CN1834222A - 臭曲霉菌株及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种臭曲霉菌株，该臭曲霉菌株保藏名称为：臭曲霉(Aspergillus foetidus)ZU－G1，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称：CGMCC，保藏日期：2006年03月03日，保藏号：CGMCCNo.1628。该臭曲霉ZU－G1用于生产α－半乳糖苷酶。

Description

臭曲霉菌株及其用途
技术领域
本发明涉及一种高产α-半乳糖苷酶的菌株，特别是一种臭曲霉菌株。
背景技术
α-半乳糖苷酶是一种以特异性水解半乳糖类寡糖和多聚半乳-(葡)甘露聚糖的非还原性末端α-1，6-半乳糖苷键为特征的寡糖水解酶，具有极大的经济价值和应用价值。近年来，α-半乳糖苷酶主要用于医药、饲料和食品等工业之中。α-半乳糖苷酶主要用作水解豆类中蜜二糖、棉籽糖、水苏糖和毛蕊花糖等低聚糖和半乳甘露聚糖的多糖，改善糖代谢等作用。
大豆将是随着人口增加同时粮食短缺状况下的理想粮食替代物，然而美中不足的是豆类所含的低聚糖如蜜二糖、棉籽糖、水苏糖和少量的毛蕊花糖不能被消化吸收，却被人体肠道细菌发酵，引起嗝气、肠鸣、腹胀、腹痛等症状，严重时引起渗透性腹泻。
在饲料工业中，豆类和饼粕饲料中含有α-半乳糖苷的棉籽糖、水苏糖和毛蕊花糖等的抗营养因子，可增殖畜禽后肠道微生物，产生二氧化碳、甲烷和氢气等气体，引起胀气，导致能量损失，增加食糜的通行速度，降低养分吸收。
为了消除这些不溶性低聚糖的抗营养作用，长期以来一直采用高温、高压、高湿和延长时间等方法压榨大豆，或者采用有机溶剂萃取法消除这些抗营养因子。但即使采取最适宜的加工工艺处理大豆，豆粕中仍然存在一定量的α-半乳糖苷。目前，我国α-半乳糖苷酶在豆乳制品中对非消化性寡糖降解的研究未见报道；在动物饲料中的应用还处于初步研究阶段，尤其与其他酶制剂的配伍研究未见报道，由此可见，利用微生物发酵法工业化、规模化地生产α-半乳糖苷酶有着广阔的应用发展前景。
目前也利用微生物生产α-半乳糖苷酶，但是现有的α-半乳糖苷酶产生菌多以固态发酵居多，限制了在豆奶制品中的应用，而且产酶水平普遍偏低，对产酶菌的发酵特性、营养特性和发酵成本并未进行系统的研究。因此探索其它新型、安全的α-半乳糖苷酶产生菌显得很有必要，具有极大的研究和开发价值。
发明内容
针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供一种能用于生产α-半乳糖苷酶的臭曲霉菌株。
本发明为达到以上目的，是通过这样的技术方案来实现的：提供一种臭曲霉菌株，该臭曲霉菌株保藏名称为：臭曲霉(Aspergillus foetidus)ZU-G1，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称：CGMCC，保藏日期：2006年03月03日，保藏号：CGMCC No.1628。
该臭曲霉ZU-G1为曲霉属，在察氏培养基上，菌株生长良好，形成圆形菌落，具有辐射状沟纹；菌丝体呈黄棕色，质地丝绒状，菌丝体周围形成边缘区，边缘区的菌丝稀疏向四周延伸；培养3～4天后可见菌落中央的菌丝顶部长出棕色的孢子头，6～7天后直径可达4.5～5cm，菌落背面有明显的辐射性褶皱，菌落反面无色，有土惺味；菌株具有典型的足细胞，分生孢子结构大量，黑褐色至碳黑色，分生孢子梗发生于基质，分生孢子球形或近球形，稍大，壁平滑或稍粗糙。
本发明的臭曲霉ZU-G1采用液体发酵工艺可生产α-半乳糖苷酶。
