CN112760311B - 一种具有较优β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶酶活比的酶液及其制备方法和应用 - Google Patents

一种具有较优β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶酶活比的酶液及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有较优β‑甘露聚糖酶和α‑半乳糖苷酶酶活比的酶液及其制备方法和应用，属于微生物培养技术领域。该制备方法以里氏木霉为产酶菌株，以微晶纤维素和/或蜜二糖为碳源，采用发酵法生产酶液，该酶液中β‑甘露糖苷酶的酶活力不高于0.05U/mL，而且具有较优β‑甘露聚糖酶和α‑半乳糖苷酶酶活比。该酶液无需纯化即可直接水解半乳甘露聚糖制备小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖，可有效提高小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖的得率，降低生产成本，具有非常好的应用前景。

Description

一种具有较优β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶酶活比的酶液及 其制备方法和应用
技术领域
本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及一种具有较优β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶酶活比的酶液及其制备方法和应用。
背景技术
目前，我国人口的老龄化和疾病的年轻化引起了人们对健康问题的重视。在2016年，国家提出了“健康中国2030”规划纲要，旨在发展中国健康产业，改善人民健康。膳食纤维以其独特的生理功能成为“健康中国”背景下的研究热点之一。膳食纤维包括天然多糖，低聚糖和小分子聚糖等，其中低聚糖和小分子聚糖由于其突出的增殖肠道有益菌、增加肠道生物多样性以及增强免疫力的效果得到了越来越多的人的重视。通常来说，小分子聚糖和低聚糖是由多糖降解得到，因此如何提高低聚合度组分的含量成为小分子聚糖和低聚糖制备的关键技术之一。
目前，小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖因其出色的增强免疫力的作用得到了越来越多人的关注，其主要生产工艺包括：稀酸水解法、酶水解法、物理降解法及联合降解法，生物酶法由于制备条件温和、高选择性、可控性强并可简化产品分离纯化程序受到越来越多人的青睐。利用微生物发酵技术控制酶组分的合成还能够有效控制副产物的生成，进而简化提取工艺和生产成本，因此基于生物酶法生产小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖具有广阔发展前景。目前，酶法制备小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖的方法是以含半乳甘露聚糖的洋槐豆胶、葫芦巴胶、田菁胶和野皂荚等为原料，在β-甘露聚糖酶的作用下部分酶水解而制得。通常，通过微生物得到β-甘露聚糖酶是由β-甘露聚糖酶(也称内切β-甘露聚糖酶)和β-甘露糖苷酶组成的复合酶系，其中，β-甘露聚糖酶主要降解半乳甘露聚糖主链上的β-1,4-糖苷键，将大分子多糖降解成小分子，β-甘露糖苷酶是将小分子的多糖或低聚糖降解成单糖。因而，β-甘露糖苷酶的存在将引起降解产物中单糖含量提高和小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖的得率降低。为此，在β-甘露聚糖酶降解半乳甘露聚糖制备小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖的反应体系中，β-甘露糖苷酶的含量(通常用酶活力表示)应尽可能低。
半乳甘露聚糖是一种高分支度的聚合物，其主链结构由甘露糖通过β-1,4-糖苷键形成，半乳糖以α-1,6-糖苷键与主链连接。例如，来源于田菁种子的半乳甘露聚糖分子中，甘露糖和半乳糖分子的摩尔比为1.6，即主链上平均每3个甘露糖分子上连有2个半乳糖分子。在β-甘露聚糖酶降解半乳甘露聚糖过程中，半乳糖支链对β-甘露聚糖酶形成空间位阻效应，阻碍β-甘露聚糖酶的降解，具体表现为半乳甘露聚糖降解产物中生物活性高的小分子聚糖和半乳甘露低聚糖组分在降解产物中所占的比例不高。
