后，释放至上清液中的半乳糖的量(以克计)。出于本发明的目的，释放的半乳糖/kg大豆粉可以如在本文半乳糖SBM测定中描述的，当在如下反应条件下进行时确定：20mg多肽/kg大豆粉于10％w/v 0.1M柠檬酸-磷酸盐缓冲液pH 6.5中，在40℃孵育2小时。

在一个更具体实施例中，由碾磨至0.5mm粒径的大豆粉和0.1M柠檬酸-磷酸盐缓冲液，pH 6.5±0.05制备10w/v％大豆粉浆料。将含有10w/v％大豆粉浆料的孵育容器加热至稳定的温度40℃±2℃，同时搅拌。当达到稳定温度后，向孵育容器中添加6个D-(+)-半乳糖标准品，使孵育容器内的浓度为5mg、2.5mg、1.25mg、0.625mg、0.313mg和0.157mg半乳糖/mL孵育体积。一式两份地孵育每个标准品。然后将稀释的酶按达到所需浓度所需的体积分别添加到各自的孵育容器中(以mg EP/kg大豆粉)。一式三份地孵育每个酶处理。此外，包括二乘三个孵育容器，其不含标准品或酶处理作为空白处理以获得大豆粉浆液中基线半乳糖浓度。孵育容器在40℃±2℃孵育2小时，同时搅拌。孵育后在5℃下在1500g离心15分钟。然后，在基于来自麦格酶公司(Megazyme)(产品名称K-RAFGA)的棉子糖/半乳糖试剂盒的测定中分析上清液，然后如本文半乳糖SBM测定中计算半乳糖的浓度。

在一个实施例中，本发明的具有α-半乳糖苷酶的GH36多肽释放至少19g，例如至少19.5g、至少20g、至少20.5g、至少21g、至少21.5g、至少22g或至少23g半乳糖/kg大豆粉。

基于植物的材料：术语“基于植物的材料”是指基于植物的材料来自于蔷薇亚纲。在一方面，基于植物的材料来自豆目，例如豆科，优选云实亚科或含羞草亚科或蝶形花亚科，或更优选来自菜豆族、鹰嘴豆族、染料木族、野碗豆族、黄檀族或菜豆族。在一方面，基于植物的材料来自十字花目，例如十字花科，优选芸薹族(Brassiceae)，更优选芸薹属(Brassica)。

在具体的实施例中，基于植物的材料是大豆、野生大豆、豆类、羽扇豆、花菜豆、红花菜豆、瘦豆(slimjim bean)、利马豆、法国菜豆、蚕豆(fava bean)、鹰嘴豆、小扁豆、花生、西班牙花生、低芥酸菜籽、油菜籽(油菜)或豌豆或处于其加工形式例如大豆粉、全脂大豆粉、大豆蛋白质浓缩物(SPC)、发酵大豆粉(FSBM)或其任何组合。在一个优选的实施例中，基于植物的材料是大豆或大豆粉。

序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS:The European MolecularBiology Open Software Suite[EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件],Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势],16:276-277)(优选3.0.0版或更新版本)的Needle程序中所实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性的程度。使用版本6.1.0。所用的任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。Needle标注的“最长的同一性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比同一性，并且如下计算：

(相同的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人，2000，见上文)(优选3.0.0版或更新版本)的Needle程序中所实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性的程度。使用版本6.1.0。所用的任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)替代矩阵。Needle标注的“最长的同一性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比同一性，并且如下计算：

(相同的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对的长度-在比对中的空位总数)

子序列：术语“子序列”意指使一个或多个(例如，若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失的多核苷酸；其中该子序列编码具有α-半乳糖苷酶活性的片段。

基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”意指含有按重量计至多10％、至多8％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％、以及至多0.5％的其他多肽材料的制剂，这些其他多肽材料是所述基本上纯的多肽天然或重组地相关的。优选地，该多肽按存在于制剂中的总多肽材料的重量计是至少92％纯的，例如至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％纯的、至少99.5％纯的、以及100％纯的。本发明的多肽优选处于基本上纯的形式。例如，这可以通过采用熟知的重组方法或采用经典的纯化方法制备多肽来实现。

变体：术语“变体”意指在一个或多个(若干个)位置包含改变(即，一个或多个(若干个)氨基酸残基的取代、插入和/或缺失)的具有α-半乳糖苷酶活性的多肽。取代意指将占据一个位置的氨基酸用不同的氨基酸置换；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指邻近占据一个位置的氨基酸添加1-3个氨基酸。在一个方面，当在以下反应条件下进行时，本发明的变体释放至少19g、例如至少19.5g、例如至少20g、至少20.5g、至少21g、至少21.5g、至少22g或至少23g半乳糖/kg大豆粉，所述条件是：20mg多肽/kg大豆粉，在10％w/v0.1M柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，pH 6.5，在40℃孵育2小时。

在另一个方面，当使用本文描述的α-半乳糖苷酶测定时本发明的变体具有SEQ IDNO:12的多肽的α-半乳糖苷酶活性的至少60％、例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。

具体实施方式

诸位发明人已经发现来自糖苷水解酶家族36(在此称为GH36)的某些α-半乳糖苷酶出乎意料地擅长降解棉子糖家族的寡糖(RFO)，例如三糖棉子糖、四糖水苏糖和五糖毛蕊花糖。这些RFO典型地是在来自蔷薇亚纲特别是蝶形花亚科的植物中发现的，例如大豆、鹰嘴豆、豆类、羽扇豆、小扁豆、花生和豌豆或芸薹族(Brassiceae)，例如低芥酸菜籽油菜或油菜籽。

可以将RFO的降解测量为当例如用α-半乳糖苷酶处理大豆粉时释放到上清液中的半乳糖的量。增加的溶解量将导致更多的半乳糖被释放，这可以使用例如如在本文所述的半乳糖SBM测定方法来检测。

释放半乳糖的方法

因此，本发明涉及一种从基于植物的材料中释放半乳糖的方法，所述方法包括用一种或多种具有α-半乳糖苷酶活性的GH36多肽处理基于植物的材料，其中该具有α-半乳糖苷酶活性的GH36多肽选自下组，该组由以下组成：

(a)与SEQ ID NO:2的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；

(b)与SEQ ID NO:5的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；

(c)与SEQ ID NO:8的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；

(d)与SEQ ID NO:12的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；

(e)与SEQ ID NO:14的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；

(f)与SEQ ID NO:19的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；

(g)多肽的变体，该多肽选自由以下组成的组：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:19，其中该变体具有α-半乳糖苷酶活性并包括在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；

(h)多肽，该多肽包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)的多肽以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；

(i)多肽，该多肽包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)的多肽以及多至10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的N-末端和/或C-末端延伸；和

(j)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)的多肽的片段，该片段具有α-半乳糖苷酶活性并且具有该成熟多肽的至少90％的长度。

在一个实施例中，基于植物的材料来自于蔷薇亚纲。在一方面，基于植物的材料来自豆目，例如豆科，优选云实亚科或含羞草亚科或蝶形花亚科，或更优选来自菜豆族、鹰嘴豆族、染料木族、野碗豆族、黄檀族或菜豆族。在一方面，基于植物的材料来自十字花目，例如十字花科，优选芸薹族，更优选芸薹属。

在一个实施例中，具有α-半乳糖苷酶的GH36多肽获得自或可获得自芽孢杆菌目(Bacillales)，优选芽孢杆菌科(Bacillaceae)，更优选芽孢杆菌属(Bacillus)。在一个实施例中，具有α-半乳糖苷酶的GH36多肽获得自或可获得自芽孢杆菌目(Bacillales)，优选芽孢杆菌科(Bacillaceae)并且选自由以下组成的组：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:8和SEQ ID NO:14。

在一个实施例中，具有α-半乳糖苷酶的GH36多肽获得自或可获得自散囊菌目(Eurotiales)，优选曲霉科(Aspergillaceae)，更优选曲霉属(Aspergillus)。在一个实施例中，具有α-半乳糖苷酶的GH36多肽获得自或可获得自散囊菌目(Eurotiales)，优选曲霉科(Aspergillaceae)，更优选曲霉属(Aspergillus)并且选自由以下组成的组：SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:19。

在一个实施例中，具有α-半乳糖苷酶的GH36多肽释放至少19g，例如至少19.5g、至少20g、至少20.5g、至少21g、至少21.5g、至少22g或至少23g半乳糖/kg大豆粉。在一个实施例中，当在以下反应条件下进行时，具有α-半乳糖苷酶的GH36多肽释放至少19g、例如至少19.5g、例如至少20g、至少20.5g、至少21g、至少21.5g、至少22g或至少23g半乳糖/kg大豆粉，所述条件是：20mg多肽/kg大豆粉，在10％w/v 0.1M柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，pH 6.5，在40℃孵育2小时。

在一个优选的实施例中，本发明涉及一种从基于植物的材料中释放半乳糖的方法，该方法包括用一种或多种具有α-半乳糖苷酶活性的GH36多肽处理该基于植物的材料，其中该具有α-半乳糖苷酶活性的GH36多肽选自下组，该组由以下组成：

(a)与SEQ ID NO:2的多肽具有至少85％序列同一性的多肽；

(b)与SEQ ID NO:5的多肽具有至少85％序列同一性的多肽；

(c)与SEQ ID NO:8的多肽具有至少85％序列同一性的多肽；

(d)与SEQ ID NO:12的多肽具有至少85％序列同一性的多肽；

(e)与SEQ ID NO:14的多肽具有至少85％序列同一性的多肽；

(f)与SEQ ID NO:19的多肽具有至少85％序列同一性的多肽；

在一个更优选的实施例中，本发明涉及一种从基于植物的材料中释放半乳糖的方法，该方法包括用一种或多种具有α-半乳糖苷酶活性的GH36多肽处理该基于植物的材料，其中该具有α-半乳糖苷酶活性的GH36多肽选自下组，该组由以下组成：

(a)与SEQ ID NO:2的多肽具有至少90％序列同一性的多肽；

(b)与SEQ ID NO:5的多肽具有至少90％序列同一性的多肽；

(c)与SEQ ID NO:8的多肽具有至少90％序列同一性的多肽；

(d)与SEQ ID NO:12的多肽具有至少90％序列同一性的多肽；

(e)与SEQ ID NO:14的多肽具有至少90％序列同一性的多肽；

(f)与SEQ ID NO:19的多肽具有至少90％序列同一性的多肽；

(a)与SEQ ID NO:2的多肽具有至少95％序列同一性的多肽；

(b)与SEQ ID NO:5的多肽具有至少95％序列同一性的多肽；

(c)与SEQ ID NO:8的多肽具有至少95％序列同一性的多肽；

(d)与SEQ ID NO:12的多肽具有至少95％序列同一性的多肽；

(e)与SEQ ID NO:14的多肽具有至少95％序列同一性的多肽；

(f)与SEQ ID NO:19的多肽具有至少95％序列同一性的多肽；

(g)多肽的变体，该多肽选自由以下组成的组：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:19，其中该变体具有α-半乳糖苷酶活性并包括在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；

在一个实施例中，GH36多肽包含或由如下氨基酸组成：SEQ ID NO:2的氨基酸1至728、SEQ ID NO:3的氨基酸1至734、SEQ ID NO:5的氨基酸1至731、SEQ ID NO:6的氨基酸1至737、SEQ ID NO:8的氨基酸1至732、SEQ ID NO:9的氨基酸1至738、SEQ ID NO:11的氨基酸1至719、SEQ ID NO:12的氨基酸1至719、SEQ ID NO:14的氨基酸1至731和/或SEQ ID NO:15的氨基酸1至737。

具有α-半乳糖苷酶活性的多肽

在第二方面，本发明涉及具有α-半乳糖苷酶活性的多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽相差多达50个氨基酸，例如1与50个之间的氨基酸，如1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个氨基酸，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。

在第二方面的延续中，本发明涉及具有α-半乳糖苷酶活性的多肽，该多肽与SEQID NO:3的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:3的成熟多肽相差多达50个氨基酸，例如1与50个之间的氨基酸，如1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个氨基酸，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。

在一个实施例中，该多肽优选地包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列和N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签，例如SEQ ID NO:3；或者是其片段，该片段具有α-半乳糖苷酶活性并且具有该成熟多肽的至少90％，如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的长度。在另一个实施例中，该多肽包括SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。在另一个实施例中，该多肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸1至728或由其组成。在另一个实施例中，该多肽包括SEQ ID NO:3的成熟多肽或由其组成。在另一个实施例中，该多肽包括SEQ ID NO:3的氨基酸1至734或由其组成。在一个实施例中，该多肽已经被分离。

在第二方面的延续中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有α-半乳糖苷酶活性的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。在一个另外的实施例中，该多肽已经被分离。

在第二方面的一个实施例中，当在以下反应条件下进行时，该多肽释放至少19g、例如至少19.5g、例如至少20g、至少20.5g、至少21g、至少21.5g、至少22g或至少23g半乳糖/kg大豆粉，所述条件是：20mg多肽/kg大豆粉，在10％w/v 0.1M柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，pH6.5，在40℃孵育2小时。

在第二方面的延续中，本发明涉及具有α-半乳糖苷酶活性的SEQ ID NO:2的变体，这些变体包括在一个或多个(例如，若干个)位置处的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合。在一个实施例中，在SEQ IDNO:2中包括一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过50，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个。在另一个实施例中，在SEQ ID NO:2中包括一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目是在1与45之间，如1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个位置。在一个实施例中，在SEQ ID NO:2中包括一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另一个实施例中，在SEQ ID NO:2中的取代和/或缺失和/或插入的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另一个实施例中，在SEQ ID NO:2中的取代的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另外的实施例中，在SEQ ID NO:2中保守取代的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。

在第二方面的一个实施例中，当在以下反应条件下进行时，该变体释放至少19g、例如至少19.5g、例如至少20g、至少20.5g、至少21g、至少21.5g、至少22g或至少23g半乳糖/kg大豆粉，所述条件是：20mg多肽/kg大豆粉，在10％w/v 0.1M柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，pH6.5，在40℃孵育2小时。

这些氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-末端或羧基末端延伸，例如氨基末端的甲硫氨酸残基；多至20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一功能(例如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。

保守取代的实例是在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins[蛋白质],学术出版社(Academic Press)，纽约中描述。常见取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。保守取代的其他实例是G至A；A至G、S；V至I、L、A、T、S；I至V、L、M；L至I、M、V；M至L、I、V；P至A、S、N；F至Y、W、H；Y至F、W、H；W至Y、F、H；R至K、E、D；K至R、E、D；H至Q、N、S；D至N、E、K、R、Q；E至Q、D、K、R、N；S至T、A；T至S、V、A；C至S、T、A；N至D、Q、H、S；Q至E、N、H、K、R。

可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,1989,Science[科学]244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一种技术中，在分子中的每个残基处引入单丙氨酸突变，并测试所得的突变分子的α-半乳糖苷酶活性以鉴定对分子活性关键的氨基酸残基。还参见，Hilton等人，1996，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定的对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见，例如，de Vos等人，1992，Science[科学]255:306-312；Smith等人，1992，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904；Wlodaver等人，1992，FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的同一性。

Gouet等人定义了对于来自嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)的GH36α-半乳糖苷酶AgaA(Uniprot Q9ALJ4)的催化氨基酸(J.Biol.Chem.[生物化学杂志],2012,287(47),39642-39652)为Asp478和Asp548。使用比对程序，本发明的α-半乳糖苷酶与AgaA进行比对并确定催化氨基酸，如下所示。在一个实施例中，对催化氨基酸未作出改变。

使用已知的诱变、重组和/或改组方法、随后进行一个相关的筛选程序可以做出单一或多种氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，这些相关的筛选程序例如由瑞德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等人，1991，Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(Derbyshire等人，1986，Gene[基因]46:145；Ner等人，1988，DNA 7:127)。

诱变/改组方法可以与高通量自动化筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的诱变多肽的活性(Ness等人，1999，Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许迅速确定多肽中个体氨基酸残基的重要性。

该多肽可为杂合多肽，其中一个多肽的区域在另一个多肽的区域的N-末端或C-末端处融合。

该多肽可为融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一个多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一个多肽的多核苷酸与本发明多核苷酸融合而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，且包括连接编码多肽的编码序列使得它们符合读框，而且融合多肽的表达处于相同的启动子和终止子的控制之下。还可使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽(Cooper等人，1993，EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；Dawson等人，1994，Science[科学]266:776-779)。

融合多肽可进一步包含两种多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割而释放这两个多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：Martin等人，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物生物技术杂志]3:568-576；Svetina等人，2000，J.Biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；Rasmussen-Wilson等人，1997，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:3488-3493；Ward等人，1995，Biotechnology[生物技术]13:498-503；和Contreras等人，1991，Biotechnology[生物技术]9:378-381；Eaton等人，1986,Biochemistry[生物化学]25:505-512；Collins-Racie等人，1995，Biotechnology[生物技术]13:982-987；Carter等人，1989,Proteins[蛋白质]；Structure,Function,and Genetics[结构、功能以及遗传学]6:240-248；以及Stevens，2003，Drug Discovery World[世界药物发现]4:35-48。

在第三方面，本发明涉及具有α-半乳糖苷酶活性的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少82％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:5的成熟多肽相差多达50个氨基酸，例如1与50个之间的氨基酸，如1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个氨基酸，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。

在第三方面的延续中，本发明涉及具有α-半乳糖苷酶活性的多肽，该多肽与SEQID NO:6的成熟多肽具有至少82％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:6的成熟多肽相差多达50个氨基酸，例如1与50个之间的氨基酸，如1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个氨基酸，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。

在一个实施例中，该多肽优选地包括SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列和N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签，例如SEQ ID NO:6；或者是其片段，该片段具有α-半乳糖苷酶活性并且具有该成熟多肽的至少90％，如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的长度。在另一个实施例中，该多肽包括SEQ ID NO:5的成熟多肽或由其组成。在另一个实施例中，该多肽包括SEQ ID NO:5的氨基酸1至731或由其组成。在另一个实施例中，该多肽包括SEQ ID NO:6的成熟多肽或由其组成。在另一个实施例中，该多肽包括SEQ ID NO:6的氨基酸1至737或由其组成。在一个实施例中，该多肽已经被分离。

在第三方面的延续中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有α-半乳糖苷酶活性的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:4的成熟多肽编码序列具有至少82％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。在一个另外的实施例中，该多肽已经被分离。

在第三方面的一个实施例中，当在以下反应条件下进行时，该多肽释放至少19g、例如至少19.5g、例如至少20g、至少20.5g、至少21g、至少21.5g、至少22g或至少23g半乳糖/kg大豆粉，所述条件是：20mg多肽/kg大豆粉，在10％w/v 0.1M柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，pH6.5，在40℃孵育2小时。

在第三方面的延续中，本发明涉及具有α-半乳糖苷酶活性的SEQ ID NO:5的变体，这些变体包括在一个或多个(例如，若干个)位置处的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合。在一个实施例中，在SEQ IDNO:5中包括一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过50，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个。在另一个实施例中，在SEQ ID NO:5中包括一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目是在1与45之间，如1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个位置。在一个实施例中，在SEQ ID NO:5中包括一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另一个实施例中，在SEQ ID NO:5中的取代和/或缺失和/或插入的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另一个实施例中，在SEQ ID NO:5中的取代的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另外的实施例中，在SEQ ID NO:5中保守取代的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在本文的第二方面中描述了氨基酸变化、保守取代和融合肽的实例。

在第三方面的一个实施例中，当在以下反应条件下进行时，该变体释放至少19g、例如至少19.5g、例如至少20g、至少20.5g、至少21g、至少21.5g、至少22g或至少23g半乳糖/kg大豆粉，所述条件是：20mg多肽/kg大豆粉，在10％w/v 0.1M柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，pH6.5，在40℃孵育2小时。

在第四方面，本发明涉及具有α-半乳糖苷酶活性的多肽，该多肽与SEQ ID NO:8的成熟多肽具有至少82％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:8的成熟多肽相差多达50个氨基酸，例如1与50个之间的氨基酸，如1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个氨基酸，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。

在第四方面的延续中，本发明涉及具有α-半乳糖苷酶活性的多肽，该多肽与SEQID NO:9的成熟多肽具有至少82％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:9的成熟多肽相差多达50个氨基酸，例如1与50个之间的氨基酸，如1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个氨基酸，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。

在一个实施例中，该多肽优选地包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列和N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签，例如SEQ ID NO:9；或者是其片段，该片段具有α-半乳糖苷酶活性并且具有该成熟多肽的至少90％，如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的长度。在另一个实施例中，该多肽包括SEQ ID NO:8的成熟多肽或由其组成。在另一个实施例中，该多肽包括SEQ ID NO:8的氨基酸1至731或由其组成。在另一个实施例中，该多肽包括SEQ ID NO:9的成熟多肽或由其组成。在另一个实施例中，该多肽包括SEQ ID NO:9的氨基酸1至737或由其组成。在一个实施例中，该多肽已经被分离。

在第四方面的延续中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有α-半乳糖苷酶活性的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列具有至少82％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。在一个另外的实施例中，该多肽已经被分离。

在第四方面的一个实施例中，当在以下反应条件下进行时，该多肽释放至少19g、例如至少19.5g、例如至少20g、至少20.5g、至少21g、至少21.5g、至少22g或至少23g半乳糖/kg大豆粉，所述条件是：20mg多肽/kg大豆粉，在10％w/v 0.1M柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，pH6.5，在40℃孵育2小时。

在第四方面的延续中，本发明涉及具有α-半乳糖苷酶活性的SEQ ID NO:8的变体，这些变体包括在一个或多个(例如，若干个)位置处的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合。在一个实施例中，在SEQ IDNO:8中包括一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过50，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个。在另一个实施例中，在SEQ ID NO:8中包括一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目是在1与45之间，如1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个位置。在一个实施例中，在SEQ ID NO:8中包括一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另一个实施例中，在SEQ ID NO:8中的取代和/或缺失和/或插入的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另一个实施例中，在SEQ ID NO:8中的取代的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另外的实施例中，在SEQ ID NO:8中保守取代的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在本文的第二方面中描述了氨基酸变化、保守取代和融合肽的实例。

在第四方面的一个实施例中，当在以下反应条件下进行时，该变体释放至少19g、例如至少19.5g、例如至少20g、至少20.5g、至少21g、至少21.5g、至少22g或至少23g半乳糖/kg大豆粉，所述条件是：20mg多肽/kg大豆粉，在10％w/v 0.1M柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，pH6.5，在40℃孵育2小时。

在第五方面，本发明涉及具有α-半乳糖苷酶活性的多肽，该多肽与SEQ ID NO:11的成熟多肽具有至少84％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:11的成熟多肽相差多达50个氨基酸，例如1与50个之间的氨基酸，如1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个氨基酸，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。

在第五方面的延续中，本发明涉及具有α-半乳糖苷酶活性的多肽，该多肽与SEQID NO:12具有至少84％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:27相差多达50个氨基酸，例如1与50个之间的氨基酸，如1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个氨基酸，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、12、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。

在一个实施例中，该多肽优选地包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列和N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；或者是其片段，该片段具有α-半乳糖苷酶活性并且具有该成熟多肽的至少90％，如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的长度。在另一个实施例中，该多肽包括SEQ ID NO:12的成熟多肽或由其组成。在另一个实施例中，该多肽包括SEQ ID NO:11的氨基酸1至719或由其组成。在另一个实施例中，该多肽包括SEQ ID NO:11的成熟多肽或由其组成。在另一个实施例中，该多肽包括SEQ IDNO:12的氨基酸1至719或由其组成。在一个实施例中，该多肽已经被分离。

在第五方面的延续中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有α-半乳糖苷酶活性的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:10的成熟多肽编码序列具有至少84％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。在一个另外的实施例中，该多肽已经被分离。

在第五方面的一个实施例中，当在以下反应条件下进行时，该多肽释放至少19g、例如至少19.5g、例如至少20g、至少20.5g、至少21g、至少21.5g、至少22g或至少23g半乳糖/kg大豆粉，所述条件是：20mg多肽/kg大豆粉，在10％w/v 0.1M柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，pH6.5，在40℃孵育2小时。

在第五方面的延续中，本发明涉及具有α-半乳糖苷酶活性的SEQ ID NO:12的变体，这些变体包括在一个或多个(例如，若干个)位置处的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合。在一个实施例中，在SEQID NO:12中包括一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过50，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个。在另一个实施例中，在SEQ ID NO:12中包括一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目是在1与45之间，如1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个位置。在一个实施例中，在SEQ ID NO:12中包括一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另一个实施例中，在SEQ ID NO:12中的取代和/或缺失和/或插入的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另一个实施例中，在SEQ ID NO:12中的取代的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另外的实施例中，在SEQ IDNO:12中保守取代的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在本文的第二方面中描述了氨基酸变化、保守取代和融合肽的实例。

在第五方面的一个实施例中，当在以下反应条件下进行时，该变体释放至少19g、例如至少19.5g、例如至少20g、至少20.5g、至少21g、至少21.5g、至少22g或至少23g半乳糖/kg大豆粉，所述条件是：20mg多肽/kg大豆粉，在10％w/v 0.1M柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，pH6.5，在40℃孵育2小时。

在第六方面，本发明涉及具有α-半乳糖苷酶活性的多肽，该多肽与SEQ ID NO:14的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:14的成熟多肽相差多达50个氨基酸，例如1与50个之间的氨基酸，如1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个氨基酸，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。

在第六方面的延续中，本发明涉及具有α-半乳糖苷酶活性的多肽，该多肽与SEQID NO:15的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:15的成熟多肽相差多达50个氨基酸，例如1与50个之间的氨基酸，如1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个氨基酸，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。

在一个实施例中，该多肽优选地包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列和N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签，例如SEQ ID NO:15；或者是其片段，该片段具有α-半乳糖苷酶活性并且具有该成熟多肽的至少90％，如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的长度。在另一个实施例中，该多肽包括SEQ ID NO:14的成熟多肽或由其组成。在另一个实施例中，该多肽包括SEQ ID NO:14的氨基酸1至731或由其组成。在另一个实施例中，该多肽包括SEQ ID NO:15的成熟多肽或由其组成。在另一个实施例中，该多肽包括SEQ ID NO:15的氨基酸1至737或由其组成。在一个实施例中，该多肽已经被分离。

在第六方面的延续中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有α-半乳糖苷酶活性的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:13的成熟多肽编码序列具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。在一个另外的实施例中，该多肽已经被分离。

在第六方面的一个实施例中，当在以下反应条件下进行时，该多肽释放至少19g、例如至少19.5g、例如至少20g、至少20.5g、至少21g、至少21.5g、至少22g或至少23g半乳糖/kg大豆粉，所述条件是：20mg多肽/kg大豆粉，在10％w/v 0.1M柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，pH6.5，在40℃孵育2小时。

在第六方面的延续中，本发明涉及具有α-半乳糖苷酶活性的SEQ ID NO:14的变体，这些变体包括在一个或多个(例如，若干个)位置处的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合。在一个实施例中，在SEQID NO:14中包括一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过50，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个。在另一个实施例中，在SEQ ID NO:14中包括一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目是在1与45之间，如1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个位置。在一个实施例中，在SEQ ID NO:14中包括一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另一个实施例中，在SEQ ID NO:14中的取代和/或缺失和/或插入的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另一个实施例中，在SEQ ID NO:14中的取代的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另外的实施例中，在SEQ IDNO:14中保守取代的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在本文的第二方面中描述了氨基酸变化、保守取代和融合肽的实例。

在第六方面的一个实施例中，当在以下反应条件下进行时，该变体释放至少19g、例如至少19.5g、例如至少20g、至少20.5g、至少21g、至少21.5g、至少22g或至少23g半乳糖/kg大豆粉，所述条件是：20mg多肽/kg大豆粉，在10％w/v 0.1M柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，pH6.5，在40℃孵育2小时。

在第七方面，本发明涉及具有α-半乳糖苷酶活性的多肽，该多肽与SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:18的成熟多肽相差多达50个氨基酸，例如1与50个之间的氨基酸，如1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个氨基酸，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。

在第七方面的延续中，本发明涉及具有α-半乳糖苷酶活性的多肽，该多肽与SEQID NO:19具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:27相差多达50个氨基酸，例如1与50个之间的氨基酸，如1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个氨基酸，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、19、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。

在一个实施例中，该多肽优选地包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列和N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；或者是其片段，该片段具有α-半乳糖苷酶活性并且具有该成熟多肽的至少90％，如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的长度。在另一个实施例中，该多肽包括SEQ ID NO:19的成熟多肽或由其组成。在另一个实施例中，该多肽包括SEQ ID NO:18的氨基酸1至735或由其组成。在另一个实施例中，该多肽包括SEQ ID NO:18的成熟多肽或由其组成。在另一个实施例中，该多肽包括SEQ IDNO:19的氨基酸1至735或由其组成。在一个实施例中，该多肽已经被分离。

在第七方面的延续中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有α-半乳糖苷酶活性的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:17的成熟多肽编码序列具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。在一个另外的实施例中，该多肽已经被分离。

在第七方面的一个实施例中，当在以下反应条件下进行时，该多肽释放至少19g、例如至少19.5g、例如至少20g、至少20.5g、至少21g、至少21.5g、至少22g或至少23g半乳糖/kg大豆粉，所述条件是：20mg多肽/kg大豆粉，在10％w/v 0.1M柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，pH6.5，在40℃孵育2小时。

在第七方面的延续中，本发明涉及具有α-半乳糖苷酶活性的SEQ ID NO:19的变体，这些变体包括在一个或多个(例如，若干个)位置处的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合。在一个实施例中，在SEQID NO:19中包括一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过50，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个。在另一个实施例中，在SEQ ID NO:19中包括一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目是在1与45之间，如1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个位置。在一个实施例中，在SEQ ID NO:19中包括一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合的位置的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另一个实施例中，在SEQ ID NO:19中的取代和/或缺失和/或插入的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另一个实施例中，在SEQ ID NO:19中的取代的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另外的实施例中，在SEQ IDNO:19中保守取代的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在本文的第二方面中描述了氨基酸变化、保守取代和融合肽的实例。

在第七方面的一个实施例中，当在以下反应条件下进行时，该变体释放至少19g、例如至少19.5g、例如至少20g、至少20.5g、至少21g、至少21.5g、至少22g或至少23g半乳糖/kg大豆粉，所述条件是：20mg多肽/kg大豆粉，在10％w/v 0.1M柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，pH6.5，在40℃孵育2小时。

包含具有α-半乳糖苷酶活性的多肽的颗粒

在第八方面，本发明涉及包含具有α-半乳糖苷酶活性的一种或多种多肽的颗粒，其中该多肽选自下组，该组由以下组成：

(a)多肽与SEQ ID NO:2的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；

(b)与SEQ ID NO:5的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；

(c)与SEQ ID NO:8的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；

(d)与SEQ ID NO:12的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；

(e)与SEQ ID NO:14的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；

(f)与SEQ ID NO:19的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；

在一个实施例中，该颗粒包含核心颗粒和一种或多种包衣。在一个优选的实施例中，该包衣包含盐和/或蜡和/或面粉。优选的配制品披露于如下的配制品部分。

在第八方面的一个实施例中，本发明涉及包含具有α-半乳糖苷酶活性的一种或多种多肽的颗粒，其中该多肽选自下组，该组由以下组成：

(a)与SEQ ID NO:2的多肽具有至少85％序列同一性的多肽；

(b)与SEQ ID NO:5的多肽具有至少85％序列同一性的多肽；

(c)与SEQ ID NO:8的多肽具有至少85％序列同一性的多肽；

(d)与SEQ ID NO:12的多肽具有至少85％序列同一性的多肽；

(e)与SEQ ID NO:14的多肽具有至少85％序列同一性的多肽；

(f)与SEQ ID NO:19的多肽具有至少85％序列同一性的多肽；

(a)与SEQ ID NO:2的多肽具有至少90％序列同一性的多肽；

(b)与SEQ ID NO:5的多肽具有至少90％序列同一性的多肽；

(c)与SEQ ID NO:8的多肽具有至少90％序列同一性的多肽；

(d)与SEQ ID NO:12的多肽具有至少90％序列同一性的多肽；

(e)与SEQ ID NO:14的多肽具有至少90％序列同一性的多肽；

(f)与SEQ ID NO:19的多肽具有至少90％序列同一性的多肽；

(a)与SEQ ID NO:2的多肽具有至少95％序列同一性的多肽；

(b)与SEQ ID NO:5的多肽具有至少95％序列同一性的多肽；

(c)与SEQ ID NO:8的多肽具有至少95％序列同一性的多肽；

(d)与SEQ ID NO:12的多肽具有至少95％序列同一性的多肽；

(e)与SEQ ID NO:14的多肽具有至少95％序列同一性的多肽；

(f)与SEQ ID NO:19的多肽具有至少95％序列同一性的多肽；

在第八方面的任一部分的一个实施例中，具有α-半乳糖苷酶的GH36多肽获得自或可获得自芽孢杆菌目(Bacillales)，优选芽孢杆菌科(Bacillaceae)，更优选芽孢杆菌属(Bacillus)。在一个实施例中，具有α-半乳糖苷酶的GH36多肽获得自或可获得自芽孢杆菌目(Bacillales)，优选芽孢杆菌科(Bacillaceae)并且选自由以下组成的组：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:14。

在第八方面的任一部分的一个实施例中，具有α-半乳糖苷酶的GH36多肽获得自或可获得自散囊菌目(Eurotiales)，优选曲霉科(Aspergillaceae)，更优选曲霉属(Aspergillus)。在一个实施例中，具有α-半乳糖苷酶的GH36多肽获得自或可获得自散囊菌目(Eurotiales)，优选曲霉科(Aspergillaceae)，更优选曲霉属(Aspergillus)并且选自由以下组成的组：SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:19。

在第八方面的任一部分的一个实施例中，该组合物包含每千克组合物至少0.01mg的多肽(酶蛋白质)，例如每千克组合物至少0.02mg、0.05mg、0.10mg、0.2mg、0.5mg、1.0mg、2mg、5mg、10mg、20mg、50mg、100mg、200mg、500mg、1.0g、2.5g、5g、7.5g、10g、25g、50g、75g或100g。在一个实施例中，该组合物包含每千克组合物至多250g的多肽，例如每千克组合物至少150g、100g、50g、40g、30g、20g、10g、7.5g、5g、2.5g、1.0g、750mg、500mg、250mg、100mg、50mg、25mg、10mg、5mg、2.5mg或1mg。在一个实施例中，该组合物包含每千克组合物在0.01mg和250g之间的多肽(酶蛋白质)，例如在每千克组合物0.02mg、0.05mg、0.10mg、0.2mg、0.5mg、1.0mg、2mg、5mg、10mg、20mg、50mg、100mg、200mg、500mg、1.0g、2.5g、5g、7.5g、10g、25g、50g、75g或100g和每千克组合物150g、100g、50g、40g、30g、20g、10g、7.5g、5g、2.5g、1.0g、750mg、500mg、250mg、100mg、50mg、25mg、10mg、5mg、2.5mg或1mg之间，或其任何组合。

在第八方面的任一部分的一个实施例中，该颗粒包含一种或多种配制剂(例如本文描述的那些)，优选地选自以下列表的配制剂，该列表由以下组成：甘油、乙二醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、淀粉、高岭土、麦芽糊精、环糊精、小麦、PVA、乙酸盐、磷酸盐和纤维素，优选地选自以下列表，该列表由以下组成：1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、硫酸钠、糊精、纤维素、硫代硫酸钠、高岭土和碳酸钙。

在第八方面的任一部分的一个实施例中，该颗粒包含核心颗粒和一种或多种包衣。在一个优选的实施例中，该包衣包含盐和/或蜡和/或面粉。优选的配制品披露于如下的配制品部分。

在第八方面的任一部分的一个实施例中，该颗粒包含一种或多种另外的酶。该一种或多种另外的酶优选地选自下组，该组由以下组成：乙酰木聚糖酯酶、酰基甘油脂肪酶、淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶、β-糖苷酶、溶血磷脂酶、溶菌酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶(甘露聚糖酶)、植酸酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶D、蛋白酶、支链淀粉酶、果胶酯酶、三乙酰基甘油脂肪酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶或其任何组合。

在第八方面的任一部分的一个实施例中，该颗粒包含一种或多种益生菌。该一种或多种益生菌优选地选自下组，该组由以下组成：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、多粘菌芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、动物双歧杆菌、肉食杆菌属、丁酸梭菌、梭菌属、屎肠球菌、肠球菌属、乳酸杆菌属、嗜酸乳杆菌、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminus)、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、唾液乳酸杆菌、乳酸乳球菌、乳球菌属、明串珠菌属、埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii)、巨型球菌属、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、片球菌属、特氏丙酸杆菌(Propionibacterium thoenii)、丙酸杆菌属、以及链球菌属或其任何组合。

