CN110331115A - 一种用于α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于α‑半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基及其应用，可有效快速寻找筛选出自然条件下产α‑半乳糖苷酶微生物的问题，培养基由：蜜二糖5.0～10.0g、棉子糖5.0～10.0g、水苏糖5.0～10.0g、蛋白胨5.0～8.0g、KCl 0.1～0.3g、Na₂HPO₄ 0.2～0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.5～1.0g、MnSO₄ 0.1～0.3g、X‑α‑Gal（5‑溴‑4‑氯‑3‑吲哚‑α‑D‑半乳糖苷）0.02～0.04g和琼脂20.0g加蒸馏水至1000mL，调pH7.1～7.5制成；把X‑α‑Gal溶解于二甲基甲酰胺中，过滤除菌；其余组分用蒸馏水溶解，灭菌，然后加入X‑α‑Gal溶液，混匀，加无菌蒸馏水至1000mL，调pH7.1～7.5，快速倒平板，即成。本发明操作简单方便易行，可快速筛选出α‑半乳糖苷酶产生菌，时间仅35h，有巨大的经济和社会效益。

Description

一种用于α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种用于α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基及其应用。

背景技术

α-半乳糖苷酶属于外切糖苷酶，水解酶的一种，能够特异性的水解半乳糖寡糖非还原端的α-1,6-半乳糖苷键，在食品、饲料、医药等领域都有很好的应用前景，日益受到重视，被认为是最有应用潜力的酶制剂（李楠，2014）。在食品工业中 主要用于在豆制品中加入α-半乳糖苷酶，分解α-半乳糖苷类寡糖类的抗营养因子，消除胀气和消化不良的现象，增加人类对豆类营养的吸收，α-半乳糖苷酶用于豆奶的发酵，水解豆奶中易使人胃胀气的棉子糖（蜜三糖）、水苏糖（四糖），利于人体消化（杨冠东，2006）。α-半乳糖苷是饲料中重要的抗营养因子，不能被单胃动物自身分泌的消化酶分解，引起肠道胀气、腹泻等不适症状，降低动物对能量和蛋白质的消化利用率，饲料中添加α-半乳糖苷酶是降解和消除α-半乳糖苷抗营养作用的有效方法（高研，2016），可以降解单胃动物不能消化的α-半乳糖苷类低聚寡糖，如棉子糖、水苏糖等，从而提高动物对饲料营养的利用率。蒋小丰等（2009）在仔猪上添加α-半乳糖苷酶，明显改善仔猪生产性能，显著提高蛋白质利用率；戴求仲等（2010）在肉鸡饲料中添加α-半乳糖苷酶，可有效促进有益菌的生长，改善肉鸡生长状况，明显降低料重比。在医药领域用于血型改造（宫锋，2005），治疗人类α-半乳糖苷酶缺乏引起的法布里病等（毕云枫，2017）。α-半乳糖苷酶在自然界分布广范，存在于动物、植物、微生物中，微生物发酵法是有工业应用前景的方法（陈国参，2019），利用微生物法生产α-半乳糖苷酶的方法有2种，一是采用基因工程方法，但因方法存在生物安全性等问题争论已久（李志军等，2002）、（孙建全，2008），不是应用于食品、饲料产品的最佳方案；另一种是采用自然选育方法筛选出对人体安全的微生物通过发酵法制备，在适宜的培养基等条件下提高其活力，寻找自然条件下产α-半乳糖苷酶微生物及高产酶量的微生物成为研究热点。

发明内容

针对上述情况，本发明的目的就是提供一种用于α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基及其应用，可有效快速寻找筛选出自然条件下产α-半乳糖苷酶微生物，解决采用自然选育方法筛选出对人体安全的微生物一系列难题，如自然筛选法周期长，一般需要1周甚至数周时间；操作人工成本高、样品处理繁琐的问题。

