CN104846035A - 一种田菁酶法制备半乳甘露低聚糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种田菁酶法制备半乳甘露低聚糖的方法，酶解底物为直接机械粉碎后的田菁种子；具体步骤包括：1）风干田菁种子机械粉碎至20-100目；2）将粉碎后的田菁种子与低β-甘露糖苷酶活力的β-甘露聚糖酶混合，加入水，加入pH缓冲液或酸、碱，混合至固液重量比1:3-50，控制pH值4-6，反应体系中每克半乳甘露聚糖的β-甘露聚糖酶用量为10-100U，于45-55℃的条件下反应12h以上；3）酶水解反应结束后，水解物于100℃下处理10min使β-甘露聚糖酶失活；4）水解物固液分离，清液即为半乳甘露低聚糖溶液。该方法具有工艺简单、有利于提高酶反应的底物和产物浓度，以及降低酶解反应搅拌能耗等优点。
Description
技术领域
本发明属于糖生物工程技术领域，具体涉及一种田菁酶法制备半乳甘露低聚糖的方法。
背景技术
田菁是中国特有的一种耐涝、耐盐碱、耐贫瘠一年生灌木状草本豆科植物。在沿海滩涂开发中，田菁是新垦盐碱地的先锋植物，在盐碱地上种植田菁，可以显著降低土壤盐分，耕层盐分平均下降30-50％。但田菁的综合利用水平较低，目前茎叶主要作为绿肥植物或粗饲料、部分种子用于生产田菁胶，附加值不高，制约了农民种植田菁的积极性。田菁种子内胚乳主要成分为半乳甘露聚糖，是生产高附加值糖工程产品半乳甘露低聚糖的优质原料。将田菁中的半乳甘露聚糖通过生物催化技术转化为半乳甘露低聚糖，可以大幅度提高田菁的经济价值，从而激发农民种植田菁的积极性。
来源于田菁的半乳甘露低聚糖是由2-10个甘露糖通过β-1,4-糖苷键形成直链、半乳糖以α-1,6-糖苷键形成支链的一种低聚合度糖类。半乳甘露低聚糖是功能性低聚糖的一种，它具有对双歧杆菌等肠道有益菌高选择性的增殖效应，阻断、抑制病原菌在消化道中的定植和诱生免疫因子等功效，是一种优良的食品和饲料添加剂。
目前研究较多的半乳甘露低聚糖制备方法主要是酶法，利用β-甘露聚糖酶选择性降解半乳甘露聚糖，获得半乳甘露低聚糖。自然界中，绝大多数微生物在分泌β-甘露聚糖酶的同时也分泌β-甘露糖苷酶。在甘露聚糖的酶法降解机理中，β-甘露聚糖酶的作用是随机切断甘露聚糖分子中的β-1,4-糖苷键，生成甘露低聚糖，随后生成的甘露低聚糖在β-甘露糖苷酶作用下被降解成单糖。因此，在甘露聚糖酶法降解制备甘露低聚糖反应体系中，β-甘露糖苷酶活力越低，则甘露聚糖水解生成的甘露低聚糖被β-甘露糖苷酶降解的就越少，甘露低聚糖的得率越高。即用于降解甘露聚糖制备甘露低聚糖的β-甘露聚糖酶必须是低β-甘露糖苷酶活力的β-甘露聚糖酶(酶液中β-甘露糖苷酶活力应尽可能低)。低β-甘露糖苷酶活力的β-甘露聚糖酶的制备，可通过产酶微生物诱变、转基因技术、调控发酵等手段获得，也可通过物理拆分的方法从β-甘露聚糖酶酶液中拆分除去β-甘露糖苷酶组分。
在已有的文献报道中，半乳甘露低聚糖的酶法制备均是采用β-甘露聚糖酶水解从植物中提取的半乳甘露聚糖的方法。即首先采用热水抽提等方法从植物中提取半乳甘露聚糖，然后以提取的半乳甘露聚糖为底物经β-甘露聚糖酶水解制备半乳甘露低聚糖。但半乳甘露聚糖是一种水溶性多糖，其水溶液粘度大，因此如果直接以半乳甘露聚糖为酶反应底物，一方面，高粘度的反应体系影响酶反应的传质和反应效率，另一方面，高粘度的反应体系增加了搅拌器的动力消耗，同时，当以半乳甘露聚糖作为酶反应底物时，底物浓度受到限制，只能保持在较低水平，导致反应体系中产物浓度较低，增加了后续产物分离纯化的成本。