包含具有α-半乳糖苷酶活性的多肽的液体配制品

在第九方面，本发明涉及包含具有α-半乳糖苷酶活性的一种或多种多肽的液体配制品，其中该液体配制品包含：

(A)0.001％w/w至25％w/w的具有α-半乳糖苷酶活性的多肽，其中该具有α-半乳糖苷酶活性的多肽选自下组，该组由以下组成：

(a)与SEQ ID NO:2的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的多肽；

(b)与SEQ ID NO:5的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的多肽；

(c)与SEQ ID NO:8的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的多肽；

(d)与SEQ ID NO:12的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的多肽；

(e)与SEQ ID NO:14的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的多肽；

(f)与SEQ ID NO:19的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的多肽；

(j)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)的多肽的片段，该片段具有α-半乳糖苷酶活性并且具有该成熟多肽的至少90％的长度；和

(B)水。

在第九方面的一个实施例中，本发明涉及包含具有α-半乳糖苷酶活性的一种或多种多肽的液体配制品，其中该液体配制品包含：

(j)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)的多肽的片段，该片段具有α-半乳糖苷酶活性并且具有该成熟多肽的至少90％的长度；

(B)20％w/w至80％w/w的多元醇；和

(C)水。

(B)0.001％w/w至2.0％w/w的防腐剂；和

(C)水。

(B)20％w/w至80％w/w的多元醇；

(C)0.001％w/w至2.0％w/w的防腐剂；和

(D)水。

在第九方面的任一部分的一个实施例中，具有α-半乳糖苷酶的GH36多肽获得自或可获得自芽孢杆菌目(Bacillales)，优选芽孢杆菌科(Bacillaceae)，更优选芽孢杆菌属(Bacillus)。在一个实施例中，具有α-半乳糖苷酶的GH36多肽获得自或可获得自芽孢杆菌目(Bacillales)，优选芽孢杆菌科(Bacillaceae)并且选自由以下组成的组：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:14。

在第九方面的任一部分的一个实施例中，具有α-半乳糖苷酶的GH36多肽获得自或可获得自散囊菌目(Eurotiales)，优选曲霉科(Aspergillaceae)，更优选曲霉属(Aspergillus)。在一个实施例中，具有α-半乳糖苷酶的GH36多肽获得自或可获得自散囊菌目(Eurotiales)，优选曲霉科(Aspergillaceae)，更优选曲霉属(Aspergillus)并且选自由以下组成的组：SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:19。

在第九方面的任一部分的一个实施例中，该液体配制品包含一种或多种配制剂(例如本文描述的那些)，优选地选自以下列表的配制剂，该列表由以下组成甘油、乙二醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、淀粉、PVA、乙酸盐和磷酸盐，优选地选自以下列表，该列表由以下组成：1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、硫酸钠、糊精、纤维素、硫代硫酸钠、高岭土和碳酸钙。

在第九方面的任一部分的一个实施例中，该液体配制品包含一种或多种多元醇，优选地选自下组的多元醇，该组由以下组成：甘油、山梨醇、丙二醇(MPG)、乙二醇、二甘醇、三甘醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、二丙二醇、具有平均分子量低于约600的聚乙二醇(PEG)和具有平均分子量低于约600的聚丙二醇(PPG)，更优选地选自下组，该组由以下组成：甘油、山梨醇和丙二醇(MPG)或其任何组合。

在第九方面的任一部分的一个实施例中，该液体配制品包含20％-80％的多元醇(即多元醇的总量)，优选地25％-75％的多元醇、更优选地30％-70％的多元醇、更优选地35％-65％的多元醇或最优选地40％-60％的多元醇。在第九方面的任一部分的一个实施例中，该液体配制品包含20％-80％的多元醇，优选地25％-75％的多元醇、更优选地30％-70％的多元醇、更优选地35％-65％的多元醇或最优选地40％-60％的多元醇，其中该多元醇选自下组，该组由以下组成：甘油、山梨醇、丙二醇(MPG)、乙二醇、二乙二醇、三乙二醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、二丙二醇、具有平均分子量低于约600的聚乙二醇(PEG)和具有平均分子量低于约600的聚丙二醇(PPG)。在第九方面的任一部分的一个实施例中，该液体配制品包含20％-80％多元醇(即多元醇的总量)，优选地25％-75％多元醇、更优选地30％-70％多元醇、更优选地35％-65％多元醇或最优选地40％-60％多元醇，其中该多元醇选自下组，该组由以下组成：甘油、山梨醇和丙二醇(MPG)。

在第九方面的任一部分的一个实施例中，该防腐剂选自下组，该组由以下组成：山梨酸钠、山梨酸钾、苯甲酸钠和苯甲酸钾或其任何组合。在一个实施例中，该液体配制品包含0.02％至1.5％w/w的防腐剂，更优选地0.05％至1.0％w/w的防腐剂或最优选地0.1％至0.5％w/w的防腐剂。在一个实施例中，该液体配制品包含0.001％至2.0％w/w的防腐剂(即防腐剂的总量)，优选0.02％至1.5％w/w的防腐剂、更优选地0.05％至1.0％w/w的防腐剂或最优选地0.1％至0.5％w/w的防腐剂，其中防腐剂选自下组，该组由以下组成：山梨酸钠、山梨酸钾、苯甲酸钠和苯甲酸钾或其任何组合。

在第九方面的任一部分的一个实施例中，该液体配制品包含0.01％至25％w/w的具有α-半乳糖苷酶活性的多肽，优选0.05％至20％w/w的具有α-半乳糖苷酶活性的多肽、更优选地0.2％至15％w/w的具有α-半乳糖苷酶活性的多肽、更优选地0.5％至15％w/w的具有α-半乳糖苷酶活性的多肽或最优选地1.0％至10％w/w的具有α-半乳糖苷酶活性的多肽。

在第九方面的任一部分的一个实施例中，该液体配制品包含一种或多种另外的酶。该一种或多种另外的酶优选地选自下组，该组由以下组成：乙酰木聚糖酯酶、酰基甘油脂肪酶、淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶、β-糖苷酶、溶血磷脂酶、溶菌酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶(甘露聚糖酶)、植酸酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶D、蛋白酶、支链淀粉酶、果胶酯酶、三乙酰基甘油脂肪酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶或其任何组合。

在第九方面的任一部分的一个实施例中，该液体配制品包含一种或多种益生菌。该一种或多种益生菌优选地选自下组，该组由以下组成：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、多粘菌芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、动物双歧杆菌、肉食杆菌属、丁酸梭菌、梭菌属、屎肠球菌、肠球菌属、乳酸杆菌属、嗜酸乳杆菌、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminus)、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、唾液乳酸杆菌、乳酸乳球菌、乳球菌属、明串珠菌属、埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii)、巨型球菌属、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、片球菌属、特氏丙酸杆菌(Propionibacterium thoenii)、丙酸杆菌属、以及链球菌属或其任何组合。

具有α-半乳糖苷酶活性的多肽的来源

本发明的具有α-半乳糖苷酶活性的多肽可以从任何属的微生物获得。出于本发明的目的，如在此结合给定来源使用的术语“从……获得”应当意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或

由已经插入了来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一方面，获得自给定来源的多肽被分泌到细胞外。

在一个实施例中，该多肽是来自于芽孢杆菌纲的细菌，例如来自芽孢杆菌目(Bacillales)，或来自芽孢杆菌科(Bacilliaceae)，或来自芽孢杆菌属(Bacillus)，或来自嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌种(Bacillus acidopullulyticus)、芽孢杆菌属物种-19140或脱支芽孢杆菌(Bacillus deramificans)。在另一个实施例中，该多肽是来自于芽孢杆菌纲的细菌，例如来自芽孢杆菌目(Bacillales)，或来自芽孢杆菌科(Bacilliaceae)，或来自厌氧芽胞杆菌属(Anoxybacillus)，或来自Anoxybacillus bogrovensis种。

在一个另外的实施例中，该多肽是来自于散囊菌纲的真菌，例如来自散囊菌目(Eurotiales)，或来自曲霉科(Aspergillaceae)，或来自曲霉属(Aspergillus)，或来自爪甲曲霉种(Aspergillus unguis)或红紫曲霉种(Aspergillus puniceus)。

应理解的是对于前述物种，本发明涵盖完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其他分类学的等效物(equivalent)，例如，无性型(anamorph)，而与他们已知的种名无关。本领域的技术人员将容易地识别适当等效物的身份。

这些物种的菌株可容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection,Northern Regional Research Center,NRRL)。

可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得该多肽。用于从天然生境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域已知的。然后可通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦已经用探针检测到编码多肽的多核苷酸，便可以通过利用本领域普通技术人员所知的技术(参见例如，Sambrook等人，1989，见上文)分离或克隆多核苷酸。

多核苷酸

本发明还涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸。

用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域中已知的并且包括从基因组DNA或cDNA，或其组合进行分离。可以例如通过使用熟知的聚合酶链反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段，实现从基因组DNA克隆多核苷酸。参见例如，Innis等人,1990,PCR:A Guide to Methods and Application[PCR：方法和应用指南],学术出版社(Academic Press)，纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。这些多核苷酸可以克隆自芽孢杆菌属的菌株或相关有机体，并且因此，例如可以是该多核苷酸多肽编码区的等位基因变体或物种变体。

编码本发明多肽的多核苷酸的修饰对于合成实质上类似于该多肽的多肽可以是必需的。术语“实质上类似”于该多肽是指多肽的非天然存在的形式。

核酸构建体

本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，这个或这些控制序列指导编码序列在适合的宿主细胞中的表达。

可用许多方式操作所述多核苷酸以提供多肽的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操作可为合意的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域已知的。

该控制序列可为启动子，即，被宿主细胞识别用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的多核苷酸。该启动子包含转录控制序列，其介导该多肽的表达。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括变体、截短型及杂合型启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。

用于在细菌宿主细胞中指导本发明核酸构建体的转录的适合启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus，1994，Molecular Microbiology[分子微生物学]13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人，1988，Gene[基因]69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)以及tac启动子(DeBoer等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:21-25)。其他启动子描述在Gilbert等人，1980，Scientific American[科学美国人]242:74-94的“Usefulproteins from recombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”；以及Sambrook等人，1989，见上文。串联启动子的实例披露于WO 99/43835中。

在丝状真菌宿主细胞中，用于指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是获得自以下酶的基因的启动子：构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡萄糖淀粉酶(glaA)、米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶-样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉(Trichoderma reesei)β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶，以及里氏木霉翻译延长因子，以及NA2-tpi启动子(来自曲霉属中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中未翻译的前导序列已经用来自曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替换；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因的经修饰的启动子，其中未翻译的前导序列已经用来自构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替换)；及其变体、截短的及杂合的启动子。其他启动子在美国专利号6,011,147中描述。

在酵母宿主中，从以下酶的基因获得有用的启动子：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。Romanos等人，1992，Yeast[酵母]8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。

控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。终止子与编码该多肽的多核苷酸的3’-末端可操作地连接。在宿主细胞中有功能的任何终止子可用于本发明中。

细菌宿主细胞的优选终止子从针对以下的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。

用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子从以下酶的基因获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖孢镰孢胰蛋白酶-样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶以及里氏木霉翻译延长因子。

用于酵母宿主细胞的优选终止子从以下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。由Romanos等人，1992(见上文)描述了酵母宿主细胞的其他有用终止子。

控制序列还可为启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，其增加该基因的表达。

合适的mRNA稳定子区域的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人，1995，Journal of Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。

该控制序列也可以是前导序列，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。该前导子可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的5’-末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得的。

对于酵母宿主细胞适合的前导序列从以下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

控制序列也可以是多聚腺苷化序列，一种与多核苷酸3’-末端可操作地连接并在转录时由宿主细胞识别为向转录的mRNA添加聚腺苷酸残基的信号序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从以下的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的多聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995，Mol.Cellular Biol.[分子细胞生物学]15:5983-5990描述。

控制序列也可为编码与多肽的N-末端连接的信号肽并指导多肽进入细胞的分泌途径的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’-端可固有地含有在翻译阅读框中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5'-末端可含有对于编码序列为外来的信号肽编码序列。在编码序列天然地不含有信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以单纯地替代天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导已表达多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从芽孢杆菌NCIB 11837生麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草杆菌prsA的基因获得的信号肽编码序列。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews[微生物评论]57:109-137描述。

用于丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码序列是从以下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶。

用于酵母宿主细胞的有用的信号肽从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。Romanos等人(1992，见上文)描述了其他有用的信号肽编码序列。

控制序列也可为编码处于多肽的N-末端的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下酶的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子。

在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列位于紧邻多肽的N-末端且该信号肽序列位于紧邻该前肽序列的N-末端。

也可为合意的是添加调节序列，所述调节序列调节宿主细胞生长相关的多肽的表达。调节序列的实例是引起基因表达以响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些。原核系统中的调节序列包括lac、tac以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKA α-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子以及里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其他实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的多核苷酸将与调控序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。多个核苷酸和控制序列可连接在一起以产生重组表达载体，其可包括一个或多个便利的限制位点以允许编码该多肽的多核苷酸在这些位点处的插入或取代。可替代地，多核苷酸可通过将该多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中使得该编码序列与该用于表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是可方便地经受重组DNA程序并且可引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合的环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以包含用于确保自我复制的任何装置。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同包含待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。

载体优选包含允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标志物是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养性等。

细菌选择性标志物的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、或四环素抗性)的标志物。用于酵母宿主细胞的适合的标志物包括但不限于：ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于，adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、连同其等效物。优选地用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌bar基因。优选用于木霉属细胞中的是adeA、adeB、amdS、hph和pyrG基因。

选择性标记可为双选择性标记系统，如WO 2010/039889中描述的。在一个方面，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。

载体优选包含允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可包含用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，整合的元件应包含足够数量的核酸，如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，其与相应的靶序列具有高度的序列同一性以增强同源重组的可能性。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一个方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。

对于自主复制，载体可以进一步包含使载体能够在所讨论的宿主细胞中自主地进行复制的复制起点。复制起点可为在细胞中有功能的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。

细菌复制起点的实例是容许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，以及容许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、及ARS4与CEN6的组合。

用于丝状真菌细胞中的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人，1991，Gene[基因]98:61-67；Cullen等人，1987，Nucleic Acids Res[核酸研究]15:9163-9175；WO 00/24883)。可根据WO 00/24883中公开的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。

可将本发明多核苷酸的多于一个拷贝插入宿主细胞以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标志基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标志基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。

用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域的技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等人，1989，见上文)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，这些宿主细胞包含可操作地连接到一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，这个或这些控制序列指导本发明的多肽的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体维持，如较早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制过程中发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择会在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。

宿主细胞可为在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。

原核宿主细胞可为任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于：类马链球菌、化脓性链球菌、乳房链球菌以及马链球菌兽疫亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌细胞，包括但不局限于不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰链丝菌、以及浅青紫链霉菌细胞。

将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与基因组学]168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]56:209-221)、电穿孔(参见例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques[生物技术]6:742-751)或接合(参见例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见例如，Dower等人,1988,Nucleic AcidsRes.[核酸研究]16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，Gong等人，2004，Folia Microbiol.(Praha)[叶线形微生物学(布拉格)]49:399-405)、接合(参见例如，Mazodier等人，1989，J.Bacteriol.[细菌学杂志]171:3583-3585)或转导(参见例如，Burke等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可以通过以下来实现：电穿孔(参见例如，Choi等人,2006,J.Microbiol.Methods[微生物学方法杂志]64:391-397)或接合(参见例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]71:51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：例如天然感受态(naturalcompetence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.[感染与免疫]32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick，1991，Microbios[微生物学]68:189-207)、电穿孔(参见，例如，Buckley等人，1999，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)、或接合(参见，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞中的任何方法。

宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如由Hawksworth等人，所定义的，在：Ainsworth andBisby's Dictionary of The Fungi[Ainsworth和Bisby的真菌大词典]，第8版，1995，国际CAB，大学出版社，剑桥，英国)。

真菌宿主细胞可为酵母细胞。如本申请中使用的“酵母”包括产子嚢酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于半知菌类(芽孢纲)的酵母。由于酵母的分类可能在将来变化，出于本发明的目的，酵母应当如酵母的生物学与活性(Skinner、Passmore和Davenport编辑，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9[应用细菌学学会专题论文集系列9]，1980)所描述那样定义。

酵母宿主细胞可为假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁弗酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。

真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)的亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth等人，1995，见上文)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳多糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(例如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵性的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、梨囊鞭菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。

真菌细胞可以通过下述过程转化，该过程涉及原生质体形成、原生质体的转化、以及以本身已知的方式的细胞壁的再生。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序描述于以下文献中：EP 238023，Yelton等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474以及Christensen等人，1988，Bio/Technology[生物/技术]6:1419-1422。用于转化镰孢属物种的适合方法在Malardier等人，1989，Gene[基因]78:147-156和WO 96/00787中描述。可使用由如以下文献描述的程序转化酵母：Becker和Guarente，于Abelson，J.N.和Simon，M.I.编，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology[酵母遗传学与分子生物学指南]，Methods in Enzymology[酶学方法]，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，纽约；Ito等人，1983，J.Bacteriol.[细菌学杂志]153:163；以及Hinnen等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]75:1920。

产生方法

本发明还涉及产生本发明多肽的方法，该方法包括：(a)培养细胞，该细胞处于其野生型形式，在有益于产生该多肽的条件下产生该多肽；和任选地(b)回收该多肽。在一方面，该细胞是芽孢杆菌属细胞。在另一方面，该细胞是脱支芽孢杆菌、芽孢杆菌属物种-19140或嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌细胞。在另一方面，该细胞是厌氧芽胞杆菌属细胞。在另一方面，该细胞是Anoxybacillus bogrovensis细胞。

在一方面，该细胞是曲霉属细胞。在另一方面，该细胞是聚多曲霉细胞。在另一方面，该细胞是红紫曲霉(Aspergillus puniceus)细胞。

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，该方法包括：(a)在有益于产生该多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞；和任选地(b)回收该多肽。

这些宿主细胞是在适合于使用本领域中已知的方法产生这些多肽的营养介质中培养的。例如，可通过摇瓶培养、或在实验室或工业发酵器中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)培养细胞，所述培养在适合的介质中并且在允许表达和/或分离多肽的条件下进行。该培养是使用本领域中已知的程序，在适合的营养介质中发生，该营养介质包含碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽被分泌到营养培养基中，那么可以直接从该培养基中回收多肽。如果多肽不进行分泌，那么其可以从细胞裂解液中进行回收。

可以使用特异性针对具有α-半乳糖苷酶活性的多肽的本领域已知的方法来检测该多肽。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定多肽的活性。

可使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，可通过常规方法，包括但不限于，收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从营养介质回收多肽。在一个方面，回收包含多肽的发酵液。

可通过本领域已知的多种方法纯化多肽以获得基本上纯的多肽，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，ProteinPurification[蛋白质纯化]，Janson和Ryden编辑，VCH Publishers[VCH出版公司]，纽约，1989)。

在一个替代性方面，不回收多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作多肽的来源。

植物中的产生

本发明还涉及分离的植物，例如转基因植物、植物部分或植物细胞，其包括本发明的多肽，从而以可回收的量表达和产生多肽或结构域。可从植物或植物部分回收多肽或结构域。可替代地，含有该多肽或结构域的植物或植物部分可以按原样用于改进食品或饲料的质量，例如改进营养价值、可口性及流变学特性，或破坏抗营养因素。

转基因植物可为双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草，如草地早熟禾(蓝草，早熟禾属)；饲用草，如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；温带草，如翦股颖属(Agrostis)；和谷类，例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱、以及玉蜀黍(玉米)。

双子叶植物的实例是烟草、豆科作物(如羽扇豆(lupins)、马铃薯、糖甜菜(sugarbeet)、豌豆、豆(bean)和大豆(soybean))、以及十字花科植物(十字花科(familyBrassicaceae))(如花椰菜、油菜籽、以及紧密相关的模式生物拟南芥)。

植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子和块茎、以及包含这些部分的独立组织，例如，表皮、叶肉、薄壁组织(parenchyme)、维管组织、分生组织。

植物细胞和具体的植物细胞区室(如叶绿体、质外体、线粒体、液泡、过氧化物酶体和细胞质)也被认为是植物部分。

同样包括于本发明范围内的是这些植物、植物部分以及植物细胞的后代。

可根据本领域已知的方法构建表达该多肽或结构域的转基因植物或植物细胞。

本发明还涉及产生本发明的多肽或结构域的方法，其包括(a)在有益于产生该多肽或结构域的条件下培养转基因植物或植物细胞，该转基因植物或植物细胞包含编码该多肽或结构域的多核苷酸；和(b)回收该多肽或结构域。

发酵液配制物或细胞组合物

本发明还涉及包括本发明的多肽的发酵液配制物或细胞组合物。发酵液产物进一步包含在发酵过程中使用的另外的成分，例如像细胞(包括含有编码本发明的多肽的基因的宿主细胞，所述宿主细胞被用于产生感兴趣的多肽)、细胞碎片、生物质、发酵介质和/或发酵产物。在一些实施例中，组合物是含有有机酸、杀灭的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。

如在本申请中使用的术语“发酵液”是指由细胞发酵产生的、不经历或经历最少的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物在允许蛋白合成(例如，由宿主细胞表达酶)并且将蛋白分泌到细胞培养基中的碳限制条件下孵育生长到饱和时，产生发酵液。发酵液可含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，发酵液是未分级的且包含耗尽的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，发酵液含有用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。

在一个实施例中，该发酵液配制品和细胞组合物包含第一有机酸组分(包含至少一种1-5碳的有机酸和/或其盐)和第二有机酸组分(包含至少一种6碳或更多碳的有机酸和/或其盐)。在一个具体实施例中，该第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐，或前述中的两种或更多种的混合物；并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐，或前述中的两种或更多种的混合物。

在一方面，该组合物含有一种或多种有机酸，并且任选地进一步含有杀灭的细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀灭的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。

这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含防腐剂和/或抗微生物(例如，抑菌)剂，包括但不限于：山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域已知的其他试剂。

该细胞杀灭的全培养液或组合物可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的内容物。典型地，该细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)生长至饱和、在允许蛋白合成的碳限制条件下孵育之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，该细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基、胞外酶和杀灭的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知的方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。

如在此所述的，全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶性组分，例如杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以除去不溶性组分以提供澄清的液体组合物。

本发明的全培养液配制品和细胞组合物可以通过WO 90/15861或WO 2010/096673中所描述的方法来产生。

酶组合物

本发明还涉及包含本发明的多肽的组合物。优选地，这些组合物富含本发明的多肽。术语“富集”表示组合物的α-半乳糖苷酶活性已增加，例如富集因子为至少1.1，例如至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少2.0、至少3.0、至少4.0、至少5.0、至少10。

在一个实施例中，该组合物包括一种或多种本发明的多肽，和一种或多种如下所述的配制剂。

在一个方面，本发明涉及包含本发明的一种或多种多肽和一种或多种配制剂的组合物，所述一种或多种多肽具有α-半乳糖苷酶活性，其中当在如下反应条件下进行时，所述具有α-半乳糖苷酶活性的多肽释放至少19g半乳糖/kg大豆粉，所述反应条件是：20mg多肽/kg大豆粉于10％w/v 0.1M柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，pH 6.5，在40℃孵育2小时。在一个实施例中，α-半乳糖苷酶活性释放至少19g，例如至少19.5g、例如至少20g、至少20.5g、至少21g、至少21.5g、至少22g或至少23g半乳糖/kg大豆粉。

这些组合物可以进一步包括多种酶活性，例如选自下组的一种或多种(如，若干种)酶，该组由以下组成：乙酰木聚糖酯酶、酰基甘油脂肪酶、淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶、β-糖苷酶、溶血磷脂酶、溶菌酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶(甘露聚糖酶)、植酸酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶D、蛋白酶、支链淀粉酶、果胶酯酶、三乙酰基甘油脂肪酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶或其任何组合。

组合物可以进一步包含一种或多种微生物。在一个实施例中，该微生物选自下组，该组由以下组成：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、多粘菌芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、动物双歧杆菌、肉食杆菌属、丁酸梭菌、梭菌属、屎肠球菌、肠球菌属、乳酸杆菌属、嗜酸乳杆菌、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminus)、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、唾液乳酸杆菌、乳酸乳球菌、乳球菌属、明串珠菌属、埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii)、巨型球菌属、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、片球菌属、特氏丙酸杆菌(Propionibacteriumthoenii)、丙酸杆菌属、以及链球菌属或其任何组合。

配制品

__本发明的酶可以配制为液体或固体。针对液体配制品，该配制剂可以包括多元醇(像例如，甘油、乙二醇或丙二醇)、盐(像例如，氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾)或糖或糖衍生物(像例如，糊精、葡萄糖、蔗糖、和山梨醇)。因此，在一个实施例中，该组合物是一种液体组合物，该液体组合物包括本发明的多肽和一种或多种选自以下列表的配制剂，该列表由以下组成：甘油、乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、糊精、葡萄糖、蔗糖、和山梨醇。该液体配制品可以喷涂在已经历粒化的饲料上，或可以添加至供给动物的饮用水中。

针对固体配制品，该配制品可以是例如作为颗粒、喷雾干粉或聚结物(例如如在WO2000/70034中披露的)。配制剂可以包括盐(有机的或无机的锌、钠、钾或钙盐，像例如，如乙酸钙、苯甲酸钙、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、山梨酸钙、硫酸钙、乙酸钾、苯甲酸钾、碳酸钾、氯化钾、柠檬酸钾、山梨酸钾、硫酸钾、乙酸钠、苯甲酸钠、碳酸钠、氯化钠、柠檬酸钠、硫酸钠、乙酸锌、苯甲酸锌、碳酸锌、氯化锌、柠檬酸锌、山梨酸锌、硫酸锌)、淀粉或糖或糖衍生物(像例如，蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖、山梨醇)。

在一个实施例中，该组合物是一种固体组合物，例如喷雾干燥组合物，该固体组合物包括本发明的α-半乳糖苷酶和一种或多种选自以下列表的配制剂，该列表由以下组成：氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、淀粉和纤维素。在一个优选实施例中，该配制剂选自以下化合物中的一种或多种：硫酸钠、糊精、纤维素、硫代硫酸钠、硫酸镁和碳酸钙。

本发明还涉及包含本发明的α-半乳糖苷酶的酶颗粒/粒子任选地与一种或多种另外的酶的组合。该颗粒由核，以及任选地包围该核一个或多个包衣(外层)构成。

典型地，颗粒/粒子(granule/particle)的粒度，测量为当量球径(基于体积的平均粒度)是20-2000μm，具体是50-1500μm、100-1500μm或250-1200μm。

该核心可以通过粒化成分的共混物来制备，例如通过包括造粒技术的方法，如结晶、沉淀、锅包衣(pan-coating)、流化床包衣、流化床附聚、旋转雾化、挤压、颗粒化(prilling)、滚圆(spheronization)、粒度减小(size reduction)法、转鼓造粒(drumgranulation)和/或高剪切造粒。

用于制备该核心的方法可以发现于Handbook of Powder Technology[粉末技术手册]；由C.E.Capes编辑的Particle size enlargement[粒径增大]；第1卷；1980；Elsevier[爱思唯尔]中。制备方法包括已知的饲料和颗粒配制品技术，例如：

a)喷雾干燥产物，其中在喷雾干燥塔中雾化液体含酶溶液以形成小液滴，在它们在沿干燥塔下降的过程中干燥形成含有酶的颗粒状物质；

b)成层的(layered)产物，其中酶作为层包被在预成型的惰性核心颗粒周围，其中将含有酶的溶液雾化，通常流化床设备中(其中预形成的核心粒子被流化)雾化，含有酶的溶液粘附于核心粒子并干燥，在核心颗粒的表面上留下干燥酶的层。如果能找到具有期望尺寸的有用的核心粒子，则该方法可获得具有期望尺寸的颗粒。这种类型的产物描述于，例如，WO 97/23606中；

c)吸收的(absorbed)粒子，其中不是将酶包被为核心周围的层，而是使酶被吸收到核心的表面上和/或表面中。这样的方法描述于WO 97/39116中。

d)挤压或压片产品，其中含酶糊剂被挤压成丸或在压力下被压入小孔并切成颗粒随后干燥。这种颗粒通常具有相当大的尺寸，因为开有挤出开口的材料(通常是具有钻孔的平板)限制了通过挤出开口可允许的压力降。而且，当使用小孔时非常高的挤压力在酵糊中增加放热，其对酶有害；

e)颗粒化的产物，其中含酶的粉末悬浮于熔化的蜡中并且，例如，通过转盘喷雾器将悬浮液喷射到冷却室中，在此液滴快速地固化(Michael S.Showell(编辑)；Powdereddetergents[粉状洗涤剂]；Surfactant Science Series[表面活性剂科学系]；1998；第71卷；第140-142页；马塞尔德克尔出版社(Marcel Dekker))。所获得产物是一种产物，其中酶被均匀分布遍及整个惰性材料而不是集中在其表面上。US 4,016,040和US 4,713,245也是涉及此技术的文献；

f)混合造粒产物，其中将液体添加到例如常用造粒组分的干燥粉末组合物中，经由液体或粉末或二者引入该酶。将液体和粉末混合，并且因为液体的水分为干燥粉末所吸收，干燥粉末的组分开始附着并附聚，并且粒子将构建，形成包括酶的颗粒。这样的方法描述于US 4,106,991和有关的文献EP 170360、EP 304332、EP 304331、WO 90/09440和WO 90/09428中。在该方法的一种具体产品中，其中可以用各种高剪切混合器作为造粒机，将由作为活性化合物的酶、填充剂和粘合剂等组成的微粒与纤维素纤维混合以强化粒子，而得到所谓的T-微粒(T-granulate)。增强的粒子更加坚固，释放较少的酶粉尘。

g)粒度减小，其中通过碾磨或压碎含酶的较大的粒子、球粒、平片体、坯块(briquettes)等产生核。通过将碾磨或压碎的产物过筛获得所需要的核心粒子级分。可以回收尺寸过大和尺寸过小的粒子。粒度减小描述于(Martin Rhodes(编辑)；Principles ofPowder Technology[粉末技术原理]；1990；第10章；约翰威利父子公司(John Wiley&Sons))中；

h)流化床造粒，其包括将细粒(particulate)悬浮于空气流中并经喷嘴喷射液体到流化的粒子上。被喷射的液滴击中的粒子湿润并发粘。粘性的粒子与其它粒子碰撞并粘附于其上而形成颗粒；

i)可对核心进行干燥，如在流化床干燥器中干燥。本领域技术人员可以使用其他已知的在饲料或洗涤剂工业中用于干燥颗粒的方法。干燥优选在从25℃-90℃的产物温度下进行。对于一些酶来说，重要的是包括酶的核在包衣之前包含少量的水。如果在过量水除去之前水敏性酶被包衣，则水分会截留在核心中并可能消极地影响酶的活性。在干燥之后，这些核优选包含0.1-10％w/w水。

该核心可以包括另外材料例如填料、纤维材料(纤维素或合成纤维)、稳定剂、增溶剂、悬浮剂、黏度调节剂、轻球体、增塑剂、盐、润滑剂和芳香剂。

该核心可以包括粘合剂，如合成聚合物、蜡、脂肪、或碳水化合物。

该核心典型地作为均匀的共混物可以包括多价阳离子的盐、还原剂、抗氧剂、过氧化物分解催化剂和/或酸性缓冲液组分。

在一个实施例中，核心包含选自下组的材料，该组由以下组成：盐(如乙酸钙、苯甲酸钙、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、山梨酸钙、硫酸钙、乙酸钾、苯甲酸钾、碳酸钾、氯化钾、柠檬酸钾、山梨酸钾、硫酸钾、乙酸钠、苯甲酸钠、碳酸钠、氯化钠、柠檬酸钠、硫酸钠、乙酸锌、苯甲酸锌、碳酸锌、氯化锌、柠檬酸锌、山梨酸锌、硫酸锌)、淀粉或糖或糖衍生物(像例如，蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖、山梨醇)、糖或糖衍生物(像例如，蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖、山梨醇)、有机小分子、淀粉、面粉、纤维素和矿物质以及粘土矿物质(也称作含水层状硅酸铝)。在一个实施例中，该核心包括粘土矿物质，例如高岭石或高岭土。

核心可以包括惰性颗粒，其中酶被吸附到该惰性颗粒之内，或者被施用(例如通过流化床包衣)到该惰性颗粒的表面上。

该核心可以具有20μm-2000μm，具体地50μm-1500μm、100μm-1500μm或250μm-1200μm的直径。

该核心可以被至少一个包衣包围，例如，以改进储存稳定性、以减少在处理过程中的粉尘形成或用于着色该颗粒。该一个或多个可任选的包衣可以包括盐和/或蜡和/或面粉包衣，或其他适合的包衣材料。

该包衣可以以按核心重量计至少0.1％，例如至少0.5％、1％或5％的量施加。该量至多可以是100％、70％、50％、40％或30％。

该包衣优选地是至少0.1μm厚，具体地至少0.5μm、至少1μm或至少5μm。在一些实施例中，包衣的厚度为低于100μm，例如低于60μm，或低于40μm。

该包衣应当通过形成基本上连续的层来密封该核心单元。基本上连续的层应理解为极少有孔或无孔的包衣，从而使得核心单元被包裹/封装，极少有或没有未包被区域。该层或包衣在厚度上应当特别均匀。

该包衣可以进一步包含其他本领域已知的材料，例如，填料、防粘剂、颜料、染料、增塑剂和/或粘合剂，如二氧化钛、高岭土、碳酸钙或滑石。

盐包衣按重量计可以包括至少60％的盐，例如，按重量计，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。

所述盐可以从盐溶液(其中所述盐是完全溶解的)中添加，或者从盐悬浮液(其中所述细颗粒是小于50μm，例如小于10μm或小于5μm)中添加。

该盐包衣可以包括单一盐或者两种或更多种盐的混合物。该盐可以是水溶性的，具体地具有在20℃下在100g水中至少0.1g的溶解度，优选地至少0.5g/100g水，例如，至少1g/100g水，例如，至少5g/100g水。

盐可以是无机盐，例如硫酸盐、亚硫酸盐、磷酸盐、膦酸盐、硝酸盐、氯化物、碳酸盐或简单有机酸(小于10个碳原子，例如6个或更少碳原子)的盐，例如柠檬酸盐、丙二酸盐或醋酸盐。在这些盐中的阳离子的实例是碱或碱土金属离子，铵离子或第一过渡系的金属离子，如钠、钾、镁、钙、锌或铝。阴离子的实例包括氯、溴、碘、硫酸根、亚硫酸根、亚硫酸氢根、硫代硫酸根、磷酸根、磷酸二氢根、磷酸氢根、次磷酸根、焦磷酸二氢根(dihydrogenpyrophosphate)、四硼酸根、硼酸根、碳酸根、碳酸氢根、正硅酸根、柠檬酸根、苹果酸根、马来酸根、丙二酸根、琥珀酸根、山梨酸根、乳酸根、甲酸根、醋酸根、丁酸根、丙酸根、苯甲酸根、酒石酸根、抗坏血酸根或葡萄糖酸根。特别地，可以使用碱金属或碱土金属的硫酸盐、亚硫酸盐、磷酸盐、膦酸盐、硝酸盐、氯化物或碳酸盐，或者简单有机酸例如柠檬酸、丙二酸或醋酸的盐。

在包衣中的盐可以在20℃下具有超过60％的恒定湿度，具体地超过70％、超过80％或超过85％，或者它可以是此盐的另一种水合物形式(例如，无水物)。该盐包衣可以如在WO 1997/05245、WO 1998/54980、WO 1998/55599、WO 2000/70034、WO 2006/034710、WO2008/017661、WO 2008/017659、WO 2000/020569、WO 2001/004279、WO 1997/05245、WO2000/01793、WO 2003/059086、WO 2003/059087、WO 2007/031483、WO 2007/031485、WO2007/044968、WO 2013/192043、WO 2014/014647和WO 2015/197719中所描述，或是例如在WO 2001/00042中描述的聚合物包衣。