本发明的技术方案是，α-半乳糖苷酶为诱导酶，诱导物一般为α-半乳糖苷酶分解底物，

但不同来源的α-半乳糖苷酶的有底物特异性，某些产α-半乳糖苷酶的微生物在只有特定糖类的诱导下才大量合成该酶，采用蜜二糖、棉子糖（蜜三糖）、水苏糖（四糖）为复合碳源，同时蜜二糖、棉子糖（蜜三糖）、水苏糖（四糖）也为α-半乳糖苷酶的底物及诱导物，X-α-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷）是α-半乳糖苷酶的显色底物，在α-半乳糖苷酶的催化下无色的X-α-Gal水解后呈蓝色，基于这个特点，因此可以作为α-半乳糖苷酶活性的指示剂，在固体培养基上通过蓝色菌落的筛选，直接快速而简便的识别产α-半乳糖苷酶的微生物。据此，本发明一种用于α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基，所述的培养基是以下重量计的：蜜二糖5.0～10.0g、棉子糖5.0～10.0g、水苏糖5.0～10.0g、蛋白胨5.0～8.0g、KCl0.1～0.3g、Na₂HPO₄ 0.2～0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.5～1.0g、MnSO₄ 0.1～0.3g、X-α-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷）0.02～0.04g和琼脂20.0g加蒸馏水至1000mL，调pH7.1～7.5制成；其中，首先把X-α-Gal溶解于二甲基甲酰胺（DMF）中，制成质量浓度为20mg/mL的X-α-Gal溶液，0.22µm滤膜过滤除菌，得过滤除菌后的X-α-Gal溶液，备用；再将其余组分用蒸馏水溶解， 121℃灭菌20分钟，冷却至55℃，然后加入上述过滤除菌后的X-α-Gal溶液，混匀，加无菌蒸馏水至1000mL，用盐酸或氢氧化钠调节为pH7.1～7.5，快速倒平板，即成α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基平板。

一种用于α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基主要应用于快速筛选α-半乳糖苷酶产生菌。

本发明采用蜜二糖、棉子糖、水苏糖为复合碳源，添加显色剂X-α-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷)配制培养基筛选平板，可以快速筛选产α-半乳糖苷酶微生物，对新的微生物产α-半乳糖苷酶源进行筛选，积累微生物产α-半乳糖苷酶高产菌株和产酶基因，为α-半乳糖苷酶研究开发提供技术支持，培养基配方简单，蛋白胨、KCl、Na₂HPO₄、 MgSO₄·7H₂O、MnSO₄ 等为常规试剂，操作简单方便易行，可快速筛选出α-半乳糖苷酶产生菌，时间仅35h，有巨大的经济和社会效益。

具体实施方式

以下结合实施例和具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。

本发明在具体实施中可由以下实施例给出。

实施例1

本发明一种用于α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基，所述的培养基是以下重量计的：蜜二糖5.0g、棉子糖5.0g、水苏糖5.0g、蛋白胨5.0g、KCl 0.1g、Na2HPO4 0.2g、MgSO4·7H2O 0.5g、MnSO4 0.1g、X-α-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷）0.02g和琼脂20.0g加蒸馏水至1000mL，调pH7.1～7.5制成；其中，首先把X-α-Gal溶解于二甲基甲酰胺（DMF）中，制成质量浓度为20mg/mL的X-α-Gal溶液，0.22µm滤膜过滤除菌，得过滤除菌后的X-α-Gal溶液，备用；再将其余组分用蒸馏水溶解， 121℃灭菌20分钟，冷却至55℃，然后加入上述过滤除菌后的X-α-Gal溶液，混匀，加无菌蒸馏水至1000mL，用盐酸或氢氧化钠调节为pH7.1～7.5，快速倒平板，即成α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基平板。

实施例2

本发明一种用于α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基，所述的培养基是以下重量计的：蜜二糖10.0g、棉子糖10.0g、水苏糖10.0g、蛋白胨8.0g、KCl 0.3g、Na2HPO4 0.5g、MgSO4·7H2O 1.0g、MnSO4 0.3g、X-α-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷）0.04g和琼脂20.0g加蒸馏水至1000mL，调pH7.1～7.5制成；其中，首先把X-α-Gal溶解于二甲基甲酰胺（DMF）中，制成质量浓度为20mg/mL的X-α-Gal溶液，0.22µm滤膜过滤除菌，得过滤除菌后的X-α-Gal溶液，备用；再将其余组分用蒸馏水溶解， 121℃灭菌20分钟，冷却至55℃，然后加入上述过滤除菌后的X-α-Gal溶液，混匀，加无菌蒸馏水至1000mL，用盐酸或氢氧化钠调节为pH7.1～7.5，快速倒平板，即成α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基平板。

实施例3

本发明一种用于α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基，所述的培养基是以下重量计的：蜜二糖7.5g、棉子糖7.5g、水苏糖7.5g、蛋白胨6.5g、KCl 0.2g、Na2HPO4 0.35g、MgSO4·7H2O 0.75g、MnSO4 0.2g、X-α-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷）0.03g和琼脂20.0g加蒸馏水至1000mL，调pH7.1～7.5制成；其中，首先把X-α-Gal溶解于二甲基甲酰胺（DMF）中，制成质量浓度为20mg/mL的X-α-Gal溶液，0.22µm滤膜过滤除菌，得过滤除菌后的X-α-Gal溶液，备用；再将其余组分用蒸馏水溶解， 121℃灭菌20分钟，冷却至55℃，然后加入上述过滤除菌后的X-α-Gal溶液，混匀，加无菌蒸馏水至1000mL，用盐酸或氢氧化钠调节为pH7.1～7.5，快速倒平板，即成α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基平板。