例如，20g/L的半乳甘露聚糖溶液粘度高达750cps，要继续提高半乳甘露聚糖的浓度十分困难。因此，降低以甘露聚糖为底物的酶反应体系的粘度是酶法降解甘露聚糖制备甘露低聚糖研究中需要重点突破的难题。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种田菁酶法制备半乳甘露低聚糖的方法，具有工艺简单、有利于提高酶反应的底物和产物浓度，以及降低酶解反应搅拌能耗等优点。
技术方案：为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种田菁酶法制备半乳甘露低聚糖的方法，酶解底物为直接机械粉碎后的田菁种子。
一种田菁酶法制备半乳甘露低聚糖的方法，包括以下步骤：
(1)风干田菁种子机械粉碎至20-100目；
(2)将粉碎后的田菁种子与低β-甘露糖苷酶活力的β-甘露聚糖酶混合，加入水，加入pH缓冲液或酸、碱，混合至固液重量比1:3-50，控制pH值4-6，反应体系中每克半乳甘露聚糖的β-甘露聚糖酶用量为10-100U，于45-55℃的条件下反应12h以上；
(3)酶水解反应结束后，水解物于100℃下处理10min使β-甘露聚糖酶失活；
(4)水解物固液分离，清液即为半乳甘露低聚糖溶液。
所述的低β-甘露糖苷酶活力的β-甘露聚糖酶是通过微生物发酵制备，或从β-甘露聚糖酶系中通过物理方法拆分除去部分或全部β-甘露糖苷酶组分后获得。
所述的β-甘露聚糖酶是由里氏木霉(T.reesei)、黑曲霉(A.niger)等真菌或枯草芽孢杆菌(B.subtilis)等细菌分泌的β-甘露聚糖酶。
所述的低β-甘露糖苷酶活力的β-甘露聚糖酶中，β-甘露聚糖酶活力：β-甘露糖苷酶活力不小于100。
本发明的方法，以富含半乳甘露聚糖的田菁种子粉碎后直接作为酶反应的底物，使水溶性的半乳甘露聚糖在酶反应过程中主要以固相的方式存在于田菁种子颗粒中，避免了水溶性半乳甘露聚糖溶解在水中引起的高粘度，在酶反应过程中逐渐溶出的或存在于固相中的半乳甘露聚糖被体系中的β-甘露聚糖酶水解成低粘度的半乳甘露低聚糖，从而保证了整个反应过程中体系的低粘度，有利于提高底物和产物浓度，降低酶解反应的搅拌能耗并简化了工艺流程。
有益效果：与现有技术相比，本发明提出的以田菁种子粉碎后直接作为酶反应底物，避免了水溶性半乳甘露聚糖溶解在水中引起的高粘度，同时在酶反应过程中逐渐溶出的或存在于固相中的半乳甘露聚糖被体系中的β-甘露聚糖酶水解成低粘度的半乳甘露低聚糖，从而保证了整个反应过程中体系的低粘度。具有工艺简单、有利于提高酶反应的底物和产物浓度，以及降低酶解反应搅拌能耗等优点。
附图说明
图1是含20g/L半乳甘露聚糖的田菁种子酶水解历程结果图；
图2是含60g/L半乳甘露聚糖的田菁种子酶水解历程结果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的阐述。实施例是为说明而非限制本发明。本领域中任何普通技术人员能够理解这些实施例不以任何方式限制本发明，可做适当的修改而不违背本发明的实质和偏离本发明的范围。
实施例1里氏木霉合成低β-甘露糖苷酶活力的β-甘露聚糖酶
(1)产酶培养基组成(g/L)：葡萄糖1.0，微晶纤维素25.0，硫酸铵4.72，尿素2.15，磷酸二氢钾2.0，无水氯化钙0.3，七水硫酸镁0.3，七水硫酸亚铁0.005，七水硫酸锰0.0016，七水硫酸锌0.0014，氯化钴0.002。培养基用0.05mol/L的柠檬酸钠缓冲液调节pH值4.8。
