CN105176849A - 一种高产扬奇青霉α-半乳糖苷酶的里氏木霉菌株的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株高产扬奇青霉α-半乳糖苷酶的里氏木霉菌株的制备方法及其应用。本发明的高产扬奇青霉α-半乳糖苷酶的里氏木霉菌株是将扬奇青霉α-半乳糖苷酶的编码基因和筛选标记基因导入宿主里氏木霉菌Trichoderma？reesei得到的菌。本发明利用里氏木霉cbh1强启动子及其信号肽序列在里氏木霉中实现了扬奇青霉α-半乳糖苷酶的高效分泌表达。通过试验证明：对高产扬奇青霉α-半乳糖苷酶的里氏木霉菌株进行发酵获得的发酵液的酶活力单位可达到119.16U/ml，且本发明的发酵工艺简单、原料廉价易得，大大降低了生产成本，非常适合工业生产及应用。

Description

一种高产扬奇青霉α-半乳糖苷酶的里氏木霉菌株的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株高产扬奇青霉α-半乳糖苷酶的里氏木霉菌株的制备方法及其应用。

背景技术

α-半乳糖苷酶(α-D-galactosidegalactohydrolase；EC3.2.1.22)是一种外切糖苷酶，能特异性水解糖链非还原末端的α-1,6-半乳糖苷键。它能够催化含α-半乳糖苷键的寡糖水解，如蜜二糖、棉子糖、水苏糖、毛蕊花糖等，同时还能够催化含该键的杂多糖水解，如α一半乳甘露聚糖等。已有研究表明，α-半乳糖苷酶在工业中有着巨大应用前景。比如饲料工业中，α-半乳糖苷酶能够有效除去豆粕饲料中的抗营养因子，提高饲料中营养物质的利用率；制糖工业中，α-半乳糖苷酶能够提高蔗糖得率，降低制糖成本；造纸业中，α-半乳糖苷酶能够协同甘露聚糖酶的作用提高纸张的漂白效果；在医疗行业中，α-半乳糖苷酶在治疗Fabry病和Schindler病以及血型改造方面都有着重要的应用价值。

α-半乳糖苷酶广泛存在于动物、植物及微生物中，但与微生物相比，动植物体内该酶的含量少且提取纯化工艺复杂。目前α-半乳糖苷酶主要来源于黑曲霉及青霉，但利用原菌株发酵的产量较低，成本较高。近年来利用基因工程技术克隆新的α-半乳糖苷酶基因并在常用表达宿主中表达已成为主要研究趋势，且酶的产量与原菌株相比有较大提高(表1)。其中毕赤酵母中表达的α-半乳糖苷酶产量最高，酶活特异性好，但仍未达到工业生产水平，发酵过程中需转接且需要用大量的甲醇进行诱导，程序繁琐，成本高，更为重要的是巴斯德毕赤酵母不是FDA认证的GRAS微生物，生物安全性存在隐患，不适用于食品医疗中的应用。因此，开发安全性高、发酵提纯工艺简单、成本低的新的表达系统是十分必要的。

里氏木霉(Trichodermareesei)是美国FDA认证的安全生产菌株，蛋白表达分泌能力强，某些突变株的胞外蛋白分泌量可达到100g/L，并且具有与高等哺乳动物相似的糖基化修饰系统，因此里氏木霉非常适合表达真核来源的药用、食品级蛋白。