适合的盐的具体实例是NaCl(CH20℃＝76％)、Na2CO3(CH20℃＝92％)、NaNO3(CH20℃＝73％)、Na2HPO4(CH20℃＝95％)、Na3PO4(CH25℃＝92％)、NH4Cl(CH20℃＝79.5％)、(NH4)2HPO4(CH20℃＝93,0％)、NH4H2PO4(CH20℃＝93.1％)、(NH4)2SO4(CH20℃＝81.1％)、KCl(CH20℃＝85％)、K2HPO4(CH20℃＝92％)、KH2PO4(CH20℃＝96.5％)、KNO3(CH20℃＝93.5％)、Na2SO4(CH20℃＝93％)、K2SO4(CH20℃＝98％)、KHSO4(CH20℃＝86％)、MgSO4(CH20℃＝90％)、ZnSO4(CH20℃＝90％)以及柠檬酸钠(CH25℃＝86％)。其他实例包括NaH2PO4、(NH4)H2PO4、CuSO4、Mg(NO3)2、醋酸镁、醋酸钙、苯甲酸钙、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、山梨酸钙、硫酸钙、醋酸钾、苯甲酸钾、碳酸钾、氯化钾、柠檬酸钾、山梨酸钾、醋酸钠、苯甲酸钠、柠檬酸钠、硫酸钠、醋酸锌、苯甲酸锌、碳酸锌、氯化锌、柠檬酸锌和山梨酸锌。

该盐可以处于无水形式，或它可以是水合盐，即，具有结晶化的一个或多个结合水的结晶盐水合物，如描述于WO 99/32595中。具体实例包括无水硫酸钠(Na2SO4)、无水硫酸镁(MgSO4)、七水硫酸镁(MgSO4.7H2O)、七水硫酸锌(ZnSO4.7H2O)、七水磷酸氢二钠(Na2HPO4.7H2O)、六水硝酸镁(Mg(NO3)2(6H2O))、二水柠檬酸钠以及四水乙酸镁。

优选地，作为盐溶液使用该盐，例如使用流化床。

蜡包衣按重量计可以包括至少60％的蜡，例如，按重量计，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。

蜡的具体实例是聚乙二醇；聚丙烯；巴西棕榈蜡；小烛树蜡；蜂蜡；氢化植物油或动物脂油例如聚乙二醇(PEG)、甲基羟丙基纤维素(MHPC)、聚乙烯醇(PVA)、氢化牛脂、氢化棕榈油、氢化棉籽油和/或氢化豆油；脂肪酸醇；单甘油酯和/或二甘油酯，例如甘油硬脂酸酯，其中硬脂酸酯是硬脂酸和棕榈酸的混合物；微晶蜡；石蜡；以及脂肪酸，例如氢化的线性长链脂肪酸和其衍生物。优选的蜡是棕榈油或氢化棕榈油。

该颗粒可以包含核心(其包含本发明的α-半乳糖苷酶)、一种或多种盐包衣和一种或多种蜡包衣。具有多种包衣的酶颗粒的实例示于WO 1993/07263、WO 1997/23606和WO2016/149636中。

可以产生非粉尘颗粒，如美国专利号4,106,991以及4,661,452中所披露，并且这些颗粒可任选地通过在本领域中已知的方法来包衣。该包衣材料可以是蜡包衣材料和成膜包衣材料。蜡状包衣材料的实例是具有平均分子量为1000至20000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有从16个到50个环氧乙烷单位的乙氧基化壬基酚；具有从12个碳原子至20个碳原子并且存在15个至80个环氧乙烷单元的乙氧基化脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯、和甘油二酯、和甘油三酯。适用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB 1483591中给出。

该颗粒进一步包括一种或多种另外的酶。然后，每种酶将存在于多种颗粒中，这些颗粒确保酶的分布更均匀，并且还减少了由于不同的粒度产生的不同酶的物理隔离。用于生产多酶共颗粒的方法披露于ip.com公开内容IPCOM000200739D中。

通过使用共颗粒的酶的配制品的另一个实例披露于WO 2013/188331中。

本发明还涉及根据披露于EP 238,216中的方法制备的受保护的酶。

因此，在另外的方面，本发明提供了颗粒，该颗粒包含：

(a)包含根据本发明的α-半乳糖苷酶的核心，和

(b)包衣，该包衣由包围该核心的一个或多个层组成。

在一个实施例中，该包衣包含本文所述的盐包衣。在一个实施例中，该包衣包含本文所述的蜡包衣。在一个实施例中，该包衣包含盐包衣，然后是本文所述的蜡包衣。

基于植物的材料

在一个实施例中，该基于植物的材料来自蔷薇亚纲，例如豆目或十字花目。

在一个实施例中，该基于植物的材料来自豆科，例如云实亚科或含羞草亚科或蝶形花亚科。在一个实施例中，该基于植物的材料来自蝶形花亚科，例如相思子族或紫穗槐族或Bossiaeeae或Brongniartieae或鹰嘴豆族或猪屎豆族或黄檀族或山蚂蝗族或Dipterygeae或山豆根族或蚕豆族或山羊豆族或染料木族或岩黄耆族或Hypocalypteae或槐蓝族或百脉根族或崖豆族或Mirbelieae或菜豆族或黄花木族或补骨脂族或洋槐族或Sesbanieae或槐族或Swartzieae或黄华族或车轴草族。

在一个实施例中，来自蝶形花亚科的基于植物的材料是来自菜豆族，例如Adenodolichos或Alistilus或两型豆属或Ancistrotropis或块茎豆属或虫豆属或Bionia或Bolusafra或紫铆属或木豆属或毛蔓豆属或Camptosema或刀豆属或距瓣豆属或Cleobulia或蝶豆属或旋花豆属或Cochliasanthus或Collaea或Cologania或Condylostylis或Cratylia或Cymbosema或Decorsea或Dioclea或Dipogon或Dolichopsis或扁豆属或山黑豆属或野扁豆属或雀脷珠属或刺桐属或千斤拔属或乳豆属或大豆属或一叶豆属或Helicotropis或珊瑚豌豆属或扁豆属或Leptospron或大翼豆属或硬皮豆属或闭荚藤属或黧豆属或Mysanthus或爪哇大豆属或Neorautanenia或Nesphostylis或土黄芪属或拟大豆属或Otoptera或Oxyrhynchus或豆薯属或豆薯属或菜豆属或苞护豆属或毒扁豆属或Pseudeminia或Pseudovigna或四棱豆属或葛属或Ramirezella或Rhodopis或鹿霍属或宿苞豆属或Sigmoidotropis或华扁豆属或Spathionema或密花豆属或楔柱豆属或碧玉藤属或Strophostyles或钩豆属或琼豆属或Vandasina或Vatovaea或豇豆属或Wajira。

在一个实施例中，来自蝶形花亚科的基于植物的材料是来自大豆属，例如烟豆或白色大豆(Glycine albicans)或金丝黄大豆(Glycine aphyonota)或沙生大豆(Glycinearenaria)或Glycine argyrea或灰色大豆(Glycine canescens)或澎湖大豆或弯叶大豆(Glycine curvata)或野生豆(Glycine cyrtoloba)或扁豆荚大豆(Glycinedolichocarpa)或镰叶大豆(Glycine falcata)或Glycine gracei或毛枝大豆(Glycinehirticaulis)或Glycine lactovirens或阔叶大豆(Glycine latifolia)或Glycinelatrobeana或小叶大豆(Glycine microphylla)或Glycine peratosa或Glycinepindanica或Glycine pullenii或黄紫大豆(Glycine rubiginosa)或Glycine stenophita或Glycine syndetika或烟豆或短绒野大豆或大豆种T1或大豆种T5或半野生大豆或大豆(大豆)或大豆x野大豆或野大豆(野生大豆)。

在一个实施例中，来自蝶形花亚科的基于植物的材料是来自木豆属，例如木豆(树豆)、Cajanus cajanifolius和蔓草虫豆。

在一个实施例中，来自蝶形花亚科的基于植物的材料是来自菜豆属，例如尖叶菜豆(Phaseolus acutifolius)(花菜豆)或宽叶菜豆(Phaseolus acutifoliusvar.latifolius)或淡色菜豆(Phaseolus albescens)或白花菜豆(Phaseolusalbiflorus)或Phaseolus albinervus或Phaseolus altimontanus或Phaseolusamblyosepalus或狭叶菜豆(Phaseolus angustissimus)或奥古斯菜豆(Phaseolusaugusti)或玻利维亚菜豆(Phaseolus bolivianus)或钟形菜豆(Phaseoluscampanulatus)或卡特氏菜豆(Phaseolus carteri)或Phaseolus chiapasanus或荷包豆(多花菜豆)或荷包豆(Phaseolus coccineus subsp.Coccineus)或)或多花荷包豆(Phaseolus coccineus subsp.polyanthus)或哥斯达黎加菜豆(Phaseoluscostaricensis)或白藓菜豆(Phaseolus dasycarpus)或Phaseolus dumosus或Phaseolusesperanzae或Phaseolus esquincensis或丝叶菜豆(Phaseolus filiformis)(瘦豆)或无毛菜豆(Phaseolus glabellus)或Phaseolus gladiolatus或Phaseolus grayanus或欣顿菜豆(Phaseolus hintonii)或Phaseolus jaliscanus或Phaseolus juquilensis或疏花菜豆(Phaseolus laxiflorus)或Phaseolus leptostachyus或木质菜豆(Phaseoluslignosus)或棉豆(利马豆)或Phaseolus macrolepis或Phaseolus maculatifolius或斑点菜豆(Phaseolus maculatus)(cocolmeca bean)或Phaseolus maculatus subsp.ritensis或Phaseolus macvaughii或Phaseolus magnilobatus或Phaseolus marechalii或Phaseolus micranthus或小果菜豆(Phaseolus microcarpus)或柔枝菜豆(Phaseolusmollis)或Phaseolus neglectus或纳尔逊氏菜豆(Phaseolus nelsonii)或结节菜豆(Phaseolus nodosus)或Phaseolus novoleonensis或Phaseolus oaxacanus或Phaseolusoligospermus或Phaseolus pachyrrhizoides或小叶菜豆(Phaseolus parvifolius)或微小菜豆(Phaseolus parvulus)或少花菜豆(Phaseolus pauciflorus)或长梗菜豆(Phaseolus pedicellatus)或Phaseolus perplexus或Phaseolus persistentus或Phaseolus plagiocylix或Phaseolus pluriflorus或多形菜豆(Phaseolus polymorphus)或Phaseolus polystachios或Phaseolus polystachios subsp.sinuatus或Phaseoluspolystachios subsp.smilacifolius或网纹菜豆(Phaseolus reticulatus)或圆菜豆(Phaseolus rotundatus)或柳叶菜豆(Phaseolus salicifolius)或Phaseolussonorensis或Phaseolus talamancensis或针叶菜豆(Phaseolus tenellus)或德州菜豆(Phaseolus texensis)或Phaseolus tuerckheimii或菜豆(法国菜豆)或菜豆aborigineusaborigineus或矮菜豆(Phaseolus vulgaris var.nanus)或黄毛菜豆(Phaseolus xanthotrichus)或Phaseolus xolocotzii或Phaseolus zimapanensis。

在一个实施例中，来自蝶形花亚科的基于植物的材料是来自鹰嘴豆族，例如鹰嘴豆属，例如Cicer anatolicum或鹰嘴豆(鹰嘴豆)或Cicer bijugum或Cicer canariense或Cicer chorassanicum或楔叶鹰嘴豆(Cicer cuneatum)或Cicer echinospermum或弯叶鹰嘴豆(Cicer flexuosum)或多花鹰嘴豆(Cicer floribundum)或希腊鹰嘴豆(Cicergraecum)或虎尾鹰嘴豆(Cicer incisum)或Cicer isauricum或犹太鹰嘴豆(Cicerjudaicum)或Cicer kermanense或Cicer macracanthum或小叶鹰嘴豆(Cicermicrophyllum)或Cicer montbretii或多叶鹰嘴豆(Cicer multijugum)或Cicernuristanicum或尖齿鹰嘴豆(Cicer oxyodon)或长叶鹰嘴豆(Cicer pinnatifidum)或尖刺鹰嘴豆(Cicer pungens)或丽庆鹰嘴豆(Cicer rechingeri)或网状鹰嘴豆(Cicerreticulatum)或准噶尔鹰嘴豆(Cicer songaricum)或Cicer spiroceras或玉龙鹰嘴豆(Cicer stapfianum)或Cicer subaphyllum或刺鹰嘴豆(Cicer tragacanthoides)或Ciceryamashitae。

在一个实施例中，来自蝶形花亚科的基于植物的材料是来自染料木族，例如Adenocarpus或Anarthrophyllum或Argyrocytisus或银豆属或Calicotome或Chamaecytisus或Cytisophyllum或金雀花属或Dichilus或Echinospartum或Erinacea或染料木属或Gonocytisus或Hesperolaburnum或毒豆属或Lembotropis或羽扇豆属或Melolobium或Petteria或Podocytisus或Polhillia或Retama或Sellocharis或鹰爪豆属或Stauracanthus或Teline或荆豆属。

在一个实施例中，来自蝶形花亚科的基于植物的材料是来自蚕豆族，例如香豌豆属或兵豆属或豌豆属或Vavilovia或蚕豆属。在一个实施例中，来自蝶形花亚科的基于植物的材料是来自兵豆属，例如兵豆(小扁豆)或兵豆亚种小扁豆(Lens culinarissubsp.culinaris)或兵豆亚种odemensis或兵豆亚种绒毛兵豆(Lens culinarissubsp.tomentosus)或蓝兵豆(Lens cyanea)或Lens ervoides或拉蒙兵豆(Lenslamottei)或黑兵豆(Lens nigricans)或东方兵豆(Lens orientalis)(野兵豆(ye bingdou))。

在一个实施例中，来自蝶形花亚科的基于植物的材料是来自野豌豆属，例如Viciagarinensis或Vicia sojakii或丽庆野豌豆(Vicia rechingeri)或库尔德野豌豆(Viciakurdica)或多叶野豌豆或Vicia akhmaganica或变异野豌豆(Vicia variabilis)或Viciavariegata或波斯野豌豆(Vicia persica)或二节野豌豆(Vicia kotschyana)或Viciahirta或簇生野豌豆(Vicia gregaria)或Vicia ciceroidea或Vicia cappadocica或巴氏野豌豆(Vicia balansae)或光叶野豌豆(Vicia aucheri)或Vicia sp.'telaponensis'或脉叶野豌豆(Vicia venulosa)或毛野豌豆或窄叶野豌豆(Vicia stenophylla)或西库拉野豌豆(Vicia sicula)或Vicia sibthorpii或Vicia semiglabra或缠绕野豌豆(Viciascandens)或松林野豌豆(Vicia pinetorum)或Vicia picta或栉野豌豆(Viciapectinata)或少叶野豌豆(Vicia paucifolia)或巴勒斯坦野豌豆(Vicia palaestina)或Vicia onobrychioides或黄白野豌豆(Vicia ochroleuca)或Vicia nataliae或蒙特威野豌豆(Vicia montevidensis)或Vicia monardii或小花野豌豆(Vicia minutiflora)或曼西野豌豆(Vicia menziesii)或大花野豌豆或Vicia malosana或新月野豌豆(Vicialunata)或白花野豌豆(Vicia leucantha)或莱文沃斯野豌豆(Vicia leavenworthii)或拉里萨野豌豆(Vicia larissae)或伊朗野豌豆(Vicia iranica)或灰白野豌豆(Viciaincana)或Vicia hololasia或粉花野豌豆(Vicia glauca)或Vicia freyniana或佛罗里达野豌豆(Vicia floridana)或纤枝野豌豆(Vicia filicaulis)或Vicia ferreirensis或微细野豌豆(Vicia exigua)或Vicia dennesiana或塞浦路斯野豌豆(Vicia cypria)或Viciacretica或新疆野豌豆或Vicia claessensii或Vicia chaetocalyx或卡西亚野豌豆(Viciacassia)或Vicia capreolata或凯撒利亚野豌豆(Vicia caesarea)或二年生野豌豆(Viciabiennis)或贝加尔野豌豆或居高野豌豆(Vicia altissima)或高山野豌豆或尖叶野豌豆(Vicia acutifolia)或绢毛野豌豆(Vicia pubescens)或微花(Vicia cirrhosa)或Viciakoeieana或北野豌豆或多茎野豌豆(Vicia multicaulis)或小花野豌豆(Viciaparviflora)或拟蚕豆野豌豆(Vicia vicioides)或狭叶野豌豆(Vicia tenuifolia)或Vicia orobus或黑野豌豆(Vicia nigra)或裂叶野豌豆(Vicia incisa)或Viciaepetiolaris或Vicia crocea或少花野豌豆(Vicia sparsiflora)或西南野豌豆或二色野豌豆或Vicia cassubica或单花野豌豆(Vicia monantha)(单花野豌豆)或灰色野豌豆(Vicia cinerea)或Vicia oroboides或藏野豌豆(Vicia tibetica)或加罗林野豌豆(Vicia caroliniana)(加罗林野豌豆或林生野豌豆)或Vicia disperma或Viciaesdraelonensis或艳丽野豌豆(Vicia pulchella)或墨西哥野豌豆(Vicia mexicana)或伊卡里亚岛野豌豆(Vicia leucophaea)或矮野豌豆(Vicia humilis)或Vicia barbazitae或比利牛斯野豌豆(Vicia pyrenaica)或Vicia qatmensis或宽翼野豌豆(Vicialathyroides)或尖叶野豌豆(Vicia cuspidata)或Vicia dionysiensis或短茎野豌豆(Vicia abbreviata)或野豌豆或Vicia sericocarpa或Vicia noeana或Vicia hyrcanica或杂交野豌豆(Vicia hybrida)或Vicia galeata或Vicia ciliatula或Vicia assyriaca或虎掌野豌豆(Vicia tigridis)或安纳托利野豌豆(Vicia anatolica)或林生野豌豆(Vicia sylvatica)或灌丛野豌豆(Vicia dumetorum)或柔枝野豌豆(Vicia mollis)或Vicia aintabensis或褐色野豌豆(Vicia peregrina)或黄花野豌豆(Vicia lutea)(黄野豌豆)或大花野豌豆(Vicia grandiflora)或节枝野豌豆(Vicia articulata)或美洲野豌豆(Vicia americana)或密叶野豌豆(Vicia michauxii)或Vicia vicina或柳叶野豌豆或四籽野豌豆(Vicia tetrasperma)或苦野豌豆(Vicia ervilia)或孟加拉野豌豆(Viciabenghalensis)(深紫野豌豆或冬野豌豆)或Vicia angustipinnata或黑龙江野豌豆或歪头菜或假香野碗豆或豆状野豌豆(Vicia pisiformis)或日本野豌豆(Vicia nipponica)或黑色野豌豆(Vicia nigricans)或线叶野豌豆(Vicia linearifolia)或日本野豌豆(Viciajaponica)或Vicia hirticalycina或Vicia fauriae或朝鲜野豌豆(Vicia chosenensis)或三齿萼野豌豆(Vicia bungei)或二叶野豌豆(Vicia bifolia)或山野豌豆或Viciamontbretii或齿叶野豌豆(Vicia serratifolia)或深裂野豌豆(Vicia paucijuga)或Vicia kalakhensis或Vicia johannis或Vicia hyaeniscyamus或Vicia galilaea或Viciaeristalioides或Vicia bithynica或Vicia melanops或Vicia ludoviciana或褐毛野豌豆(Vicia pannonica)或法国野豌豆或密毛野豌豆(Vicia villosa)或粗毛野豌豆(Viciahirsuta)或紫花野豌豆(Vicia sativa)(箭舌豌豆)或蚕豆(蚕豆或蚕豆)或广布野碗豆(Vicia cracca)(鸟豌豆)。

在一个实施例中，来自蝶形花亚科的基于植物的材料是来自豌豆属，例如阿比西尼亚豌豆(Pisum abyssinicum)(阿比西尼亚豌豆)或绒叶豌豆(Pisum fulvum)或豌豆(豌豆)或亚洲豌豆(Pisum sativum subsp.asiaticum)或高豌豆(Pisum sativumsubsp.elatius)(野生豌豆)或短小豌豆(Pisum sativum var.pumilio)(叙利亚饲料豌豆)或Pisum sativum subsp.jomardii或Pisum sativum subsp.Sativum或饲料豌豆(Pisumsativum var.arvense)或Pisum sativum var.choresmicum或Pisum sativumvar.macrocarpon(糖荚豌豆)或Pisum sativum var.ponderosum或Pisum sativumvar.tibetanicum或外高加索豌豆(Pisum sativum subsp.transcaucasicum)。

在一个实施例中，来自蝶形花亚科的基于植物的材料是来自黄檀族，例如长足甲属或合明属或Amicia或Andira或落花生属或Brya或Bryaspis或Cascaronia或正裂果属或Chaetocalyx或Chapmannia或Cranocarpus或Cyclocarpa或黄檀属或川续断属或Discolobium或Etaballia或Fiebrigiella或Fissicalyx或睫苞豆属或Geoffroea或Grazielodendron或Humularia或Hymenolobium或Inocarpus或Kotschya或Machaerium或Maraniona或Nissolia或Ormocarpopsis或链荚木属或Paramachaerium或Peltiera或Pictetia或Platymiscium或Platypodium或Poiretia或紫檀属或Ramorinoa或Riedeliella或Smithia或Soemmeringia或Steinbachiella或柱花草属或Tipuana或Weberbauerella或丁葵草属。

在一个实施例中，来自蝶形花亚科的基于植物的材料是来自落花生属，例如Appressipila(amendoim bravo)或Arachis batizocoi或短柄落花生(Arachisbrevipetiolata)或Arachis burchellii或Arachis burkartii或Arachis cardenasii或Arachis chiquitana或科伦蒂纳落花生(Arachis correntina)或克鲁斯落花生(Arachiscruziana)或Arachis decora或Arachis diogoi或蔓花生或蔓花生x Arachisstenosperma或无毛落花生(Arachis glabrata)(amendoim-bravo)或无毛落花生(Arachisglabrata var.glabrata)或Arachis glabrata var.hagenbeckii或无毛落花生(Arachisglabrata)x花生或Arachis glandulifera或深蓝落花生(Arachis guaranitica)或沼生落花生(Arachis helodes)或赫尔曼氏落花生(Arachis hermannii)或霍氏落花生(Arachishoehnei)或花生(花生)或Arachis hypogaea subsp.Fastigiata或普通花生(Arachishypogaea var.vulgaris)(西班牙花生)或落花生(Arachis hypogaea subsp.Hypogaea)或粗毛花生(Arachis hypogaea var.hirsuta)或Arachis ipaensis或Arachis ipaensis xArachis magna或Arachis kempff-mercadoi或Arachis kretschmeri或Arachiskuhlmannii或线叶落花生(Arachis linearifolia)或土黄色落花生(Arachis lutescens)或Arachis magna或大型落花生(Arachis major)或Arachis matiensis或细籽落花生(Arachis microsperma)或山地落花生(Arachis monticola)或沼生落花生(Arachispalustris)或巴拉圭落花生(Arachis paraguariensis)或Arachis paraguariensissubsp.capibarensis或巴拉圭落花生(Arachis paraguariensis subsp.paraguariensis)或Arachis pflugeae或平托花生(Arachis pintoi)或早发落花生(Arachis praecox)或细叶落花生(Arachis pusilla)(amendoim de caracar)或匍匐落花生(Arachis repens)或Arachis rigonii或Arachis schinini或Arachis simpsonii或狭叶落花生(Arachisstenophylla)或Arachis stenosperma或Arachis stenosperma x Arachis cardenasii或林地落花生(Arachis sylvestris)(amendoim do porco)或Arachis trinitensis或Arachis triseminata或球茎落花生(Arachis tuberosa)或强壮落花生(Arachis valida)或绒毛落花生(Arachis villosa)或Arachis villosulicarpa或威廉姆斯落花生(Arachiswilliamsii)。

在一方面，基于植物的材料来自十字花目，例如十字花科，优选芸薹族，更优选芸薹属。

在一个实施例中，来自芸薹族的基于植物的材料是来自芸薹属，例如光叶芸薹(Brassica aucheri)、巴利阿里芸薹(Brassica balearica)、Brassica barrelieri、隆线芸薹(Brassica carinata)(阿比西尼亚芥菜)、隆线芸薹(Brassica carinata)x欧洲油菜、隆线芸薹(Brassica carinata)x芜菁、Brassica cretica、弯折芸薹(Brassica deflexa)、Brassica desnottesii、Brassica drepanensis、长穗芸薹(Brassica elongata)、灌木芸薹(Brassica fruticulosa)、Brassica fruticulosa subsp.cossoniana、毛里塔尼芸灌木苔亚(Brassica fruticulosa subsp.mauritanica)、Brassica fruticulosasubsp.rifana、Brassica gravinae、Brassica hilarionis、杂交栽培芸薹(Brassicahybrid cultivar)、灰白芸薹(Brassica incana)、海岛芸薹(Brassica insularis)、Brassica insularis subsp.insularis、芥菜(印度芥菜)、粗茎芥菜(Brassica junceavar.crassicaulis)、抱子芥(Brassica juncea var.gemmifera)、细枝芥菜、印度芥菜(Brassia juncea)、多头芥菜(Brassica juncea var.multiceps)、Brassica junceavar.multisecta、Brassica juncea var.napiformis(芥菜疙瘩)、皱叶芥菜、Brassicajuncea var.strumata、Brassica juncea var.subintegrifolia、膨胀芥菜(Brassicajuncea var.tumida)(榨菜)、Brassica juncea var.utilis、大果芸薹(Brassicamacrocarpa)、Brassica maurorum、蒙大拿芸薹(Brassica montana)、欧洲油菜(油菜)、Brassica napus subsp.rapifera(瑞典芜菁)、欧洲油菜变种甘蓝型油菜(Brassica napusvar.napus)(一年生油菜)、欧洲油菜x芜菁、黑芥菜(Brassica nigra)(黑芥)、Brassicanigra var.abyssinica、甘蓝、白花甘蓝(Brassica oleracea var.albiflora)、芥蓝(Brassica oleracea var.alboglabra)(芥蓝)、Brassica oleracea var.botrytis(花椰菜)、头花甘蓝(卷心菜)、多肋甘蓝(贝德福德卷心菜(Bedford cabbage))、抱子甘蓝(Brassica oleracea var.gemmifera)(抱子甘蓝)、球茎甘蓝(Brassica oleraceavar.gongylodes)(苤蓝)、意大利甘蓝(Brassica oleracea var.italica)(花茎甘蓝(asparagus broccoli))、Brassica oleracea var.medullosa(marrow-stem kale)、野甘蓝、多枝甘蓝(Brassica oleracea var.ramosa)(枝丛甘蓝)、Brassica oleraceavar.sabauda、绿色甘蓝(绿色)(羽衣甘蓝)、甘蓝x北京芜菁、Brassica oxyrrhina、平卧芸薹(Brassica procumbens)、芜菁(荠菜)、中华芜菁(Brassica rapa subsp.chinensis)(小白菜)、菜心芜菁(Brassica rapa var.parachinensis)(菜心)、紫色芜菁(Brassica rapavar.purpuraria)(紫茎芥菜)、塌棵菜、京菜(Brassica rapa subsp.nipposinica)(日本沙拉菜(mizuna))、Brassica rapa var.perviridis(kabuna)、Brassica rapasubsp.oleifera(biennial turnip rape)、芜菁(Nippo-oleifera Group)、北京芜菁(Brassica rapa subsp.pekinensis)(大白菜)、Brassica rapa subsp.rapa(芜菁甘蓝)、Brassica rapa var.oleifera、芜菁x黑芥菜、Brassica repanda、Brassica repandasubsp.baldensis、Brassica repanda subsp.blancoana、Brassica repandasubsp.cadevallii、Brassica repanda subsp.confusa、光叶Brassica repandasubsp.glabrescens、Brassica repanda subsp.gypsicola、Brassica repandasubsp.latisiliqua、Brassica repanda subsp.maritima、Brassica repandasubsp.repanda、岩栖Brassica repanda subsp.saxatilis、石生Brassica rupestris、Brassica ruvo(broccoletto)、Brassica souliei、抱茎Brassica soulieisubsp.amplexicaulis、锐刺芸薹(Brassica spinescens)、Brassica tournefortii、密毛芸薹(Brassica villosa)或Brassica villosa subsp.Bivoniana。

动物饲料和动物饲料添加剂

本发明还涉及包括本发明一种或多种α-半乳糖苷酶的动物饲料组合物和动物饲料添加剂。在一个实施例中，该动物饲料或动物饲料添加剂包括配制剂和本发明一种或多种α-半乳糖苷酶。在另外的实施例中，该配制剂包括以下化合物中的一种或多种：甘油、乙二醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、淀粉、高岭土和纤维素。

动物饲料组合物或饮食具有相对高的蛋白含量。家禽和猪饮食的特征如WO 01/58275，表B第2-3栏所示。鱼食可被表征为该表B第4栏中所示的。此外，这类鱼食通常具有200g/kg-310g/kg的粗脂肪含量。

根据本发明的动物饲料组合物具有50g/kg-800g/kg的粗蛋白含量，并且此外还包含至少一种在此所要求保护的α-半乳糖苷酶。

而且，或在(上面显示的粗蛋白含量的)替换方案中，本发明的动物饲料组合物具有10MJ/kg-30MJ/kg的可代谢能量的含量；和/或0.1g/kg-200g/kg的钙含量；和/或0.1g/kg-200g/kg的可用磷含量；和/或0.1g/kg-100g/kg的甲硫氨酸含量；和/或0.1g/kg-150g/kg的甲硫氨酸加半胱氨酸含量；和/或0.5g/kg-50g/kg的赖氨酸含量。

在具体实施例中，可代谢能量、粗蛋白、钙、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸、和/或赖氨酸的含量落入WO 01/58275，表B，范围2、3、4或5(R.2-5)中的任何一个中。

粗蛋白以氮(N)乘以系数6.25计算，即粗蛋白(g/kg)＝N(g/kg)X 6.25。通过凯氏定氮法(Kjeldahl method)测定氮含量(A.O.A.C.,1984，Official Methods of Analysis[官方分析方法]第14版，Association of Official Analytical Chemists[官方分析化学家集]，华盛顿特区)。

可代谢能量可根据如下进行计算：NRC出版物Nutrient requirements in swine[猪的营养需求]，第九次再版1988，subcommittee on swine nutrition,committee onanimal nutrition,board of agriculture,national research council[美国国家研究委员会农业部动物营养协会猪营养分会].美国国家科学院出版社，华盛顿特区，第2-6页和欧洲家禽饲养材料能量值表(European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs)，斯克得霍特(Spelderholt)家禽研究与推广中心，7361DA贝克贝亨，荷兰，Grafisch bedrijf Ponsen&looijen公司，瓦赫宁恩(Wageningen)，ISBN 90-71463-12-5。

可基于饲料表，如在Veevoedertabel[饲料表]1997，gegevens over chemischesamenstelling[化学成分数据]，verteerbaarheid en voederwaarde vanvoedermiddelen[饲料的消化率和营养价值]，Central Veevoederbureau[中央饲料局]，Runderweg 6，8219 pk Lelystad[莱利斯塔德].ISBN 90-72839-13-7中所述的，计算在动物全饮食中的钙、有效磷和氨基酸的膳食含量。

在具体实施例中，本发明的动物饲料组合物包含如上定义的至少一种植物蛋白。

本发明的动物饲料组合物还可以包含动物性蛋白，如肉和骨粉、羽毛粉、和/或鱼粉，通常量为0-25％。本发明的动物饲料组合物还可以包含具有可溶物的干酒糟(DriedDistillers Grains with Solubles(DDGS))，通常量为0-30％。

本发明的动物饲料组合物还可以包含昆虫蛋白，例如来自黄粉虫(mealworm)、家蝇、黑水虻的蛋白，通常处于粉末形式。昆虫粉可以全部或部分替代鱼粉，并且因此可以构成全部饲料的0％-10％。

在再进一步具体的实施例中，本发明的动物饲料组合物包含0-80％玉蜀黍；和/或0-80％高粱；和/或0-70％小麦；和/或0-70％大麦；和/或0-30％燕麦；和/或0％-40％大豆粉；和/或0-25％鱼粉；和/或0-25％肉和骨粉；和/或0-20％乳清。

该动物饲料可以包括植物蛋白。在具体实施例中，这些植物蛋白的蛋白含量是至少为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％(w/w)。植物蛋白可以衍生自植物蛋白来源，如豆科作物和谷类，例如得自蝶形花科(豆科)、十字花科、苋科和早熟禾科植物的材料，如大豆粉、羽扇豆粉、油菜籽粉及其组合。

在一个具体实施例中，植物蛋白来源是来自豆科(Fabaceae)的一种或多种植物的材料，如大豆、羽扇豆、豌豆、豆。在另一个具体实施例中，植物蛋白来源是得自苋科的一种或多种植物，例如甜菜、糖甜菜、菠菜或奎奴亚藜的材料。植物蛋白来源的其他实例是油菜、海甘蓝和卷心菜。在另一个具体实施例中，大豆是一种优选的植物蛋白来源。植物蛋白来源的其他实例是谷物，如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉蜀黍(玉米)、水稻、和高粱。

可将动物饮食制成例如糊状饲料(非粒化)或粒化饲料。通常，混合研磨的饲料并根据所讨论的这些种类的说明添加充足量的必需维生素和矿物质。以固体或液体酶配制品的形式添加酶。例如，对于糊状饲料，在成分混合步骤前或期间可添加固体或液体酶配制品。对于粒化饲料而言，也可以在饲料成分步骤之前或过程中添加该(液体或固体)α-半乳糖苷酶/酶制剂。典型地，液体α-半乳糖苷酶/酶制剂包括本发明的α-半乳糖苷酶，任选地伴随着多元醇(例如甘油、乙二醇或丙二醇)，并且是在压丸步骤后添加，例如通过将该液体配制品喷涂至丸粒上。也可以将酶掺入饲料添加剂或预混物。

可替代地，可以通过冷冻液体酶溶液与填充剂(例如研磨的大豆粉)的混合物，并且然后冻干该混合物，来制备α-半乳糖苷酶。

在一个实施例中，该动物饲料或动物饲料添加剂包括一种或多种另外的酶。在一个实施例中，该动物饲料包括一种或多种微生物。在一个实施例中，该动物饲料包括一种或多种维生素。在一个实施例中，该动物饲料包括一种或多种矿物质。在一个实施例中，该动物饲料包括一种或多种氨基酸。在一个实施例中，该动物饲料包括一种或多种其他饲料成分。

在另一个实施例中，该动物饲料或动物饲料添加剂包括本发明的多肽、一种或多种配制剂和一种或多种另外的酶。在一个实施例中，该动物饲料或动物饲料添加剂包括本发明的多肽、一种或多种配制剂和一种或多种微生物。在一个实施例中，该动物饲料包括本发明的多肽、一种或多种配制剂和一种或多种维生素。在一个实施例中，该动物饲料或动物饲料添加剂包括一种或多种矿物质。在一个实施例中，该动物饲料或动物饲料添加剂包括本发明的多肽、一种或多种配制剂和一种或多种氨基酸。在一个实施例中，该动物饲料或动物饲料添加剂包括本发明的多肽、一种或多种配制剂和一种或多种其他饲料成分。

在另外的实施例中，该动物饲料或动物饲料添加剂包括本发明的多肽、一种或多种配制剂和一种或多种选自以下清单的组分，该清单由以下组成：一种或多种另外的酶；一种或多种微生物；一种或多种维生素；一种或多种矿物质；一种或多种氨基酸；以及一种或多种其他饲料成分。

在一个实施例中，该动物饲料添加剂包括一种或多种配制剂，优选本文如下描述的。

在一个实施例中，该动物饲料添加剂包括一种或多种另外的酶，优选本文如下描述的。

在一个实施例中，该动物饲料添加剂包括一种或多种益生菌，优选本文如下描述的。

在一个实施例中，该动物饲料添加剂包括一种或多种维生素，优选本文如下描述的。

在一个实施例中，该动物饲料添加剂包括一种或多种矿物质，优选本文如下描述的。

在一个实施例中，该动物饲料添加剂包括一种或多种氨基酸，优选本文如下描述的。

在一个实施例中，该动物饲料添加剂包括一种或多种益生元，优选本文如下描述的。

在一个实施例中，该动物饲料添加剂包括一种或多种有机酸，优选本文如下描述的。

在一个实施例中，该动物饲料添加剂包括一种或多种植生素，优选本文如下描述的。

饮食中的最终酶浓度在0.01-200mg酶蛋白/kg饮食的范围内，优选地在0.1-100mg/kg饮食之间，更优选地0.5-50mg，甚至更优选地1-25mg酶蛋白/kg动物饮食。

目前考虑以下述量(剂量范围)中的一种或多种给予酶：0.01-200；0.05-100；0.1-50；0.2-20；0.1-1；0.2-2；0.5-5；5-50；10-30；20-30；10-20；15-25；或1-10；-所有这些范围都是以mgα-半乳糖苷酶蛋白/kg饲料(ppm)。