(2)产酶条件：向产酶培养基中接种培养36h的里氏木霉种子，接种量为10％，于温度26-32℃、摇床转速150-250转/分培养4d，离心，取上清测定β-甘露聚糖酶活力和β-甘露糖苷酶活力。
(3)β-甘露聚糖酶活力测定：25mL刻度试管中加入0.9mL用pH 5.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配制的质量浓度为5.0g/L的洋槐豆胶底物溶液，50℃预热5min，加入0.1mL经适当稀释的酶液，于50℃下反应30min，立即加入3.0mL DNS试剂，煮沸7min，冷却后定容至25mL，摇匀，在540nm下测定水解后产生的还原糖。以每分钟水解底物产生1μmol还原糖(以甘露糖计)的酶量定义为1个β-甘露聚糖酶活力单位(U)。
(4)β-甘露糖苷酶活力测定：
在15mL试管中加入0.1mL适当稀释的酶液和0.9mL 1mmol/L的对硝基苯酚-β-D-吡喃甘露糖苷(pNPM)溶液(预先50℃预热5min)，于50℃下保温10min，立即加入2.0mL 1mol/L的Na2CO3溶液终止反应，加入10mL蒸馏水，摇匀，于400nm下测定释放的对硝基苯酚吸光度。以每分钟水解pNPM释放1μmol对硝基苯酚所需的酶量定义为1个β-甘露糖苷酶酶活力单位(U)。
结果表明，里氏木霉以微晶纤维素为碳源合成β-甘露聚糖酶，培养4d，β-甘露聚糖酶活力为3.80U/mL、β-甘露糖苷酶活力为0.03U/mL。β-甘露聚糖酶活力:β-甘露糖苷酶活力＝126.7，β-甘露聚糖酶活力远高于β-甘露糖苷酶活力，可用于半乳甘露低聚糖的制备。
实施例2固液重量比为1:13.02的田菁种子(含20g/L半乳甘露聚糖)酶解制备半乳甘露低聚糖
以下实施例中，甘露糖和半乳糖浓度采用高效液相离子交换色谱法测定。色谱条件如下：色谱仪：戴安离子色谱仪ICS-5000，色谱柱：Dionex AminoPac PA10(2×250mm)，保护柱：Dionex AminoPac PA10(2×50mm)，检测器：电导检测器，流动相：3mmol/L氢氧化钠，流动相流速：0.20mL/min，柱温：30℃，进样体积：10.0μL，外标法测定。
半乳甘露低聚糖水解糖液中半乳甘露低聚糖浓度测定方法：
取V mL半乳甘露低聚糖溶液于水解瓶中，加入V mL 8％的H2SO4于121℃下反应1h，反应结束后用50％NaOH调节反应液pH值为1～3，用蒸馏水定容至一定体积V0，在ICS-5000离子交换色谱仪上测定稀释液中甘露糖和半乳糖浓度CA1和CA2。另取V mL半乳甘露低聚糖水解糖液，稀释一定倍数，离子色谱法测定其中原有的甘露糖和半乳糖浓度C1和C2，则水解糖液中半乳甘露低聚糖浓度计算如下：
C半乳甘露低聚糖＝[V0/V×(CA1+CA2)–(C1+C2)]×0.9
式中：V为半乳甘露低聚糖溶液体积，mL；V0为样品水解、中和、定容后的稀释液的体积，mL；CA1为酸解稀释液中甘露糖浓度，g/L；CA2为酸解稀释液中半乳糖浓度，g/L；C1为酶水解糖液中甘露糖浓度，g/L；C2为酶水解糖液中半乳糖浓度，g/L；0.9为聚糖和单糖的转化系数。
(1)田菁种子粉碎。风干田菁种子机械粉碎，取20-100目组分。采用红外水分测定仪测定粉碎田菁种子水分含量10.87％，采用美国国家可再生能源实验室(NREL)方法定量分析田菁种子中的半乳甘露聚糖含量，测得田菁种子中半乳甘露聚糖含量为26.05％。
(2)低β-甘露糖苷酶活力的β-甘露聚糖酶定向降解田菁种子制备半乳甘露低聚糖