本发明方法制备的α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基在α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选中的应用，包括以下步骤：

（1）无菌条件下用称取1.0g采集土样加入装有100mL灭菌冷却后的富集培养基中，于32℃、160r/min摇床震荡培养25h，得富集培养液；

所述富集培养基是由蜜二糖5.0g、棉子糖5.0g和水苏糖5.0g加蒸馏水至1000mL制成；

（2）取富集培养液分别用无菌水稀释至10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，分别取10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀释度（即稀释至原体积的1000倍、10000倍、100000倍、1000000倍、10000000倍）涂布于α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基平板表面，32℃恒温培养箱中培养35h，用接种环挑取蓝色单菌落进一步划线纯化，将纯化后的单菌落转接于菌种保藏培养基斜面试管上，32℃培养，观察菌落的生长情况，待长满菌落，即为α-半乳糖苷酶产生菌菌株，进行记录编号，置于甘油管中，放4℃冰箱中保存，备用；

（3）筛选出α-半乳糖苷酶产生菌菌株接种于液体培养基100 mL三角瓶中，32℃、160r/min摇床震荡培养35h，发酵培养液于4℃、10000r/min离心10min，收集上清液用于α-半乳糖苷酶酶活性分析；

所述的液体培养基是由：蜜二糖5.0g、棉子糖5.0g、水苏糖5.0g、蛋白胨5.0g、KCl0.1g、Na2HPO4 0.2g、MgSO4·7H2O 0.5g和MnSO4 0.1g加蒸馏水至1000mL，用盐酸或氢氧化钠调节为pH7.2制成，121℃灭菌20分钟；

所述的α-半乳糖苷酶酶活性分析：α-半乳糖苷酶的活力单位：在37℃，pH 5.0条件下，1min分解底物对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖苷（ρNPG）生成1µmol对硝基苯酚所需的酶量为1个酶活力单位（U）；

1.0mL底物ρNPG于37℃水浴预热2min，加入稀释酶液1.0mL，37℃水浴恒温震荡10min，加入8.0mL0.2mol/L碳酸钠溶液终止反应，以蒸馏水调零，在405nm下测量OD值；标准空白用稀释酶液1.0mL，先加入8.0mL0.2mol/L碳酸钠溶液震荡混匀，再1.0mL底物ρNPG于37℃水浴恒温震荡10min，以蒸馏水调零，在405nm下测量OD值：

计算公式：α-半乳糖苷酶酶活力（U/ mL）A＝[(Ax- A0)×K+C0]×Df/vt

式中：Ax样品酶液吸光度OD值；A0空白吸光度OD值；K对硝基酚标准曲线的斜率；C0对硝基酚标准曲线的截距；Df稀释倍数；v吸取样品酶液体积/mL；t反应时间/min。

标准曲线绘制：准确称取0.13910g 对硝基酚，用0.2mol/L碳酸钠溶液定容至100mL，再稀释配制成浓度分别为：0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 mmol/L的标准对硝基酚溶液。分别吸取1.0mL 上述稀释标准对硝基酚标准溶液(做3 个重复) 于试管中，分别加入1.0 mL0.05mol/L醋酸钠缓冲液（pH 5.0），加入8.0mL0.2mol/L碳酸钠溶液，振荡，以蒸馏水调零，在405 nm 处测定吸光度OD值。以对硝基酚浓度为Y轴，吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线。

本发明经试验和测试，效果非常好，有关资料如下：

试验1：（1）从郑州荥阳某豆制品加工厂长期堆放豆渣的周围土壤中采集土样，无菌条件下用称取1.0g采集土样加入装有100mL灭菌冷却后的富集培养基中，于32℃、160r/min摇床震荡培养25h，得富集培养液；

所述富集培养基是由蜜二糖5.0g、棉子糖5.0g和水苏糖5.0g加蒸馏水至1000mL制成；

（2）取富集培养液分别用无菌水稀释至10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7，分别取10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7稀释度（即稀释至原体积的1000倍、10000倍、100000倍、1000000倍、10000000倍）涂布于α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基平板（实施例1）表面，32℃恒温培养箱中培养28h，用接种环挑取蓝色单菌落进一步划线纯化，将纯化后的单菌落转接于菌种保藏培养基斜面试管上，32℃培养，观察菌落的生长情况，待长满菌落，即为α-半乳糖苷酶产生菌菌株，进行记录编号，置于甘油管中，放4℃冰箱中保存，备用；