本发明采用统计优化方法对上述曲霉菌株的液体发酵产酶培养条件进行了系统优化，从而获得适合工业化生产的最佳培养条件和技术参数。本发明的菌株产α-半乳糖苷酶水平是现有液体发酵条件下报道的3～10倍，该酶的最适作用温度为60℃，较国内报道的同类酶耐热；最适pH为5.0，在酸性环境下稳定性很高，易于应用。本发明采用粗料培养基作为发酵原料，并获得了其培养基的组成，为α-半乳糖苷酶的大规模化生产降低生产成本提供依据。本发明的曲霉菌株及其代谢产物-α-半乳糖苷酶，不产生有害物质，能安全地作为食品级添加剂。
具体实施方式
1、菌种的分离及鉴定
1.1菌种筛选
从发酵豆制品：豆豉、臭豆腐、腐乳、酱醅(分别采集发酵4天、12天和60天)和腐烂的豆粕(用水浸泡后发酵5天)以及实验室保藏的酵母菌株、少孢根霉、点青霉、黑曲霉、米曲霉、纳豆芽孢杆菌中筛选，以其作为样品。将发酵豆制品采用增殖培养基富集培养，挑取单菌落于初筛培养基上，培养适宜时间后将在初筛培养基上显示蓝色的菌落挑出进行复筛。将发酵复筛得到一株产酶活性较高的菌株编号为G5，28℃培养96h酶活达到22.27U/mL；经60Co-γ诱变和N+离子束诱变，其酶活达33.18U/ml。
1.1.1筛选所用培养基及其培养方法：
富集及斜面培养基(g/L)：马铃薯200，葡萄糖20，琼脂20，蒸馏水1000ml，pH自然。
初筛培养基(g/L)：NaNO3 3，K2HPO4 1，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 0.5，FeSO40.01，棉籽糖30，琼脂20，x-α-Gal 2ml，蒸馏水1000ml，pH 6.0。
复筛培养基(g/L)：NaNO3 3，K2HPO4 1，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 0.5，FeSO40.01，棉籽糖30，蒸馏水1000ml，pH 6.0。
种子斜面及平板培养：28℃培养72h。
复筛发酵培养：发酵培养基30mL盛于250mL三角瓶中，接种后在旋转式摇床上28℃，转速200r/min，发酵培养96h。
发酵条件研究：发酵培养基30mL盛于250mL三角瓶中，接种用生理盐水冲洗的孢子1ml(孢子数约为106个/ml)，28℃在旋转式摇床上发酵培养96h，转速200r/min。
1.1.2胞外α-半乳糖苷酶产生菌的筛选分离方法：
采集到的样品先经增殖培养基培养72h后，稀释涂布于察氏培养基平板形成单菌落，再点种于初筛培养基上进行初筛。选择显示蓝色的菌落进行摇瓶发酵复筛，得到一株产酶活性较高的菌株编号为G5，并测定发酵液α-半乳糖苷酶活力。然后将此菌株G5先经750Gy的60Co-γ辐照，经初筛和复筛(培养基及培养方法见1.1.1)，将复筛酶活较高的菌株注入能量为20Kev，剂量为50×2.6×1013ions/cm2·s的N+离子束，经初筛和复筛(培养基及培养方法见1.1.1)，获得本发明的菌株。
1.2该微生物的特征描述和鉴定结果
上述本发明的菌株在察氏培养基上，菌株生长良好，形成圆形菌落，具有辐射状沟纹；菌丝体呈黄棕色，质地丝绒状，菌丝体周围形成边缘区，边缘区的菌丝稀疏向四周延伸。培养3～4天后可见菌落中央的菌丝顶部长出棕色的孢子头；6～7天后直径可达4.5-5cm，菌落背面有明显的辐射性褶皱，菌落反面无色，有土惺味，能利用亚硝酸盐。菌株具有典型的足细胞，分生孢子结构大量，黑褐色至碳黑色，分生孢子梗发生于基质，孢梗茎500-1000μm×8-18μm，分生孢子头的顶囊呈球形或近球形，直径20-30μm，分生孢子串生在小梗上，小梗双层生；梗基6-20μm×3μm，瓶梗5μm×3μm；分生孢子球形或近球形，稍大，4-5μm，壁平滑或稍粗糙。
综合其菌落形态、足细胞及分生孢子头的特征，可以鉴定为臭曲霉，并命名为臭曲霉ZU-G1(Aspergillus foetidus ZU-G1)。这是目前还未见报道和发明的产α-半乳糖苷酶新微生物资源。