称取实施例2(1)中粉碎后的田菁种子4.31g(绝干重3.84g，其中半乳甘露聚糖含量为1.00g，水分0.47g)于250mL酶解瓶中，加入实施例1中的β-甘露聚糖酶液5.26mL(酶加量20U/g半乳甘露聚糖)，加入蒸馏水41.77mL、1mol/L柠檬酸缓冲液2.5mL，充分混合均匀，于50℃、100转/分的摇床中酶解48h，酶水解反应结束后，将酶水解物置于100℃下处理10min，使β-甘露聚糖酶失活，于10000转/分条件下离心5min，上清即为半乳甘露低聚糖液。含20g/L半乳甘露聚糖的田菁种子酶水解历程如图1。
结果表明，含20g/L半乳甘露低聚糖的田菁种子在低β-甘露糖苷酶活力的β-甘露聚糖酶水解制备半乳甘露低聚糖过程中，水解体系始终保持低粘度，水解体系中粘度保持在3cps以下。水解36h，水解体系的粘度、半乳甘露低聚糖水解得率、酶对半乳甘露低聚糖的选择性分别为2.22cps、76.10％和88.49％。
实施例3固液重量比为1:4.34的田菁种子(含60g/L半乳甘露聚糖)酶解制备半乳甘露低聚糖
(1)称取实施例2(1)中粉碎后的田菁种子12.92g(绝干重11.52g，其中半乳甘露聚糖量为3.00g，水分1.40g)于250mL酶解瓶中，加入实施例1中的β-甘露聚糖酶液15.79mL(酶加量为20U/g半乳甘露聚糖)，加入蒸馏水30.31mL、1mol/L柠檬酸缓冲液2.5mL，充分混合均匀，于50℃、100转/分的摇床中水解48h，酶水解反应结束后，将酶水解物置于100℃下处理10min，使β-甘露聚糖酶失活，于10000转/分条件下离心10min，上清即为半乳甘露低聚糖液。含60g/L半乳甘露聚糖的田菁种子酶水解历程如图2。
结果表明，含60g/L半乳甘露低聚糖的田菁种子在低β-甘露糖苷酶活力的β-甘露聚糖酶水解制备半乳甘露低聚糖过程中，水解体系仍然保持较低粘度，在水解前期有小幅上升然后逐渐下降，水解体系中粘度保持在20cps以下，对水解过程影响仍然较小。水解36h，水解体系的粘度、半乳甘露低聚糖水解得率、酶对半乳甘露低聚糖的选择性分别为5.54cps、64.88％和86.74％。
以田菁种子粉碎后直接作为酶反应底物，避免了水溶性半乳甘露聚糖溶解在水中引起的高粘度，从而保证了整个酶反应过程中体系的低粘度。酶反应底物浓度从20g/L提高到60g/L时，酶解体系初始粘度由1.23cps增加到2.56cps，且酶反应过程中反应体系的粘度维持在一个较低水平。当底物中半乳甘露聚糖浓度由20g/L提高到60g/L，酶解36h，反应体系中半乳甘露低聚糖浓度从15.22g/L提高到38.93g/L，有利于后续的分离纯化过程。
比较例1不同固液比的粉碎田菁种子和田菁半乳甘露聚糖溶液的粘度
(1)不同固液比的粉碎田菁种子混合液的粘度测定
室温下，取实施例2(1)中粉碎后的田菁种子，分别按固液重量比分别为1:52.11、1:26.05、1:17.37、1:13.02、1:8.68、1:6.51、1:5.21、1:4.34(半乳甘露聚糖浓度分别为5、10、15、20、30、40、50、60g/L)与水充分混合，10000转/分离心10min，取上清，用流变仪分别测定其粘度。结果如表1。
(2)不同浓度田菁半乳甘露聚糖溶液粘度测定
1000.00g绝干田菁种子经机械粉碎至20-100目，在固液比为1:15、95℃下经热水抽提8h，于10000转/分条件下离心10min，得到上清半乳甘露聚糖液，将上清置于80℃水浴锅中浓缩分别获得含5、10、15、20、30、40、50、60g/L半乳甘露聚糖的溶液，冷却到与比较例1中(1)的相同室温下，用流变仪分别测定其粘度。结果如表1。