为了确定mgα-半乳糖苷酶蛋白/kg饲料，从饲料组合物中纯化α-半乳糖苷酶，并且使用相关试验(参见α-半乳糖苷酶活性)确定经纯化的α-半乳糖苷酶的比活性。也可以使用相同的测定同样地确定饲料组合物的α-半乳糖苷酶活性，并且根据这两个确定结果，计算以mgα-半乳糖苷酶蛋白/kg饲料表示的剂量。

在具体实施例中，本发明的动物饲料添加剂以0.01％至10.0％，更具体0.05％至5.0％或0.2％至1.0％(％指g添加剂/100g饲料)的水平包含(或规定为必须包含)在动物饮食或饲料中。具体地说，对预混物也是如此。

将同样的原理应用于确定饲料添加剂中的α-半乳糖苷酶蛋白的mg数。当然，如果样品使用了用于制备饲料添加剂或饲料的α-半乳糖苷酶，可以由此样品确定比活性(不需要从饲料组合物或添加剂中纯化α-半乳糖苷酶)。

另外的酶

在另一个实施例中，在此描述的这些组合物任选地包括一种或多种酶。可以根据来自NC-IUBMB,1992的酶命名手册(handbook Enzyme Nomenclature from NC-IUBMB,1992)对酶进行分类，也可参见因特网上的ENZYME网站：http://www.expasy.ch/enzyme/。ENZYME是相对于酶命名法的信息储库。它主要基于国际生物化学和分子生物学联合会命名委员会(IUB-MB)，学术出版社公司(Academic Press，Inc.)，1992的推荐并且描述了所表征的酶的每种类型，为所述酶提供EC(酶委员会)编号(Bairoch A.The ENZYME database[酶数据库],2000,Nucleic Acids Res[核酸研究]28:304-305)。这种IUB-MB酶命名法是基于它们的底物特异性，有时基于它们的分子机制；这样的分类法不反映这些酶的结构特征。

Henrissat等人在“The carbohydrate-active enzymes database(CAZy)in 2013[2013年的碳水化合物活性酶数据库(CAZy)]”,Nucl.Acids Res.[核酸研究](2014年1月1日)42(D1):D490-D495中描述了某些糖苷水解酶(例如内切葡聚糖酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶、溶菌酶和半乳糖苷酶)的另一种分类；还参见www.cazy.org。

因此，本发明的组合物还可以包括选自下组的至少一种其他的酶，该组由以下组成：乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.23)、酰基甘油酯酶(EC 3.1.1.72)、α-淀粉酶(EC3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)、阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)、纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)、纤维素酶(EC 3.2.1.4)、阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)、半乳糖苷酶(EC3.2.1.89)、α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)、β-葡聚糖酶(EC3.2.1.6)、β-糖苷酶(EC 3.2.1.21)、三乙酰基甘油脂肪酶(EC 3.1.1.3)、溶血磷脂酶(EC3.1.1.5)、溶菌酶(EC 3.2.1.17)、α-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.24)、β-甘露糖苷酶(甘露聚糖酶)(EC 3.2.1.25)、植酸酶(EC 3.1.3.8、EC 3.1.3.26、EC 3.1.3.72)、磷脂酶A1(EC3.1.1.32)、磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)、磷脂酶D(EC 3.1.4.4)、蛋白酶(EC 3.4)、支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)、果胶酯酶(EC 3.1.1.11)、木聚糖酶(EC 3.2.1.8、EC 3.2.1.136)、β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)或其任何组合。

在一个具体实施例中，本发明的组合物包含半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)和β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)。

在一个具体实施例中，本发明的组合物包含植酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)。可商购的植酸酶的实例包括Bio-Feed^TM植酸酶(诺维信公司(Novozymes))、P、NP和HiPhos(帝斯曼营养产品公司(DSM NutritionalProducts))、Natuphos^TM(巴斯夫(BASF))、Natuphos^TME(巴斯夫(BASF))、和Blue(AB酶公司(AB Enzymes))、(Huvepharma)、Phytase(Aveve Biochem)、XP(范恩尼姆/杜邦公司(Verenium/DuPont))和PHY(杜邦公司(DuPont))。其他优选的植酸酶包括描述于，例如，WO 98/28408、WO 00/43503、和WO 03/066847中的那些。

在一个具体实施例中，本发明的组合物包含木聚糖酶(EC 3.2.1.8)。可商购的木聚糖酶的实例包括WX(帝斯曼营养产品公司(DSM Nutritional Products))、XT和Barley(AB维斯塔公司(AB Vista))、(范恩尼姆公司(Verenium))、X(Huvepharma)、XB(木聚糖酶/β-葡聚糖酶，杜邦公司(DuPont))和XAP(木聚糖酶/淀粉酶/蛋白酶，杜邦公司(DuPont))、XG 10(木聚糖酶/葡聚糖酶)和02 CS(木聚糖酶/葡聚糖酶/果胶酶，Aveve Biochem)、和Naturgrain(BASF)。

在一个具体实施例中，本发明的组合物包含蛋白酶(EC 3.4)。可商购的蛋白酶的实例包括ProAct(帝斯曼营养产品公司(DSM Nutritional Products))。

在一个具体实施例中，本发明的组合物包含α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)。可商购的α-淀粉酶的实例包括A和RumiStar^TM(帝斯曼营养产品公司(DSMNutritional Products))。

在一个实施例中，本发明的组合物包含多成分的酶产品，例如Octazyme(Framelco)、G2、VP和MultiGrain(帝斯曼营养产品公司(DSM Nutritional Products))、Excel或Advance(安迪苏(Adisseo))。

摄生物(Eubiotics)

摄生物(Eubiotics)是被设计为在胃肠道给出微生物群落的健康平衡的化合物。摄生物(Eubiotics)涵盖大量不同的饲料添加剂，例如益生菌、益生元、植生素(精华油)和有机酸，其在下文更加详细地描述。

益生菌

在一个实施例中，该动物饲料组合物进一步包含一种或多种另外的益生菌。在一个具体实施例中，该动物饲料组合物进一步包括来自以下属中的一个或多个属的细菌：乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、芽孢杆菌属、片球菌属、肠球菌属、明串珠菌属、Carnobacterium、杆菌属、丙酸杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属和巨型球菌属(Megasphaera)或其任何组合。

在一个优选的实施例中，该动物饲料组合物进一步包括来自以下菌株中的一个或多个菌株的细菌：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、多粘菌芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、屎肠球菌、肠球菌属和片球菌属、乳酸杆菌属、双歧杆菌属、嗜酸乳杆菌、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、乳酸乳球菌、两歧双歧杆菌、特氏丙酸杆菌(Propionibacteriumthoenii)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminus)、鼠李糖乳杆菌、丁酸梭菌、动物双歧杆菌动物专化型(Bifidobacterium animalis ssp.animalis)、罗伊氏乳杆菌、唾液乳酸杆菌唾液专化型(Lactobacillus salivarius ssp.salivarius)、埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii)、丙酸杆菌属。

在一个更优选的实施例中，组合物、动物饲料添加剂或动物饲料还包括来自以下枯草芽孢杆菌菌株中的一个或多个的细菌：3A-P4(PTA-6506)、15A-P4(PTA-6507)、22C-P1(PTA-6508)、2084(NRRL B-500130)、LSSA01(NRRL-B-50104)、BS27(NRRL B-501 05)、BS 18(NRRL B-50633)、BS 278(NRRL B-50634)、DSM 29870、DSM 29871、DSM 32315、NRRL B-50136、NRRL B-50605、NRRL B-50606、NRRL B-50622和PTA-7547。

在一个更优选的实施例中，组合物、动物饲料添加剂或动物饲料进一步包括来自以下短小芽孢杆菌菌株中的一个或多个的细菌：NRRL B-50016、ATCC 700385、NRRL B-50885或NRRL B-50886。

在一个更优选的实施例中，组合物、动物饲料添加剂或动物饲料进一步包括来自以下地衣芽孢杆菌菌株中的一个或多个的细菌：NRRL B 50015、NRRL B-50621或NRRL B-50623。

在一个更优选的实施例中，组合物、动物饲料添加剂或动物饲料还包括来自以下解淀粉芽孢杆菌菌株中的一个或多个的细菌：DSM 29869、DSM 29869、NRRL B 50607、PTA-7543、PTA-7549、NRRL B-50349、NRRL B-50606、NRRL B-50013、NRRL B-50151、NRRL B-50141、NRRL B-50147或NRRL B-50888。

该动物饲料组合物中的每种细菌菌株的细菌计数为1x 10⁴和1x 10¹⁴CFU/kg的干物质之间，优选地1x 10⁶和1x 10¹²CFU/kg的干物质之间，并且更优选地1x 10⁷至1x10¹¹CFU/kg的干物质之间。在一个更优选的实施例中，该动物饲料组合物中的每种细菌菌株的细菌计数为1x 10⁸和1x 10¹⁰CFU/kg的干物质之间。

该动物饲料组合物中的每种细菌菌株的细菌计数为1x 10⁵和1x 10¹⁵CFU/动物/天之间，优选地1x 10⁷和1x 10¹³CFU/动物/天之间，并且更优选地1x 10⁸和1x 10¹²CFU/动物/天之间。在一个更优选的实施例中，该动物饲料组合物中的每种细菌菌株的细菌计数为1x10⁹和1x 10¹¹CFU/动物/天之间。

在另一个实施例中，该一种或多种细菌菌株以稳定的孢子形式存在。

可商购产品的实例是(帝斯曼营养产品公司(DSM NutritionalProducts))、Alterion(Adisseo)、Enviva PRO(杜邦动物营养公司)、Max、Guard、和(科汉森公司(Chr.Hansen))、sol、me、(Biomin)、(混合酶+益生菌，杜邦动物营养公司)、和(Norel/Evonik)和PY1(赢创公司(Evonik))。

益生元

益生元是诱导微生物(如细菌和真菌)生长或活性的物质，其有助于其宿主的健康。益生元是典型的不可消化的纤维化合物，其未消化地通过胃肠道上半部分，通过作为底物刺激定殖于大肠的优势细菌的生长或活性。通常，益生元增加胃肠(GI)道内双歧杆菌和乳酸菌的数量或活性。

酵母衍生物(灭活的全酵母或酵母细胞壁)也可以被认为是益生元。它们通常包含锰寡糖、酵母β-葡聚糖或蛋白质成分，并且通常源自酵母酿酒酵母的细胞壁。

酵母产品的实例是和Agrimos(拉曼动物营养公司(Lallemand AnimalNutrition))。

植生素

植生素是一组自然生长促进剂或非抗生素生长促进剂，其用作饲料添加剂，源自草药、香料或其他植物。植生素可以是由精油/提取物、精油/提取物、单一植物和植物的混合物(草药产品)或精油/提取物/植物的混合物(专业产品)制备的单一物质。

植生素的实例有迷迭香、鼠尾草、牛至、百里香、丁香和柠檬草。精油的实例是百里香酚、丁子香酚、间甲酚、香兰素、水杨酸盐、间苯二酚、邻甲氧基苯酚、姜辣素、熏衣草油、紫罗酮、鸢尾酮、桉油精、薄荷醇、薄荷油、α-蒎烯；柠檬烯、茴香脑、芳樟醇、二氢茉莉酮酸甲酯、香芹酚、丙酸/丙酸盐、乙酸/乙酸盐、丁酸/丁酸盐、迷迭香油、丁香油、香叶醇、松油醇、香茅醇、水杨酸戊酯和/或水杨酸苄酯、肉桂醛、植物多酚(鞣酸)、姜黄和姜黄提取物。

可商购产品的实例是(帝斯曼营养产品公司(DSM NutritionalProducts))；Cinergy^TM、Cinergy^TMFIT、Biacid^TM、(Cargill)、和DC(Biomin)和Envivo EO(杜邦动物营养公司)。

有机酸

有机酸(C1-C7)作为植物或动物组织的正常成分广泛分布在自然界中。它们主要是通过大肠中碳水化合物的微生物发酵形成。它们经常被用于猪和家禽生产中，作为抗生素生长促进剂的替代品，因为它们对鸡的坏死性肠炎和幼猪的大肠杆菌感染等肠道问题具有预防作用。有机酸可作为单组份或通常2或3种不同有机酸的混合物出售。有机酸的例子有丙酸、甲酸、柠檬酸、乳酸、山梨酸、苹果酸、乙酸、富马酸、苯甲酸、丁酸和酒石酸或其盐(通常是钠或钾盐，例如二甲酸钾或丁酸钠)。

可商购产品的实例是(帝斯曼营养产品公司(DSM NutritionalProducts))、NA(巴斯夫(BASF))、正丁酸AF(OXEA)、Biacid^TM、Prohacid^TMClassic和Prohacid^TMAdvance^TM(嘉吉(Cargill))、(Biomin)和Adimix Precision(Nutriad)。

预混物

将如以上在此示例的饲料添加剂的组合物合并到动物饲料例如家禽饲料中在实际情况下是使用一种浓缩剂或一种预混物进行的。预混物是指一种或多种微小成分与稀释剂和/或载体的一种优选地均匀的混合物。预混物用于促进微小成分在较大混合物中均匀分散。根据本发明的一种预混物可以作为固体(例如作为水溶性粉末)或液体添加到饲料成分或饮用水中。

氨基酸

本发明的组合物还可包括一种或多种氨基酸。用于动物饲料的氨基酸的实例是赖氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸和色氨酸。

维生素和矿物质

在另一个实施例中，该动物饲料可以包括一种或多种维生素，例如一种或多种脂溶性维生素和/或一种或多种水溶性维生素。在另一个实施例中，该动物饲料可任选地包括一种或多种矿物质，例如一种或多种痕量矿物质和/或一种或多种巨量矿物质。

通常，脂溶性维生素-和水溶-性维生素、以及痕量矿物质形成了一种所谓的旨在添加到饲料中的预混物的部分，而大量矿物质通常被分开地添加到饲料中。

脂-溶性维生素的非限制性实例包括维生素A、维生素D3、维生素E、以及维生素K，例如维生素K3。

水-溶性维生素的非限制性实例包括维生素B12、生物素和胆碱、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、叶酸和泛酸盐，例如Ca-D-泛酸盐。

痕量矿物质的非限制性实例包括硼、钴、氯化物、铬、铜、氟化物、碘、铁、锰、钼、硒和锌。

巨量矿物质的非限制性实例包括钙、镁、钾和钠。

在WO 01/58275的表A中，列出了这些组分的营养需求(以家禽和仔猪/猪为例)。营养需求指的是应在饮食中提供指定浓度的这些组分。

在可替代的实施例中，本发明的动物饲料添加剂包含WO 01/58275的表A中指定的单独组分中的至少一种。至少一种指的是一种或两种或三种或四种等直至所有十三种、或直至所有十五种单独组分中的任一种，一种或多种。更具体地，该至少一种单独组分以提供在表A的第四栏或第五栏或第六栏说明的范围内的饲料中浓度(in-feed-concentration)的量包括在本发明的添加剂内。

在仍另外的实施例中，本发明的动物饲料添加剂包含以下维生素中的至少一种，优选使得其饲料内浓度落入下表1中所限定的范围之内(分别对于仔猪饮食和肉鸡饮食)。

表1：一般性维生素建议

维生素	小猪饮食	肉仔鸡饮食
			维生素A	10,000-15,000IU/kg饲料	8-12,500IU/kg饲料
维生素D3	1800-2000IU/kg饲料	3000-5000IU/kg饲料
			维生素E	60-100mg/kg饲料	150-240mg/kg饲料
维生素K3	2-4mg/kg饲料	2-4mg/kg饲料
			维生素B1	2-4mg/kg饲料	2-3mg/kg饲料
维生素B2	6-10mg/kg饲料	7-9mg/kg饲料
			维生素B6	4-8mg/kg饲料	3-6mg/kg饲料
维生素B12	0.03-0.05mg/kg饲料	0.015-0.04mg/kg饲料
			烟酸(维生素B3)	30-50mg/kg饲料	50-80mg/kg饲料
泛酸	20-40mg/kg饲料	10-18mg/kg饲料
			叶酸	1-2mg/kg饲料	1-2mg/kg饲料
生物素	0.15-0.4mg/kg饲料	0.15-0.3mg/kg饲料
			氯化胆碱	200-400mg/kg饲料	300-600mg/kg饲料

其他饲料成分

本发明的组合物可以进一步包括着色剂、稳定剂、生长改进添加剂和香料化合物/调味品、多不饱和脂肪酸(PUFA)；活性氧产生物质、抗微生物肽和抗真菌多肽。

着色剂的实例是类葫萝卜素，例如β-胡萝卜素、虾青素、和叶黄素。

香料化合物/调味品的实例是甲氧甲酚，茴香醚，十、十一和/或十二内酯、紫罗酮、鸢尾酮、姜辣素、哌啶、亚丙基苯酞(propylidene phatalide)、亚丁基苯酞(butylidenephatalide)、辣椒素和鞣质。

抗微生物肽(AMP)的实例是CAP18、林可霉素(Leucocin)A、三色肽(Tritrpticin)、Protegrin-1、死亡素(Thanatin)、防卫素(Defensin)、乳铁蛋白、乳铁蛋白肽、和奥维司匹林(Ovispirin)如诺维司匹林(Novispirin)(罗伯特莱勒(Robert Lehrer)，2000)、菌丝霉素(Plectasins)以及他汀类，包含在WO 03/044049和WO 03/048148中所披露的化合物和多肽，以及以上的保留了抗微生物活性的变体或片段。

抗真菌多肽(AFP)的实例是巨大曲霉(Aspergillus giganteus)和黑曲霉的肽，连同其保留了抗真菌活性的变体和片段，如在WO 94/01459和WO 02/090384中披露的。

多不饱和脂肪酸的实例为C18、C20和C22多不饱和脂肪酸，如花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸和γ-亚油酸。

活性氧生成种类的实例为化学品，如过硼酸盐、过硫酸盐或过碳酸盐；和酶，如氧化酶、氧合酶或合成酶。

本发明的组合物可以进一步包括至少一种氨基酸。用于动物饲料的氨基酸的实例是赖氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸和色氨酸。

改善动物性能的方法

在另一方面，本发明涉及改进动物的一个或多个性能参数的方法，所述方法包括给予动物本发明的多肽或包含一种或多种本发明的多肽的组合物、动物饲料或动物饲料添加剂。

在一个实施例中，该组合物包括一种或多种如在此定义的配制剂。在一个实施例中，该组合物包括一种或多种如在此定义的另外的酶。在一个实施例中，该组合物包括一种或多种如在此定义的微生物。在一个优选的实施例中，该组合物是任选地包含盐和/或蜡和/或面粉包衣的颗粒。

在一个实施例中，该动物饲料包括一种或多种如在此定义的配制剂。在一个实施例中，该动物饲料包括一种或多种如在此定义的另外的酶。在一个实施例中，该动物饲料包括一种或多种如在此定义的微生物。在一个实施例中，该动物饲料包括来自蔷薇亚纲的基于植物的材料。在一个优选的实施例中，该动物饲料是已经粒化的。

在一个实施例中，基于植物的材料是大豆、野生大豆、豆类、羽扇豆、花菜豆、红花菜豆、瘦豆(slimjim bean)、利马豆、法国菜豆、蚕豆(fava bean)、鹰嘴豆、小扁豆、花生、西班牙花生、低芥酸菜籽、油菜籽(油菜)或豌豆或处于其加工形式例如大豆粉、全脂大豆粉、大豆蛋白质浓缩物(SPC)、发酵大豆粉(FSBM)或其任何组合。在一个优选的实施例中，基于植物的材料是大豆或大豆粉。

在一个实施例中，该动物饲料添加剂包括一种或多种如在此定义的配制剂。在一个实施例中，该动物饲料添加剂包括一种或多种如在此定义的另外的酶。在一个实施例中，该动物饲料添加剂包括一种或多种如在此定义的微生物。在一个实施例中，该动物饲料添加剂包括一种或多种维生素、一种或多种矿物质和/或一种或多种氨基酸。在一个优选的实施例中，该动物饲料添加剂是任选地包含盐和/或蜡和/或面粉包衣的颗粒。

在一个实施例中，本发明的多肽是SEQ ID NO:2。在一个实施例中，本发明的多肽是SEQ ID NO:3。在一个实施例中，本发明的多肽是SEQ ID NO:5。在一个实施例中，本发明的多肽是SEQ ID NO:6。在一个实施例中，本发明的多肽是SEQ ID NO:8。在一个实施例中，本发明的多肽是SEQ ID NO:9。在一个实施例中，本发明的多肽是SEQ ID NO:11。在一个实施例中，本发明的多肽是SEQ ID NO:12。在一个实施例中，本发明的多肽是SEQ ID NO:14。在一个实施例中，本发明的多肽是SEQ ID NO:15。在一个实施例中，本发明的多肽是SEQ IDNO:18。在一个实施例中，本发明的多肽是SEQ ID NO:19。

在一个实施例中，术语“改进动物的一个或多个性能参数”意指存在体增重的增加。在另一个实施例中，术语“改进动物的一个或多个性能参数”意指存在改进的饲料转化率。在另一个实施例中，术语“改进动物的一个或多个性能参数”意指存在增加的饲料效率。在另一个实施例中，术语“改进动物的一个或多个性能参数”意指存在体增重的增加和/或改进的饲料转化率和/或增加的饲料效率。

用于改进动物饲料的营养价值的方法

术语改进动物饲料的营养价值意指提高饲料中的营养素的可利用性。营养价值具体是指改进寡糖的棉子糖家族(RFO)(例如三糖棉子糖、四糖水苏糖和五糖毛蕊花糖)的溶解和降解，从而增加可以被动物利用的释放的半乳糖量。因此，改进的半乳糖释放将导致饲料营养价值的改进，导致生长速率和/或体增重和/或饲料转化(即相对于体增重的饲料摄取量)增加。

因此，本发明进一步涉及用于改进动物饲料的营养价值的方法，所述方法包括用本发明的多肽或包含一种或多种本发明的多肽的组合物或动物饲料添加剂处理动物饲料。在一个实施例中，该动物饲料将具有改进的营养素消化率。

在一个优选的实施例中，该动物饲料是已经粒化的。可以在造粒步骤之前用本发明的酶处理该动物饲料，或在造粒步骤之后喷涂至其上。

降低动物饲料的抗营养效果的方法

后肠中寡糖的过量导致由于肠胀气的抗营养效果。通过减少寡糖的发酵，可以减少一些动物饲料的抗营养效果，导致改进的肠道和动物健康。

因此，本发明进一步涉及降低动物饲料的抗营养效果的方法，所述方法包括向饲料中添加本发明的多肽或包含一种或多种本发明的多肽的组合物或动物饲料添加剂。

制备动物饲料的方法

在另一方面，本发明涉及制备动物饲料的方法，所述方法包括将本发明的多肽或包含一种或多种本发明的多肽的组合物、动物饲料或动物饲料添加剂与基于植物的材料混合。

用途

本发明还针对用于使用具有α-半乳糖苷酶活性的多肽或其组合物(用于例如动物饲料)的方法。本发明还针对用于使用具有α-半乳糖苷酶活性的多肽或其组合物的方法，如例如以下所描述的那些。

在动物饲料中的用途

本发明还针对用于在动物饲料中使用本发明的α-半乳糖苷酶的方法。

术语动物包括所有动物。动物的实例为非反刍动物和反刍动物。反刍动物包括例如，动物，如绵羊、山羊、和牛，例如，肉牛、奶牛和牛犊。在具体实施例中，动物为非反刍动物。非反刍动物包括单胃动物，例如，猪(包括但不限于小猪、成长猪、和母猪)；家禽，如火鸡、鸭和鸡(包括但不限于肉仔鸡和蛋鸡)；马(包括但不限于热血马、冷血马和温血马)、小牛；和鱼(包括但不限于，鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼)；和甲壳动物(包括但不限于虾和对虾)。

在根据本发明的用途中，可在饮食之前，之后或同时向动物饲喂α-半乳糖苷酶。优选后者。

在具体实施例中，明确限定了处于往饲料中添加的α-半乳糖苷酶或当包含在饲料添加剂中时的形式的α-半乳糖苷酶。明确限定指的是如经大小排阻色谱法(参见WO01/58275的实例12)测定的，α-半乳糖苷酶制剂至少为50％纯。在其他具体实施例中，如通过此方法确定的，α-半乳糖苷酶制品为至少60％、70％、80％、85％、88％、90％、92％、94％、或至少95％纯。

明确限定的α-半乳糖苷酶制剂是有利的。例如，对于实质上不受其他α-半乳糖苷酶干扰或污染的α-半乳糖苷酶而言，更容易确定它在饲料中的正确剂量。术语正确配量具体指得到一致和恒定的结果的目标，和基于所希望的效果优化剂量的能力。

然而，为了在动物饲料中使用，α-半乳糖苷酶不必那么纯；它可例如包括其他酶，在此情况下它可被定义为α-半乳糖苷酶制品。

该α-半乳糖苷酶制剂可以(a)直接加入饲料，或者(b)它可以用于随后加入饲料(或者用于处理过程中)的一种或多种中间组合物，如饲料添加剂或者预混物的生产。不论是否根据上述(a)或(b)来使用，上文所述的纯度指的都是原始α-半乳糖苷酶制剂的纯度。

本发明的优选实施例

在下面的一组项目中描述了本发明的优选实施例。

1.一种从基于植物的材料中释放半乳糖的方法，该方法包括用一种或多种具有α-半乳糖苷酶活性的GH36多肽处理该基于植物的材料，其中该具有α-半乳糖苷酶活性的GH36多肽选自下组，该组由以下组成：

(a)与SEQ ID NO:2的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；

(b)与SEQ ID NO:5的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；

(c)与SEQ ID NO:8的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；

(d)与SEQ ID NO:12的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；

(e)与SEQ ID NO:14的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；

(f)与SEQ ID NO:19的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；

2.一种从基于植物的材料中释放半乳糖的方法，该方法包括用一种或多种具有α-半乳糖苷酶活性的GH36多肽处理该基于植物的材料，其中：

(A)该GH36多肽释放至少19g半乳糖/kg大豆粉；和

(B)该具有α-半乳糖苷酶活性的GH36多肽选自下组，该组由以下组成：

(a)与SEQ ID NO:2的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；

(b)与SEQ ID NO:5的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；

(c)与SEQ ID NO:8的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；

(d)与SEQ ID NO:12的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；

(e)与SEQ ID NO:14的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；

(f)与SEQ ID NO:19的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；

3.根据项目1至2中任一项所述的方法，其中当在如下反应条件下进行时，该GH36多肽释放至少19g，例如至少19.5g、例如至少20g、至少20.5g、至少21g、至少21.5g、至少22g或至少23g半乳糖/kg大豆粉，所述条件是：20mg多肽/kg大豆粉于10％w/v 0.1M柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，pH 6.5，在40℃孵育2小时。

4.根据项目1至3中任一项所述的方法，其中该GH36多肽包含或由如下组成：SEQID NO:2的氨基酸1至728、SEQ ID NO:3的氨基酸1至734、SEQ ID NO:5的氨基酸1至731、SEQID NO:6的氨基酸1至737、SEQ ID NO:8的氨基酸1至732、SEQ ID NO:9的氨基酸1至738、SEQID NO:11的氨基酸1至719、SEQ ID NO:12的氨基酸1至719、SEQ ID NO:14的氨基酸1至731、SEQ ID NO:15的氨基酸1至737、SEQ ID NO:18的氨基酸1至735、或SEQ ID NO:19的氨基酸1至735。

5.根据项目1至4中任一项所述的方法，其中该基于植物的材料来自蔷薇亚纲。

6.根据项目1至4中任一项所述的方法，其中该基于植物的材料来自豆科，优选蝶形花亚科。

7.根据项目1至4中任一项所述的方法，其中该基于植物的材料来自菜豆族、鹰嘴豆族、染料木族、野碗豆族、黄檀族或菜豆族。

8.根据项目1至4中任一项所述的方法，其中该基于植物的材料是大豆、野生大豆、豆类、羽扇豆、花菜豆、红花菜豆、瘦豆(slimjim bean)、利马豆、法国菜豆、蚕豆(favabean)、鹰嘴豆、小扁豆、花生、西班牙花生、低芥酸菜籽、油菜籽(油菜)或豌豆或处于其加工形式例如大豆粉、全脂大豆粉、大豆蛋白质浓缩物(SPC)、发酵大豆粉(FSBM)或其任何组合。

9.一种分离的具有α-半乳糖苷酶活性的多肽，该多肽选自下组，该组由以下组成：

(a)多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性；

(b)多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有至少82％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性；

(c)多肽，该多肽与SEQ ID NO:8的多肽具有至少82％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性；

(d)多肽，该多肽与SEQ ID NO:12的多肽具有至少84％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性；

(e)多肽，该多肽与SEQ ID NO:14的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性；

(f)多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性；

(g)多肽，该多肽由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多核苷酸编码；

(h)多肽，该多肽由与SEQ ID NO:4的成熟多肽编码序列具有至少82％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多核苷酸编码；

(i)多肽，该多肽由与SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列具有至少82％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多核苷酸编码；

(j)由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:12的多肽具有至少84％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性；

(k)由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:14的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性；

(l)由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:19的多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性；

(m)SEQ ID NO:2的变体，其中该变体具有α-半乳糖苷酶活性并且包括在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；

(n)SEQ ID NO:5的变体，其中该变体具有α-半乳糖苷酶活性并且包括在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；

(o)SEQ ID NO:8的变体，其中该变体具有α-半乳糖苷酶活性并且包括在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；

(p)SEQ ID NO:12的变体，其中该变体具有α-半乳糖苷酶活性并且包括在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；

(q)SEQ ID NO:14的变体，其中该变体具有α-半乳糖苷酶活性并且包括在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；

(r)SEQ ID NO:19的变体，其中该变体具有α-半乳糖苷酶活性并且包括在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；

(s)多肽，该多肽包括(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)或(r)的多肽以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签；

(t)多肽，该多肽包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)或(r)的多肽以及多至10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的N-末端和/或C-末端延伸；和

(u)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)或(r)的多肽的片段，该片段具有α-半乳糖苷酶活性并且具有该成熟多肽的至少90％的长度。

10.根据项目9所述的多肽，其中该多肽包含或由如下组成：SEQ ID NO:2的氨基酸1至728、SEQ ID NO:3的氨基酸1至734、SEQ ID NO:5的氨基酸1至731、SEQ ID NO:6的氨基酸1至737、SEQ ID NO:8的氨基酸1至732、SEQ ID NO:9的氨基酸1至738、SEQ ID NO:11的氨基酸1至719或SEQ ID NO:12的氨基酸1至719、SEQ ID NO:14的氨基酸1至731、SEQ ID NO:15的氨基酸1至737、SEQ ID NO:18的氨基酸1至735、或SEQ ID NO:19的氨基酸1至735。

11.一种组合物，该组合物包括项目9至10中任一项所述的一种或多种多肽。

12.如项目11所述的组合物，该组合物进一步包括一种或多种配制剂。

13.如项12所述的组合物，其中该一种或多种调配剂选自下组，该组由以下组成：甘油、乙二醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、淀粉和纤维素或其任何组合。

14.如项目11至13中任一项所述的组合物，该组合物进一步包括一种或多种另外的酶。

15.如项目14的组合物，其中该一种或多种另外的酶选自下组，该组由以下组成：乙酰木聚糖酯酶、酰基甘油脂肪酶、淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶、β-糖苷酶、溶血磷脂酶、溶菌酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶(甘露聚糖酶)、植酸酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶D、蛋白酶、支链淀粉酶、果胶酯酶、三乙酰基甘油脂肪酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶或其任何组合。

16.如项目11至15中任一项所述的组合物，该组合物进一步包括一种或多种微生物。

17.如项目16所述的组合物，其中该一种或多种微生物选自下组，该组由以下组成：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、多粘菌芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、动物双歧杆菌、肉食杆菌属、丁酸梭菌、梭菌属、屎肠球菌、肠球菌属、乳酸杆菌属、嗜酸乳杆菌、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminus)、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、唾液乳酸杆菌、乳酸乳球菌、乳球菌属、明串珠菌属、埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii)、巨型球菌属、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、片球菌属、特氏丙酸杆菌(Propionibacterium thoenii)、丙酸杆菌属、以及链球菌属或其任何组合。

18.如项目11至17中任一项所述的组合物，该组合物进一步包括基于植物的材料。

19.如项目18所述的组合物，其中该基于植物的材料来自蔷薇亚纲。

20.如项目18所述的组合物，其中该基于植物的材料来自豆科，优选蝶形花亚科。

21.如项目18所述的组合物，其中该基于植物的材料来自菜豆族、鹰嘴豆族、染料木族、野碗豆族、黄檀族或菜豆族或其任何组合。

22.如项目18所述的组合物，其中该基于植物的材料是大豆、野生大豆、豆类、羽扇豆、花菜豆、红花菜豆、瘦豆(slimjim bean)、利马豆、法国菜豆、蚕豆(fava bean)、鹰嘴豆、小扁豆、花生、西班牙花生、低芥酸菜籽、油菜籽(油菜)或豌豆或处于其加工形式例如大豆粉、全脂大豆粉、大豆蛋白质浓缩物(SPC)、发酵大豆粉(FSBM)或其任何组合。

23.一种颗粒，其包括项目9至10中任一项所述的一种或多种多肽或项目11至17中任一项所述的组合物。

24.如项目23所述的颗粒，其中该颗粒是包衣的。

25.如项目24所述的颗粒，其中该包衣包含盐和/或蜡和/或面粉。

26.一种动物饲料添加剂，其包括项目9至10中任一项所述的多肽、项目11至17中任一项所述的组合物或项目23至25中任一项所述的颗粒、以及选自以下列表的一种或多种组分，该列表由以下组成：

一种或多种维生素；

一种或多种矿物质；

一种或多种氨基酸；

一种或多种益生元；

一种或多种植生素；

一种或多种有机酸；和

一种或多种其他饲料成分。

27.一种动物饲料，其包括基于植物的材料和项目9至10中任一项所述的一种或多种多肽、项目11至17中任一项所述的组合物、项目23至25中任一项所述的颗粒或项目26所述的动物饲料添加剂。

28.如项目27所述的动物饲料，其中该基于植物的材料来自蔷薇亚纲，优选豆科、更优选蝶形花亚科或甚至更优选来自菜豆族、鹰嘴豆族、染料木族、野碗豆族、黄檀族或菜豆族或其任何组合。

29.如项目27所述的动物饲料，其中该基于植物的材料是大豆、野生大豆、豆类、羽扇豆、花菜豆、红花菜豆、瘦豆(slimjim bean)、利马豆、法国菜豆、蚕豆(fava bean)、鹰嘴豆、小扁豆、花生、西班牙花生、低芥酸菜籽、油菜籽(油菜)或豌豆或处于其加工形式例如大豆粉、全脂大豆粉、大豆蛋白质浓缩物(SPC)、发酵大豆粉(FSBM)或其任何组合。

30.一种粒化动物饲料，其包括基于植物的材料和项目9至10中任一项所述的一种或多种多肽、项目11至17中任一项所述的组合物、项目23至25中任一项所述的颗粒或项目26所述的动物饲料添加剂。

31.如项目30所述的粒化动物饲料，其中该基于植物的材料来自蔷薇亚纲，优选豆科、更优选蝶形花亚科或甚至更优选来自菜豆族、鹰嘴豆族、染料木族、野碗豆族、黄檀族或菜豆族或其任何组合。

32.如项目30所述的粒化动物饲料，其中该基于植物的材料是大豆、野生大豆、豆类、羽扇豆、花菜豆、红花菜豆、瘦豆(slimjim bean)、利马豆、法国菜豆、蚕豆(fava bean)、鹰嘴豆、小扁豆、花生、西班牙花生、低芥酸菜籽、油菜籽(油菜)或豌豆或处于其加工形式例如大豆粉、全脂大豆粉、大豆蛋白质浓缩物(SPC)、发酵大豆粉(FSBM)或其任何组合。

33.如项目30至32中任一项所述的种粒化动物饲料，其中将项目9至10中任一项所述的多肽、项目11至17中任一项所述的组合物、项目23至25中任一项所述的颗粒或项目26所述的动物饲料添加剂喷涂在颗粒上。

34.一种液体配制品，其包括项目9至10中任一项所述的多肽或项目11至17中任一项所述的组合物。

35.如项目34所述的液体配制品，其中该具有α-半乳糖苷酶活性的多肽的给药为液体配制品的0.001％至25％w/w之间，优选0.01％至25％w/w、更优选0.05％至20％w/w、更优选0.2％至15％w/w、甚至更优选0.5％至15％w/w或最优选1.0％至10％w/w多肽。