表1、近期不同宿主表达α-半乳糖苷酶的相关研究

发明内容

本发明的一个目的是提供一种重组菌。

本发明提供的重组菌，为如下1)或2)：

1)所示的重组菌是将扬奇青霉α-半乳糖苷酶的编码基因导入宿主里氏木霉菌Trichodermareesei，得到的菌；

2)所示的重组菌是将扬奇青霉α-半乳糖苷酶的编码基因和筛选标记基因导入宿主里氏木霉菌Trichodermareesei，得到的菌；

所述扬奇青霉α-半乳糖苷酶的氨基酸序列为序列3。

上述重组菌中，所述扬奇青霉α-半乳糖苷酶的编码基因是通过表达扬奇青霉α-半乳糖苷酶的重组载体导入宿主里氏木霉菌；

上述重组菌中，所述表达扬奇青霉α-半乳糖苷酶的重组载体为pSK-Pagl-Histag重组载体；

所述pSK-Pagl-Histag重组载体是将所述扬奇青霉α-半乳糖苷酶的编码基因插入pSK-Pcbh1-sig-Tcbh1载体的多克隆位点得到的。

上述重组菌中，所述筛选标记基因为pyr4基因。

上述重组菌中，所述pyr4基因是通过pSK-pyr4重组载体导入宿主里氏木霉菌；

所述pSK-pyr4重组载体是将pyr4基因插入pBluescriptSK(+)载体的多克隆位点得到的。

上述重组菌中，所述扬奇青霉α-半乳糖苷酶的编码基因的核苷酸序列为序列1；所述pyr4基因的核苷酸序列为序列2。

上述重组菌中，所述里氏木霉菌为尿嘧啶缺陷型里氏木霉菌。

本发明的另一个目的是提供上述重组菌的新用途。

本发明提供了上述重组菌在生产α-半乳糖苷酶中的应用。

本发明还提供了上述重组菌在提高α-半乳糖苷酶活力中的应用。

本发明的最后一个目的是提供一种生产扬奇青霉α-半乳糖苷酶的方法。

本发明提供的生产扬奇青霉α-半乳糖苷酶的方法包括如下步骤：发酵培养上述重组菌，得到所述扬奇青霉α-半乳糖苷酶。

上述方法中，所述培养的条件为30℃培养7天。

上述方法中，所述发酵的培养基为玉米浆工业发酵培养基；所述玉米浆工业发酵培养基由溶质和溶剂组成，所述溶剂为水，所述溶质在所述玉米浆工业发酵培养基中的浓度为玉米芯1.5g/30ml；麸皮0.9g/30ml；玉米浆1.5％(体积分数)。

本发明去除了扬奇青霉α-半乳糖苷酶基因自身的信号肽序列，选用了里氏木霉cbh1基因的启动子、信号肽及终止子来构建表达载体，将来自扬奇青霉的α-半乳糖苷酶基因定点整合到里氏木霉基因组中的高效表达位点——cbh1基因位点，得到高产扬奇青霉α-半乳糖苷酶的里氏木霉菌株，利用里氏木霉cbh1强启动子及其信号肽序列在里氏木霉中实现了扬奇青霉α-半乳糖苷酶的高效分泌表达。通过试验证明：对高产扬奇青霉α-半乳糖苷酶的里氏木霉菌株进行发酵获得的发酵液的酶活力单位可达到119.16U/ml。本发明的发酵工艺简单，只需将孢子液接种至玉米芯发酵培养基中即可，不需转接，且本发明的原料廉价易得，大大降低成本，非常适合工业生产及应用。

附图说明

图1为里氏木霉α-半乳糖苷酶表达菌株阳性转化子的PCR鉴定结果。图1A为里氏木霉α-半乳糖苷酶阳性转化子的PCR验证示意图；图1B为阳性转化子的PCR验证核酸电泳图。其中，1-4泳道为阳性转化子的PCR结果，5-8泳道为△tku70菌株的PCR结果，1、5为Paglorf片段验证，2、6为Paglup片段验证，3、7为Pagldown片段验证，4、8为cbh1orf片段验证。

图2为里氏木霉α-半乳糖苷酶表达菌株阳性转化子的SDS-PAGE鉴定。其中，1为对照菌株△tku70菌株的发酵168h结果，2-7为阳性转化子pagl6发酵48h、72h、96h、120h、144h、168h结果。

图3为里氏木霉重组表达纯化的α半乳糖苷酶的SDS-PAGE鉴定。其中，1为纯化前样品，2为纯化穿透，3和4为纯化后样品。

图4为里氏木霉重组表达的α半乳糖苷酶最适温度。

图5为里氏木霉重组表达的α半乳糖苷酶温度稳定性。

图6为里氏木霉重组表达的α半乳糖苷酶最适pH。

图7为里氏木霉重组表达的α半乳糖苷酶pH稳定性。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的里氏木霉△tku70菌株为尿嘧啶缺陷型菌株，作为α-半乳糖苷酶的表达宿主，在文献“ZhangGuangtao,LukasHartl,AndreSchuster,etal.GenetargetinginanonhomologousendjoiningdeficientHypocreajecorina.JournalofBiotechnology,2009,139:146-151”中公开过，公众可从中国科学院微生物研究所获得。