（3）从步骤（2）筛选出一个α-半乳糖苷酶产生菌菌株，进行分子生物学鉴定，以提取的菌株的DNA为模板，采用细菌提取扩增通用引物27F:5,-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3和1492R:5,-GGTTACCTTGTTACGACTT-3进行PCR扩增，菌株测序后，得到完整的16S rDNA的基因序列，其测序序列片段长度为1416bp，具体序列为：

GCTGGCTCCAAAAAGGTTACCCCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCG

TGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCA

TGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGTAGGCGAGTTGCAG

CCTACAATCCGAACTGAGAACGGTTTTATGAGATTAGCTCCACCTCGCGG

TCTTGCAGCTCTTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCA

TAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCAC

CGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTAAATGATGGCAACTAAAATCAAGG

GTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACG

ACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCTCCCGAAGGAGAAGCCCTATCTC

TAGGGTTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTC

GAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTT

GAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTA

ACTTCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTT

ACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCG

CGCCTCAGTGTCAGTTACAGACCAGAAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTC

CTCCATATCTCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTTTCCTC

TTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCGT

GGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCACCTGCGCGCGCTTTACGCCCAA

TAATTCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACG

TAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCAGCTTATTC

AACTAGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCT

TCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGA

TTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGT

GTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCC

GTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGACGCGGGTCCATCCATAAGTGACAG

CCGAAGCCGCCTTTCAATTTCGAACCATGCGGTTCAAAATGTTATCCGGT

ATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTATGGGCAGGTTACCCA

CGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACTTCATAAGAGCAAGCTCTTAATC

CATTCGCTCGACTTGC，将测序结果基因序列提交到GenBank核酸序列数据库中与已有的相关同源序列BALST比对分析，初步鉴定为芽孢杆菌（Bacillus sp）。

将该菌株接种于液体培养基100 mL三角瓶中，32℃、160r/min摇床震荡培养35h，发酵培养液于4℃、10000r/min离心10min，收集上清液用于α-半乳糖苷酶酶活性分析；

所述的液体培养基是由：蜜二糖5.0g、棉子糖5.0g、水苏糖5.0g、蛋白胨5.0g、KCl0.1g、Na2HPO4 0.2g、MgSO4·7H2O 0.5g和MnSO4 0.1g加蒸馏水至1000mL，用盐酸或氢氧化钠调节为pH7.2制成，121℃灭菌20分钟；

所述的α-半乳糖苷酶酶活性分析：α-半乳糖苷酶的活力单位：在37℃，pH 5.0条件下，1min分解底物对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖苷（ρNPG）生成1µmol对硝基苯酚所需的酶量为1个酶活力单位（U）；

标准曲线绘制：准确称取0.13910g 对硝基酚，用0.2mol/L碳酸钠溶液定容至100 mL，再稀释配制成浓度分别为：0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 mmol/L的标准对硝基酚溶液。分别吸取1.0mL 上述稀释对硝基酚标准溶液(做3 个重复) 于试管中，分别加入1.0 mL0.05mol/L醋酸钠缓冲液（pH 5.0），加入8.0mL0.2mol/L碳酸钠溶液，振荡，以蒸馏水调零，在405 nm 处测定吸光度OD值。以对硝基酚浓度为Y轴，吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线。

1.0mL底物ρNPG于37℃水浴预热2min，加入稀释酶液1.0mL，37℃水浴恒温震荡10min，加入8.0mL0.2mol/L碳酸钠溶液终止反应，以蒸馏水调零，在405nm下测量OD值；标准空白用稀释酶液1.0mL，先加入8.0mL0.2mol/L碳酸钠溶液震荡混匀，再1.0mL底物ρNPG于37℃水浴恒温震荡10min，以蒸馏水调零，在405nm下测量OD值：

计算公式：α-半乳糖苷酶酶活力（U/ mL）A＝[(Ax- A0)×K+C0]×Df/vt

式中：Ax样品酶液吸光度OD值；A0空白吸光度OD值；K对硝基酚标准曲线的斜率；C0对硝基酚标准曲线的截距；Df稀释倍数；v吸取样品酶液体积/mL；t反应时间/min。