36.如项目34至35中任一项所述的液体配制品，其中该配制品进一步包含20％w/w至80％w/w的多元醇。

37.如项目36所述的液体配制品，其中该多元醇选自下组，该组由以下组成：甘油、山梨醇、丙二醇(MPG)、乙二醇、二甘醇、三甘醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、二丙二醇、具有平均分子量低于约600的聚乙二醇(PEG)和具有平均分子量低于约600的聚丙二醇(PPG)或其任何组合。

38.如项目34至37中任一项所述的液体配制品，其中该配制品进一步包含0.01％w/w至2.0％w/w的防腐剂。

39.如项目38所述的液体配制品，其中该防腐剂选自下组，该组由以下组成：山梨酸钠、山梨酸钾、苯甲酸钠和苯甲酸钾或其任何组合。

40.如项目34至39中任一项所述的液体配制品，其进一步包含选自以下列表的一种或多种组分，该列表由以下各项组成：

一种或多种酶；

一种或多种微生物；

一种或多种维生素；

一种或多种矿物质；

一种或多种氨基酸；

一种或多种植生素；

一种或多种益生元；

一种或多种有机酸；和

一种或多种其他饲料成分。

41.一种制备动物饲料的方法，该方法包括将如项目34至40中任一项所述的液体配制品应用于基于植物的材料。

42.如项目41所述的方法，其中该液体配制品通过喷涂应用。

43.如项目41至42中任一项所述的方法，其中该基于植物的材料选自下组，该组由以下组成：大豆、野生大豆、豆类、羽扇豆、花菜豆、红花菜豆、瘦豆(slimjim bean)、利马豆、法国菜豆、蚕豆(fava bean)、鹰嘴豆、小扁豆、花生、西班牙花生、低芥酸菜籽、油菜籽(油菜)或豌豆或处于其加工形式例如大豆粉、全脂大豆粉、大豆蛋白质浓缩物(SPC)、发酵大豆粉(FSBM)或其任何组合。

44.如项目41至43中任一项所述的方法，其中该基于植物的材料处于粒化形式。

45.一种粒化动物饲料，其使用如项目41至44中任一项所述的方法制备。

46.一种改善动物的一个或多个性能参数的方法，该方法包括向该一种或多种动物给予一种或多种项目9至10中任一项所述的多肽、项目11至17中任一项所述的组合物、项目23至25中任一项所述的颗粒、项目26所述的动物饲料添加剂、项目27至29中任一项所述的动物饲料、项目30至33或45中任一项所述的粒化动物饲料或项目34至39中任一项所述的液体配制品。

47.如项目46所述的方法，其中该性能参数选自以下列表，该列表由以下组成：体增重(BWG)、欧洲生产效率因子(EPEF)以及饲料转化率(FCR)或其任何组合。

48.一种用于改善动物饲料营养价值的方法，该方法包括向该饲料中添加一种或多种项目9至10中任一项所述的多肽、项目11至17中任一项所述的组合物、项目23至25中任一项所述的颗粒、项目26所述的动物饲料添加剂或项目34至39中任一项所述的液体配制品。

49.一种用于减少动物饲料的抗营养效果的方法，该方法包括向该饲料中添加一种或多种项目9至10中任一项所述的多肽、项目11至17中任一项所述的组合物、项目23至25中任一项所述的颗粒、项目26所述的动物饲料添加剂或项目34至39中任一项所述的液体配制品。

50.一种制备动物饲料的方法，该方法包括将一种或多种项目9至10中任一项所述的多肽、项目11至17中任一项所述的组合物、项目23至25中任一项所述的颗粒、项目26所述的动物饲料添加剂或项目34至39中任一项所述的液体配制品与基于植物的材料混合。

51.一种从基于植物的材料中释放半乳糖的方法，该方法包括将一种或多种项目9至10中任一项所述的多肽、项目11至17中任一项所述的组合物、项目23至25中任一项所述的颗粒、项目26所述的动物饲料添加剂或项目34至39中任一项所述的液体配制品与该基于植物的材料混合。

52.如项目46至51中任一项所述的方法，其中该基于植物的材料来自蔷薇亚纲。

53.如项目46至51中任一项所述的方法，其中该基于植物的材料来自豆科，优选蝶形花亚科。

54.如项目46至51中任一项所述的方法，其中该基于植物的材料来自菜豆族、鹰嘴豆族、染料木族、野碗豆族、黄檀族或菜豆族或其任何组合。

55.如项目46至51中任一项所述的方法，其中该基于植物的材料是大豆、野生大豆、豆类、羽扇豆、花菜豆、红花菜豆、瘦豆(slimjim bean)、利马豆、法国菜豆、蚕豆(favabean)、鹰嘴豆、小扁豆、花生、西班牙花生、低芥酸菜籽、油菜籽(油菜)或豌豆或处于其加工形式例如大豆粉、全脂大豆粉、大豆蛋白质浓缩物(SPC)、发酵大豆粉(FSBM)或其任何组合。

56.项目9至10中任一项所述的多肽、项目11至17中任一项所述的组合物、项目23至25中任一项所述的颗粒、项目27至29中任一项所述的动物饲料、项目30至33或45中任一项所述的粒化动物饲料或项目34至39中任一项所述的液体配制品在以下中的用途：

在动物饲料中；

在动物饲料添加剂中；

在用于动物饲料的组合物的制备中；

用于改善动物饲料的营养价值；

用于增加动物饲料的消化率；

用于改善动物的一个或多个性能参数；和/或

用于从蔷薇亚纲的基于植物的材料中释放半乳糖。

57.一种多核苷酸，其编码如项目9至10中任一项所述的多肽。

58.一种核酸构建体或表达载体，包括可操作地连接至一个或多个控制序列的如项目57所述的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导该多肽在表达宿主中的产生。

59.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包括如项目57所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽产生的一个或多个控制序列上。

60.一种产生如项目9至10中任一项所述的多肽的方法，该方法包括：

(a)在有益于产生该多肽的条件下培养细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；和

(b)回收该多肽。

61.一种产生如项目9至10中任一项所述的多肽的方法，该方法包括：

(a)在有益于产生该多肽的条件下培养项目59所述的重组宿主细胞；和

(b)回收该多肽。

62.一种转基因植物、植物部分或植物细胞，其用编码如项目9至10中任一项的多肽的多核苷酸转化。

63.一种全培养液配制品或细胞培养组合物，其包含如项目9至10中任一项的所述的多肽。

通过以下实例进一步描述本发明，该实例不应理解为对本发明的范围进行限制。

实例

菌株

α-半乳糖苷酶来源于通过标准微生物分离技术从环境样品分离的菌株。鉴定菌株并基于16S核糖体基因的DNA测序对分类进行指定(表2)。

表2：菌株的分离

¹保藏为NCIB 11610

用来自凯杰公司(Qiagen)(希尔登，德国)的DNA酶血液和组织试剂盒(DNeasyBlood&Tissue Kit)从单个菌株的纯培养物中分离染色体DNA，并使用Illumina技术进行全基因组测序。基因组测序，随后的读取和基因发现的装配(即基因功能的注释)对于本领域技术人员是已知的并且该服务是可商购的。

对来自CAZY数据库家族GH36的α-半乳糖苷酶进行基因组序列分析(Lombard等人，The Carbohydrate-active enzymes database CAZy[碳水化合物活性酶数据库CAZy].Nucleic Acids Res[核酸研究]2013,42:D490-D495)。该分析鉴定了编码推定的α-半乳糖苷酶的三个基因，该基因具SEQ ID NO:1、4、7、10和13中给出的核苷酸序列。

α-半乳糖苷酶测定

可以使用4-硝基苯基α-D-半乳吡喃糖苷(产品代码：O-PNPBGAL，可从麦格酶国际有限公司(Megazyme International)，布雷，威克洛郡，爱尔兰(Bray,Co.Wicklow,Ireland)获得)如下确定α-半乳糖苷酶活性。

使用100mM MES(西格玛公司)缓冲液pH 7.0±0.05以2倍稀释酶并且然后添加4-硝基苯基α-D-半乳吡喃糖苷(1mg/ml于100mM MES缓冲液pH 7.0±0.05，使用前即时制备)至含有酶的溶液中。各自的半乳糖苷酶活性在缓冲液中通过测量作为时间的函数的在室温下(通常为23℃)在405nm时释放的pNP(对硝基苯酚)的吸光度5钟直接进行跟踪。酶的浓度的1mg/mL是一个好的起始点；然而其取决于不同的酶及其比活性。

使用1-5分钟的时间窗口和0-2分钟的吸光度窗口，活性被计算为吸光度与时间(单位：mOD/min)的曲线的斜率。然后，通过将酶的活性除以酶的浓度(单位：(mOD/min)/(mg/ml))，可以将酶的活性转化为比活性。

半乳糖SBM测定

引言

对富含半乳糖的底物大豆粉进行水解后采用分光光度法测定了半乳糖单糖在溶液中的浓度。

总结，一种或多种酶在10w/v％大豆粉浆液在pH 6.5±0.05在40℃±2℃下孵育2小时。然后基于来自麦格酶公司(Megazyme)的棉子糖/半乳糖试剂盒(产品名K-RAFGA)在测定中对上清液进行分析。首先，使用半乳糖变旋酶，上清液中的α-D-半乳糖转化至与β-D-半乳糖。然后β-D-半乳糖在β-半乳糖脱氢酶存在下被NAD+氧化为D-半乳糖酸。反应中形成的NADH含量与上清液中D-半乳糖含量呈化学计量关系。然后用340nm吸光度的增加来测量NADH浓度。

大豆粉浆液

由大豆粉碾磨至0.5mm粒径和0.1M柠檬酸-磷酸盐缓冲液，pH 6.5±0.05制备10w/v％大豆粉浆料。

将0.1M柠檬酸-磷酸盐缓冲液，pH 6.5±0.05加热至温度约40℃，同时搅拌。将预热的缓冲液转移至大豆粉中。搅拌所得的浆液，同时加热(此时不需监测温度-加热仅用于保证搅拌浆液的同时温度不会降低太多)。然后用预湿的大口径移液管将浆液转移至在其中孵育的容器中。从混合物的大约中心点吸取浆液。从混合浆液到转移到最后一个孵育容器的时间最多是15分钟。调整搅拌速度使得粒子在浆液中均匀分布。

酶的稀释

将酶用超纯水稀释至所希望的浓度。酶被稀释到的浓度是基于每mL的mg酶蛋白中的酶的前浓度(mg EP/mL)和每个孵育容器中干物质(大豆粉)的质量(kg)。

D-(+)-半乳糖标准品

由D-(+)-半乳糖和超纯水制备标准曲线。通过将D-(+)-半乳糖溶解于超纯水中最终达到250mg半乳糖/mL的浓度，制备D-(+)-半乳糖原液。将原液稀释两倍，以获得浓度为250mg、125mg、62.5mg、31.25mg、15.625mg和7.813mg半乳糖/mL的六种标准品。

α-半乳糖苷酶与大豆粉的孵育

将含有10w/v％大豆粉浆料的孵育容器加热至稳定的温度40℃±2℃，同时搅拌。当达到稳定温度后，向孵育容器中添加6个D-(+)-半乳糖标准品，使孵育容器内的浓度为5mg、2.5mg、1.25mg、0.625mg、0.313mg和0.157mg半乳糖/mL孵育体积。一式两份地孵育每个标准品。

然后将稀释的酶按达到所需浓度所需的体积分别添加到各自的孵育容器中(以mgEP/kg大豆粉)。一式三份地孵育每个酶处理。

此外，包括二乘三个孵育容器，其不含标准品或酶处理作为空白处理以获得大豆粉浆液中基线半乳糖浓度。

孵育容器在40℃±2℃孵育2小时，同时搅拌。孵育后在5℃下在1500g离心15分钟。

半乳糖浓度的确定

然后基于来自麦格酶公司(Megazyme)的棉子糖/半乳糖试剂盒(产品名K-RAFGA)在测定中对离心的孵育容器中的上清液进行分析。测定中使用来自于K-RAFGA试剂盒的三种试剂：测定缓冲液(在试剂盒中瓶1中提供和准备)、β-NAD试剂(在试剂盒中瓶2中提供，在使用前如在试剂盒中描述进行制备)和GalDH+GalM溶液(在试剂盒中瓶3中提供，在使用前在超纯水中1:1稀释)。下面描述的所有步骤都是使用Eppendorf 5075自动移液系统进行的。

首先，将来自离心的孵育容器的上清液在0.1M柠檬酸-磷酸盐缓冲液，pH 6.5±0.05中稀释10倍(1份上清液加9份0.1M柠檬酸-磷酸盐缓冲液，pH 6.5±0.05)。

然后将每个稀释的上清液的69μL转移到一个新的容器中并添加34μL超纯水至稀释的上清液(从现在开始称为测定样品)。然后添加69μL测定缓冲液至测定样品中，随后稀释于687μL超纯水中。将34μLβ-NAD试剂添加到测定样品中，随后添加14μL GalDH+GalM溶液并和剧烈混合。

然后转移每个测定样品的262μL到96孔微量滴定板。在340nm在40℃±2℃下测量96孔微量滴定板每个孔的吸光度持续时间20分钟或直到每个孔的吸光度已经达到稳定水平。当达到稳定吸光度时，这种稳定吸光度在以后的计算中会用到。

半乳糖浓度的计算

来自孵育容器中半乳糖标准品的测定样品的吸光度被用作标准曲线(6种标准品，5mg、2.5mg、1.25mg、0.625mg、0.313mg和0.157mg半乳糖/mL孵育体积，n＝2/标准品)。在excel中计算半乳糖标准曲线方程，其中y为OD340，并且x为半乳糖浓度(mg半乳糖/mL孵育体积)：

每个样品的半乳糖浓度(mg半乳糖/mL孵育体积)由下计算：

然后，以干物质为基础计算半乳糖浓度(g半乳糖/kg大豆粉)，并在下面的实例中报告：

实例1：GH36α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO:1、4、7和13)的克隆

通过PCR扩增编码α-半乳糖苷酶的基因，并将其与调节元件、亲和纯化标签和同源区融合以重组到枯草芽孢杆菌基因组中。线性整合构建体是SOE-PCR融合产物(Horton,R.M.,Hunt,H.D.,Ho,S.N.,Pullen,J.K.和Pease,L.R.(1989)，Engineering hybrid geneswithout the use of restriction enzymes,gene splicing by overlap extension[不使用限制酶，通过重叠延伸的基因剪接的工程化杂种基因]Gene[基因]77:61-68)，该融合产物由两个枯草芽孢杆菌染色体区域之间的基因连同强启动子与氯霉素抗性标记的融合制备。SOE PCR方法也描述于专利申请WO 2003095658中。

在三联启动子系统(如WO 99/43835中所述)的控制下表达该基因，该启动子系统由包括稳定化序列的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)启动子、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)启动子和苏云金芽孢杆菌cryIIIA启动子组成。

此外，表达构建体导致由6个连续组氨酸残基组成的羧基末端多组氨酸尾的添加。

该SOE-PCR产物被转化进枯草芽孢杆菌中并且在染色体上通过同源重组将其整合到果胶裂解酶位点中。随后，选择一个包含对应的α-半乳糖苷酶表达构建体的重组枯草芽孢杆菌克隆，并且在旋转摇床上在500ml带挡板的锥形瓶中进行培养，每个锥形瓶包含100ml富淀粉基培养基。在30℃至37℃下的3-5天培养时间后，通过离心收获包含酶的上清液并通过固定化的金属亲和层析对这些酶进行纯化。

实例2：GH36α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO:3、6、9和15)的纯化

将来自实验1的上清液的pH调节至pH 8，通过0.2μM滤器进行过滤，并且然后施加于5ml HisTrap^TMexcel柱上(GE医疗集团生命科学部(GE Healthcare Life Sciences)，匹兹堡，美国)。在加载之前，该柱已经在5个柱体积(CV)的50mM Tris/HCl(pH 8)中平衡好。为了去除未结合的材料，将该柱用8CV的50mM Tris/HCl(pH 8)进行洗涤，靶标的洗脱是用50mM HEPES(pH 7)+10mM咪唑获得。将洗脱的蛋白在HiPrep^TM26/10脱盐柱(GE医疗集团生命科学部(GE Healthcare Life Sciences)，匹兹堡，美国)上进行脱盐，将该脱盐柱使用3CV的50mM HEPES(pH 7)+100mM NaCl进行平衡。也将此缓冲液用于靶标的洗脱，并且流速是10ml/min。选择相关级分，并且基于色谱图和SDS-PAGE分析进行合并。

实例3：GH36α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO:10)的克隆

将具有核苷酸序列SEQ ID NO:10和示于SEQ ID NO:11中的蛋白质的肽翻译的α-半乳糖苷酶从分离自聚多曲霉的基因组DNA中进行PCR扩增，并使用BamHI和XhoI限制站点克隆到如WO 2013024021中所述的表达载体pDAu222中。

证实了克隆于表达载体中的α-半乳糖苷酶编码基因的序列，并将该表达构建体转化到米曲霉菌株MT3568(WO 11/057140)中，以产生具有蛋白质序列SEQ ID NO:12的分泌成熟肽。在从原生质体再生期间，在乙酰胺上选择转化体，并且随后在选择下重新分离(Christensen等人,1988,Biotechnology[生物技术]6,1419-1422和WO 04/032648)。

为了生产重组α-半乳糖苷酶，将单个曲霉属转化体在各自含有150ml的DAP-4C-1培养基(WO 12/103350)的两个500ml带挡板烧瓶中进行培养。将培养物在旋转台上以100RPM在30℃下振荡4天。随后将培养液通过穿过0.22um过滤器与细胞材料分离并如实例4所述纯化。

实例4：GH36α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO:12)的纯化

将培养液用3.6M硫酸铵50:50稀释，搅拌30分钟并然后通过0.2μm过滤器过滤。将该样品施加至purifier上的5ml HiTrap^TMPhenyl(FF)柱上(GE医疗集团(GEhealthcare)，皮斯卡塔韦，新泽西州，美国)。在加载之前，该柱已在5个柱体积(CV)的50mMHEPES+1.8M硫酸铵(pH 7)中平衡。为了除去未结合的材料，将该柱用5CV的50mM HEPES+1.8M硫酸铵(pH 7)进行洗涤。使用50mM HEPES+20％异丙醇(pH 7)将靶蛋白从柱洗脱到10ml环中。从该环中，将样品装载到已经用3CV的50mM HEPES+100mM NaCl(pH 7.0)平衡的脱盐柱(HiPrep^TM26/10脱盐)上。将靶蛋白用50mM HEPES+100mM NaCl(pH 7.0)洗脱，选择相关级分，并基于色谱图进行池化。流速为5ml/min。

实例5：使用GH36α-半乳糖苷酶的大豆粉(SBM)的水解

使用半乳糖SBM测定确定来自本发明的三种GH36α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO:3、6和9)和现有技术中的GH36α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO:16)从大豆粉释放的半乳糖并将结果示于下表3和4中。

表3：使用GH36α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO:3、6、9和16)从大豆粉的半乳糖释放

¹意指不使用相同字母的为差异显著(p<0.05)。

表4：使用GH36α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO:3、6、9和16)从大豆粉的半乳糖释放

¹意指不使用相同字母的为差异显著(p<0.05)。

结果显示本发明的α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO:3、6和9)在从大豆粉中释放半乳糖方面比现有技术的序列(SEQ ID NO:16)显著更具活性。

实例6：使用GH36α-半乳糖苷酶的大豆粉(SBM)的水解

使用半乳糖SBM测定确定来自本发明的两种GH36α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO:3和12)的大豆粉释放的半乳糖和现有技术中的GH36α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO:16)并将结果示于下表5和6中。

表5：使用GH36α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO:3、12和16)从大豆粉的半乳糖释放

¹意指不使用相同字母的为差异显著(p<0.05)。

表6：使用GH36 α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO:3、12和16)从大豆粉的半乳糖释放

¹意指不使用相同字母的为差异显著(p<0.05)。

结果显示本发明的α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO:3和12)在从大豆粉中释放半乳糖方面比现有技术的序列(SEQ ID NO:16)显著更具活性。

实例7：使用GH36α-半乳糖苷酶的大豆粉(SBM)的水解

使用半乳糖SBM测定确定来自本发明的四种GH36α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO:3、6、9和12)的大豆粉释放的半乳糖和现有技术中的GH36α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO:16)并将结果示于下表7中。

表7：使用GH36α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO:3、6、9、12和16)从大豆粉的半乳糖释放

¹意指不使用相同字母的为差异显著(p<0.05)。

结果显示本发明的α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO:3、6、9和12)均在数字上比现有技术的序列(SEQ ID NO:16)从大豆粉中释放更多的半乳糖，并且α-半乳糖苷酶SEQ ID NO:3、6和12比现有技术的序列从大豆粉中释放显著更高量的半乳糖。

实例8：使用GH36α-半乳糖苷酶的大豆粉(SBM)的水解

使用半乳糖SBM测定确定来自本发明的两种GH36α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO:3和15)的大豆粉释放的半乳糖和现有技术中的GH36α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO:16)并将结果示于下表8中。

表8：使用GH36α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO:3、15和16)从大豆粉的半乳糖释放

¹意指不使用相同字母的为差异显著(p<0.05)。

结果显示本发明的α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO:3和15)在从大豆粉中释放半乳糖方面比现有技术的序列(SEQ ID NO:16)显著更具活性。

实例9：包含α-半乳糖苷酶的动物饲料和动物饲料添加剂

动物饲料添加剂

将含有0.01g至10g酶蛋白酶/千克预混物(任选地配制为包衣颗粒)的本发明的α-半乳糖苷酶(例如SEQ ID NO:2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、18或19)的预混物配制品添加至如下预混物中：

动物饲料

这是一个动物饲料(肉鸡饲料)的实例，其包含如上文描述的动物饲料添加剂：

62.55％玉米

33.8％大豆粉(50％粗蛋白)

1.0％大豆油

0.2％DL-蛋氨酸

0.22％DCP(磷酸二钙)

0.76％CaCO₃(碳酸钙)

0.32％沙子

0.15％NaCl(氯化钠)

1％的上述预混物

将这些成分混合，将饲料在所希望的温度下粒化，例如60℃、65℃、75℃、80℃、85℃、90℃或甚至95℃。

液体配制品

本发明的α-半乳糖苷酶(例如SEQ ID NO:2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、18或19)的液体配制品包含0.1％至10w/w酶蛋白、40％-60％甘油、0.1％至0.5％苯甲酸钠和水。将液体配制品喷涂在上文所述的粒化动物饲料上(在这种情况下，动物饲料添加剂不包括本发明的α-半乳糖苷酶)。

实例10：GH36α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO:17)的克隆

将具有核苷酸序列SEQ ID NO:17和示于SEQ ID NO:18中的蛋白质的肽翻译的α-半乳糖苷酶从分离自聚多曲霉的基因组DNA中进行PCR扩增，并使用BamHI和XhoI限制站点克隆到如WO 2013024021中所述的表达载体pDAu222中。

证实了克隆于表达载体中的α-半乳糖苷酶编码基因的序列，并将该表达构建体转化到米曲霉菌株MT3568(WO 11/057140)中，以产生具有蛋白质序列SEQ ID NO:18的分泌成熟肽。在从原生质体再生期间，在乙酰胺上选择转化体，并且随后在选择下重新分离(Christensen等人,1988,Biotechnology[生物技术]6,1419-1422和WO 04/032648)。

为了生产重组α-半乳糖苷酶，将单个曲霉属转化体在各自含有150ml的DAP-4C-1培养基(WO 12/103350)的两个500ml带挡板烧瓶中进行培养。将培养物在旋转台上以100RPM在30℃下振荡4天。随后将培养液通过穿过0.22um过滤器与细胞材料分离并如实例11所述纯化。

实例11：GH36α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO:19)的纯化

将培养液用1.8M硫酸铵50:50稀释，搅拌30分钟并然后通过0.2μm过滤器过滤。将该样品施加至Explorer上的5ml HiTrap^TMPhenyl(FF)柱上(GE医疗集团(GEhealthcare)，皮斯卡塔韦，新泽西州，美国)。在加载之前，该柱已在5个柱体积(CV)的50mMHEPES+1.8M硫酸铵(pH 7)中平衡。为了除去未结合的材料，将该柱用5CV的50mM HEPES+1.8M硫酸铵(pH 7)进行洗涤。使用50mM HEPES+20％乙醇(pH 7)将靶蛋白从柱洗脱到10ml环中。从该环中，将样品装载到已经用3CV的50mM HEPES+100mM NaCl(pH 7.0)平衡的脱盐柱(HiPrep^TM26/10脱盐)上。将靶蛋白用50mM HEPES+100mM NaCl(pH 7.0)洗脱，选择相关级分，并基于色谱图进行池化。流速为5ml/min。

实例12：使用GH36α-半乳糖苷酶的大豆粉(SBM)的水解

使用半乳糖SBM测定确定来自本发明的两种GH36α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO:3和19)的大豆粉释放的半乳糖和现有技术中的GH36α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO:16)并将结果示于下表9中。

表9：使用GH36α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO:3、15和16)从大豆粉的半乳糖释放

¹意指不使用相同字母的为差异显著(p<0.05)。

结果显示本发明的α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO:3和19)在从大豆粉中释放半乳糖方面比现有技术的序列(SEQ ID NO:16)显著更具活性。

实例13：使用GH36α-半乳糖苷酶的大豆粉(SBM)的水解

将本发明的GH36α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO:3)从大豆粉释放的半乳糖与现有技术的GH36α-半乳糖苷酶SEQ ID NO:16以及如WO 2009/108941(AXR38459)中SEQ ID NO:597披露的现有技术的GH36α-半乳糖苷酶的接近类似物进行比较。SEQ ID NO:20与AXR3845997.3％相同。使用半乳糖SBM测定确定从大豆粉中释放的半乳糖并且结果示于下表10中。

表10：使用GH36α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO:3、16和20)从大豆粉的半乳糖释放

¹意指不使用相同字母的为差异显著(p<0.05)。

结果显示现有技术的序列AXR38459(即，SEQ ID NO:20)的接近类似物与其他现有技术的GH36α-半乳糖苷酶SEQ ID NO:16或本发明的GH36α-半乳糖苷酶(SEQ ID NO:3)比较在从大豆粉中释放半乳糖方面并不是很有效。

在此描述和要求保护的本发明不限于在此披露的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。任何等同方面意欲在本发明的范围之内。实际上，除了在此所示和描述的那些之外，对于本领域的技术人员而言本发明的各种修改将从前述的说明书变得显而易见。这样的修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本披露内容为准。

序列表

<110> 诺维信公司

<120> 具有α-半乳糖苷酶活性的多肽以及编码其的多核苷酸

<130> 13201-WO-PCT

<150> EP16170960.5

<151> 2016-05-24

<160> 20

<170> PatentIn版本 3.5

<210> 1

<211> 2187

<212> DNA

<213> 脱支芽孢杆菌

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(2184)

<220>

<221> 成熟多肽

<222> (1)..(2184)

<400> 1

atg ggc atc tca tat gat tcc gag aat cgc att ttt cat cta caa ggt 48

Met Gly Ile Ser Tyr Asp Ser Glu Asn Arg Ile Phe His Leu Gln Gly

1 5 10 15

aaa ggt acc agt tat ctc atg cag gta tta aaa gac ggt tat ctg gct 96

Lys Gly Thr Ser Tyr Leu Met Gln Val Leu Lys Asp Gly Tyr Leu Ala

20 25 30

cat ctt tac tgg ggg aga ggg gtt cgt caa tat agt gga ggg att cca 144

His Leu Tyr Trp Gly Arg Gly Val Arg Gln Tyr Ser Gly Gly Ile Pro

35 40 45

ata acg ttt ttt gat cgc ggt ttt tca cca aac cct gac cct tct gac 192

Ile Thr Phe Phe Asp Arg Gly Phe Ser Pro Asn Pro Asp Pro Ser Asp

50 55 60

cga acc ttc tct ctt gat acg ctg ccg caa gaa tac cct gct tat ggg 240

Arg Thr Phe Ser Leu Asp Thr Leu Pro Gln Glu Tyr Pro Ala Tyr Gly

65 70 75 80

aac acg gat ttt cgc aca ccg gct tat caa gtt cag tta gag aat ggt 288

Asn Thr Asp Phe Arg Thr Pro Ala Tyr Gln Val Gln Leu Glu Asn Gly

85 90 95

tcc acc att tca gac ctc cgc tat aaa gga cac gcc ata tat aaa ggg 336

Ser Thr Ile Ser Asp Leu Arg Tyr Lys Gly His Ala Ile Tyr Lys Gly

100 105 110

aag cct aag tta gaa gga ttg cca gcg gtg tat gtt gaa gac gac cgt 384

Lys Pro Lys Leu Glu Gly Leu Pro Ala Val Tyr Val Glu Asp Asp Arg

115 120 125

gaa gcc gaa aca tta gaa ata aca ctg gaa gat tcg cta att ggt ttg 432

Glu Ala Glu Thr Leu Glu Ile Thr Leu Glu Asp Ser Leu Ile Gly Leu

130 135 140

gaa atg gtc tta gtt tat aca gta ttt gaa aac ttt agt gct atc acg 480

Glu Met Val Leu Val Tyr Thr Val Phe Glu Asn Phe Ser Ala Ile Thr

145 150 155 160

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Arg Ser Val Arg Phe Glu Asn Lys Gly Thr Gln Asp Leu Lys Ile Leu

165 170 175

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Arg Ala Leu Ser Ala Asn Ile Asp Phe Arg Asp Asp Asp Phe Glu Leu

180 185 190

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Ile Thr Leu Tyr Gly Ser His Ile Asn Glu Arg Asn Ile Ala Arg Arg

195 200 205

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210 215 220

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Ser His Gln Gln Asn Pro Phe Leu Ala Leu Leu Arg Pro Asn Ala Thr

225 230 235 240

gaa gac caa gga gat gta tac ggg ctg aat ctt gtc tac agc ggg aac 768

Glu Asp Gln Gly Asp Val Tyr Gly Leu Asn Leu Val Tyr Ser Gly Asn

245 250 255

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Phe Leu Gly Gln Val Glu Val Asn Gln Phe Gln Thr Thr Arg Val Ser

260 265 270

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275 280 285

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Asn Phe Gln Ala Pro Glu Ala Val Met Val Tyr Ser Ser Glu Gly Leu

290 295 300

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Ala Gly Met Ser Gln Thr Tyr His Glu Leu Tyr Arg Thr Arg Leu Ser

305 310 315 320

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Arg Gly Glu His Arg Asp Lys Val Arg Pro Ile Leu Ile Asn Asn Trp

325 330 335

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Glu Ala Thr Tyr Phe Asp Phe Asn Ala Asp Lys Ile Val Glu Ile Ala

340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

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Val Asp Lys Arg Lys Leu Pro His Gly Leu Thr Asp Leu Ala Glu Arg

385 390 395 400

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Val Arg Ser Leu Gly Met Glu Phe Gly Leu Trp Phe Glu Pro Glu Met

405 410 415

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Val Ser Met Glu Ser Asp Leu Tyr Lys Arg His Pro Asp Trp Cys Leu

420 425 430

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435 440 445

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450 455 460

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465 470 475 480

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485 490 495

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500 505 510

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515 520 525

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530 535 540

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545 550 555 560

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565 570 575

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580 585 590

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Gly His Ala Ala Met Ser Gly Asn Leu Gly Tyr Glu Leu Asp Leu Thr

595 600 605

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Lys Leu Ser Asp Gln Glu Lys Glu Glu Val Lys Leu Gln Ile Ala Gln

610 615 620

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Tyr Lys Glu Ile Arg Gln Leu Val Gln Phe Gly Ser Phe Tyr Arg Leu

625 630 635 640

ctc agt ccg ttt gag ggg aat gag aca gct tgg gtc ttt gta tca tct 1968

Leu Ser Pro Phe Glu Gly Asn Glu Thr Ala Trp Val Phe Val Ser Ser

645 650 655

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Asp Gln Lys Glu Cys Leu Phe Gly Tyr Phe Arg Val Leu Ser Gln Pro

660 665 670

aat gca cct act aaa atc atc aaa tta aaa ggg cta aat ctg ggt gag 2064

Asn Ala Pro Thr Lys Ile Ile Lys Leu Lys Gly Leu Asn Leu Gly Glu

675 680 685

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Arg Tyr Lys Lys Thr Gly Ser Asp Glu Ser Phe Phe Gly Asp Glu Leu

690 695 700

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Met Tyr Leu Gly Ile Asn Ile Pro Glu Leu Lys Gly Asp Phe Gln Ser

705 710 715 720

gtg ttt tgg cat ttc gaa gcg gaa taa 2187

Val Phe Trp His Phe Glu Ala Glu

725

<210> 2

<211> 728

<212> PRT

<213> 脱支芽孢杆菌

<400> 2

Met Gly Ile Ser Tyr Asp Ser Glu Asn Arg Ile Phe His Leu Gln Gly

1 5 10 15

Lys Gly Thr Ser Tyr Leu Met Gln Val Leu Lys Asp Gly Tyr Leu Ala

20 25 30

His Leu Tyr Trp Gly Arg Gly Val Arg Gln Tyr Ser Gly Gly Ile Pro

35 40 45

Ile Thr Phe Phe Asp Arg Gly Phe Ser Pro Asn Pro Asp Pro Ser Asp

50 55 60

Arg Thr Phe Ser Leu Asp Thr Leu Pro Gln Glu Tyr Pro Ala Tyr Gly

65 70 75 80

Asn Thr Asp Phe Arg Thr Pro Ala Tyr Gln Val Gln Leu Glu Asn Gly

85 90 95

Ser Thr Ile Ser Asp Leu Arg Tyr Lys Gly His Ala Ile Tyr Lys Gly

100 105 110

Lys Pro Lys Leu Glu Gly Leu Pro Ala Val Tyr Val Glu Asp Asp Arg

115 120 125

Glu Ala Glu Thr Leu Glu Ile Thr Leu Glu Asp Ser Leu Ile Gly Leu

130 135 140

Glu Met Val Leu Val Tyr Thr Val Phe Glu Asn Phe Ser Ala Ile Thr

145 150 155 160

Arg Ser Val Arg Phe Glu Asn Lys Gly Thr Gln Asp Leu Lys Ile Leu

165 170 175

Arg Ala Leu Ser Ala Asn Ile Asp Phe Arg Asp Asp Asp Phe Glu Leu

180 185 190

Ile Thr Leu Tyr Gly Ser His Ile Asn Glu Arg Asn Ile Ala Arg Arg

195 200 205

Pro Ile Gln Pro Gly Thr Gln Ser Ile Glu Ser Arg Arg Gly Ala Ser

210 215 220

Ser His Gln Gln Asn Pro Phe Leu Ala Leu Leu Arg Pro Asn Ala Thr

225 230 235 240

Glu Asp Gln Gly Asp Val Tyr Gly Leu Asn Leu Val Tyr Ser Gly Asn

245 250 255

Phe Leu Gly Gln Val Glu Val Asn Gln Phe Gln Thr Thr Arg Val Ser

260 265 270

Ile Gly Ile Asn Pro Phe Asp Phe Ser Trp Leu Leu Gln Pro Gly Glu

275 280 285

Asn Phe Gln Ala Pro Glu Ala Val Met Val Tyr Ser Ser Glu Gly Leu

290 295 300

Ala Gly Met Ser Gln Thr Tyr His Glu Leu Tyr Arg Thr Arg Leu Ser

305 310 315 320

Arg Gly Glu His Arg Asp Lys Val Arg Pro Ile Leu Ile Asn Asn Trp

325 330 335

Glu Ala Thr Tyr Phe Asp Phe Asn Ala Asp Lys Ile Val Glu Ile Ala

340 345 350

Gln Val Gly Lys Glu Leu Gly Met Glu Leu Met Val Leu Asp Asp Gly

355 360 365

Trp Phe Gly Lys Arg Asp Asp Asp Phe Thr Ser Leu Gly Asp Trp Val

370 375 380

Val Asp Lys Arg Lys Leu Pro His Gly Leu Thr Asp Leu Ala Glu Arg

385 390 395 400

Val Arg Ser Leu Gly Met Glu Phe Gly Leu Trp Phe Glu Pro Glu Met

405 410 415

Val Ser Met Glu Ser Asp Leu Tyr Lys Arg His Pro Asp Trp Cys Leu

420 425 430

His Val Pro Asn Arg Pro Lys Ser Glu Gly Arg Asn Gln Leu Ile Leu

435 440 445

Asp Leu Ser Arg Gln Glu Val Cys Asp Tyr Val Ile Glu Ser Val Ser

450 455 460

Ser Ile Leu Ser Thr Val Pro Ile Ser Tyr Val Lys Trp Asp Met Asn

465 470 475 480

Arg His Met Thr Glu Ile Gly Ser Ala Asp Leu Leu Pro Glu Arg Gln

485 490 495

Arg Glu Thr Ala His Arg Tyr Met Leu Gly Leu Tyr Tyr Val Leu Glu

500 505 510

Thr Ile Val Thr Arg Phe Pro His Val Leu Phe Glu Ser Cys Ser Gly

515 520 525

Gly Gly Gly Arg Phe Asp Pro Gly Met Leu Tyr Tyr Met Pro Gln Val

530 535 540

Trp Thr Ser Asp Asn Thr Asp Ala Ile Ser Arg Leu Lys Ile Gln Tyr

545 550 555 560

Gly Thr Ser Leu Val Tyr Pro Ile Ser Ser Met Gly Ser His Val Ser

565 570 575

Ala Val Pro Asn His Gln Val Gly Arg Val Thr Pro Leu Asp Ile Arg

580 585 590

Gly His Ala Ala Met Ser Gly Asn Leu Gly Tyr Glu Leu Asp Leu Thr

595 600 605

Lys Leu Ser Asp Gln Glu Lys Glu Glu Val Lys Leu Gln Ile Ala Gln

610 615 620

Tyr Lys Glu Ile Arg Gln Leu Val Gln Phe Gly Ser Phe Tyr Arg Leu

625 630 635 640

Leu Ser Pro Phe Glu Gly Asn Glu Thr Ala Trp Val Phe Val Ser Ser

645 650 655

Asp Gln Lys Glu Cys Leu Phe Gly Tyr Phe Arg Val Leu Ser Gln Pro

660 665 670

Asn Ala Pro Thr Lys Ile Ile Lys Leu Lys Gly Leu Asn Leu Gly Glu

675 680 685

Arg Tyr Lys Lys Thr Gly Ser Asp Glu Ser Phe Phe Gly Asp Glu Leu

690 695 700

Met Tyr Leu Gly Ile Asn Ile Pro Glu Leu Lys Gly Asp Phe Gln Ser

705 710 715 720

Val Phe Trp His Phe Glu Ala Glu

725

<210> 3

<211> 734

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有His-标签的成熟序列

<220>

<221> 成熟多肽

<222> (1)..(734)