下述实施例中的pBluescriptSK(+)购买自Stratagene公司，产品目录号VKS0288。

下述实施例中的MM培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其在MM培养基中的质量分数为：(NH₄)₂SO₄0.5％；KH₂PO₄1.5％；MgSO₄0.06％；CaCl₂0.06％；FeSO₄·7H₂O0.0005％；MnSO₄·H₂O0.00016％；ZnSO₄·7H₂O0.00014％；CoCl₂0.0002％；调pH5.3，115℃高压蒸汽灭菌。

下述实施例中的LB培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其在LB培养基中的质量分数为：蛋白胨1％；氯化钠1％；酵母提取物0.5％，自然pH，121℃高压蒸汽灭菌。

下述实施例中的pNPG溶液(15mM)的制备方法：准确称取0.45189gpNPG(对硝基苯α-D-吡喃半乳糖苷)，溶解到蒸馏水中定容至100ml。

下述实施例中的100mMpH5.2Mcllvaine缓冲液:51.5ml的0.2MNa₂HPO₄与48.5ml的0.lM柠檬酸混匀得到的。

下述实施例中的0.1M碳酸钠溶液的制备方法：准确称取10.599g无水碳酸钠，用蒸馏水溶解，定容至I000mL。

下述实施例中的(pNP)标准溶液的制备方法：将10mgpNP(对硝基酚)用0.1M碳酸钠溶液溶解并定容成lmg/mL的标准母液，然后稀释成0、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250mg/ml的pNP标准溶液，以制作标准曲线。

下述实施例中的质粒pSK-Pcbh1-sig-Tcbh1为在pBluescriptSK(+)载体上插入cbh1基因的启动子Pcbh1、信号肽sig和终止子Tcbh1后得到的载体；其中，pBluescriptSK(+)购买自Stratagene公司，产品目录号为VKS0288。

实施例1、高产扬奇青霉α-半乳糖苷酶的里氏木霉菌株的制备

一、高产扬奇青霉α-半乳糖苷酶的里氏木霉菌株的制备

1、扬奇青霉α-半乳糖苷酶表达载体的构建

(1)扬奇青霉α-半乳糖苷酶基因的扩增

以含有扬奇青霉α-半乳糖苷酶基因全序列质粒为模板，采用Pagl-F和Pagl-R引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，为序列表中序列1所示的DNA分子，即为不含信号肽的扬奇青霉α-半乳糖苷酶基因片段。引物序列如下(下划线代表酶切为点)：Pagl-F：5’-GGAATTCCAGGACTCAAACGCAAACCCAATCGTG-3’；Pagl-R：5’-GACTAGTCTAATGATGATGATGATGATGCTGCCTCTCCAACATCACAA-3’。

上述PCR扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃扩展延伸10min。

(2)扬奇青霉α-半乳糖苷酶表达载体pSK-Pagl-Histag的构建

用限制性内切酶EcoRI和SpeI双酶切质粒pSK-Pcbh1-sig-Tcbh1，回收大小为7.1kb的骨架载体，用限制性内切酶EcoRI和SpeI双酶切上述步骤(1)获得的PCR扩增产物，回收大小为2.2kb的DNA片段，连接大小为7.1kb的骨架载体和大小为2.2kb的DNA片段，得到pSK-Pagl-Histag重组载体。并对其进行测序验证。

测序结果表明：pSK-Pagl-Histag重组载体为将序列表中序列1所示的DNA分子插入pSK-Pcbh1-sig-Tcbh1载体的EcoRI和SpeI酶切位点间，且保持pSK-Pcbh1-sig-Tcbh1载体的其他序列不变得到的载体。pSK-Pagl-Histag重组载体表达扬奇青霉α-半乳糖苷酶，扬奇青霉α-半乳糖苷酶的氨基酸序列如序列表中序列3所示。

(3)含筛选基因质粒pSK-pyr4的构建

以里氏木霉基因组为模板，采用Fpyr4和Rpyr4引物进行PCR扩增，得到大小约为2.9kb的pyr4表达盒，pyr4表达盒的核苷酸序列如序列表中序列2所示。引物序列如下：Fpyr4：GACTAGACTGACCCCCCCG(下划线为HindIII酶切位点)；Rpyr4：CAACTGCATCCAAACCATCCTACC(下划线为ClaI酶切位点)。