对该菌株产的α-半乳糖苷酶的酶学性质进行了初步研究，发现酶的最适作用温度和pH分别为60℃、5.0；酶在30℃到50℃间热稳定性良好；该酶在酸性环境下稳定性很高；Ag+严重抑制α-半乳糖苷酶活性，而Ca2+、Fe2+在试验的浓度下对酶反而有激活作用。
1.3新微生物的命名和保藏情况
命名为臭曲霉ZU-G1(Aspergillus foetidus ZU-G1)保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2006年03月03日，保藏号：CGMCC No.1628。
2.该微生物的培养方法或繁殖方法
该臭曲霉产生α-半乳糖苷酶的发酵培养方法见下所示，首先采用种子培养基进行增殖培养，随后接入发酵培养基中在一定条件下培养一定时间后测定其酶活。产酶发酵培养基可以采用葡萄糖、棉籽糖等为发酵基质，也可以采用豆饼粉、麸皮为发酵原料。
种子培养方法：培养基(g/L)：马铃薯200，葡萄糖20，琼脂20，蒸馏水1000ml，pH自然。
摇瓶发酵培养方法：发酵温度为28℃，转速为200r/min，发酵培养一定时间后停止发酵，分析其α-半乳糖苷酶活性。
2.1摇瓶发酵培养法一：
培养基(g/L)：豆饼粉40.0、硝酸铵20.0、磷酸二氢钾2.0、硫酸镁2.0。
发酵培养方法：发酵培养基30ml盛于250ml三角瓶中，接1×106的孢子1ml，28℃培养96h小时后获得的α-半乳糖苷酶活为33.18U/ml。
2.2粗料摇瓶发酵培养法二：
发酵培养基成分如下(g/L)：豆粕20.0，麸皮20.0，磷酸氢二钾1.0，硫酸亚铁0.5，pH5.8。
发酵培养方法：发酵培养基30ml盛于250ml三角瓶中，接1×106的孢子1ml，28℃培养96h小时后获得的α-半乳糖苷酶活为34.77U/ml。
2.3粗料摇瓶发酵培养法三：
培养基(g/L)：豆粕35.0，麸皮20.0，磷酸氢二钾1.0，硫酸亚铁0.5，pH 6.4。
发酵培养方法：发酵培养基30ml盛于250ml三角瓶中，接1×106的孢子lml，28℃培养96h小时后获得的α-半乳糖苷酶活为62.79U/ml。
3、安全性研究
该菌株发酵生产的产物及其菌液经过浙江省疾病预防控制中心检测为经小鼠口服急性无毒，半致死剂量为10g/kg以上，食品上应用是安全的。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有液体发酵变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (3)

1、一种臭曲霉菌株，其特征是：该臭曲霉菌株保藏名称为：臭曲霉(Aspergillusfoetidus)ZU-G1，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称：CGMCC，保藏日期：2006年03月03日，保藏号：CGMCC No.1628。
2、根据权利要求1所述的臭曲霉菌株，其特征是：所述臭曲霉ZU-G1为曲霉属，在察氏培养基上，菌株生长良好，形成圆形菌落，具有辐射状沟纹；菌丝体呈黄棕色，质地丝绒状，菌丝体周围形成边缘区，边缘区的菌丝稀疏向四周延伸；培养3～4天后可见菌落中央的菌丝顶部长出棕色的孢子头，6～7天后直径可达4.5～5cm，菌落背面有明显的辐射性褶皱，菌落反面无色，有土惺味；菌株具有典型的足细胞，分生孢子结构大量，黑褐色至碳黑色，分生孢子梗发生于基质，分生孢子球形或近球形，稍大，壁平滑或稍粗糙。
3、如权利要求1或2所述的臭曲霉菌株，其特征是：所述臭曲霉ZU-G1用于生产α-半乳糖苷酶。
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