<400> 3

Met Gly Ile Ser Tyr Asp Ser Glu Asn Arg Ile Phe His Leu Gln Gly

1 5 10 15

Lys Gly Thr Ser Tyr Leu Met Gln Val Leu Lys Asp Gly Tyr Leu Ala

20 25 30

His Leu Tyr Trp Gly Arg Gly Val Arg Gln Tyr Ser Gly Gly Ile Pro

35 40 45

Ile Thr Phe Phe Asp Arg Gly Phe Ser Pro Asn Pro Asp Pro Ser Asp

50 55 60

Arg Thr Phe Ser Leu Asp Thr Leu Pro Gln Glu Tyr Pro Ala Tyr Gly

65 70 75 80

Asn Thr Asp Phe Arg Thr Pro Ala Tyr Gln Val Gln Leu Glu Asn Gly

85 90 95

Ser Thr Ile Ser Asp Leu Arg Tyr Lys Gly His Ala Ile Tyr Lys Gly

100 105 110

Lys Pro Lys Leu Glu Gly Leu Pro Ala Val Tyr Val Glu Asp Asp Arg

115 120 125

Glu Ala Glu Thr Leu Glu Ile Thr Leu Glu Asp Ser Leu Ile Gly Leu

130 135 140

Glu Met Val Leu Val Tyr Thr Val Phe Glu Asn Phe Ser Ala Ile Thr

145 150 155 160

Arg Ser Val Arg Phe Glu Asn Lys Gly Thr Gln Asp Leu Lys Ile Leu

165 170 175

Arg Ala Leu Ser Ala Asn Ile Asp Phe Arg Asp Asp Asp Phe Glu Leu

180 185 190

Ile Thr Leu Tyr Gly Ser His Ile Asn Glu Arg Asn Ile Ala Arg Arg

195 200 205

Pro Ile Gln Pro Gly Thr Gln Ser Ile Glu Ser Arg Arg Gly Ala Ser

210 215 220

Ser His Gln Gln Asn Pro Phe Leu Ala Leu Leu Arg Pro Asn Ala Thr

225 230 235 240

Glu Asp Gln Gly Asp Val Tyr Gly Leu Asn Leu Val Tyr Ser Gly Asn

245 250 255

Phe Leu Gly Gln Val Glu Val Asn Gln Phe Gln Thr Thr Arg Val Ser

260 265 270

Ile Gly Ile Asn Pro Phe Asp Phe Ser Trp Leu Leu Gln Pro Gly Glu

275 280 285

Asn Phe Gln Ala Pro Glu Ala Val Met Val Tyr Ser Ser Glu Gly Leu

290 295 300

Ala Gly Met Ser Gln Thr Tyr His Glu Leu Tyr Arg Thr Arg Leu Ser

305 310 315 320

Arg Gly Glu His Arg Asp Lys Val Arg Pro Ile Leu Ile Asn Asn Trp

325 330 335

Glu Ala Thr Tyr Phe Asp Phe Asn Ala Asp Lys Ile Val Glu Ile Ala

340 345 350

Gln Val Gly Lys Glu Leu Gly Met Glu Leu Met Val Leu Asp Asp Gly

355 360 365

Trp Phe Gly Lys Arg Asp Asp Asp Phe Thr Ser Leu Gly Asp Trp Val

370 375 380

Val Asp Lys Arg Lys Leu Pro His Gly Leu Thr Asp Leu Ala Glu Arg

385 390 395 400

Val Arg Ser Leu Gly Met Glu Phe Gly Leu Trp Phe Glu Pro Glu Met

405 410 415

Val Ser Met Glu Ser Asp Leu Tyr Lys Arg His Pro Asp Trp Cys Leu

420 425 430

His Val Pro Asn Arg Pro Lys Ser Glu Gly Arg Asn Gln Leu Ile Leu

435 440 445

Asp Leu Ser Arg Gln Glu Val Cys Asp Tyr Val Ile Glu Ser Val Ser

450 455 460

Ser Ile Leu Ser Thr Val Pro Ile Ser Tyr Val Lys Trp Asp Met Asn

465 470 475 480

Arg His Met Thr Glu Ile Gly Ser Ala Asp Leu Leu Pro Glu Arg Gln

485 490 495

Arg Glu Thr Ala His Arg Tyr Met Leu Gly Leu Tyr Tyr Val Leu Glu

500 505 510

Thr Ile Val Thr Arg Phe Pro His Val Leu Phe Glu Ser Cys Ser Gly

515 520 525

Gly Gly Gly Arg Phe Asp Pro Gly Met Leu Tyr Tyr Met Pro Gln Val

530 535 540

Trp Thr Ser Asp Asn Thr Asp Ala Ile Ser Arg Leu Lys Ile Gln Tyr

545 550 555 560

Gly Thr Ser Leu Val Tyr Pro Ile Ser Ser Met Gly Ser His Val Ser

565 570 575

Ala Val Pro Asn His Gln Val Gly Arg Val Thr Pro Leu Asp Ile Arg

580 585 590

Gly His Ala Ala Met Ser Gly Asn Leu Gly Tyr Glu Leu Asp Leu Thr

595 600 605

Lys Leu Ser Asp Gln Glu Lys Glu Glu Val Lys Leu Gln Ile Ala Gln

610 615 620

Tyr Lys Glu Ile Arg Gln Leu Val Gln Phe Gly Ser Phe Tyr Arg Leu

625 630 635 640

Leu Ser Pro Phe Glu Gly Asn Glu Thr Ala Trp Val Phe Val Ser Ser

645 650 655

Asp Gln Lys Glu Cys Leu Phe Gly Tyr Phe Arg Val Leu Ser Gln Pro

660 665 670

Asn Ala Pro Thr Lys Ile Ile Lys Leu Lys Gly Leu Asn Leu Gly Glu

675 680 685

Arg Tyr Lys Lys Thr Gly Ser Asp Glu Ser Phe Phe Gly Asp Glu Leu

690 695 700

Met Tyr Leu Gly Ile Asn Ile Pro Glu Leu Lys Gly Asp Phe Gln Ser

705 710 715 720

Val Phe Trp His Phe Glu Ala Glu His His His His His His

725 730

<210> 4

<211> 2196

<212> DNA

<213> 嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(2193)

<220>

<221> 成熟多肽

<222> (1)..(2193)

<400> 4

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Met Ala Ile Gln Phe Asn Ser Thr Lys Arg Ile Phe His Leu Lys Ala

1 5 10 15

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Lys Asp Thr Ser Tyr Val Met Glu Ile Val Arg Asp Gly Phe Leu Leu

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

aat act gat ttt cgg aaa cct gca tac cag gtt caa tta gag aat ggg 288

Asn Thr Asp Phe Arg Lys Pro Ala Tyr Gln Val Gln Leu Glu Asn Gly

85 90 95

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Ser Thr Ile Thr Asp Leu Arg Tyr Glu Ser His Glu Ile Phe Lys Gly

100 105 110

aaa att ccg ttg gaa ggg ctt cct gct acc tat gtt gaa gac gaa aat 384

Lys Ile Pro Leu Glu Gly Leu Pro Ala Thr Tyr Val Glu Asp Glu Asn

115 120 125

gaa gct gaa aca cta gaa atc acg atg agg gat tcc tta aca ggt tta 432

Glu Ala Glu Thr Leu Glu Ile Thr Met Arg Asp Ser Leu Thr Gly Leu

130 135 140

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Lys Val Ile Leu Ser Tyr Thr Val Phe Glu His Phe Asn Val Ile Thr

145 150 155 160

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Arg Ser Ala Arg Phe Val Asn Glu Gly Thr Glu Gly Leu Thr Leu Leu

165 170 175

agt gct tta agt tta tcc gtt gat ttc aga gat gcg gat ttt gac ttc 576

Ser Ala Leu Ser Leu Ser Val Asp Phe Arg Asp Ala Asp Phe Asp Phe

180 185 190

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Leu His Leu His Gly Ala His Val Lys Glu Arg His Ile Glu Arg Gln

195 200 205

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210 215 220

agt cat cag cat aat cct ttt att gcc ttg tta aga aaa gaa aca aat 720

Ser His Gln His Asn Pro Phe Ile Ala Leu Leu Arg Lys Glu Thr Asn

225 230 235 240

gaa gat gtc ggg gaa gtc ttt gct ttt aac ttt gta tat agt ggc aat 768

Glu Asp Val Gly Glu Val Phe Ala Phe Asn Phe Val Tyr Ser Gly Asn

245 250 255

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Phe Leu Ala Gln Ala Glu Val Asp Gln Phe Asn Asn Thr Arg Val Thr

260 265 270

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Leu Gly Ile Asn Pro Phe Asp Phe Ser Trp Lys Leu Gln Pro Gly Glu

275 280 285

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Thr Phe Gln Thr Pro Glu Ala Val Met Val Tyr Ser Ser Glu Gly Leu

290 295 300

ggg gat atg tcc cgg aca ttc cat cag ata tat aag act cgg ctt gta 960

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305 310 315 320

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Arg Gly Thr Phe Arg Asp Lys Glu Arg Pro Ile Leu Val Asn Asn Trp

325 330 335

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Glu Ala Thr Tyr Phe Asp Phe Asn Ala Glu Lys Ile Glu Asp Ile Ala

340 345 350

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Lys Ala Gly Ser Glu Leu Gly Ile Glu Leu Phe Val Leu Asp Asp Gly

355 360 365

tgg ttt ggc aag cgg aac aat gat acg acc tca cta ggt gac tgg ttt 1152

Trp Phe Gly Lys Arg Asn Asn Asp Thr Thr Ser Leu Gly Asp Trp Phe

370 375 380

gta gat cgg gaa aaa ctt cca gaa gga ctt gat cag ctt gca cat cgt 1200

Val Asp Arg Glu Lys Leu Pro Glu Gly Leu Asp Gln Leu Ala His Arg

385 390 395 400

gta acg gat ttg ggt atg gaa ttt ggt ctt tgg ttt gaa ccg gaa atg 1248

Val Thr Asp Leu Gly Met Glu Phe Gly Leu Trp Phe Glu Pro Glu Met

405 410 415

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Ile Ser Val Asp Ser Asp Leu Tyr Arg Glu His Pro Asp Trp Cys Leu

420 425 430

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His Val Pro Asn Arg Asn Arg Ser Glu Ser Arg Asn Gln Leu Ile Leu

435 440 445

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Asp Phe Ser Arg Glu Asp Val Cys Ala Glu Ile Thr Lys Arg Val Ser

450 455 460

gat atc ctt tcg agt tta ccg att tcc tat gtg aaa tgg gat atg aac 1440

Asp Ile Leu Ser Ser Leu Pro Ile Ser Tyr Val Lys Trp Asp Met Asn

465 470 475 480

cgg cat atg act gaa atc ggt tct gca gcg tta ccg ccg gag cgt caa 1488

Arg His Met Thr Glu Ile Gly Ser Ala Ala Leu Pro Pro Glu Arg Gln

485 490 495

cgg gag act gcc cat cgc tat atg tta ggg cta tat aaa gta ttg gag 1536

Arg Glu Thr Ala His Arg Tyr Met Leu Gly Leu Tyr Lys Val Leu Glu

500 505 510

gaa att act tct gga ttc cct aac atc cta ttt gaa agc tgt tcc gga 1584

Glu Ile Thr Ser Gly Phe Pro Asn Ile Leu Phe Glu Ser Cys Ser Gly

515 520 525

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Gly Gly Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ile Leu Tyr Tyr Met Pro Gln Thr

530 535 540

tgg aca agt gac aac aca gat gcg gtt tcc cga ttg aaa att caa tac 1680

Trp Thr Ser Asp Asn Thr Asp Ala Val Ser Arg Leu Lys Ile Gln Tyr

545 550 555 560

gga aca agt ctt gtt tat cca att gtt tcc atg ggt gct cac gtt tct 1728

Gly Thr Ser Leu Val Tyr Pro Ile Val Ser Met Gly Ala His Val Ser

565 570 575

gct gtt cca aat cac cag gtc gac aga atc aca acg ttg acc atg cgc 1776

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645 650 655

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<212> PRT

<213> 嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌

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<213> 人工序列

<220>

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<220>

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385 390 395 400

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405 410 415

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565 570 575

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580 585 590

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His

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<220>

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<222> (1)..(2196)

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ggc aca agt atc gtt tat cca atc agc gca atg gga gca cat gtg tca 1728

Gly Thr Ser Ile Val Tyr Pro Ile Ser Ala Met Gly Ala His Val Ser

565 570 575

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Ala Val Pro Asn His Gln Val His Arg Ile Thr Ser Leu Asp Ile Arg

580 585 590

ggg cat gtg gcg atg tca gga aac ttt ggc tat gaa ctc gat tta acg 1824

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645 650 655

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Lys Leu Thr Asp Glu Glu Lys Glu Lys Val Lys Glu Gln Val Ala Phe

610 615 620

Tyr Lys Glu Ile Arg Arg Leu Val Gln Tyr Gly Asn Phe Tyr Arg Ile

625 630 635 640

Leu Ser Pro Phe Glu Gly Asn Glu Thr Ala Trp Met Phe Val Ser Glu

645 650 655

Asp Gln Ser Glu Ala Phe Val Ala Tyr Phe Arg Val Leu Ala Glu Ala

660 665 670

Asn Ala Pro Ile Ser Ser Ile Arg Leu Lys Gly Leu Asn Pro Arg Lys

675 680 685

Gln Tyr Tyr Leu Val Gly Lys Gly Glu Val Tyr Gly Gly Asp Glu Leu

690 695 700

Met Tyr Val Gly Ile Asn Ile Pro Tyr Ile Leu Gly Asp Phe Met Ser

705 710 715 720

Phe Thr Trp Val Leu Lys Glu Trp Glu Lys Asp Phe

725 730

<210> 9

<211> 738

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有His-标签的成熟序列

<220>

<221> 成熟多肽

<222> (1)..(738)

<400> 9

Met Ala Ile Met Phe Asp Ser Ile Asn Gln Thr Phe His Leu Gln Ala

1 5 10 15

Lys Asp Thr Ser Tyr Val Met Gln Ile Phe Arg Asp Gly Tyr Leu Ala

20 25 30

His Leu Tyr Phe Gly Lys Lys Val Arg Asn Tyr His His Ser Asn Lys

35 40 45

Leu Gln Phe Leu Asp Arg Gly Phe Ser Pro Asn Pro Asp Pro Ser Asp

50 55 60

Arg Thr Phe Ser Leu Asp Thr Leu Pro Gln Glu Tyr Pro Ala Tyr Gly

65 70 75 80

Asn Thr Asp Phe Arg Thr Pro Ala Tyr Gln Ile Gln Leu Glu Asn Gly

85 90 95

Ser Thr Val Ser Asp Leu Arg Tyr Lys Thr His Lys Ile Tyr Lys Gly

100 105 110

Lys Pro Lys Leu Asn Gly Leu Pro Ala Thr Tyr Val Glu Thr Glu Asp

115 120 125

Glu Ala Glu Thr Leu Glu Ile Glu Leu Glu Asp Asn Ile Thr Lys Leu

130 135 140

Lys Val Ile Leu Ser Tyr Thr Val Phe Glu His Phe Asn Ala Ile Thr

145 150 155 160

Arg Phe Val Arg Phe Glu Asn Gln Gly Ser Glu Asn Ile Lys Ile Leu

165 170 175

Arg Ala Leu Ser Met Asn Ile Asp Phe Arg Asp Ala Asn Phe Asp Phe

180 185 190

Leu His Leu Ser Gly Ala His Cys Arg Glu Arg Tyr Val Glu Arg Lys

195 200 205

Pro Leu Phe Val Gly Thr Gln Ser Ile Glu Ser Arg Arg Gly Ala Ser

210 215 220

Ser His Gln Gln Asn Pro Phe Ile Ala Leu Leu Arg Lys Asn Ala Asn

225 230 235 240

Glu Asp Glu Gly Glu Val Phe Gly Phe Ser Leu Val Tyr Ser Gly Asn

245 250 255

Phe Leu Ala Gln Val Glu Val Asp Gln Phe His Thr Ala Arg Val Ser

260 265 270

Leu Gly Ile Asn Pro Phe Asp Phe Thr Trp Leu Leu Glu Pro Gly Glu

275 280 285

Ser Phe Gln Thr Pro Glu Val Val Met Val Tyr Ser Asp Gln Gly Leu

290 295 300

Asn Gly Met Ser Gln Thr Phe His Arg Leu Tyr Arg Thr Arg Leu Ala

305 310 315 320

Arg Gly Pro Phe Arg Asp Lys Glu Arg Pro Ile Leu Ile Asn Asn Trp

325 330 335

Glu Ala Thr Tyr Phe Asp Phe Asn Glu Glu Lys Ile Leu Glu Ile Val

340 345 350

Lys Ala Gly Lys Glu Leu Gly Ile Glu Leu Phe Val Leu Asp Asp Gly

355 360 365

Trp Phe Gly Lys Arg Asp Asp Asp Lys Ser Ser Leu Gly Asp Trp Phe

370 375 380

Val Asp Lys Arg Lys Leu Ser Asn Gly Leu Val Gly Leu Ala Thr Lys

385 390 395 400

Ile Arg Glu Met Gly Met Gln Phe Gly Leu Trp Val Glu Pro Glu Met

405 410 415

Ile Ser Ile Asp Ser Asp Leu Tyr Arg Lys His Pro Asp Trp Cys Leu

420 425 430

His Val Pro Lys Arg Pro Arg Ser Glu Gly Arg Asn Gln Leu Ile Leu

435 440 445

Asp Tyr Ser Arg Lys Glu Val Cys Asp Tyr Ile Ile Lys Val Met Ser

450 455 460

Asp Ile Leu Ser Ser Ala Pro Ile Ser Tyr Val Lys Trp Asp Met Asn

465 470 475 480

Arg His Met Thr Glu Ile Gly Ser Ala Ser Leu Pro Pro Glu Arg Gln

485 490 495

Arg Glu Thr Ala His Arg Tyr Met Leu Gly Leu Tyr Arg Val Met Glu

500 505 510

Glu Ile Thr Ser Lys Phe Pro His Val Leu Phe Glu Ser Cys Ser Gly

515 520 525

Gly Gly Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ile Leu Tyr Tyr Met Pro Gln Thr

530 535 540

Trp Thr Ser Asp Asn Thr Asp Ala Ile Ser Arg Leu Lys Ile Gln Tyr

545 550 555 560

Gly Thr Ser Ile Val Tyr Pro Ile Ser Ala Met Gly Ala His Val Ser

565 570 575

Ala Val Pro Asn His Gln Val His Arg Ile Thr Ser Leu Asp Ile Arg

580 585 590

Gly His Val Ala Met Ser Gly Asn Phe Gly Tyr Glu Leu Asp Leu Thr

595 600 605

Lys Leu Thr Asp Glu Glu Lys Glu Lys Val Lys Glu Gln Val Ala Phe

610 615 620

Tyr Lys Glu Ile Arg Arg Leu Val Gln Tyr Gly Asn Phe Tyr Arg Ile

625 630 635 640

Leu Ser Pro Phe Glu Gly Asn Glu Thr Ala Trp Met Phe Val Ser Glu

645 650 655

Asp Gln Ser Glu Ala Phe Val Ala Tyr Phe Arg Val Leu Ala Glu Ala

660 665 670

Asn Ala Pro Ile Ser Ser Ile Arg Leu Lys Gly Leu Asn Pro Arg Lys

675 680 685

Gln Tyr Tyr Leu Val Gly Lys Gly Glu Val Tyr Gly Gly Asp Glu Leu

690 695 700

Met Tyr Val Gly Ile Asn Ile Pro Tyr Ile Leu Gly Asp Phe Met Ser

705 710 715 720

Phe Thr Trp Val Leu Lys Glu Trp Glu Lys Asp Phe His His His His

725 730 735

His His

<210> 10

<211> 2326

<212> DNA

<213> 聚多曲霉

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(85)

<220>

<221> 信号肽

<222> (1)..(69)

<220>

<221> 成熟多肽

<222> (70)..(2364)

<220>

<221> CDS

<222> (131)..(734)

<220>

<221> CDS

<222> (787)..(2323)

<400> 10

atg gtt gcg ttt tct cct gtg gcc ctg ggc ctt ttg gcg ctt gcc agc 48

Met Val Ala Phe Ser Pro Val Ala Leu Gly Leu Leu Ala Leu Ala Ser

-20 -15 -10

cac tcc aca atg gct tct gcg cag tcg gat tca gct g gttcgtattc 95

His Ser Thr Met Ala Ser Ala Gln Ser Asp Ser Ala

-5 -1 1 5

ctgaatgcct cgaggaaacg agactaattc tgtag tt gtc gcc gat ggc act 147

Val Val Ala Asp Gly Thr

10

acc ttc gcg ctg aat ggt gac aat gta tcc tac cga ttc cac gtc aac 195

Thr Phe Ala Leu Asn Gly Asp Asn Val Ser Tyr Arg Phe His Val Asn

15 20 25

gag acc acc ggt gat ctt gta tcc gac cac ttt ggc ggc cgt gtc ggc 243

Glu Thr Thr Gly Asp Leu Val Ser Asp His Phe Gly Gly Arg Val Gly

30 35 40

ggc gat atc ccc tcg ccc aag gaa cca gtc gtc aac ggc tgg gtc ggc 291

Gly Asp Ile Pro Ser Pro Lys Glu Pro Val Val Asn Gly Trp Val Gly

45 50 55

atg cct ggt cga atc cgg cgc gag ttc ccc gac cag ggc cgt ggc gac 339

Met Pro Gly Arg Ile Arg Arg Glu Phe Pro Asp Gln Gly Arg Gly Asp

60 65 70 75

ttc cgc att cct gct gtt cgc att cgg cag tcg gct ggg tat act gtg 387

Phe Arg Ile Pro Ala Val Arg Ile Arg Gln Ser Ala Gly Tyr Thr Val

80 85 90

agc gat ctg cag tat aaa tcg cac gag gtg gtt gag ggc aag agc ggg 435

Ser Asp Leu Gln Tyr Lys Ser His Glu Val Val Glu Gly Lys Ser Gly

95 100 105

ctg cct gga ctg ccg gcg acc ttt ggg gac gca gag gat gtg acg acg 483

Leu Pro Gly Leu Pro Ala Thr Phe Gly Asp Ala Glu Asp Val Thr Thr

110 115 120

cta gtt gtg cat ctt tat gac aat tat agc tct gtt gct gcg gat ttg 531

Leu Val Val His Leu Tyr Asp Asn Tyr Ser Ser Val Ala Ala Asp Leu

125 130 135

tcg tac tcg atc ttt ccc aag tat gat gct gtg gtg agg agc gtc aat 579

Ser Tyr Ser Ile Phe Pro Lys Tyr Asp Ala Val Val Arg Ser Val Asn

140 145 150 155

gtt acg aac aag ggc gag ggc aat atc act atc gag tcg ctg gcc agt 627

Val Thr Asn Lys Gly Glu Gly Asn Ile Thr Ile Glu Ser Leu Ala Ser

160 165 170

ctg agc gtc gac ttt aac tat gag gat ctg gag atg atc agc cta cga 675

Leu Ser Val Asp Phe Asn Tyr Glu Asp Leu Glu Met Ile Ser Leu Arg

175 180 185

ggc gac tgg gcc aga gaa gcg aat gtc cag agg agc aag atc gac tat 723

Gly Asp Trp Ala Arg Glu Ala Asn Val Gln Arg Ser Lys Ile Asp Tyr

190 195 200

ggc gtg cat gg gtatgttgcc gcaagattta tatcagacgg gctatactga 774

Gly Val His Gly

205

ctgacagcac ag a ttc gga agc aac act ggc tac tcg tct cac ctg cac 823

Phe Gly Ser Asn Thr Gly Tyr Ser Ser His Leu His

210 215

aat ccc ttc ctc gca ata gtc gag cca tcg act acg gaa tcc caa ggc 871

Asn Pro Phe Leu Ala Ile Val Glu Pro Ser Thr Thr Glu Ser Gln Gly

220 225 230 235

gag gca tgg ggc ttc aac ctc atc tac acc ggc tcc ttc tcc gct gaa 919

Glu Ala Trp Gly Phe Asn Leu Ile Tyr Thr Gly Ser Phe Ser Ala Glu

240 245 250

gtc gaa aaa gga tcc caa ggt ctg acc cga gcc ctc ctc ggc ttc aac 967

Val Glu Lys Gly Ser Gln Gly Leu Thr Arg Ala Leu Leu Gly Phe Asn

255 260 265

cct gac cgt cta tca tgg acc ctt ggc cct gac gag acc ctc acc acc 1015

Pro Asp Arg Leu Ser Trp Thr Leu Gly Pro Asp Glu Thr Leu Thr Thr

270 275 280

cct gaa tgc gtt gca gtc tac tca aag aac ggt atc gga ggc atg tct 1063

Pro Glu Cys Val Ala Val Tyr Ser Lys Asn Gly Ile Gly Gly Met Ser

285 290 295

cgc aag ttc cac cgg ctc tac cgc aac cac ttg atc aag agc aag ttc 1111

Arg Lys Phe His Arg Leu Tyr Arg Asn His Leu Ile Lys Ser Lys Phe

300 305 310 315

gca aca tca gac cgc ccc gtc ctc ctc aac agc tgg gag ggc gtc tac 1159

Ala Thr Ser Asp Arg Pro Val Leu Leu Asn Ser Trp Glu Gly Val Tyr

320 325 330

ttc gac ttc aac cag agc atc atc gag act ctt gcc gag caa tcc gcc 1207

Phe Asp Phe Asn Gln Ser Ile Ile Glu Thr Leu Ala Glu Gln Ser Ala

335 340 345

gct cta gga atc cac ctg ttc gtc atg gat gac ggc tgg ttc ggt gac 1255

Ala Leu Gly Ile His Leu Phe Val Met Asp Asp Gly Trp Phe Gly Asp

350 355 360

aag tac ccc aga act tca gac aac gcg ggc ctg ggc gac tgg aca ccc 1303

Lys Tyr Pro Arg Thr Ser Asp Asn Ala Gly Leu Gly Asp Trp Thr Pro

365 370 375

aac cca gat cgc ttc cca gac ggt ctc tcc ccg gtc gta gaa gac atc 1351

Asn Pro Asp Arg Phe Pro Asp Gly Leu Ser Pro Val Val Glu Asp Ile

380 385 390 395

aca agc atg tcc gtc aat gga aca caa gat aca aag ctc cgc ttc gga 1399

Thr Ser Met Ser Val Asn Gly Thr Gln Asp Thr Lys Leu Arg Phe Gly

400 405 410

atc tgg gtc gag ccc gag atg gtc aat ccc aac tcc agc ctg tac cgt 1447

Ile Trp Val Glu Pro Glu Met Val Asn Pro Asn Ser Ser Leu Tyr Arg

415 420 425

gaa cat ccg gac tgg gtc ctc cac gca ggg ccc tac cca cgc aca gaa 1495

Glu His Pro Asp Trp Val Leu His Ala Gly Pro Tyr Pro Arg Thr Glu

430 435 440

cga cgc aac caa ctt gtc ttg aac gtc gcc ttg cca gag gtc cag gac 1543

Arg Arg Asn Gln Leu Val Leu Asn Val Ala Leu Pro Glu Val Gln Asp

445 450 455

ttc atc atc gac ttc atg aca aac ctg ctg aat ggt tcc gac att tcc 1591

Phe Ile Ile Asp Phe Met Thr Asn Leu Leu Asn Gly Ser Asp Ile Ser

460 465 470 475

tac ata aaa tgg gac aat aac cgc gga atg cac gag aca cca tcc ccg 1639

Tyr Ile Lys Trp Asp Asn Asn Arg Gly Met His Glu Thr Pro Ser Pro

480 485 490

agc aac gac cac aag tac atg ctc ggc ctc tac cgc gtc ttc gac aca 1687

Ser Asn Asp His Lys Tyr Met Leu Gly Leu Tyr Arg Val Phe Asp Thr

495 500 505

ttg acc acc cgt ttc gcc gac gtc ctc tgg gaa gga tgc gcc tca ggc 1735

Leu Thr Thr Arg Phe Ala Asp Val Leu Trp Glu Gly Cys Ala Ser Gly

510 515 520

ggt ggg cgc ttc gat gcc ggc gtc ctg cag tac ttc ccc cag atc tgg 1783

Gly Gly Arg Phe Asp Ala Gly Val Leu Gln Tyr Phe Pro Gln Ile Trp

525 530 535

acc tcc gat aac acc gac ggg gtc gac aga gtc acc atc caa ttc ggg 1831

Thr Ser Asp Asn Thr Asp Gly Val Asp Arg Val Thr Ile Gln Phe Gly

540 545 550 555

acc tcc ctt gca tac cct ccc tcg gcg atg ggg gcg cat ctc tcg gcc 1879

Thr Ser Leu Ala Tyr Pro Pro Ser Ala Met Gly Ala His Leu Ser Ala

560 565 570

gta cca aac cac caa aca ggc cgg acc gtg ccg atg gaa ttc cgc gcg 1927

Val Pro Asn His Gln Thr Gly Arg Thr Val Pro Met Glu Phe Arg Ala

575 580 585

cac gtc gca atg atg ggc ggg tca ttc ggg ctg gaa ctc gac ccg gcc 1975

His Val Ala Met Met Gly Gly Ser Phe Gly Leu Glu Leu Asp Pro Ala

590 595 600

acg atc cag aat aac acc gcc gtg ccg gaa ctg ttg aag ctg gcg gag 2023

Thr Ile Gln Asn Asn Thr Ala Val Pro Glu Leu Leu Lys Leu Ala Glu

605 610 615

aag att aac ccg att atc ctg act ggg gat ctg tat cgg ttg agg gca 2071

Lys Ile Asn Pro Ile Ile Leu Thr Gly Asp Leu Tyr Arg Leu Arg Ala

620 625 630 635

ccc gag gac tcg cag tgg ccg gct gcg ttg ttt gtg gcg gag gat ggg 2119

Pro Glu Asp Ser Gln Trp Pro Ala Ala Leu Phe Val Ala Glu Asp Gly

640 645 650

tcc cag gct gtg ctg ttt tat ttc cag ctt agt ccg aat gtc aac cat 2167

Ser Gln Ala Val Leu Phe Tyr Phe Gln Leu Ser Pro Asn Val Asn His

655 660 665

gcg gcg ccg tgg gtg aag ctt cag ggg ttg gat gag acg gcg caa tat 2215

Ala Ala Pro Trp Val Lys Leu Gln Gly Leu Asp Glu Thr Ala Gln Tyr

670 675 680

aag gtc gag gga gag ggg aca ttc tct ggc gcg acg ctg atg aat atg 2263

Lys Val Glu Gly Glu Gly Thr Phe Ser Gly Ala Thr Leu Met Asn Met

685 690 695

ggg ctg cag tat acg ttt gat acg gag tat ggc agt aag gtg gtg gtt 2311

Gly Leu Gln Tyr Thr Phe Asp Thr Glu Tyr Gly Ser Lys Val Val Val

700 705 710 715

att gag agg cag tag 2326

Ile Glu Arg Gln

<210> 11

<211> 742

<212> PRT

<213> 聚多曲霉

<400> 11

Met Val Ala Phe Ser Pro Val Ala Leu Gly Leu Leu Ala Leu Ala Ser

-20 -15 -10

His Ser Thr Met Ala Ser Ala Gln Ser Asp Ser Ala Val Val Ala Asp

-5 -1 1 5

Gly Thr Thr Phe Ala Leu Asn Gly Asp Asn Val Ser Tyr Arg Phe His

10 15 20 25

Val Asn Glu Thr Thr Gly Asp Leu Val Ser Asp His Phe Gly Gly Arg

30 35 40

Val Gly Gly Asp Ile Pro Ser Pro Lys Glu Pro Val Val Asn Gly Trp

45 50 55

Val Gly Met Pro Gly Arg Ile Arg Arg Glu Phe Pro Asp Gln Gly Arg

60 65 70

Gly Asp Phe Arg Ile Pro Ala Val Arg Ile Arg Gln Ser Ala Gly Tyr

75 80 85

Thr Val Ser Asp Leu Gln Tyr Lys Ser His Glu Val Val Glu Gly Lys

90 95 100 105

Ser Gly Leu Pro Gly Leu Pro Ala Thr Phe Gly Asp Ala Glu Asp Val

110 115 120

Thr Thr Leu Val Val His Leu Tyr Asp Asn Tyr Ser Ser Val Ala Ala

125 130 135

Asp Leu Ser Tyr Ser Ile Phe Pro Lys Tyr Asp Ala Val Val Arg Ser

140 145 150

Val Asn Val Thr Asn Lys Gly Glu Gly Asn Ile Thr Ile Glu Ser Leu

155 160 165

Ala Ser Leu Ser Val Asp Phe Asn Tyr Glu Asp Leu Glu Met Ile Ser

170 175 180 185

Leu Arg Gly Asp Trp Ala Arg Glu Ala Asn Val Gln Arg Ser Lys Ile

190 195 200

Asp Tyr Gly Val His Gly Phe Gly Ser Asn Thr Gly Tyr Ser Ser His

205 210 215

Leu His Asn Pro Phe Leu Ala Ile Val Glu Pro Ser Thr Thr Glu Ser

220 225 230

Gln Gly Glu Ala Trp Gly Phe Asn Leu Ile Tyr Thr Gly Ser Phe Ser

235 240 245

Ala Glu Val Glu Lys Gly Ser Gln Gly Leu Thr Arg Ala Leu Leu Gly

250 255 260 265

Phe Asn Pro Asp Arg Leu Ser Trp Thr Leu Gly Pro Asp Glu Thr Leu

270 275 280

Thr Thr Pro Glu Cys Val Ala Val Tyr Ser Lys Asn Gly Ile Gly Gly

285 290 295

Met Ser Arg Lys Phe His Arg Leu Tyr Arg Asn His Leu Ile Lys Ser

300 305 310

Lys Phe Ala Thr Ser Asp Arg Pro Val Leu Leu Asn Ser Trp Glu Gly

315 320 325

Val Tyr Phe Asp Phe Asn Gln Ser Ile Ile Glu Thr Leu Ala Glu Gln

330 335 340 345

Ser Ala Ala Leu Gly Ile His Leu Phe Val Met Asp Asp Gly Trp Phe

350 355 360

Gly Asp Lys Tyr Pro Arg Thr Ser Asp Asn Ala Gly Leu Gly Asp Trp

365 370 375

Thr Pro Asn Pro Asp Arg Phe Pro Asp Gly Leu Ser Pro Val Val Glu

380 385 390

Asp Ile Thr Ser Met Ser Val Asn Gly Thr Gln Asp Thr Lys Leu Arg

395 400 405

Phe Gly Ile Trp Val Glu Pro Glu Met Val Asn Pro Asn Ser Ser Leu

410 415 420 425

Tyr Arg Glu His Pro Asp Trp Val Leu His Ala Gly Pro Tyr Pro Arg

430 435 440

Thr Glu Arg Arg Asn Gln Leu Val Leu Asn Val Ala Leu Pro Glu Val

445 450 455

Gln Asp Phe Ile Ile Asp Phe Met Thr Asn Leu Leu Asn Gly Ser Asp

460 465 470

Ile Ser Tyr Ile Lys Trp Asp Asn Asn Arg Gly Met His Glu Thr Pro

475 480 485

Ser Pro Ser Asn Asp His Lys Tyr Met Leu Gly Leu Tyr Arg Val Phe

490 495 500 505

Asp Thr Leu Thr Thr Arg Phe Ala Asp Val Leu Trp Glu Gly Cys Ala

510 515 520

Ser Gly Gly Gly Arg Phe Asp Ala Gly Val Leu Gln Tyr Phe Pro Gln

525 530 535

Ile Trp Thr Ser Asp Asn Thr Asp Gly Val Asp Arg Val Thr Ile Gln

540 545 550

Phe Gly Thr Ser Leu Ala Tyr Pro Pro Ser Ala Met Gly Ala His Leu

555 560 565

Ser Ala Val Pro Asn His Gln Thr Gly Arg Thr Val Pro Met Glu Phe

570 575 580 585

Arg Ala His Val Ala Met Met Gly Gly Ser Phe Gly Leu Glu Leu Asp

590 595 600

Pro Ala Thr Ile Gln Asn Asn Thr Ala Val Pro Glu Leu Leu Lys Leu

605 610 615

Ala Glu Lys Ile Asn Pro Ile Ile Leu Thr Gly Asp Leu Tyr Arg Leu

620 625 630

Arg Ala Pro Glu Asp Ser Gln Trp Pro Ala Ala Leu Phe Val Ala Glu

635 640 645

Asp Gly Ser Gln Ala Val Leu Phe Tyr Phe Gln Leu Ser Pro Asn Val

650 655 660 665

Asn His Ala Ala Pro Trp Val Lys Leu Gln Gly Leu Asp Glu Thr Ala

670 675 680

Gln Tyr Lys Val Glu Gly Glu Gly Thr Phe Ser Gly Ala Thr Leu Met

685 690 695

Asn Met Gly Leu Gln Tyr Thr Phe Asp Thr Glu Tyr Gly Ser Lys Val

700 705 710

Val Val Ile Glu Arg Gln

715

<210> 12

<211> 719

<212> PRT

<213> 聚多曲霉

<220>

<221> 成熟多肽

<222> (1)..(719)