用限制性内切酶HindIII和ClaI双酶切pBluescriptSK(+)载体，回收大小为3.0kb的骨架载体，用限制性内切酶HindIII和ClaI双酶切上述pyr4表达盒，回收大小为2.9kb的DNA片段，连接大小为3.0kb的骨架载体和大小为2.9kb的DNA片段，得到pSK-pyr4载体。并对其进行测序验证。

测序结果表明：pSK-pyr4载体为将序列表中序列2所示的DNA分子插入pBluescriptSK(+)载体的HindIII和ClaI酶切位点间，且保持pBluescriptSK(+)载体的其他序列不变得到的载体。

2、里氏木霉原生质体制备

(1)取培养在平板(马铃薯200g；葡萄糖20g；琼脂粉20g；自来水定容至1L，自然pH，115℃高压蒸汽灭菌)上新鲜的里氏木霉Tu6△tku70菌株的孢子，用适量无菌水洗涤孢子制成孢子悬液，200目筛子过滤除去残余的菌丝。将过滤的孢子悬液接种到装有100mLMM培养基的三角瓶中，28℃培养14h，至菌丝伸展，得到培养液；

(2)将步骤(1)获得的培养液经200目筛子过滤，收集菌体，无菌水洗涤2-3次，最后用1.2M的硫酸镁洗涤一次，让溶液自然流尽，得到洗涤后的菌体；

(3)将洗涤后的菌体冲洗到装有15mL裂解液的三角瓶中(裂解液是含有150mg的lysingenzyme和15mgcellulose的1.2M硫酸镁)30℃反应1.5h，显微镜下观察原生质体产生的情况，1h后每隔10min取样观察一次；

(4)当原生质体大量产生并仍有大量菌丝存在时，加等体积0.6M的山梨醇溶液终止反应，200目筛子过滤除去残余的菌丝，室温3000rpm离心10min收集原生质体沉淀；

(5)沿着沉淀一侧倒去上清，用1.0M山梨醇溶液重悬上述步骤(4)获得的原生质体沉淀，室温3000rpm离心10min；

(6)重复步骤(5)，弃上清，将原生质体悬浮于200微升1.0M山梨醇溶液中，血球板计数器观察并计数，得到里氏木霉原生质体。

3、转化

(1)用限制性内切酶AseI对上述步骤1获得的pSK-Pagl-Histag重组载体线性化，得到线性化的pSK-Pagl-Histag。在反应体系中加入1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)充分混匀，再加入2.5倍体积无水乙醇充分混匀后置于-20℃条件下反应30分钟，4℃、12000rpm离心15分钟，弃上清，留白色沉淀，用70％乙醇洗两次，再用ddH₂O溶解，使线性化片段的浓度达到微克级；

(2)将上述步骤1获得的pSK-pyr4载体及线性化的pSK-Pagl-Histag按摩尔比1:4的比例(总体积不超过20μl)加入到上述步骤2制备的里氏木霉原生质体中，轻轻混匀，加入50μl50％PEG4000混匀，冰浴30分钟，并以ddH₂O代替线性化的pSK-Pagl-Histag作为对照；

(3)向步骤(2)的产物中加入1ml50％PEG4000混匀室温放置20分钟；

(4)在步骤(3)的产物中加入1ml1M山梨醇，混匀后分装4支EP管，与冷却的含1M山梨醇的MM培养基混匀后铺于MM加1M山梨醇的底层培养基上；

(5)将上述平板放于30℃恒温培养箱培养4-7天。

4、里氏木霉α-半乳糖苷酶表达菌株转化子的筛选及分子鉴定

待转化子长出后，将其置于PDA平板上，30℃培养7天，孢子成熟后，用无菌水将孢子洗出制成孢子悬液，进行梯度稀释，涂布于含有0.1％TritonX100的MM培养基上培养。待长出菌丝后，抽提基因组DNA，进行PCR鉴定，得到高产扬奇青霉α-半乳糖苷酶的里氏木霉菌株，PCR鉴定的引物序列如表2所示。