计算出该α-半乳糖苷酶产生菌菌株产α-半乳糖苷酶酶活力为11.5 U/mL，可以验证快速筛选的培养基平板表面的蓝色单菌落菌株为α-半乳糖苷酶产生菌。

试验2：（1）从河南郑州花园口紫花苜蓿草种植土壤中采集土样，无菌条件下用称取1.0g采集土样加入装有100mL灭菌冷却后的富集培养基中，于32℃、160r/min摇床震荡培养25h，得富集培养液；

所述富集培养基是由蜜二糖5.0g、棉子糖5.0g和水苏糖5.0g加蒸馏水至1000mL制成；

（2）取富集培养液分别用无菌水稀释至10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7，分别取10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7稀释度（即稀释至原体积的1000倍、10000倍、100000倍、1000000倍、10000000倍）涂布于α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基平板（实施例2）表面，32℃恒温培养箱中培养35h，用接种环挑取蓝色单菌落进一步划线纯化，将纯化后的单菌落转接于菌种保藏培养基斜面试管上，32℃培养，观察菌落的生长情况，待长满菌落，即为α-半乳糖苷酶产生菌菌株，进行记录编号，置于甘油管中，放4℃冰箱中保存，备用；

（3）从步骤（2）中筛选出一个α-半乳糖苷酶产生菌菌株，进行分子生物学鉴定，以提取的菌株的DNA为模板，采用真菌提取扩增通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增，PCR扩增产物送华大基因完成测序，基因序列片段长度为600bp，具体序列为：

CCTCAGGGTGACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGCGGGTCCTTTGGGCCCAACCTCCCATCCGTGTCTATTGTACCCTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCGCTTGTCGGCCGCCGGGGGGGCGCCTCTGCCCCCCGGGCCCGTGCCCGCCGGAGACCCCAACACGAACACTGTCTGAAAGCGTGCAGTCTGAGTTGATTGAATGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTCGCCGTCCCCCTCTCCGGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACATGCTCTGTAGGATTGGCCGGCGCCTGCCGACGTTTTCCAACCATTCTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGGAGGAA，将菌株测序序列在NCBI上提交Genbank数据库进行BLAST同源性序列比对相似性分析，初步鉴定为黑曲霉（Aspergillus niger）。

将该菌株接种于液体培养基100 mL三角瓶中，32℃、160r/min摇床震荡培养35h，发酵培养液于4℃、10000r/min离心10min，收集上清液用于α-半乳糖苷酶酶活性分析；

所述的液体培养基是由：蜜二糖5.0g、棉子糖5.0g、水苏糖5.0g、蛋白胨5.0g、KCl0.1g、Na2HPO4 0.2g、MgSO4·7H2O 0.5g和MnSO4 0.1g加蒸馏水至1000mL，用盐酸或氢氧化钠调节为pH7.2制成，121℃灭菌20分钟；

所述的α-半乳糖苷酶酶活性分析：α-半乳糖苷酶的活力单位：在37℃，pH 5.0条件下，1min分解底物对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖苷（ρNPG）生成1µmol对硝基苯酚所需的酶量为1个酶活力单位（U）；

标准曲线绘制：准确称取0.13910g 对硝基酚，用0.2mol/L碳酸钠溶液定容至100 mL，再稀释配制成浓度分别为：0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 mmol/L的标准对硝基酚溶液。分别吸取1.0mL 上述稀释对硝基酚标准溶液(做3 个重复) 于试管中，分别加入1.0 mL0.05mol/L醋酸钠缓冲液（pH 5.0），加入8.0mL0.2mol/L碳酸钠溶液，振荡，以蒸馏水调零，在405 nm 处测定吸光度OD值。以对硝基酚浓度为Y轴，吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线。

1.0mL底物ρNPG于37℃水浴预热2min，加入稀释酶液1.0mL，37℃水浴恒温震荡10min，加入8.0mL0.2mol/L碳酸钠溶液终止反应，以蒸馏水调零，在405nm下测量OD值；标准空白用稀释酶液1.0mL，先加入8.0mL0.2mol/L碳酸钠溶液震荡混匀，再1.0mL底物ρNPG于37℃水浴恒温震荡10min，以蒸馏水调零，在405nm下测量OD值：

计算公式：α-半乳糖苷酶酶活力（U/ mL）A＝[(Ax- A0)×K+C0]×Df/vt

式中：Ax样品酶液吸光度OD值；A0空白吸光度OD值；K对硝基酚标准曲线的斜率；C0对硝基酚标准曲线的截距；Df稀释倍数；v吸取样品酶液体积/mL；t反应时间/min。