<400> 12

Gln Ser Asp Ser Ala Val Val Ala Asp Gly Thr Thr Phe Ala Leu Asn

1 5 10 15

Gly Asp Asn Val Ser Tyr Arg Phe His Val Asn Glu Thr Thr Gly Asp

20 25 30

Leu Val Ser Asp His Phe Gly Gly Arg Val Gly Gly Asp Ile Pro Ser

35 40 45

Pro Lys Glu Pro Val Val Asn Gly Trp Val Gly Met Pro Gly Arg Ile

50 55 60

Arg Arg Glu Phe Pro Asp Gln Gly Arg Gly Asp Phe Arg Ile Pro Ala

65 70 75 80

Val Arg Ile Arg Gln Ser Ala Gly Tyr Thr Val Ser Asp Leu Gln Tyr

85 90 95

Lys Ser His Glu Val Val Glu Gly Lys Ser Gly Leu Pro Gly Leu Pro

100 105 110

Ala Thr Phe Gly Asp Ala Glu Asp Val Thr Thr Leu Val Val His Leu

115 120 125

Tyr Asp Asn Tyr Ser Ser Val Ala Ala Asp Leu Ser Tyr Ser Ile Phe

130 135 140

Pro Lys Tyr Asp Ala Val Val Arg Ser Val Asn Val Thr Asn Lys Gly

145 150 155 160

Glu Gly Asn Ile Thr Ile Glu Ser Leu Ala Ser Leu Ser Val Asp Phe

165 170 175

Asn Tyr Glu Asp Leu Glu Met Ile Ser Leu Arg Gly Asp Trp Ala Arg

180 185 190

Glu Ala Asn Val Gln Arg Ser Lys Ile Asp Tyr Gly Val His Gly Phe

195 200 205

Gly Ser Asn Thr Gly Tyr Ser Ser His Leu His Asn Pro Phe Leu Ala

210 215 220

Ile Val Glu Pro Ser Thr Thr Glu Ser Gln Gly Glu Ala Trp Gly Phe

225 230 235 240

Asn Leu Ile Tyr Thr Gly Ser Phe Ser Ala Glu Val Glu Lys Gly Ser

245 250 255

Gln Gly Leu Thr Arg Ala Leu Leu Gly Phe Asn Pro Asp Arg Leu Ser

260 265 270

Trp Thr Leu Gly Pro Asp Glu Thr Leu Thr Thr Pro Glu Cys Val Ala

275 280 285

Val Tyr Ser Lys Asn Gly Ile Gly Gly Met Ser Arg Lys Phe His Arg

290 295 300

Leu Tyr Arg Asn His Leu Ile Lys Ser Lys Phe Ala Thr Ser Asp Arg

305 310 315 320

Pro Val Leu Leu Asn Ser Trp Glu Gly Val Tyr Phe Asp Phe Asn Gln

325 330 335

Ser Ile Ile Glu Thr Leu Ala Glu Gln Ser Ala Ala Leu Gly Ile His

340 345 350

Leu Phe Val Met Asp Asp Gly Trp Phe Gly Asp Lys Tyr Pro Arg Thr

355 360 365

Ser Asp Asn Ala Gly Leu Gly Asp Trp Thr Pro Asn Pro Asp Arg Phe

370 375 380

Pro Asp Gly Leu Ser Pro Val Val Glu Asp Ile Thr Ser Met Ser Val

385 390 395 400

Asn Gly Thr Gln Asp Thr Lys Leu Arg Phe Gly Ile Trp Val Glu Pro

405 410 415

Glu Met Val Asn Pro Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Glu His Pro Asp Trp

420 425 430

Val Leu His Ala Gly Pro Tyr Pro Arg Thr Glu Arg Arg Asn Gln Leu

435 440 445

Val Leu Asn Val Ala Leu Pro Glu Val Gln Asp Phe Ile Ile Asp Phe

450 455 460

Met Thr Asn Leu Leu Asn Gly Ser Asp Ile Ser Tyr Ile Lys Trp Asp

465 470 475 480

Asn Asn Arg Gly Met His Glu Thr Pro Ser Pro Ser Asn Asp His Lys

485 490 495

Tyr Met Leu Gly Leu Tyr Arg Val Phe Asp Thr Leu Thr Thr Arg Phe

500 505 510

Ala Asp Val Leu Trp Glu Gly Cys Ala Ser Gly Gly Gly Arg Phe Asp

515 520 525

Ala Gly Val Leu Gln Tyr Phe Pro Gln Ile Trp Thr Ser Asp Asn Thr

530 535 540

Asp Gly Val Asp Arg Val Thr Ile Gln Phe Gly Thr Ser Leu Ala Tyr

545 550 555 560

Pro Pro Ser Ala Met Gly Ala His Leu Ser Ala Val Pro Asn His Gln

565 570 575

Thr Gly Arg Thr Val Pro Met Glu Phe Arg Ala His Val Ala Met Met

580 585 590

Gly Gly Ser Phe Gly Leu Glu Leu Asp Pro Ala Thr Ile Gln Asn Asn

595 600 605

Thr Ala Val Pro Glu Leu Leu Lys Leu Ala Glu Lys Ile Asn Pro Ile

610 615 620

Ile Leu Thr Gly Asp Leu Tyr Arg Leu Arg Ala Pro Glu Asp Ser Gln

625 630 635 640

Trp Pro Ala Ala Leu Phe Val Ala Glu Asp Gly Ser Gln Ala Val Leu

645 650 655

Phe Tyr Phe Gln Leu Ser Pro Asn Val Asn His Ala Ala Pro Trp Val

660 665 670

Lys Leu Gln Gly Leu Asp Glu Thr Ala Gln Tyr Lys Val Glu Gly Glu

675 680 685

Gly Thr Phe Ser Gly Ala Thr Leu Met Asn Met Gly Leu Gln Tyr Thr

690 695 700

Phe Asp Thr Glu Tyr Gly Ser Lys Val Val Val Ile Glu Arg Gln

705 710 715

<210> 13

<211> 2196

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌属物种-19140

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(2193)

<220>

<221> 成熟多肽

<222> (1)..(2193)

<400> 13

atg gga att aca tat caa gag gaa ggg caa atc ttc cat ctg caa gga 48

Met Gly Ile Thr Tyr Gln Glu Glu Gly Gln Ile Phe His Leu Gln Gly

1 5 10 15

aaa gat acg agt tac gtt atg cag gta tta aag gat ggc tat ttg acc 96

Lys Asp Thr Ser Tyr Val Met Gln Val Leu Lys Asp Gly Tyr Leu Thr

20 25 30

cat ctc tac tgg ggg aaa cgt gtg agg ggc tac aat caa agt atc cca 144

His Leu Tyr Trp Gly Lys Arg Val Arg Gly Tyr Asn Gln Ser Ile Pro

35 40 45

gtg aca ttt ttt gac cga gga ttt tcg gcc aat cca gat ccg act gat 192

Val Thr Phe Phe Asp Arg Gly Phe Ser Ala Asn Pro Asp Pro Thr Asp

50 55 60

cgg acg ttc tct ttg gat acg tta cct caa gag tac cct gct tac ggg 240

Arg Thr Phe Ser Leu Asp Thr Leu Pro Gln Glu Tyr Pro Ala Tyr Gly

65 70 75 80

aat aca gat ttc cga acc cct gcg tat caa att caa ttg gaa aat ggt 288

Asn Thr Asp Phe Arg Thr Pro Ala Tyr Gln Ile Gln Leu Glu Asn Gly

85 90 95

tct acc atc tca gat tta cgt tat agc tcg cat aaa atc tat aaa ggt 336

Ser Thr Ile Ser Asp Leu Arg Tyr Ser Ser His Lys Ile Tyr Lys Gly

100 105 110

aaa cca aaa ctt gag ggg ctt cca tca act tat gcg gaa cgc gat gaa 384

Lys Pro Lys Leu Glu Gly Leu Pro Ser Thr Tyr Ala Glu Arg Asp Glu

115 120 125

gaa gcg gag aca tta gaa atc atc ctt gaa gat gat act att ggc ttg 432

Glu Ala Glu Thr Leu Glu Ile Ile Leu Glu Asp Asp Thr Ile Gly Leu

130 135 140

aaa gta acc ctc atc tat aca gtt ttt gaa gcg tat aac gca ctt act 480

Lys Val Thr Leu Ile Tyr Thr Val Phe Glu Ala Tyr Asn Ala Leu Thr

145 150 155 160

cga tct gtt cgt ttt gaa aac agt ggt cgt acg gta att aaa ttg tta 528

Arg Ser Val Arg Phe Glu Asn Ser Gly Arg Thr Val Ile Lys Leu Leu

165 170 175

agg gcg ctt tcg ctt aat tta gat ttt cgc gac caa gat ttt gaa tta 576

Arg Ala Leu Ser Leu Asn Leu Asp Phe Arg Asp Gln Asp Phe Glu Leu

180 185 190

att act tta tat ggt tct cac aat aat gaa cgt aac ctt gct agg cgg 624

Ile Thr Leu Tyr Gly Ser His Asn Asn Glu Arg Asn Leu Ala Arg Arg

195 200 205

cca gtg gct cca gga ctt caa gca att gaa agc agg aga ggg gcg agc 672

Pro Val Ala Pro Gly Leu Gln Ala Ile Glu Ser Arg Arg Gly Ala Ser

210 215 220

agt cac caa caa aat cct ttt cta gct ttg gtg aga cca act tca acg 720

Ser His Gln Gln Asn Pro Phe Leu Ala Leu Val Arg Pro Thr Ser Thr

225 230 235 240

gaa gac agt gga gaa gtt ttt gct tta aat tta gtt tac agc ggg aat 768

Glu Asp Ser Gly Glu Val Phe Ala Leu Asn Leu Val Tyr Ser Gly Asn

245 250 255

ttt ctt ggg cag gtg gaa gtc aac caa ttt aaa acc acc agg ttg tcc 816

Phe Leu Gly Gln Val Glu Val Asn Gln Phe Lys Thr Thr Arg Leu Ser

260 265 270

tta gga att aat ccc ttt gat ttc act tgg caa cta aac cct aag gaa 864

Leu Gly Ile Asn Pro Phe Asp Phe Thr Trp Gln Leu Asn Pro Lys Glu

275 280 285

gcc ttt caa act cct gaa gca gtt atg gtt tat tct tca aat gga tta 912

Ala Phe Gln Thr Pro Glu Ala Val Met Val Tyr Ser Ser Asn Gly Leu

290 295 300

aac gaa atg tcg caa act ttt cat gat ctc tat acg aat cgt ctt tgc 960

Asn Glu Met Ser Gln Thr Phe His Asp Leu Tyr Thr Asn Arg Leu Cys

305 310 315 320

cgg ggc cag ttc cgg aat caa att cgc cca att ctt att aat aat tgg 1008

Arg Gly Gln Phe Arg Asn Gln Ile Arg Pro Ile Leu Ile Asn Asn Trp

325 330 335

gaa gca act tat ttt aat ttt aat gcg gaa aaa gtt ctt gag att gca 1056

Glu Ala Thr Tyr Phe Asn Phe Asn Ala Glu Lys Val Leu Glu Ile Ala

340 345 350

aaa gtg gga aaa gag ctt ggg atg gaa tta gtt gta ctg gat gac ggt 1104

Lys Val Gly Lys Glu Leu Gly Met Glu Leu Val Val Leu Asp Asp Gly

355 360 365

tgg ttc ggt gaa cgt gat gat gat tgt cgt tca ctt ggc gat tgg gtg 1152

Trp Phe Gly Glu Arg Asp Asp Asp Cys Arg Ser Leu Gly Asp Trp Val

370 375 380

gtt gat cgc agg aag ctg ccg gat ggc ctt gat aat ctt gca aaa cgt 1200

Val Asp Arg Arg Lys Leu Pro Asp Gly Leu Asp Asn Leu Ala Lys Arg

385 390 395 400

gtc agg gag atg ggt tta gag ttt gga tta tgg ttt gag cct gag atg 1248

Val Arg Glu Met Gly Leu Glu Phe Gly Leu Trp Phe Glu Pro Glu Met

405 410 415

gtt tca gtt aac agt aat tta tat cgt gag cat cca gac tgg tgt ttg 1296

Val Ser Val Asn Ser Asn Leu Tyr Arg Glu His Pro Asp Trp Cys Leu

420 425 430

cat gtt cca aac cgt cca aaa agt gaa agt cga aac cag ctc att tta 1344

His Val Pro Asn Arg Pro Lys Ser Glu Ser Arg Asn Gln Leu Ile Leu

435 440 445

gat tta tct cgt cag gaa gtt tgc gag tat gtg att gaa tct gtt tcg 1392

Asp Leu Ser Arg Gln Glu Val Cys Glu Tyr Val Ile Glu Ser Val Ser

450 455 460

tct att ctt tca act gtt cct att tct tat gta aag tgg gat atg aac 1440

Ser Ile Leu Ser Thr Val Pro Ile Ser Tyr Val Lys Trp Asp Met Asn

465 470 475 480

cgg cat atg aca gaa gtt ggg tca gca gat ctt cca gcg gag cgg cag 1488

Arg His Met Thr Glu Val Gly Ser Ala Asp Leu Pro Ala Glu Arg Gln

485 490 495

cgt gaa acg gct cac cgt tat atg cta gga ctt tat cgc gta ctc gag 1536

Arg Glu Thr Ala His Arg Tyr Met Leu Gly Leu Tyr Arg Val Leu Glu

500 505 510

gct ata acc tct cgt ttt cct aat gtg ttg ttt gaa agc tgt tct gga 1584

Ala Ile Thr Ser Arg Phe Pro Asn Val Leu Phe Glu Ser Cys Ser Gly

515 520 525

ggg gga ggt cgc ttt gat cca gga ttc cta tat tat atg ccg caa acc 1632

Gly Gly Gly Arg Phe Asp Pro Gly Phe Leu Tyr Tyr Met Pro Gln Thr

530 535 540

tgg acc agc gat aat aca gat gcg gtt agc cgc ttg aaa atc caa tac 1680

Trp Thr Ser Asp Asn Thr Asp Ala Val Ser Arg Leu Lys Ile Gln Tyr

545 550 555 560

gga acg agc ctt gcc tat cca ata agt tct atg ggt tct cat gtt tcc 1728

Gly Thr Ser Leu Ala Tyr Pro Ile Ser Ser Met Gly Ser His Val Ser

565 570 575

gct gtt cct aat cat cag ctt cat cgt tca aca cct att gaa aca aga 1776

Ala Val Pro Asn His Gln Leu His Arg Ser Thr Pro Ile Glu Thr Arg

580 585 590

ggg gat gtg gca atg tcc ggg aac ctg gga tat gag ctt gat tta aca 1824

Gly Asp Val Ala Met Ser Gly Asn Leu Gly Tyr Glu Leu Asp Leu Thr

595 600 605

aag ctt tca gat caa gaa aaa gag gcg gta aaa gcc cag att tcc ttc 1872

Lys Leu Ser Asp Gln Glu Lys Glu Ala Val Lys Ala Gln Ile Ser Phe

610 615 620

tat aaa gac att cgt gaa gtt att cag ttt gga aag ttt tac agg att 1920

Tyr Lys Asp Ile Arg Glu Val Ile Gln Phe Gly Lys Phe Tyr Arg Ile

625 630 635 640

tta agc cca ttc gaa gga aat gaa gca ggt tgg gta ttt gtg tca cat 1968

Leu Ser Pro Phe Glu Gly Asn Glu Ala Gly Trp Val Phe Val Ser His

645 650 655

gat caa tct gaa tgt gtt gca gga tat ttc aga gtg ttg gcg gaa cct 2016

Asp Gln Ser Glu Cys Val Ala Gly Tyr Phe Arg Val Leu Ala Glu Pro

660 665 670

tat gaa cca acc aaa att tta aaa ata aag ggg ctt aat cca gaa ttg 2064

Tyr Glu Pro Thr Lys Ile Leu Lys Ile Lys Gly Leu Asn Pro Glu Leu

675 680 685

aat tat cgt tta gct gga act gag caa gtc ttc ggc ggt gat gag ctt 2112

Asn Tyr Arg Leu Ala Gly Thr Glu Gln Val Phe Gly Gly Asp Glu Leu

690 695 700

atg ttc atg ggt tta aat ata cct gac tta aaa ggt gat ttt agg agt 2160

Met Phe Met Gly Leu Asn Ile Pro Asp Leu Lys Gly Asp Phe Arg Ser

705 710 715 720

gtt ctt tgg cac ttt aag gca ggg tct att cat taa 2196

Val Leu Trp His Phe Lys Ala Gly Ser Ile His

725 730

<210> 14

<211> 731

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属物种-19140

<400> 14

Met Gly Ile Thr Tyr Gln Glu Glu Gly Gln Ile Phe His Leu Gln Gly

1 5 10 15

Lys Asp Thr Ser Tyr Val Met Gln Val Leu Lys Asp Gly Tyr Leu Thr

20 25 30

His Leu Tyr Trp Gly Lys Arg Val Arg Gly Tyr Asn Gln Ser Ile Pro

35 40 45

Val Thr Phe Phe Asp Arg Gly Phe Ser Ala Asn Pro Asp Pro Thr Asp

50 55 60

Arg Thr Phe Ser Leu Asp Thr Leu Pro Gln Glu Tyr Pro Ala Tyr Gly

65 70 75 80

Asn Thr Asp Phe Arg Thr Pro Ala Tyr Gln Ile Gln Leu Glu Asn Gly

85 90 95

Ser Thr Ile Ser Asp Leu Arg Tyr Ser Ser His Lys Ile Tyr Lys Gly

100 105 110

Lys Pro Lys Leu Glu Gly Leu Pro Ser Thr Tyr Ala Glu Arg Asp Glu

115 120 125

Glu Ala Glu Thr Leu Glu Ile Ile Leu Glu Asp Asp Thr Ile Gly Leu

130 135 140

Lys Val Thr Leu Ile Tyr Thr Val Phe Glu Ala Tyr Asn Ala Leu Thr

145 150 155 160

Arg Ser Val Arg Phe Glu Asn Ser Gly Arg Thr Val Ile Lys Leu Leu

165 170 175

Arg Ala Leu Ser Leu Asn Leu Asp Phe Arg Asp Gln Asp Phe Glu Leu

180 185 190

Ile Thr Leu Tyr Gly Ser His Asn Asn Glu Arg Asn Leu Ala Arg Arg

195 200 205

Pro Val Ala Pro Gly Leu Gln Ala Ile Glu Ser Arg Arg Gly Ala Ser

210 215 220

Ser His Gln Gln Asn Pro Phe Leu Ala Leu Val Arg Pro Thr Ser Thr

225 230 235 240

Glu Asp Ser Gly Glu Val Phe Ala Leu Asn Leu Val Tyr Ser Gly Asn

245 250 255

Phe Leu Gly Gln Val Glu Val Asn Gln Phe Lys Thr Thr Arg Leu Ser

260 265 270

Leu Gly Ile Asn Pro Phe Asp Phe Thr Trp Gln Leu Asn Pro Lys Glu

275 280 285

Ala Phe Gln Thr Pro Glu Ala Val Met Val Tyr Ser Ser Asn Gly Leu

290 295 300

Asn Glu Met Ser Gln Thr Phe His Asp Leu Tyr Thr Asn Arg Leu Cys

305 310 315 320

Arg Gly Gln Phe Arg Asn Gln Ile Arg Pro Ile Leu Ile Asn Asn Trp

325 330 335

Glu Ala Thr Tyr Phe Asn Phe Asn Ala Glu Lys Val Leu Glu Ile Ala

340 345 350

Lys Val Gly Lys Glu Leu Gly Met Glu Leu Val Val Leu Asp Asp Gly

355 360 365

Trp Phe Gly Glu Arg Asp Asp Asp Cys Arg Ser Leu Gly Asp Trp Val

370 375 380

Val Asp Arg Arg Lys Leu Pro Asp Gly Leu Asp Asn Leu Ala Lys Arg

385 390 395 400

Val Arg Glu Met Gly Leu Glu Phe Gly Leu Trp Phe Glu Pro Glu Met

405 410 415

Val Ser Val Asn Ser Asn Leu Tyr Arg Glu His Pro Asp Trp Cys Leu

420 425 430

His Val Pro Asn Arg Pro Lys Ser Glu Ser Arg Asn Gln Leu Ile Leu

435 440 445

Asp Leu Ser Arg Gln Glu Val Cys Glu Tyr Val Ile Glu Ser Val Ser

450 455 460

Ser Ile Leu Ser Thr Val Pro Ile Ser Tyr Val Lys Trp Asp Met Asn

465 470 475 480

Arg His Met Thr Glu Val Gly Ser Ala Asp Leu Pro Ala Glu Arg Gln

485 490 495

Arg Glu Thr Ala His Arg Tyr Met Leu Gly Leu Tyr Arg Val Leu Glu

500 505 510

Ala Ile Thr Ser Arg Phe Pro Asn Val Leu Phe Glu Ser Cys Ser Gly

515 520 525

Gly Gly Gly Arg Phe Asp Pro Gly Phe Leu Tyr Tyr Met Pro Gln Thr

530 535 540

Trp Thr Ser Asp Asn Thr Asp Ala Val Ser Arg Leu Lys Ile Gln Tyr

545 550 555 560

Gly Thr Ser Leu Ala Tyr Pro Ile Ser Ser Met Gly Ser His Val Ser

565 570 575

Ala Val Pro Asn His Gln Leu His Arg Ser Thr Pro Ile Glu Thr Arg

580 585 590

Gly Asp Val Ala Met Ser Gly Asn Leu Gly Tyr Glu Leu Asp Leu Thr

595 600 605

Lys Leu Ser Asp Gln Glu Lys Glu Ala Val Lys Ala Gln Ile Ser Phe

610 615 620

Tyr Lys Asp Ile Arg Glu Val Ile Gln Phe Gly Lys Phe Tyr Arg Ile

625 630 635 640

Leu Ser Pro Phe Glu Gly Asn Glu Ala Gly Trp Val Phe Val Ser His

645 650 655

Asp Gln Ser Glu Cys Val Ala Gly Tyr Phe Arg Val Leu Ala Glu Pro

660 665 670

Tyr Glu Pro Thr Lys Ile Leu Lys Ile Lys Gly Leu Asn Pro Glu Leu

675 680 685

Asn Tyr Arg Leu Ala Gly Thr Glu Gln Val Phe Gly Gly Asp Glu Leu

690 695 700

Met Phe Met Gly Leu Asn Ile Pro Asp Leu Lys Gly Asp Phe Arg Ser

705 710 715 720

Val Leu Trp His Phe Lys Ala Gly Ser Ile His

725 730

<210> 15

<211> 737

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有His-标签的成熟序列

<220>

<221> 成熟多肽

<222> (1)..(737)

<400> 15

Met Gly Ile Thr Tyr Gln Glu Glu Gly Gln Ile Phe His Leu Gln Gly

1 5 10 15

Lys Asp Thr Ser Tyr Val Met Gln Val Leu Lys Asp Gly Tyr Leu Thr

20 25 30

His Leu Tyr Trp Gly Lys Arg Val Arg Gly Tyr Asn Gln Ser Ile Pro

35 40 45

Val Thr Phe Phe Asp Arg Gly Phe Ser Ala Asn Pro Asp Pro Thr Asp

50 55 60

Arg Thr Phe Ser Leu Asp Thr Leu Pro Gln Glu Tyr Pro Ala Tyr Gly

65 70 75 80

Asn Thr Asp Phe Arg Thr Pro Ala Tyr Gln Ile Gln Leu Glu Asn Gly

85 90 95

Ser Thr Ile Ser Asp Leu Arg Tyr Ser Ser His Lys Ile Tyr Lys Gly

100 105 110

Lys Pro Lys Leu Glu Gly Leu Pro Ser Thr Tyr Ala Glu Arg Asp Glu

115 120 125

Glu Ala Glu Thr Leu Glu Ile Ile Leu Glu Asp Asp Thr Ile Gly Leu

130 135 140

Lys Val Thr Leu Ile Tyr Thr Val Phe Glu Ala Tyr Asn Ala Leu Thr

145 150 155 160

Arg Ser Val Arg Phe Glu Asn Ser Gly Arg Thr Val Ile Lys Leu Leu

165 170 175

Arg Ala Leu Ser Leu Asn Leu Asp Phe Arg Asp Gln Asp Phe Glu Leu

180 185 190

Ile Thr Leu Tyr Gly Ser His Asn Asn Glu Arg Asn Leu Ala Arg Arg

195 200 205

Pro Val Ala Pro Gly Leu Gln Ala Ile Glu Ser Arg Arg Gly Ala Ser

210 215 220

Ser His Gln Gln Asn Pro Phe Leu Ala Leu Val Arg Pro Thr Ser Thr

225 230 235 240

Glu Asp Ser Gly Glu Val Phe Ala Leu Asn Leu Val Tyr Ser Gly Asn

245 250 255

Phe Leu Gly Gln Val Glu Val Asn Gln Phe Lys Thr Thr Arg Leu Ser

260 265 270

Leu Gly Ile Asn Pro Phe Asp Phe Thr Trp Gln Leu Asn Pro Lys Glu

275 280 285

Ala Phe Gln Thr Pro Glu Ala Val Met Val Tyr Ser Ser Asn Gly Leu

290 295 300

Asn Glu Met Ser Gln Thr Phe His Asp Leu Tyr Thr Asn Arg Leu Cys

305 310 315 320

Arg Gly Gln Phe Arg Asn Gln Ile Arg Pro Ile Leu Ile Asn Asn Trp

325 330 335

Glu Ala Thr Tyr Phe Asn Phe Asn Ala Glu Lys Val Leu Glu Ile Ala

340 345 350

Lys Val Gly Lys Glu Leu Gly Met Glu Leu Val Val Leu Asp Asp Gly

355 360 365

Trp Phe Gly Glu Arg Asp Asp Asp Cys Arg Ser Leu Gly Asp Trp Val

370 375 380

Val Asp Arg Arg Lys Leu Pro Asp Gly Leu Asp Asn Leu Ala Lys Arg

385 390 395 400

Val Arg Glu Met Gly Leu Glu Phe Gly Leu Trp Phe Glu Pro Glu Met

405 410 415

Val Ser Val Asn Ser Asn Leu Tyr Arg Glu His Pro Asp Trp Cys Leu

420 425 430

His Val Pro Asn Arg Pro Lys Ser Glu Ser Arg Asn Gln Leu Ile Leu

435 440 445

Asp Leu Ser Arg Gln Glu Val Cys Glu Tyr Val Ile Glu Ser Val Ser

450 455 460

Ser Ile Leu Ser Thr Val Pro Ile Ser Tyr Val Lys Trp Asp Met Asn

465 470 475 480

Arg His Met Thr Glu Val Gly Ser Ala Asp Leu Pro Ala Glu Arg Gln

485 490 495

Arg Glu Thr Ala His Arg Tyr Met Leu Gly Leu Tyr Arg Val Leu Glu

500 505 510

Ala Ile Thr Ser Arg Phe Pro Asn Val Leu Phe Glu Ser Cys Ser Gly

515 520 525

Gly Gly Gly Arg Phe Asp Pro Gly Phe Leu Tyr Tyr Met Pro Gln Thr

530 535 540

Trp Thr Ser Asp Asn Thr Asp Ala Val Ser Arg Leu Lys Ile Gln Tyr

545 550 555 560

Gly Thr Ser Leu Ala Tyr Pro Ile Ser Ser Met Gly Ser His Val Ser

565 570 575

Ala Val Pro Asn His Gln Leu His Arg Ser Thr Pro Ile Glu Thr Arg

580 585 590

Gly Asp Val Ala Met Ser Gly Asn Leu Gly Tyr Glu Leu Asp Leu Thr

595 600 605

Lys Leu Ser Asp Gln Glu Lys Glu Ala Val Lys Ala Gln Ile Ser Phe

610 615 620

Tyr Lys Asp Ile Arg Glu Val Ile Gln Phe Gly Lys Phe Tyr Arg Ile

625 630 635 640

Leu Ser Pro Phe Glu Gly Asn Glu Ala Gly Trp Val Phe Val Ser His

645 650 655

Asp Gln Ser Glu Cys Val Ala Gly Tyr Phe Arg Val Leu Ala Glu Pro

660 665 670

Tyr Glu Pro Thr Lys Ile Leu Lys Ile Lys Gly Leu Asn Pro Glu Leu

675 680 685

Asn Tyr Arg Leu Ala Gly Thr Glu Gln Val Phe Gly Gly Asp Glu Leu

690 695 700

Met Phe Met Gly Leu Asn Ile Pro Asp Leu Lys Gly Asp Phe Arg Ser

705 710 715 720

Val Leu Trp His Phe Lys Ala Gly Ser Ile His His His His His His

725 730 735

His

<210> 16

<211> 747

<212> PRT

<213> 黑曲霉

<400> 16

Met Ile Gly Ser Ser His Ala Val Val Ala Leu Gly Leu Phe Thr Leu

1 5 10 15

Tyr Gly His Ser Ala Ala Ala Pro Ala Thr Gly Ala Ser Asn Ser Gln

20 25 30

Thr Ile Val Thr Asn Gly Thr Ser Phe Ala Leu Asn Gly Asp Asn Val

35 40 45

Ser Tyr Arg Phe His Val Asn Ser Thr Thr Gly Asp Leu Ile Ser Asp

50 55 60

His Phe Gly Gly Val Val Ser Gly Thr Ile Pro Ser Pro Val Glu Pro

65 70 75 80

Ala Val Asn Gly Trp Val Gly Met Pro Gly Arg Ile Arg Arg Glu Phe

85 90 95

Pro Asp Gln Gly Arg Gly Asp Phe Arg Ile Pro Ala Val Arg Ile Arg

100 105 110

Glu Ser Ala Gly Tyr Thr Val Ser Asp Leu Gln Tyr Val Ser His Glu

115 120 125

Val Ile Glu Gly Lys Asn Ala Leu Pro Gly Leu Pro Ala Thr Phe Gly

130 135 140

Asp Ala Gln Ala Val Thr Thr Leu Val Val His Leu Tyr Asp Asn Tyr

145 150 155 160

Ser Ser Val Ala Ala Asp Leu Ser Tyr Ser Ile Phe Pro Lys Tyr Asp

165 170 175

Ala Ile Val Arg Ser Val Asn Val Ile Asn Gln Gly Pro Gly Asn Ile

180 185 190

Thr Ile Glu Ala Leu Ala Ser Ile Ser Ile Asp Phe Pro Tyr Glu Asp

195 200 205

Leu Asp Met Val Ser Leu Arg Gly Asp Trp Ala Arg Glu Ala Asn Val

210 215 220

Gln Arg Ser Lys Val Gln Tyr Gly Val Gln Gly Phe Gly Ser Ser Thr

225 230 235 240

Gly Tyr Ser Ser His Leu His Asn Pro Phe Leu Ala Ile Val Asp Pro

245 250 255

Ala Thr Thr Glu Ser Gln Gly Glu Ala Trp Gly Phe Asn Leu Val Tyr

260 265 270

Thr Gly Ser Phe Ser Ala Gln Val Glu Lys Gly Ser Gln Gly Phe Thr

275 280 285

Arg Ala Leu Leu Gly Phe Asn Pro Asp Gln Leu Ser Trp Asn Leu Gly

290 295 300

Pro Gly Glu Thr Leu Thr Ser Pro Glu Cys Val Ala Val Tyr Ser Asp

305 310 315 320

Lys Gly Leu Gly Ser Val Ser Arg Lys Phe His Arg Leu Tyr Arg Asn

325 330 335

His Leu Met Lys Ser Lys Phe Ala Thr Ser Asp Arg Pro Val Leu Leu

340 345 350

Asn Ser Trp Glu Gly Val Tyr Phe Asp Tyr Asn Gln Ser Ser Ile Glu

355 360 365

Thr Leu Ala Glu Glu Ser Ala Ala Leu Gly Val His Leu Phe Val Met

370 375 380

Asp Asp Gly Trp Phe Gly Asp Lys Tyr Pro Arg Val Ser Asp Asn Ala

385 390 395 400

Gly Leu Gly Asp Trp Met Pro Asn Pro Ala Arg Phe Pro Asp Gly Leu

405 410 415

Thr Pro Val Val Gln Asp Ile Thr Asn Leu Thr Val Asn Gly Thr Glu

420 425 430

Ser Thr Lys Leu Arg Phe Gly Ile Trp Val Glu Pro Glu Met Val Asn

435 440 445

Pro Asn Ser Thr Leu Tyr His Glu His Pro Glu Trp Ala Leu His Ala

450 455 460

Gly Pro Tyr Pro Arg Thr Glu Arg Arg Asn Gln Leu Val Leu Asn Leu

465 470 475 480

Ala Leu Pro Ala Val Gln Asp Phe Ile Ile Asp Phe Met Thr Asn Leu

485 490 495

Leu Gln Asp Thr Gly Ile Ser Tyr Val Lys Trp Asp Asn Asn Arg Gly

500 505 510

Ile His Glu Thr Pro Ser Pro Ser Thr Asp His Gln Tyr Met Leu Gly

515 520 525

Leu Tyr Arg Val Phe Asp Thr Leu Thr Thr Arg Phe Pro Asp Val Leu

530 535 540

Trp Glu Gly Cys Ala Ser Gly Gly Gly Arg Phe Asp Ala Gly Met Leu

545 550 555 560

Gln Tyr Val Pro Gln Ile Trp Thr Ser Asp Asn Thr Asp Ala Ile Asp

565 570 575

Arg Ile Thr Ile Gln Phe Gly Thr Ser Leu Ala Tyr Pro Pro Ser Ala

580 585 590

Met Gly Ala His Leu Ser Ala Val Pro Asn Ala Gln Thr Gly Arg Thr

595 600 605

Val Pro Ile Thr Phe Arg Ala His Val Ala Met Met Gly Gly Ser Phe

610 615 620

Gly Leu Glu Leu Asp Pro Ala Thr Val Glu Gly Asp Glu Ile Val Pro

625 630 635 640

Glu Leu Leu Ala Leu Ala Glu Lys Val Asn Pro Ile Ile Leu Asn Gly

645 650 655

Asp Leu Tyr Arg Leu Arg Leu Pro Gln Asp Ser Gln Trp Pro Ala Ala

660 665 670

Leu Phe Val Thr Gln Asp Gly Ala Gln Ala Val Leu Phe Tyr Phe Gln

675 680 685

Val Gln Pro Asn Val Asn His Ala Val Pro Trp Val Arg Leu Gln Gly

690 695 700

Leu Asp Pro Lys Ala Asp Tyr Thr Val Asp Gly Asp Gln Thr Tyr Ser

705 710 715 720

Gly Ala Thr Leu Met Asn Leu Gly Leu Gln Tyr Ser Phe Asp Thr Glu

725 730 735

Tyr Gly Ser Lys Val Val Phe Leu Glu Arg Gln

740 745

<210> 17

<211> 2442

<212> DNA

<213> 红紫曲霉

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(109)