里氏木霉α-半乳糖苷酶表达菌株阳性转化子的鉴定结果如图1所示：从图中可以看出：α-半乳糖苷酶基因已成功转化到里氏木霉基因中，且定点整合到cbh1基因位置。

表2、里氏木霉α-半乳糖苷酶表达菌株转化子分子鉴定所用引物

二、高产扬奇青霉α-半乳糖苷酶的里氏木霉菌株发酵生产α-半乳糖苷酶

1、发酵

将上述步骤一中的4获得的高产扬奇青霉α-半乳糖苷酶的里氏木霉菌株加入到30ml的玉米浆工业发酵培养基(玉米芯1.5g；麸皮0.9g；玉米浆1.5％(体积分数)；加30ml/瓶，调pH4.8，121℃高压蒸汽灭菌)中，使终浓度为10⁵个孢子/ml发酵液，并以△tku70菌株作为对照菌株，30℃，200rpm发酵7天，离心收集发酵液，通过SDS-PAGE及质谱鉴定，得到目的蛋白α-半乳糖苷酶。

SDS-PAGE鉴定结果如图2所示：1为对照菌株△tku70发酵168h的结果，2-7为阳性转化子发酵48h、72h、96h、120h、144h、168h的结果。从图中可以看出：发酵得到大小为100kDa的扬奇青霉来源的α-半乳糖苷酶(箭头指向为目的蛋白)，说明在里氏木霉中成功分泌表达了扬奇青霉来源的α-半乳糖苷酶，且表达量高。

2、纯化

通过镍柱将上述步骤1获得的发酵液进行纯化，得到纯化后的α-半乳糖苷酶。镍柱纯化所用Bindingbuffer为含500mMNaCl的50mMTris-HCl缓冲液(pH7.5)，Elutionbuffer为在bindingbuffer的基础上加500mM咪唑(调pH7.5)得到的。将纯化后的α-半乳糖苷酶4℃保存，用于下述的酶学性质测定。

里氏木霉重组表达纯化的α半乳糖苷酶的SDS-PAGE鉴定结果如图3所示：其中，1为纯化前样品，2为纯化穿透，3和4为纯化后样品。从图中可以看出：将发酵液通过镍柱纯化，得到特异的α-半乳糖苷酶条带，大小为100kDa。

三、α-半乳糖苷酶的酶活测定及酶学性质研究

1、酶活测定

(1)标准曲线的制作

分别在不同EP管中加入200μl不同浓度的pNP标准溶液(250、225、200、175、150、125、100、75、50、25、0μg/ml)，再分别加入800μl100mMMcllvaine缓冲液，于40℃水浴10min，然后加入5ml0.1M碳酸钠溶液，混匀后在405nm下测定吸光值，绘制标准曲线。

(2)α-半乳糖苷酶酶活测定

在EP管中将300μlMcllvaine缓冲液和500μlpNPG溶液(15mM)混匀，于40℃预热10min，再加入200μl适当稀释的α-半乳糖苷酶液(0.1μg/ml)，混匀后于40℃水浴10min，然后加入5ml0.1M的碳酸钠溶液终止反应，在405nm下测定吸光值。以热失活的酶做空白对照。根据标准曲线，计算α-半乳糖苷酶酶活。

将上述步骤二的1中获得的发酵液(168h)和上述步骤二的2中获得的纯化后的α-半乳糖苷酶液按上述酶活测定方法测定酶活。结果表明：上述发酵液中的α-半乳糖苷酶酶活可达119.16U/ml，纯化后的α-半乳糖苷酶液的酶活为601.7U/mg。

2、蛋白浓度测定方法

采用folin-酚法测定α-半乳糖苷酶液的蛋白浓度，测定方法参照鼎国Folin-酚蛋白定量试剂盒中的说明书，以牛血清蛋白(BSA)做标准曲线。

结果表明：上述步骤二的2中获得的纯化后的α-半乳糖苷酶液中的蛋白浓度为0.084mg/ml。

3、酶学性质研究

(1)最适温度

将上述步骤二的2中获得的纯化后的α-半乳糖苷酶液分别在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃下，采用上述α-半乳糖苷酶酶活测定方法测定酶活，其中每个样品设三个重复，酶活最高点即为该酶的最适反应温度。

α-半乳糖苷酶酶液在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃下的酶活结果如图4所示：从图中可以看出：α-半乳糖苷酶的最适反应温度为40℃。

(2)温度稳定性测定

将上述步骤二的2中获得的纯化后的α-半乳糖苷酶液分别在35℃、37℃、40℃下保温1小时、2小时、3小时、6小时、12小时、24小时后按上述α-半乳糖苷酶酶活测定方法测定酶活，其中每个样品设三个重复，以未保温酶做对照，绘制酶的热稳定性曲线。