破解β-甘露聚糖酶降解分支度高的半乳甘露聚糖制备小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖过程中由半乳糖支链对β-甘露聚糖酶形成的空间位阻效应的策略是在β-甘露聚糖酶反应体系中添加适量的α-半乳糖苷酶。α-半乳糖苷酶是一种能够特异性水解半乳甘露聚糖分子中甘露糖和半乳糖之间形成的α-1,6-糖苷键的酶。利用β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶协同水解分支度高的半乳甘露聚糖，可以降低半乳糖支链对β-甘露聚糖酶水解半乳甘露聚糖主链的影响，从而提高降解产物中小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖组分的含量。
但是，现阶段人们研究的重点是在甘露聚糖酶中加入α-半乳糖苷酶来提高降解产物中小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖的含量，这需要通过两步方法来实现，即，分别通过微生物发酵法获得α-半乳糖苷酶和β-甘露聚糖酶，再将α-半乳糖苷酶按配比加入β-甘露聚糖酶水解半乳甘露聚糖的体系中。通过一步法获得具有最优的β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶配比的酶液将极大的降低生产成本，同时应该注意的是应采用人体安全的微生物来制备，如里氏木霉(Trichoderma reesei)。但里氏木霉也具有合成β-甘露糖苷酶的能力，因此，在合成具有最优的β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶配比的酶液时，要求酶液中β-甘露糖苷酶的活力应尽可能低，使发酵获得的酶液无需纯化即可直接用于小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖的生产，从而进一步降低生产成本，而这一技术在现阶段并没有取得很好的效果。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明要解决的一个技术问题在于提供一种具有较优β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶酶活比的酶液的制备方法，以里氏木霉为产酶菌株，以微晶纤维素和/或蜜二糖为碳源进行发酵培养，一步处理即可得到酶活比较优的酶液，操作简单，生产成本大大降低。本发明要解决的另一个技术问题在于提供一种具有较优β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶酶活比的酶液，该酶液中β-甘露糖苷酶活力较低，无需纯化除去β-甘露糖苷酶即可直接水解半乳甘露聚糖制备小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖。本发明要解决的技术问题还有一个在于提供上述酶液在酶解制备小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖中的应用，该酶液可有效提高小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖的得率，降低生产成本，具有非常好的应用前景。
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种具有较优β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶酶活比的酶液的制备方法，以里氏木霉为产酶菌株，以微晶纤维素和/或蜜二糖为碳源进行发酵培养，发酵培养结束后，培养液经处理得到具有较优β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶酶活比的酶液。
所述具有较优β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶酶活比的酶液的制备方法，以微晶纤维素为碳源时，微晶纤维素的浓度为15~30 g/L。
所述具有较优β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶酶活比的酶液的制备方法，以蜜二糖为碳源时，蜜二糖的浓度为5~15 g/L。