计算出该α-半乳糖苷酶产生菌菌株产α-半乳糖苷酶酶活力为1.02 U/mL，可以验证快速筛选的培养基平板表面的蓝色单菌落菌株为α-半乳糖苷酶产生菌。

试验3：

按照试验1或试验2的方法，对实施例3以及其他组分在有效用量范围内进行任何量的组合所制成的用于α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基，均取得了相同或相近似的结果，这里不再一一详述，试验表明，本发明制备的用于α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基以及在快速筛选α-半乳糖苷酶产生菌中的应用，性能稳定，方法稳定可靠，具有很强的实际应用价值。

土壤是微生物生长生活的大本营，是寻找和发现有重要应用潜力的微生物的主要菌源，一般步骤是：采集土样，富集培养，纯种分离，性能测定等。微生物培养基是微生物生长的基质，是供微生物生长和维持用的人工配制的养料，一般包括碳源、氮源、无机盐等，按照微生物营养、生长繁殖的需要配制而成。与现有技术相比，具有：

（1）选择性强，培养基属于选择性培养基，用来选择性筛选α-半乳糖苷酶产生菌；α-半乳糖苷酶产生菌直接采用平板划线或稀释法进行分离，难以奏效。α-半乳糖苷酶是一种诱导酶，只有在诱导物存在的情况下才会产生，采用蜜二糖、棉子糖、水苏糖为复合碳源既满足了菌株碳源的需要，同时蜜二糖、棉子糖、水苏糖也是α-半乳糖苷酶的诱导物，可使土样中的产α-半乳糖苷酶微生物变成优势种群，达到筛选所需微生物的目的，从而提高了筛选效率；

（2）具有鉴别性，培养基属于鉴别培养基，可以鉴别α-半乳糖苷酶产生菌，培养基中X-α-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷）是α-半乳糖苷酶的显色底物，在α-半乳糖苷酶的催化下无色的X-α-Gal水解后呈蓝色，特异性强，灵敏度高，可以快速鉴别筛选；

（3）培养基配方中采用蜜二糖、棉子糖、水苏糖为复合碳源，限制了不能利用蜜二糖、棉子糖、水苏糖其它杂菌的生长；培养基pH7.1～7.5，控制不在pH7.1～7.5生长范围内杂菌的生长；蛋白胨、KCl、Na₂HPO₄、MgSO₄·7H₂O、MnSO₄满足了菌株氮源及无机盐的需求；

（4）分离时间短，劳动强度低，一次培养即确定产α-半乳糖苷酶菌株。按照一般筛选程序，纯种分离需要反复涂布（划线）平板，每个单菌落都需要性能测定，依据酶的专一性，即酶对作用的底物有严格的选择性，一种酶只对某一种物质起催化作用最终确定产α-半乳糖苷酶菌株，时间长达7-10天甚至更长，工作量大。本发明只需一次培养即确定产α-半乳糖苷酶菌株，时间只需35h左右，生产效率高，劳动强度小，经济和社会效益巨大。

序列表

<110> 河南省科学院生物研究所有限责任公司

河南省科学院生物研究所有限责任公司

<120> 一种用于α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基及其应用一种用于α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1416

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌(Bacillus sp.)

<400> 1

gctggctcca aaaaggttac cccaccgact tcgggtgtta caaactctcg tggtgtgacg 60

ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgcggca tgctgatccg cgattactag 120

cgattccagc ttcatgtagg cgagttgcag cctacaatcc gaactgagaa cggttttatg 180

agattagctc cacctcgcgg tcttgcagct ctttgtaccg tccattgtag cacgtgtgta 240

gcccaggtca taaggggcat gatgatttga cgtcatcccc accttcctcc ggtttgtcac 300

cggcagtcac cttagagtgc ccaactaaat gatggcaact aaaatcaagg gttgcgctcg 360

ttgcgggact taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg acaaccatgc accacctgtc 420