表1 不同固液比的粉碎田菁种子和田菁半乳甘露聚糖溶液的粘度
结果表明，田菁半乳甘露聚糖溶液粘度很大，在含相同浓度的半乳甘露聚糖体系中，田菁半乳甘露聚糖溶液的粘度远高于粉碎田菁种子与水的混合液的粘度。因此，如果以田菁半乳甘露聚糖作为酶法制备半乳甘露低聚糖的底物，则酶解搅拌动力消耗很大，生产成本提高。同时，实验发现，半乳甘露聚糖液浓缩到20g/L后，几乎成胶体状，不能继续浓缩提高半乳甘露聚糖的浓度，因此，以田菁半乳甘露聚糖为底物酶解制备半乳甘露低聚糖，底物半乳甘露聚糖浓度不能大于20g/L，从而导致酶解产物中半乳甘露低聚糖浓度低于20g/L，将增加后续产品分离、提纯精制；而以粉碎的田菁种子为底物，即使水解体系中半乳甘露聚糖浓度为60g/L时，体系粘度也仅为2.56cps，不仅酶解搅拌动力消耗低，而且酶解产物中半乳甘露低聚糖浓度也可达到较高浓度(如实施例2中酶解36h，体系中半乳甘露低聚糖浓度达到38.93g/L)，有利于后续产物的分离、精制。
Claims (5)
1.一种田菁酶法制备半乳甘露低聚糖的方法，其特征在于，酶解底物为直接机械粉碎后的田菁种子。
2.根据权利要求1所述的田菁酶法制备半乳甘露低聚糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）风干田菁种子机械粉碎至20-100目；
（2）将粉碎后的田菁种子与低β-甘露糖苷酶活力的β-甘露聚糖酶混合，加入水，加入pH缓冲液或酸、碱，混合至固液重量比1:3-50，控制pH值4-6，反应体系中每克半乳甘露聚糖的β-甘露聚糖酶用量为10-100U，于45-55℃的条件下反应12h以上；
（3）酶水解反应结束后，水解物于100℃下处理10min使β-甘露聚糖酶失活；
（4）水解物固液分离，清液即为半乳甘露低聚糖溶液。
3.根据权利要求1所述的田菁酶法制备半乳甘露低聚糖的方法，其特征在于：所述的低β-甘露糖苷酶活力的β-甘露聚糖酶是通过微生物发酵制备，或从β-甘露聚糖酶系中通过物理方法拆分除去部分或全部β-甘露糖苷酶组分后获得。
4.根据权利要求1所述的田菁酶法制备半乳甘露低聚糖的方法，其特征在于，所述β-甘露聚糖酶是由里氏木霉、黑曲霉或枯草芽孢杆菌分泌的β-甘露聚糖酶。
5.根据权利要求1所述的田菁酶法制备半乳甘露低聚糖的方法，其特征在于：所述的低β-甘露糖苷酶活力的β-甘露聚糖酶中，β-甘露聚糖酶活力：β-甘露糖苷酶活力不小于100。
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Application publication date: 20150819 Assignee: Jiangsu Kangwei Biologic Co.,Ltd. Assignor: NANJING FORESTRY University Contract record no.: X2021980014838 Denomination of invention: Method for preparing galactomannan oligosaccharide by Sesbania enzyme method Granted publication date: 20171215 License type: Common License Record date: 20211213 |