所述具有较优β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶酶活比的酶液的制备方法，以微晶纤维素和蜜二糖的混合物为碳源时，总浓度为20.0~35.0 g/L，其中微晶纤维素和蜜二糖的浓度比为1:0.1~1:6。
所述具有较优β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶酶活比的酶液的制备方法，以微晶纤维素和蜜二糖的混合物为碳源时，总浓度为20.0、25.0、30.0、35.0 g/L；其中当总浓度为20.0 g/L时，微晶纤维素和蜜二糖的浓度分别为15 g/L与5 g/L、10 g/L与10 g/L、5 g/L与15 g/L；当总浓度为25.0 g/L时，微晶纤维素和蜜二糖的浓度分别为20 g/L与5 g/L、15 g/L与10 g/L、10 g/L与15 g/L、5 g/L与20 g/L；当总浓度为30.0 g/L时，微晶纤维素和蜜二糖的浓度分别为25 g/L与5 g/L、20 g/L与10 g/L、15 g/L与15 g/L、10 g/L与20 g/L、5 g/L与25 g/L；当总浓度为35.0 g/L时，微晶纤维素和蜜二糖的浓度分别为30 g/L与5 g/L、25g/L与10 g/L、20 g/L与15 g/L、15 g/L与20 g/L、10 g/L与25 g/L、5 g/L与30 g/L。
所述具有较优β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶酶活比的酶液的制备方法，以微晶纤维素和蜜二糖的混合物为碳源时，微晶纤维素的浓度为20 g/L，蜜二糖的浓度为5g/L。
所述具有较优β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶酶活比的酶液的制备方法，包括以下步骤：
（1）产酶培养基：由以下组分组成：葡萄糖1.0g/L，碳源，硫酸铵4.72g/L，尿素2.15g/L，磷酸二氢钾2.0g/L，无水氯化钙0.3g/L，七水合硫酸镁0.3g/L，七水合硫酸亚铁0.005g/L，七水合硫酸锰0.0016g/L，七水合硫酸锌0.0014g/L，氯化钴0.002g/L；向其中加入浓度为1mol/L的柠檬酸钠缓冲液50mL，调节培养基的pH至4.8。
（2）发酵：将产酶培养基50 mL置于250 mL带棉塞的三角瓶中，按10%的接种量接入里氏木霉孢子，置于28-30 ℃、170转/分的恒温摇床中培养4天，培养结束后培养液于3000转/分下离心10 min，得到上清液，即为具有较优β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶酶活比的酶液。
上述制备方法得到的具有较优β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶酶活比的酶液。
上述酶液在酶解制备小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖中的应用。
所述酶液在酶解制备小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖中的应用，向反应容器中加入半乳甘露聚糖、加入蒸馏水、酶液和浓度为1mol/L柠檬酸缓冲液，充分混合均匀，在50℃条件下反应24 h；反应结束后将酶水解物置于100 ℃下处理10 min使酶失活，然后在10000 转/分条件下离心10 min，上清液即为含小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖的酶解液；其中酶解反应时底物浓度2%、酶加量20 U/g半乳甘露聚糖、pH值4.8。
有益效果：与现有的技术相比，本发明的优点包括：
（1）本发明采用里氏木霉为产酶菌株，以微晶纤维素和蜜二糖为碳源和诱导物发酵产生具有较优β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶酶活比的酶液；同时，酶液中β-甘露糖苷酶含量(活力) 不高于0.05 U/mL。
（2）本发明制备的无需纯化除去β-甘露糖苷酶即可直接水解半乳甘露聚糖制备小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖，可有效提高小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖的得率，并降低生产成本。
附图说明
图1为β-甘露聚糖酶与α-半乳糖苷酶复配酶解结果；