<220>

<221> 信号肽

<222> (1)..(87)

<220>

<221> 成熟多肽

<222> (88)..(2439)

<220>

<221> CDS

<222> (173)..(779)

<220>

<221> CDS

<222> (864)..(2439)

<400> 17

atg ttt ggg tct tct acc tcg acc atc gct gct gcg gct gtg acg ggc 48

Met Phe Gly Ser Ser Thr Ser Thr Ile Ala Ala Ala Ala Val Thr Gly

-25 -20 -15

ctc ttg aca gtc tgc agt caa tcc ccc ttg gtt ctg gct cag gag tcg 96

Leu Leu Thr Val Cys Ser Gln Ser Pro Leu Val Leu Ala Gln Glu Ser

-10 -5 -1 1

agc agt cag gat g gttcgtctcc ctttcatccc ctcgaattac tactaccccc 149

Ser Ser Gln Asp

5

ccgagattcc taacgctatc cag ca atc gtc gcc tct ggt aca acg ttc tcc 201

Ala Ile Val Ala Ser Gly Thr Thr Phe Ser

10 15

cta aat ggc gac aac gtc tcg tac aac ttc cac gtc gac aac agc act 249

Leu Asn Gly Asp Asn Val Ser Tyr Asn Phe His Val Asp Asn Ser Thr

20 25 30

ggc gac ctc ata acc gac cac ttt ggc agc ccc gta tcc ggc gcg cta 297

Gly Asp Leu Ile Thr Asp His Phe Gly Ser Pro Val Ser Gly Ala Leu

35 40 45

ccc agc cca gtc gag cca gcc ata aac ggc tgg gtc gga ctc ccc ggc 345

Pro Ser Pro Val Glu Pro Ala Ile Asn Gly Trp Val Gly Leu Pro Gly

50 55 60 65

cgc gtg cgc cgc gag ttc ccg gac aca ggc cgc ggc gac ttt cgc atc 393

Arg Val Arg Arg Glu Phe Pro Asp Thr Gly Arg Gly Asp Phe Arg Ile

70 75 80

ccc gcg atc cgc atc cgt caa acc gca ggg tac gag gtt agc gat ctg 441

Pro Ala Ile Arg Ile Arg Gln Thr Ala Gly Tyr Glu Val Ser Asp Leu

85 90 95

cag tac cag tcg cac gag att gtg cag ggg aaa cct gcc ttg ccg ggg 489

Gln Tyr Gln Ser His Glu Ile Val Gln Gly Lys Pro Ala Leu Pro Gly

100 105 110

ctg ccc tcc acg ttc ggt gat gca ggg gat gtg agt act ttg att gtg 537

Leu Pro Ser Thr Phe Gly Asp Ala Gly Asp Val Ser Thr Leu Ile Val

115 120 125

cac ctg tac gac aat tac agt tcc gtt gcg gcg gat ctg gtg tat tcg 585

His Leu Tyr Asp Asn Tyr Ser Ser Val Ala Ala Asp Leu Val Tyr Ser

130 135 140 145

gtg ttt cca aag tat gat gcc atc gtg cgg agt gtg aat gtt acg aat 633

Val Phe Pro Lys Tyr Asp Ala Ile Val Arg Ser Val Asn Val Thr Asn

150 155 160

cgg ggc gag ggc aac gtg agt atc gag gcg ctg gcg agc ttt agt gtg 681

Arg Gly Glu Gly Asn Val Ser Ile Glu Ala Leu Ala Ser Phe Ser Val

165 170 175

gat ttt ccg gat gag gag ctg gag atg gtg agc ttg agg ggg gac tgg 729

Asp Phe Pro Asp Glu Glu Leu Glu Met Val Ser Leu Arg Gly Asp Trp

180 185 190

gcg cgc gag gcg aat agg cag cgg agg aag gtt gag tat ggg gtt cag 777

Ala Arg Glu Ala Asn Arg Gln Arg Arg Lys Val Glu Tyr Gly Val Gln

195 200 205

gg gtgagtactc gcataccggt tttctcaatg ttgaggcggt ttccatgggt 829

Gly

210

tgattggctt ggaggtatgc tgatgagggt gcag g ttt gga agt acg act ggt 882

Phe Gly Ser Thr Thr Gly

215

tac tcg tcg cat ttg cat aat ccc ttc ctt gcg ctc gtg cat ccg tct 930

Tyr Ser Ser His Leu His Asn Pro Phe Leu Ala Leu Val His Pro Ser

220 225 230

act acc gaa tct caa ggc gag acc tgg gga ttc tcg ctg gtc tac acg 978

Thr Thr Glu Ser Gln Gly Glu Thr Trp Gly Phe Ser Leu Val Tyr Thr

235 240 245

ggg tct ttc tcg gtg gaa gta gag aag gga tcg caa ggc ttg acg cga 1026

Gly Ser Phe Ser Val Glu Val Glu Lys Gly Ser Gln Gly Leu Thr Arg

250 255 260

gcc ctg ctt gga ctc aac ccc aac caa ctc tca tgg aac ctt ggc ccc 1074

Ala Leu Leu Gly Leu Asn Pro Asn Gln Leu Ser Trp Asn Leu Gly Pro

265 270 275 280

ggc gag aca ctc acc tcc ccc gag tgt gtt tca gtc tac tcg aaa gac 1122

Gly Glu Thr Leu Thr Ser Pro Glu Cys Val Ser Val Tyr Ser Lys Asp

285 290 295

gga atc ggc ggc atg tct cgt tcg ttc cac cgt cta tat cgc aac cac 1170

Gly Ile Gly Gly Met Ser Arg Ser Phe His Arg Leu Tyr Arg Asn His

300 305 310

ttg atc aag agc caa ttc gcc acc tcc gat agg ccg gcc ctg ctc aac 1218

Leu Ile Lys Ser Gln Phe Ala Thr Ser Asp Arg Pro Ala Leu Leu Asn

315 320 325

agt tgg gaa ggc gtc tac ttt gac ttt aat cag agc aca atc tac aac 1266

Ser Trp Glu Gly Val Tyr Phe Asp Phe Asn Gln Ser Thr Ile Tyr Asn

330 335 340

ctc gcc gag gaa gcc gct tcc ctg ggc atc cac ctc ttc gtc atg gat 1314

Leu Ala Glu Glu Ala Ala Ser Leu Gly Ile His Leu Phe Val Met Asp

345 350 355 360

gac ggc tgg ttc ggc gac gaa tac ccg cga gta tca gac gaa gcg ggt 1362

Asp Gly Trp Phe Gly Asp Glu Tyr Pro Arg Val Ser Asp Glu Ala Gly

365 370 375

cta ggc gac tgg acg ccg aat ccc gaa cgg ttc ccc aac ggc tta tcg 1410

Leu Gly Asp Trp Thr Pro Asn Pro Glu Arg Phe Pro Asn Gly Leu Ser

380 385 390

ccc ctc gtc gag ggg gtg aca aac ctc aca gcc aac gac agt agc aac 1458

Pro Leu Val Glu Gly Val Thr Asn Leu Thr Ala Asn Asp Ser Ser Asn

395 400 405

agt agc agt agc agc aat agc agc aca aag ctc cgc ttc ggc atc tgg 1506

Ser Ser Ser Ser Ser Asn Ser Ser Thr Lys Leu Arg Phe Gly Ile Trp

410 415 420

gtt gag ccc gaa atg gtc aac ccc aac tcg acc ctc tac cac gaa cac 1554

Val Glu Pro Glu Met Val Asn Pro Asn Ser Thr Leu Tyr His Glu His

425 430 435 440

cca gac tgg gcc ctg cac gca gga ccc tac cca cgc acc gaa cgc cgc 1602

Pro Asp Trp Ala Leu His Ala Gly Pro Tyr Pro Arg Thr Glu Arg Arg

445 450 455

aac caa ctc gtg cta aac ctc gcc ctc ccc gaa gtc cag gaa tac atc 1650

Asn Gln Leu Val Leu Asn Leu Ala Leu Pro Glu Val Gln Glu Tyr Ile

460 465 470

atc gac ttc atg acc acc ctg ctc aac tcc gca gac atc acg tac atc 1698

Ile Asp Phe Met Thr Thr Leu Leu Asn Ser Ala Asp Ile Thr Tyr Ile

475 480 485

aaa tgg gac aac aac cgc ggc atg cac gag acc ccc tcc ccc tca aac 1746

Lys Trp Asp Asn Asn Arg Gly Met His Glu Thr Pro Ser Pro Ser Asn

490 495 500

gac cac gcc tac atg ctc ggc ctc tac cac gtc ttc agc acc ctc aca 1794

Asp His Ala Tyr Met Leu Gly Leu Tyr His Val Phe Ser Thr Leu Thr

505 510 515 520

acc cgc ttc ccc gac gtc ctc tgg gaa ggc tgc gcc tcc ggc ggc ggc 1842

Thr Arg Phe Pro Asp Val Leu Trp Glu Gly Cys Ala Ser Gly Gly Gly

525 530 535

cgc ttc gac gca ggc gtg ctg cac tac ttc ccg cag atc tgg acc tcc 1890

Arg Phe Asp Ala Gly Val Leu His Tyr Phe Pro Gln Ile Trp Thr Ser

540 545 550

gac aac acc gac ggc gtc gac cgc gtg aca atc caa ttc ggc acc tcg 1938

Asp Asn Thr Asp Gly Val Asp Arg Val Thr Ile Gln Phe Gly Thr Ser

555 560 565

ctc gcc tac ccg ccc agc gca atg ggc gca cat cta tcc gcc gtc ccc 1986

Leu Ala Tyr Pro Pro Ser Ala Met Gly Ala His Leu Ser Ala Val Pro

570 575 580

aac cac caa acg ggc cgc acc gtg ccc ctc acc ctc cgc gcc cac gtc 2034

Asn His Gln Thr Gly Arg Thr Val Pro Leu Thr Leu Arg Ala His Val

585 590 595 600

gcc atg atg ggc ggc tcg ttc ggc ctc gaa ctc gac ccg agc gaa ctc 2082

Ala Met Met Gly Gly Ser Phe Gly Leu Glu Leu Asp Pro Ser Glu Leu

605 610 615

tcc gag gca gag aag gaa tcc gtc tca gac ctc ctc gct ctc gcg gaa 2130

Ser Glu Ala Glu Lys Glu Ser Val Ser Asp Leu Leu Ala Leu Ala Glu

620 625 630

cgc atc aac ccg atc atc cta acg ggc gac ctg tac cgc cta cgg ctc 2178

Arg Ile Asn Pro Ile Ile Leu Thr Gly Asp Leu Tyr Arg Leu Arg Leu

635 640 645

ccc gag gac tcg aaa tgg ccc gcc gcg cag ttc atc tcg caa ggt ggg 2226

Pro Glu Asp Ser Lys Trp Pro Ala Ala Gln Phe Ile Ser Gln Gly Gly

650 655 660

ggc gac caa gtc gtg ctg ttt gtc ttc cag ctc gcg ccg aac gtc aac 2274

Gly Asp Gln Val Val Leu Phe Val Phe Gln Leu Ala Pro Asn Val Asn

665 670 675 680

cat gcc gtt ccc tgg atc cgc ttg caa ggg ctg gat gcg cag gcg cgg 2322

His Ala Val Pro Trp Ile Arg Leu Gln Gly Leu Asp Ala Gln Ala Arg

685 690 695

tat gtc gtt gat ggg cgc gcg aac gag acg tac tca ggc gcc gcg ctg 2370

Tyr Val Val Asp Gly Arg Ala Asn Glu Thr Tyr Ser Gly Ala Ala Leu

700 705 710

atg aat cgg gga ctg cag ttt gcg ttt gag acg gag tat ggg agt cgc 2418

Met Asn Arg Gly Leu Gln Phe Ala Phe Glu Thr Glu Tyr Gly Ser Arg

715 720 725

gtt gtg ctt ctg gag aag gag tag 2442

Val Val Leu Leu Glu Lys Glu

730 735

<210> 18

<211> 764

<212> PRT

<213> 红紫曲霉

<400> 18

Met Phe Gly Ser Ser Thr Ser Thr Ile Ala Ala Ala Ala Val Thr Gly

-25 -20 -15

Leu Leu Thr Val Cys Ser Gln Ser Pro Leu Val Leu Ala Gln Glu Ser

-10 -5 -1 1

Ser Ser Gln Asp Ala Ile Val Ala Ser Gly Thr Thr Phe Ser Leu Asn

5 10 15

Gly Asp Asn Val Ser Tyr Asn Phe His Val Asp Asn Ser Thr Gly Asp

20 25 30 35

Leu Ile Thr Asp His Phe Gly Ser Pro Val Ser Gly Ala Leu Pro Ser

40 45 50

Pro Val Glu Pro Ala Ile Asn Gly Trp Val Gly Leu Pro Gly Arg Val

55 60 65

Arg Arg Glu Phe Pro Asp Thr Gly Arg Gly Asp Phe Arg Ile Pro Ala

70 75 80

Ile Arg Ile Arg Gln Thr Ala Gly Tyr Glu Val Ser Asp Leu Gln Tyr

85 90 95

Gln Ser His Glu Ile Val Gln Gly Lys Pro Ala Leu Pro Gly Leu Pro

100 105 110 115

Ser Thr Phe Gly Asp Ala Gly Asp Val Ser Thr Leu Ile Val His Leu

120 125 130

Tyr Asp Asn Tyr Ser Ser Val Ala Ala Asp Leu Val Tyr Ser Val Phe

135 140 145

Pro Lys Tyr Asp Ala Ile Val Arg Ser Val Asn Val Thr Asn Arg Gly

150 155 160

Glu Gly Asn Val Ser Ile Glu Ala Leu Ala Ser Phe Ser Val Asp Phe

165 170 175

Pro Asp Glu Glu Leu Glu Met Val Ser Leu Arg Gly Asp Trp Ala Arg

180 185 190 195

Glu Ala Asn Arg Gln Arg Arg Lys Val Glu Tyr Gly Val Gln Gly Phe

200 205 210

Gly Ser Thr Thr Gly Tyr Ser Ser His Leu His Asn Pro Phe Leu Ala

215 220 225

Leu Val His Pro Ser Thr Thr Glu Ser Gln Gly Glu Thr Trp Gly Phe

230 235 240

Ser Leu Val Tyr Thr Gly Ser Phe Ser Val Glu Val Glu Lys Gly Ser

245 250 255

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260 265 270 275

Trp Asn Leu Gly Pro Gly Glu Thr Leu Thr Ser Pro Glu Cys Val Ser

280 285 290

Val Tyr Ser Lys Asp Gly Ile Gly Gly Met Ser Arg Ser Phe His Arg

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Leu Tyr Arg Asn His Leu Ile Lys Ser Gln Phe Ala Thr Ser Asp Arg

310 315 320

Pro Ala Leu Leu Asn Ser Trp Glu Gly Val Tyr Phe Asp Phe Asn Gln

325 330 335

Ser Thr Ile Tyr Asn Leu Ala Glu Glu Ala Ala Ser Leu Gly Ile His

340 345 350 355

Leu Phe Val Met Asp Asp Gly Trp Phe Gly Asp Glu Tyr Pro Arg Val

360 365 370

Ser Asp Glu Ala Gly Leu Gly Asp Trp Thr Pro Asn Pro Glu Arg Phe

375 380 385

Pro Asn Gly Leu Ser Pro Leu Val Glu Gly Val Thr Asn Leu Thr Ala

390 395 400

Asn Asp Ser Ser Asn Ser Ser Ser Ser Ser Asn Ser Ser Thr Lys Leu

405 410 415

Arg Phe Gly Ile Trp Val Glu Pro Glu Met Val Asn Pro Asn Ser Thr

420 425 430 435

Leu Tyr His Glu His Pro Asp Trp Ala Leu His Ala Gly Pro Tyr Pro

440 445 450

Arg Thr Glu Arg Arg Asn Gln Leu Val Leu Asn Leu Ala Leu Pro Glu

455 460 465

Val Gln Glu Tyr Ile Ile Asp Phe Met Thr Thr Leu Leu Asn Ser Ala

470 475 480

Asp Ile Thr Tyr Ile Lys Trp Asp Asn Asn Arg Gly Met His Glu Thr

485 490 495

Pro Ser Pro Ser Asn Asp His Ala Tyr Met Leu Gly Leu Tyr His Val

500 505 510 515

Phe Ser Thr Leu Thr Thr Arg Phe Pro Asp Val Leu Trp Glu Gly Cys

520 525 530

Ala Ser Gly Gly Gly Arg Phe Asp Ala Gly Val Leu His Tyr Phe Pro

535 540 545

Gln Ile Trp Thr Ser Asp Asn Thr Asp Gly Val Asp Arg Val Thr Ile

550 555 560

Gln Phe Gly Thr Ser Leu Ala Tyr Pro Pro Ser Ala Met Gly Ala His

565 570 575

Leu Ser Ala Val Pro Asn His Gln Thr Gly Arg Thr Val Pro Leu Thr

580 585 590 595

Leu Arg Ala His Val Ala Met Met Gly Gly Ser Phe Gly Leu Glu Leu

600 605 610

Asp Pro Ser Glu Leu Ser Glu Ala Glu Lys Glu Ser Val Ser Asp Leu

615 620 625

Leu Ala Leu Ala Glu Arg Ile Asn Pro Ile Ile Leu Thr Gly Asp Leu

630 635 640

Tyr Arg Leu Arg Leu Pro Glu Asp Ser Lys Trp Pro Ala Ala Gln Phe

645 650 655

Ile Ser Gln Gly Gly Gly Asp Gln Val Val Leu Phe Val Phe Gln Leu

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Asp Ala Gln Ala Arg Tyr Val Val Asp Gly Arg Ala Asn Glu Thr Tyr

695 700 705

Ser Gly Ala Ala Leu Met Asn Arg Gly Leu Gln Phe Ala Phe Glu Thr

710 715 720

Glu Tyr Gly Ser Arg Val Val Leu Leu Glu Lys Glu

725 730 735

<210> 19

<211> 735

<212> PRT

<213> 红紫曲霉

<220>

<221> 成熟多肽

<222> (1)..(735)

<400> 19

Gln Glu Ser Ser Ser Gln Asp Ala Ile Val Ala Ser Gly Thr Thr Phe

1 5 10 15

Ser Leu Asn Gly Asp Asn Val Ser Tyr Asn Phe His Val Asp Asn Ser

20 25 30

Thr Gly Asp Leu Ile Thr Asp His Phe Gly Ser Pro Val Ser Gly Ala

35 40 45

Leu Pro Ser Pro Val Glu Pro Ala Ile Asn Gly Trp Val Gly Leu Pro

50 55 60

Gly Arg Val Arg Arg Glu Phe Pro Asp Thr Gly Arg Gly Asp Phe Arg

65 70 75 80

Ile Pro Ala Ile Arg Ile Arg Gln Thr Ala Gly Tyr Glu Val Ser Asp

85 90 95

Leu Gln Tyr Gln Ser His Glu Ile Val Gln Gly Lys Pro Ala Leu Pro

100 105 110

Gly Leu Pro Ser Thr Phe Gly Asp Ala Gly Asp Val Ser Thr Leu Ile

115 120 125

Val His Leu Tyr Asp Asn Tyr Ser Ser Val Ala Ala Asp Leu Val Tyr

130 135 140

Ser Val Phe Pro Lys Tyr Asp Ala Ile Val Arg Ser Val Asn Val Thr

145 150 155 160

Asn Arg Gly Glu Gly Asn Val Ser Ile Glu Ala Leu Ala Ser Phe Ser

165 170 175

Val Asp Phe Pro Asp Glu Glu Leu Glu Met Val Ser Leu Arg Gly Asp

180 185 190

Trp Ala Arg Glu Ala Asn Arg Gln Arg Arg Lys Val Glu Tyr Gly Val

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Gln Gly Phe Gly Ser Thr Thr Gly Tyr Ser Ser His Leu His Asn Pro

210 215 220

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Trp Gly Phe Ser Leu Val Tyr Thr Gly Ser Phe Ser Val Glu Val Glu

245 250 255

Lys Gly Ser Gln Gly Leu Thr Arg Ala Leu Leu Gly Leu Asn Pro Asn

260 265 270

Gln Leu Ser Trp Asn Leu Gly Pro Gly Glu Thr Leu Thr Ser Pro Glu

275 280 285

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Phe His Arg Leu Tyr Arg Asn His Leu Ile Lys Ser Gln Phe Ala Thr

305 310 315 320

Ser Asp Arg Pro Ala Leu Leu Asn Ser Trp Glu Gly Val Tyr Phe Asp

325 330 335

Phe Asn Gln Ser Thr Ile Tyr Asn Leu Ala Glu Glu Ala Ala Ser Leu

340 345 350

Gly Ile His Leu Phe Val Met Asp Asp Gly Trp Phe Gly Asp Glu Tyr

355 360 365

Pro Arg Val Ser Asp Glu Ala Gly Leu Gly Asp Trp Thr Pro Asn Pro

370 375 380

Glu Arg Phe Pro Asn Gly Leu Ser Pro Leu Val Glu Gly Val Thr Asn

385 390 395 400

Leu Thr Ala Asn Asp Ser Ser Asn Ser Ser Ser Ser Ser Asn Ser Ser

405 410 415

Thr Lys Leu Arg Phe Gly Ile Trp Val Glu Pro Glu Met Val Asn Pro

420 425 430

Asn Ser Thr Leu Tyr His Glu His Pro Asp Trp Ala Leu His Ala Gly

435 440 445

Pro Tyr Pro Arg Thr Glu Arg Arg Asn Gln Leu Val Leu Asn Leu Ala

450 455 460

Leu Pro Glu Val Gln Glu Tyr Ile Ile Asp Phe Met Thr Thr Leu Leu

465 470 475 480

Asn Ser Ala Asp Ile Thr Tyr Ile Lys Trp Asp Asn Asn Arg Gly Met

485 490 495

His Glu Thr Pro Ser Pro Ser Asn Asp His Ala Tyr Met Leu Gly Leu

500 505 510

Tyr His Val Phe Ser Thr Leu Thr Thr Arg Phe Pro Asp Val Leu Trp

515 520 525

Glu Gly Cys Ala Ser Gly Gly Gly Arg Phe Asp Ala Gly Val Leu His

530 535 540

Tyr Phe Pro Gln Ile Trp Thr Ser Asp Asn Thr Asp Gly Val Asp Arg

545 550 555 560

Val Thr Ile Gln Phe Gly Thr Ser Leu Ala Tyr Pro Pro Ser Ala Met

565 570 575

Gly Ala His Leu Ser Ala Val Pro Asn His Gln Thr Gly Arg Thr Val

580 585 590

Pro Leu Thr Leu Arg Ala His Val Ala Met Met Gly Gly Ser Phe Gly

595 600 605

Leu Glu Leu Asp Pro Ser Glu Leu Ser Glu Ala Glu Lys Glu Ser Val

610 615 620

Ser Asp Leu Leu Ala Leu Ala Glu Arg Ile Asn Pro Ile Ile Leu Thr

625 630 635 640

Gly Asp Leu Tyr Arg Leu Arg Leu Pro Glu Asp Ser Lys Trp Pro Ala

645 650 655

Ala Gln Phe Ile Ser Gln Gly Gly Gly Asp Gln Val Val Leu Phe Val

660 665 670

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Gln Gly Leu Asp Ala Gln Ala Arg Tyr Val Val Asp Gly Arg Ala Asn

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Glu Thr Tyr Ser Gly Ala Ala Leu Met Asn Arg Gly Leu Gln Phe Ala

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Phe Glu Thr Glu Tyr Gly Ser Arg Val Val Leu Leu Glu Lys Glu

725 730 735

<210> 20

<211> 729

<212> PRT

<213> Parageobacillus thermoglucosidans

<400> 20

Met Ala Ile Val Phe Asp Pro Thr Asn Lys Thr Phe His Leu Gln Ala

1 5 10 15

Asn Asp Thr Ser Tyr Val Met Gln Leu Val Arg Ser Gly Tyr Leu Ser

20 25 30

His Leu Tyr Trp Gly Lys Lys Ile Arg Ser Ala Asn Gly Ser Arg Arg

35 40 45

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50 55 60

Arg Thr Phe Ser Leu Asp Thr Leu Pro Gln Glu Tyr Pro Ala Tyr Gly

65 70 75 80

Asn Thr Asp Phe Arg Ala Pro Ala Tyr Gln Val Gln Leu Glu Asn Gly

85 90 95

Ala Thr Ile Ser Asp Leu Arg Tyr Lys Thr His Arg Ile Tyr Lys Gly

100 105 110

Lys Pro Lys Leu Lys Gly Leu Pro Ala Thr Tyr Val Glu Arg Glu Asn

115 120 125

Glu Ala Glu Thr Leu Glu Ile Val Leu Glu Asp Arg Val Ile Gly Leu

130 135 140

His Val Thr Leu Leu Tyr Thr Val Tyr Glu Arg Trp Asn Val Val Thr

145 150 155 160

Arg Ser Ala Arg Phe Glu Asn Arg Gly Ala Glu Arg Ile Lys Leu Leu

165 170 175

Arg Ala Leu Ser Met Asn Val Asp Phe Pro His Ala Asp Tyr Glu Trp

180 185 190

Leu His Leu Pro Gly Ala Trp Gly Arg Glu Arg Ala Val Glu Arg Arg

195 200 205

Pro Leu Val Thr Gly Ile Gln Ser Val Glu Ser Arg Arg Gly Ala Ser

210 215 220

Ser His Gln Gln Asn Pro Phe Ile Ala Leu Leu Gly Lys Asn Thr Asn

225 230 235 240

Glu Asp Val Gly Glu Val Tyr Gly Phe Ser Leu Val Tyr Ser Gly Asn

245 250 255

Phe Leu Ala Gln Val Glu Val Asp Gln Phe Gln Thr Thr Arg Val Ser

260 265 270

Met Gly Ile Asn Pro Phe Asp Phe Thr Trp Leu Leu Glu Pro Gly Glu

275 280 285

Ser Phe Gln Thr Pro Glu Val Val Met Val Tyr Ser Asp Lys Gly Leu

290 295 300

Asn Gly Met Ser Gln Thr Tyr His Gln Leu Tyr Arg Thr Arg Leu Ala

305 310 315 320

Arg Gly Ala Phe Arg Asp Arg Glu Arg Pro Ile Leu Ile Asn Asn Trp

325 330 335

Glu Ala Thr Tyr Phe His Phe Asn Glu Glu Lys Ile Leu Arg Leu Ala

340 345 350

Lys Thr Ala Ala Glu Leu Gly Ile Glu Leu Phe Val Leu Asp Asp Gly

355 360 365

Trp Phe Gly Lys Arg Asp Asp Asp His Ser Ser Leu Gly Asp Trp Phe

370 375 380

Val Asn Lys Gln Lys Leu Pro Asn Gly Leu Gly Gly Leu Ala Lys Asn

385 390 395 400

Ile Asn Gln Met Gly Met Lys Phe Gly Leu Trp Val Glu Pro Glu Met

405 410 415

Val Ser Val Asp Ser Glu Leu Tyr Arg Gln His Pro Asp Trp Cys Leu

420 425 430

His Val Pro Asn Arg Pro Arg Ser Glu Gly Arg Asn Gln Leu Val Leu

435 440 445

Asp Tyr Ser Arg Lys Glu Val Cys Asp Tyr Ile Ile Gln Val Ile Ser

450 455 460

Asp Val Leu Ala Ser Ala Pro Ile Ser Tyr Val Lys Trp Asp Met Asn

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Arg His Met Thr Glu Ile Gly Ser Ala Ala Leu Pro Pro Glu Arg Gln

485 490 495

Arg Glu Thr Ala His Arg Tyr Met Leu Gly Leu Tyr Arg Val Met Glu

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515 520 525

Gly Gly Gly Arg Phe Asp Pro Gly Met Leu Tyr Tyr Met Pro Gln Thr

530 535 540

Trp Thr Ser Asp Asn Thr Asp Ala Val Ser Arg Leu Lys Ile Gln Tyr

545 550 555 560

Gly Thr Ser Leu Val Tyr Pro Ile Ile Ser Met Gly Ala His Val Ser

565 570 575

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580 585 590

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Lys Leu Ser Glu Lys Glu Lys Gln Lys Val Lys Glu Gln Val Ala Phe

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Asp Tyr Lys Leu Val Gly Ser Gly Glu Ile Tyr Gly Gly Asp Glu Leu

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Met His Ile Gly Leu Ile Val Pro Gln Arg Arg Gly Asp Phe Val Ser

705 710 715 720

Ile Ile Trp Arg Leu Lys Ala Ala Arg

725

Claims

(a)与SEQ ID NO:2的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；

(b)与SEQ ID NO:5的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；

(c)与SEQ ID NO:8的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；

(d)与SEQ ID NO:12的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；

(e)与SEQ ID NO:14的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；

(f)与SEQ ID NO:19的多肽具有至少80％序列同一性的多肽；

(g)多肽的变体，该多肽选自由以下组成的组：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:19，其中该变体具有α-半乳糖苷酶活性并包括在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中的一个或多个氨基酸取代、和/或一个或多个氨基酸缺失、和/或一个或多个氨基酸插入或其任何组合；

(j)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)的多肽的片段，该片段具有α-半乳糖苷酶活性并且具有成熟多肽的至少90％的长度。

2.根据权利要求1所述的方法，其中该GH36多肽获得自或可获得自芽孢杆菌目(Bacillales)，优选芽孢杆菌科(Bacillaceae)或获得自或可获得自散囊菌目(Eurotiales)，优选曲霉科(Aspergillaceae)。

3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中该GH36多肽包含或由如下组成：SEQID NO:2的氨基酸1至728、SEQ ID NO:3的氨基酸1至734、SEQ ID NO:5的氨基酸1至731、SEQID NO:6的氨基酸1至737、SEQ ID NO:8的氨基酸1至732、SEQ ID NO:9的氨基酸1至738、SEQID NO:11的氨基酸1至719、SEQ ID NO:12的氨基酸1至719、SEQ ID NO:14的氨基酸1至731、SEQ ID NO:15的氨基酸1至737、SEQ ID NO:18的氨基酸1至735、或SEQ ID NO:19的氨基酸1至735。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该基于植物的材料是大豆、野生大豆、豆类、羽扇豆、花菜豆、红花菜豆、瘦豆、利马豆、法国菜豆、胡豆(蚕豆)、鹰嘴豆、小扁豆、花生、西班牙花生、低芥酸菜籽、油菜籽(油菜)或豌豆或处于其加工形式例如大豆粉、全脂大豆粉、大豆蛋白质浓缩物(SPC)、发酵大豆粉(FSBM)或其任何组合。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中当在如下反应条件下进行时，该GH36多肽释放至少19g半乳糖/kg大豆粉，所述条件是：20mg多肽/kg大豆粉于10％w/v 0.1M柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，pH 6.5，在40℃孵育2小时。

6.一种分离的具有α-半乳糖苷酶活性的多肽，该多肽选自下组，该组由以下组成：

(u)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)或(r)的多肽的片段，该片段具有α-半乳糖苷酶活性并且具有成熟多肽的至少90％的长度。

7.根据权利要求6所述的多肽，其中该多肽包含或由如下组成：SEQ ID NO:2的氨基酸1至728、SEQ ID NO:3的氨基酸1至734、SEQ ID NO:5的氨基酸1至731、SEQ ID NO:6的氨基酸1至737、SEQ ID NO:8的氨基酸1至732、SEQ ID NO:9的氨基酸1至738、SEQ ID NO:11的氨基酸1至719或SEQ ID NO:12的氨基酸1至719、SEQ ID NO:14的氨基酸1至731、SEQ ID NO:15的氨基酸1至737、SEQ ID NO:18的氨基酸1至735、或SEQ ID NO:19的氨基酸1至735。

8.一种组合物，该组合物包含一种或多种如权利要求6至7中任一项所述的多肽。

9.如权利要求8所述的组合物，该组合物进一步包含选自以下列表的一种或多种组分，该列表由以下组成：

一种或多种配制剂；

一种或多种另外的酶；和

一种或多种微生物。

10.一种颗粒，该颗粒包含一种或多种如权利要求6至7中任一项所述的多肽或如权利要求8至9中任一项所述的组合物。

11.一种动物饲料添加剂，该动物饲料添加剂包含

(a)一种或多种如权利要求6至7中任一项所述的多肽、如权利要求8至9中任一项所述的组合物或如权利要求10所述的颗粒；和

(b)一种或多种选自以下列表的组分，该列表由以下组成：

一种或多种维生素；

一种或多种矿物质；

一种或多种氨基酸；

一种或多种益生元；

一种或多种植生素；

一种或多种有机酸；和

一种或多种其他饲料成分。

12.一种液体配制品，该液体配制品包含如权利要求6至7中任一项所述的多肽或如权利要求8至9中任一项所述的组合物。

13.一种动物饲料，该动物饲料包含基于植物的材料和一种或多种如权利要求6至7中任一项所述的多肽、如权利要求8至9中任一项所述的组合物、如权利要求10所述的颗粒、如权利要求11所述的动物饲料添加剂或如权利要求12所述的液体配制品。

14.一种改善动物的一个或多个性能参数的方法，该方法包括向一个或多个动物给予一种或多种如权利要求6至7中任一项所述的多肽、如权利要求8至9中任一项所述的组合物、如权利要求10所述的颗粒、如权利要求11所述的动物饲料添加剂、如权利要求12所述的液体配制品或如权利要求13所述的动物饲料。

15.一种用于改善动物饲料营养价值的方法，该方法包括向该饲料中添加一种或多种如权利要求6至7中任一项所述的多肽、如权利要求8至9中任一项所述的组合物、如权利要求10所述的颗粒、如权利要求11所述的动物饲料添加剂或如权利要求12所述的液体配制品。

16.一种制备动物饲料的方法，该方法包括将一种或多种如权利要求6至7中任一项所述的多肽、如权利要求8至9中任一项所述的组合物、如权利要求10所述的颗粒、如权利要求11所述的动物饲料添加剂或如权利要求12所述的液体配制品与基于植物的材料混合。

17.如权利要求6至7中任一项所述的多肽、如权利要求8至9中任一项所述的组合物、如权利要求10所述的颗粒、如权利要求11所述的动物饲料添加剂、如权利要求12所述的液体配制品或如权利要求13所述的动物饲料在以下各项中的用途：

在动物饲料中；

在动物饲料添加剂中；

在用于动物饲料的组合物的制备中；

用于改善动物饲料的营养价值；

用于增加动物饲料的消化率；

用于改善动物的一个或多个性能参数；和/或

用于从蔷薇亚纲的基于植物的材料中释放半乳糖。

18.一种多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求6至7中任一项所述的多肽。

19.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含如权利要求18所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导在表达宿主内产生该多肽的一个或多个控制序列。

20.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含如权利要求18所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个控制序列。

21.一种产生如权利要求6至7中任一项所述的多肽的方法，该方法包括：

(a)在有益于产生该多肽的条件下培养如权利要求20所述的重组宿主细胞；和

(b)回收该多肽。