actctgctcc cgaaggagaa gccctatctc tagggttgtc agaggatgtc aagacctggt 480

aaggttcttc gcgttgcttc gaattaaacc acatgctcca ccgcttgtgc gggcccccgt 540

caattccttt gagtttcagc cttgcggccg tactccccag gcggagtgct taatgcgtta 600

acttcagcac taaagggcgg aaaccctcta acacttagca ctcatcgttt acggcgtgga 660

ctaccagggt atctaatcct gtttgctccc cacgctttcg cgcctcagtg tcagttacag 720

accagaaagt cgccttcgcc actggtgttc ctccatatct ctacgcattt caccgctaca 780

catggaattc cactttcctc ttctgcactc aagtctccca gtttccaatg accctccacg 840

gttgagccgt gggctttcac atcagactta agaaaccacc tgcgcgcgct ttacgcccaa 900

taattccgga taacgcttgc cacctacgta ttaccgcggc tgctggcacg tagttagccg 960

tggctttctg gttaggtacc gtcaaggtgc cagcttattc aactagcact tgttcttccc 1020

taacaacaga gttttacgac ccgaaagcct tcatcactca cgcggcgttg ctccgtcaga 1080

ctttcgtcca ttgcggaaga ttccctactg ctgcctcccg taggagtctg ggccgtgtct 1140

cagtcccagt gtggccgatc accctctcag gtcggctacg catcgttgcc ttggtgagcc 1200

gttacctcac caactagcta atgcgacgcg ggtccatcca taagtgacag ccgaagccgc 1260

ctttcaattt cgaaccatgc ggttcaaaat gttatccggt attagccccg gtttcccgga 1320

gttatcccag tcttatgggc aggttaccca cgtgttactc acccgtccgc cgctaacttc 1380

ataagagcaa gctcttaatc cattcgctcg acttgc 1416

<210> 1

<211> 600

<212> DNA

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 1

cctcagggtg acctgcggaa ggatcattac cgagtgcggg tcctttgggc ccaacctccc 60

atccgtgtct attgtaccct gttgcttcgg cgggcccgcc gcttgtcggc cgccgggggg 120

gcgcctctgc cccccgggcc cgtgcccgcc ggagacccca acacgaacac tgtctgaaag 180

cgtgcagtct gagttgattg aatgcaatca gttaaaactt tcaacaatgg atctcttggt 240

tccggcatcg atgaagaacg cagcgaaatg cgataactaa tgtgaattgc agaattcagt 300

gaatcatcga gtctttgaac gcacattgcg ccccctggta ttccgggggg catgcctgtc 360

cgagcgtcat tgctgccctc aagcccggct tgtgtgttgg gtcgccgtcc ccctctccgg 420

ggggacgggc ccgaaaggca gcggcggcac cgcgtccgat cctcgagcgt atggggcttt 480

gtcacatgct ctgtaggatt ggccggcgcc tgccgacgtt ttccaaccat tctttccagg 540

ttgacctcgg atcaggtagg gatacccgct gaacttaagc atatcaataa gcgggaggaa 600

Claims (5)

1.一种用于α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基，其特征在于，所述的培养基是以下重量计的：蜜二糖5.0～10.0g、棉子糖5.0～10.0g、水苏糖5.0～10.0g、蛋白胨5.0～8.0g、KCl 0.1～0.3g、Na₂HPO₄ 0.2～0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.5～1.0g、MnSO₄ 0.1～0.3g、X-α-Gal 0.02～0.04g和琼脂20.0g加蒸馏水至1000mL，调pH7.1～7.5制成；其中，首先把X-α-Gal溶解于二甲基甲酰胺中，制成质量浓度为20mg/mL的X-α-Gal溶液，0.22µm滤膜过滤除菌，得过滤除菌后的X-α-Gal溶液，备用；再将其余组分用蒸馏水溶解， 121℃灭菌20分钟，冷却至55℃，然后加入上述过滤除菌后的X-α-Gal溶液，混匀，加无菌蒸馏水至1000mL，用盐酸或氢氧化钠调节为pH7.1～7.5，快速倒平板，即成α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基平板。

2.根据权利要求1所述的用于α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基，其特征在于，所述的培养基是以下重量计的：蜜二糖5.0g、棉子糖5.0g、水苏糖5.0g、蛋白胨5.0g、KCl0.1g、Na2HPO4 0.2g、MgSO4·7H2O 0.5g、MnSO4 0.1g、X-α-Gal 0.02g和琼脂20.0g加蒸馏水至1000mL，调pH7.1～7.5制成；其中，首先把X-α-Gal溶解于二甲基甲酰胺中，制成质量浓度为20mg/mL的X-α-Gal溶液，0.22µm滤膜过滤除菌，得过滤除菌后的X-α-Gal溶液，备用；再将其余组分用蒸馏水溶解， 121℃灭菌20分钟，冷却至55℃，然后加入上述过滤除菌后的X-α-Gal溶液，混匀，加无菌蒸馏水至1000mL，用盐酸或氢氧化钠调节为pH7.1～7.5，快速倒平板，即成α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基平板。