图2为当总底物浓度分别为20、25、30、35 g/L时，微晶纤维素和蜜二糖不同配比下β-甘露聚糖酶与α-半乳糖苷酶的酶活结果；
图3为具有不同β-甘露聚糖酶与α-半乳糖苷酶酶活比的酶液的酶解结果。
实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
对以下实施例中使用的产品性能测试如下：
（1）小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖的分子量分布采用凝胶渗透色谱法（GPC）测定：
色谱条件如下：色谱仪：安捷伦高效液相色谱仪1260，色谱柱：WatersUltrahydrogel TM 2000（7.8×300 mm）、Waters Ultrahydrogel TM 250（7.8×300 mm）和Waters Ultrahydrogel TM 120（7.8×300 mm）三柱依次串联，保护柱：WatersUltrahydrogel TM Guard Column（6×40 mm），检测器：示差检测器，流动相：水，流动相流速：0.60 mL/min，柱温：65 ℃，进样体积：10.0 μL，采用聚乙二醇作为标准样品进行分子量测定。
（2）小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖的糖含量采用酸水解法和离子色谱法测定：
测定方法如下：取小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖样品0.3 g置于水解瓶中，加入87 mL 4% H2SO4于121 ℃下反应1 h，反应结束后取1 mL液体用50 % NaOH调节反应液pH至中性，并离心（10000转/分，5 min）取上清液，最后用ICS-5000离子交换色谱仪测定反应液中甘露糖和半乳糖浓度。
离子色谱测试条件如下：色谱仪：戴安离子色谱仪ICS-5000，色谱柱：2×250 mmDionex AminoPac PA10，保护柱：2×50 mm Dionex AminoPac PA10，检测器：电导检测器，流动相：3 mmol 氢氧化钠；流速：0.20 mL/min; 柱温：30 ℃；进样体积：10.0 μL，外标法测定。则样品中小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖的纯度计算如下：
（3）β-甘露聚糖酶活力测定：
在25 mL刻度试管中加入0.9 mL 5 g/L洋槐豆胶底物溶液，50 ºC预热5 min，加入0.1 mL适当稀释的酶液，于50 ℃下反应30 min，立即加入3.0 mL DNS试剂终止反应，随后沸水浴中处理7 min，冷却后定容到25 mL，充分摇匀，于540 nm下测定反应混合物的吸光度，并根据吸光度与还原糖的相关关系，计算反应生成的还原糖的浓度。1个β-甘露聚糖酶活力单位（U）以每分钟水解底物产生1 μmol还原糖（以甘露糖计）所需β-甘露聚糖酶的酶量进行计算。
（4）α-半乳糖苷酶活力测定：
于15 mL试管中加入0.1 mL适当稀释的酶液和0.9 mL 1mmol/L pNPG（对硝基苯酚-α-D-吡喃半乳糖苷）溶液于50 ºC下保温10 min，立即加入2.0 mL 1mol/L的Na2CO3溶液终止反应，加入10 mL蒸馏水，充分摇匀，于400 nm下测定反应混合物的吸光度，并依据吸光度与对硝基苯酚的相关关系，计算反应生成的对硝基苯酚的浓度。1个α-半乳糖苷酶活力单位（U）以每分钟水解pNPG释放1 μmol对硝基苯酚所需α-半乳糖苷酶的酶量进行计算。
（5）β-甘露糖苷酶活力测定：
于15 mL试管中加入0.1 mL适当稀释的酶液和0.9 mL 1mmol/L pNPM（对硝基苯酚-β-D-吡喃甘露糖苷）溶液，于50 ºC下保温10 min，立即加入2.0 mL 1mol/L的Na2CO3溶液终止反应，加入10 mL蒸馏水，充分摇匀，于400 nm下测定反应混合物的吸光度，并依据吸光度与对硝基苯酚的相关关系，计算酶水解反应过程生成的对硝基苯酚的浓度。1个β-甘露糖苷酶酶活力单位（U）以每分钟水解pNPM释放1 μmol对硝基苯酚所需β-甘露糖苷酶的酶量进行计算。
实施例1
里氏木霉分别以微晶纤维素和蜜二糖为碳源发酵产酶，包括以下步骤：
（1）产酶培养基组成（g/L）：葡萄糖1.0，微晶纤维素25.0或蜜二糖25.0，硫酸铵4.72，尿素2.15，磷酸二氢钾2.0，无水氯化钙0.3，七水合硫酸镁0.3，七水合硫酸亚铁0.005，七水合硫酸锰0.0016，七水合硫酸锌0.0014，氯化钴0.002。加入50 mL 1mol/L的柠檬酸钠缓冲液调节培养基的pH至4.8。