结果如图5所示：从曲线可以看出，在35℃、37℃、40℃条件下保温3小时后的酶活均维持在60％以上，说明α-半乳糖苷酶具有较好的热稳定性。

(3)最适pH

配制不同pH(pH分别为3.6、4、4.6、5.2、5.6、6、6.6、7、7.6、8)的Mcllvaine缓冲液(pH3.6-8.0)，用不同pH的缓冲液将上述步骤二的2中获得的纯化后的α-半乳糖苷酶液稀释至适当浓度，得到不同pH的α-半乳糖苷酶稀释液，在不同pH的α-半乳糖苷酶稀释液中按上述α-半乳糖苷酶酶活测定方法测定酶活，绘制相对酶活曲线。

结果如图6所示：从图6中可以看出，该酶的最适反应pH为5.2，且该酶在pH5.2至6.6之间保有50％以上的活性。

(4)pH稳定性测定

将不同pH的α-半乳糖苷酶稀释液于40℃保温30min后，按上述α-半乳糖苷酶酶活测定方法测定酶活，其中每个样品设三个重复，绘制pH稳定性曲线。

结果如图7所示：从图7中可以看出，该酶在pH5.2-8.0之间均保持着50％以上的活性，表明该酶对酸碱的耐受性较好。

(5)金属离子及EDTA对酶活性的影响

将上述步骤二的2中获得的纯化后的α-半乳糖苷酶液分别与终浓度10mM的不同金属离子和EDTA在pH5.2磷酸-柠檬酸缓冲液中4℃孵育1h。采用上述α-半乳糖苷酶酶活测定方法测定酶活，其中每个样品设三个重复。

不同金属离子对α半乳糖苷酶酶活的影响如表3所示：其中金属离子Mn²⁺、Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Fe²⁺均有提高酶活的作用，如α半乳糖苷酶与Ca²⁺在4℃孵育1h后酶活提高约1倍，而金属离子Cu²⁺有抑制酶活的作用。

表3、金属离子和EDTA对α半乳糖苷酶活性的影响

Claims (10)

1.一种重组菌，为如下1)或2)：

1)所示的重组菌是将扬奇青霉α-半乳糖苷酶的编码基因导入宿主里氏木霉菌Trichodermareesei，得到的菌；

2)所示的重组菌是将扬奇青霉α-半乳糖苷酶的编码基因和筛选标记基因导入宿主里氏木霉菌Trichodermareesei，得到的菌；

所述扬奇青霉α-半乳糖苷酶的氨基酸序列为序列3。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述扬奇青霉α-半乳糖苷酶的编码基因是通过表达扬奇青霉α-半乳糖苷酶的重组载体导入宿主里氏木霉菌。

3.根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于：所述表达扬奇青霉α-半乳糖苷酶的重组载体为pSK-Pagl-Histag重组载体；

所述pSK-Pagl-Histag重组载体是将所述扬奇青霉α-半乳糖苷酶的编码基因插入pSK-Pcbh1-sig-Tcbh1载体的多克隆位点得到的。

4.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述筛选标记基因为pyr4基因。

5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述pyr4基因是通过pSK-pyr4重组载体导入宿主里氏木霉菌；

所述pSK-pyr4重组载体是将pyr4基因插入pBluescriptSK(+)载体的多克隆位点得到的。

6.根据权利要求1-5中任一所述的重组菌，其特征在于：

所述扬奇青霉α-半乳糖苷酶的编码基因的核苷酸序列为序列1；

所述pyr4基因的核苷酸序列为序列2。

7.根据权利要求1-6中任一所述的重组菌，其特征在于：所述里氏木霉菌为尿嘧啶缺陷型里氏木霉菌。

8.权利要求1-7中任一所述的重组菌在生产α-半乳糖苷酶中的应用；

或权利要求1-7中任一所述的重组菌在提高α-半乳糖苷酶酶活力中的应用。

9.一种生产扬奇青霉α-半乳糖苷酶的方法，包括如下步骤：发酵培养权利要求1-7中任一所述的重组菌，得到所述扬奇青霉α-半乳糖苷酶。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述培养的条件为30℃培养7天。