3.根据权利要求1所述的用于α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基，其特征在于，所述的培养基是以下重量计的：蜜二糖10.0g、棉子糖10.0g、水苏糖10.0g、蛋白胨8.0g、KCl0.3g、Na2HPO4 0.5g、MgSO4·7H2O 1.0g、MnSO4 0.3g、X-α-Gal 0.04g和琼脂20.0g加蒸馏水至1000mL，调pH7.1～7.5制成；其中，首先把X-α-Gal溶解于二甲基甲酰胺中，制成质量浓度为20mg/mL的X-α-Gal溶液，0.22µm滤膜过滤除菌，得过滤除菌后的X-α-Gal溶液，备用；再将其余组分用蒸馏水溶解， 121℃灭菌20分钟，冷却至55℃，然后加入上述过滤除菌后的X-α-Gal溶液，混匀，加无菌蒸馏水至1000mL，用盐酸或氢氧化钠调节为pH7.1～7.5，快速倒平板，即成α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基平板。

4.根据权利要求1所述的用于α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基，其特征在于，所述的培养基是以下重量计的：蜜二糖7.5g、棉子糖7.5g、水苏糖7.5g、蛋白胨6.5g、KCl0.2g、Na2HPO4 0.35g、MgSO4·7H2O 0.75g、MnSO4 0.2g、X-α-Gal 0.03g和琼脂20.0g加蒸馏水至1000mL，调pH7.1～7.5制成；其中，首先把X-α-Gal溶解于二甲基甲酰胺中，制成质量浓度为20mg/mL的X-α-Gal溶液，0.22µm滤膜过滤除菌，得过滤除菌后的X-α-Gal溶液，备用；再将其余组分用蒸馏水溶解， 121℃灭菌20分钟，冷却至55℃，然后加入上述过滤除菌后的X-α-Gal溶液，混匀，加蒸馏水至1000mL，用盐酸或氢氧化钠调节为pH7.1～7.5，快速倒平板，即成α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基平板。

5.权利要求1-4所述的用于α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基在α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选中的应用，包括以下步骤：

（1）无菌条件下用称取1.0g采集土样加入装有100mL灭菌冷却后的富集培养基中，于32℃、160r/min摇床震荡培养25h，得富集培养液；

所述富集培养基是由蜜二糖5.0g、棉子糖5.0g和水苏糖5.0g加蒸馏水至1000mL制成；

（2）取富集培养液分别用无菌水稀释至10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，分别取10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀释度涂布于α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基平板表面，32℃恒温培养箱中培养35h，用接种环挑取蓝色单菌落进一步划线纯化，将纯化后的单菌落转接于菌种保藏培养基斜面试管上，32℃培养，观察菌落的生长情况，待长满菌落，即为α-半乳糖苷酶产生菌菌株，进行记录编号，置于甘油管中，放4℃冰箱中保存，备用；

（3）筛选出α-半乳糖苷酶产生菌菌株接种于液体培养基100 mL三角瓶中，32℃、160r/min摇床震荡培养35h，发酵培养液于4℃、10000r/min离心10min，收集上清液用于α-半乳糖苷酶酶活性分析；

所述的液体培养基是由：蜜二糖5.0g、棉子糖5.0g、水苏糖5.0g、蛋白胨5.0g、KCl0.1g、Na2HPO4 0.2g、MgSO4·7H2O 0.5g和MnSO4 0.1g加蒸馏水至1000mL，用盐酸或氢氧化钠调节为pH7.2制成，121℃灭菌20分钟；

所述的α-半乳糖苷酶酶活性分析：α-半乳糖苷酶的活力单位：在37℃，pH 5.0条件下，1min分解底物对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖苷生成1µmol对硝基苯酚所需的酶量为1个酶活力单位；

1.0mL底物ρNPG于37℃水浴预热2min，加入稀释酶液1.0mL，37℃水浴恒温震荡10min，加入8.0mL0.2mol/L碳酸钠溶液终止反应，以蒸馏水调零，在405nm下测量OD值；标准空白用稀释酶液1.0mL，先加入8.0mL0.2mol/L碳酸钠溶液震荡混匀，再1.0mL底物ρNPG于37℃水浴恒温震荡10min，以蒸馏水调零，在405nm下测量OD值：

计算公式：α-半乳糖苷酶酶活力（U/ mL）A＝[(Ax- A0)×K+C0]×Df/vt

式中：Ax样品酶液吸光度OD值；A0空白吸光度OD值；K对硝基酚标准曲线的斜率；C0对硝基酚标准曲线的截距；Df稀释倍数；v吸取样品酶液体积/mL；t反应时间/min。