（2）发酵产酶
将上述50 mL培养基置于250 mL带棉塞的三角瓶中，按10%的接种量接入里氏木霉孢子，置于28-30 ℃、170转/分的恒温摇床中培养4天。培养结束后，培养液于3000转/分下离心10 min，取上清液（酶液）分别测定α-半乳糖苷酶、β-甘露糖苷酶和β-甘露聚糖酶的酶活。
结果表明，里氏木霉以微晶纤维素为碳源发酵产酶，所得酶液1中β-甘露聚糖酶酶活力为3.917 U/mL，α-半乳糖苷酶活力为0.099 U/mL，β-甘露糖苷酶活力为0.02 U/mL。里氏木霉以蜜二糖为碳源发酵产酶，所得酶液2中α-半乳糖苷酶活力为0.452 U/mL。
实施例2
将甘露聚糖酶和半乳糖苷酶复配酶解制备小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖，其步骤如下：
（1）半乳甘露聚糖定向酶水解
含半乳甘露聚糖的豆科种子（田菁）经机械粉碎至20~100目，按1:50固液比加入蒸馏水，于50℃抽提24 h后，于10000 转/分条件下离心10 min获得上清液，并向上清液中加入无水乙醇，所得沉淀物经真空干燥得到半乳甘露聚糖粉状固体。
将实施例1中得到的酶液1和酶液2进行复配，使得β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的酶活比分别为2、4、6、8、10、12、15、20、30、40。随后称取上述半乳甘露聚糖20.0 g于2 L酶反应罐中，加入蒸馏水、酶液、1mol/L柠檬酸缓冲液使反应液体积为1000 mL，充分混合均匀，于底物浓度2%、酶加量20 U/g半乳甘露聚糖、pH值4.8、50 ℃条件下反应24 h。酶水解反应结束后，将酶水解物置于100 ℃下处理10 min从而使酶失活，失活的酶解液于10000 转/分条件下离心10 min，上清液即为含小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖的酶解液。
（2）取步骤（1）中的含小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖的酶解液上清1000mL，在搅拌条件下加入无水乙醇，使体系中乙醇浓度为40%（v/v），于10000 转/分条件下离心10 min得到上清液以及沉淀。沉淀用40%（v/v）的乙醇水溶液洗涤3次、离心（10000转/分、10 min）、冷冻干燥得到组分，并将之命名为GalM40，采用凝胶色谱法测定小分子半乳甘露聚糖组分GalM40的分子量，并采用酸水解法和离子色谱法测定其半乳甘露聚糖降解产物含量。上清液继续用于下一级的分级分离。
（3）取步骤（2）中固液分离后的上清液，在搅拌条件下加入无水乙醇，使体系中乙醇浓度为50%（v/v），于10000 转/分条件下离心10 min得到上清液以及沉淀。沉淀用50%（v/v）的乙醇水溶液洗涤3次、离心（10000转/分、10 min）、冷冻干燥得到组分，并将之命名为GalM50，采用凝胶色谱法测定小分子半乳甘露聚糖组分GalM50的分子量，并采用酸水解法和离子色谱法测定其半乳甘露聚糖降解产物含量。上清液继续用于下一级的分级分离。
（4）取步骤（3）中固液分离后的上清液，在搅拌条件下加入无水乙醇，使体系中乙醇浓度为65%（v/v），于10000 转/分条件下离心10 min得到上清液以及沉淀。沉淀用65%（v/v）的乙醇水溶液洗涤3次、离心（10000转/分、10 min）、冷冻干燥得到组分，并将之命名为GalM65，采用凝胶色谱法测定小分子半乳甘露聚糖组分GalM65的分子量，并采用酸水解法和离子色谱法测定其半乳甘露聚糖降解产物含量。上清液继续用于下一级的分级分离。
（5）取步骤（4）中固液分离后的上清液，于70 ℃、160 mbar下减压旋转蒸发除去其中的乙醇，取一部分上清液采用酸水解法和离子色谱法测定其半乳甘露聚糖降解产物含量，其余液体通过纳滤（200 Da）除去其中的单糖，然后将截留液于70 ℃、160 mbar下减压旋转蒸发浓缩，获得的浓缩液经干燥得到组分GalMOS，采用凝胶色谱法测定半乳甘露低聚糖组分GalMOS的分子量。
图1为β-甘露聚糖酶与α-半乳糖苷酶复配酶解结果。由如图1可知，前期随着α-半乳糖苷酶活力的不断增加，3种小分子半乳甘露聚糖GalM40、GalM50和GalM65的总得率和GalMOS得率呈现出缓慢上升的趋势，总糖得率也呈现出缓慢上升的趋势，后期随着α-半乳糖苷酶的继续增加，3种小分子半乳甘露聚糖GalM40、GalM50和GalM65的总得率和GalMOS得率开始下降，总糖得率也开始下降。从图1中可知，当β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的酶活比为8时，总糖得率最高，3种小分子半乳甘露聚糖GalM40、GalM50和GalM65的总得率和GalMOS组分得率也最高。同时，对得到的小分子半乳甘露聚糖的分子量进行测量，发现各组分的平均分子量分别为:GalM40: 13100 Da，GalM50: 8930 Da，GalM65: 4310 Da，GalMOS：1630 Da。
实施例3
微晶纤维素和蜜二糖的复配产酶，其步骤如下：
（1）产酶培养基同实施例1，其中底物替换为微晶纤维素和蜜二糖不同比例的混合物，两种底物浓度之和分别为20.0、25.0、30.0、35.0 g/L。
（2）发酵产酶方法同实施例1。
结果如图2所示，当总底物浓度为20 g/L时，随着蜜二糖的不断增加，β-甘露聚糖酶的活力不断降低。但是当总底物浓度为25、30、35 g/L时，随着蜜二糖的不断增加，β-甘露聚糖酶的酶活呈现一种先升后降的趋势。当总底物浓度为25 g/L且微晶纤维素为20 g/L和蜜二糖为5g/L时，β-甘露聚糖酶与α-半乳糖苷酶的酶活比达到最高。总体来说随着蜜二糖的增加，α-半乳糖苷酶酶活不断升高，当蜜二糖浓度过高时，α-半乳糖苷酶酶活逐步下降。
实施例4
利用微晶纤维素和蜜二糖复配产酶的酶液酶解制备小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖，其步骤如下：
半乳甘露聚糖的定向酶水解同实施例2，其中所用酶液为实施例3中的酶液，选择具有不同β-甘露聚糖酶与α-半乳糖苷酶酶活比的酶液进行酶水解测试。
结果如图3所示，微晶纤维素15 g/L和蜜二糖10 g/L所得酶液的酶解效果最好，总糖得率为86.47%，GalM OS的得率为16.51%，3种小分子半乳甘露聚糖GalM40、GalM50和GalM65的总得率为55.63%，此时β-甘露聚糖酶与α-半乳糖苷酶的酶活比为7.235。这个结果和前期β-甘露聚糖酶与α-半乳糖苷酶复配酶解的结果相呼应。

Claims (2)

1.一种酶液的应用，其特征在于，以里氏木霉为产酶菌株，以微晶纤维素和蜜二糖为碳源进行发酵培养，发酵培养结束后，培养液经处理得到具有可以提高半乳甘露聚糖定向酶水解制备小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖得率的β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶酶活比的酶液；其中，微晶纤维素的浓度为15 g/L，蜜二糖的浓度为10 g/L；
采用所述酶液，以半乳甘露聚糖为底物，制备小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖；具体为： 向反应容器中加入半乳甘露聚糖、加入蒸馏水、酶液和浓度为1 mol/L柠檬酸缓冲液，充分混合均匀，在50 ℃条件下反应24 h；反应结束后将酶水解物置于100 ℃下处理10min使酶失活，然后在10000 转/分条件下离心10 min，上清液即为含小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖的酶解液；其中酶解反应时底物浓度2%、酶加量20 U/g半乳甘露聚糖、pH值4.8。
2.根据权利要求1所述酶液的应用，其特征在于，酶液的制备包括以下步骤： （1）产酶培养基：由以下组分组成：葡萄糖1.0 g/L，微晶纤维素15 g/L，蜜二糖10 g/L，硫酸铵4.72g/L，尿素2.15 g/L，磷酸二氢钾2.0 g/L，无水氯化钙0.3 g/L，七水合硫酸镁0.3 g/L，七水合硫酸亚铁0.005 g/L，七水合硫酸锰0.0016 g/L，七水合硫酸锌0.0014 g/L，氯化钴0.002g/L；向其中加入浓度为1 mol/L的柠檬酸钠缓冲液50 mL，调节培养基的pH至4.8； （2）发酵：将产酶培养基50 mL置于250 mL带棉塞的三角瓶中，按10%的接种量接入里氏木霉孢子，置于28-30 ℃、170转/分的恒温摇床中培养4天，培养结束后培养液于3000转/分下离心10min，得到上清液，即为所述酶液。
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