CN106222214A - 一种提高半乳甘露聚糖不完全降解产物中低分子量组分产量的方法 - Google Patents

一种提高半乳甘露聚糖不完全降解产物中低分子量组分产量的方法 Download PDF

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    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds

Abstract

本发明公开了一种提高半乳甘露聚糖不完全降解产物中低分子量组分产量的方法，采用β‑甘露聚糖酶和α‑半乳糖苷酶协同水解半乳甘露聚糖，获得半乳甘露聚糖不完全降解产物。本方法采用β‑甘露聚糖酶和α‑半乳糖苷酶协同水解半乳甘露聚糖，通过α‑半乳糖苷酶对半乳甘露聚糖分子中半乳糖支链的水解，降低半乳糖支链对β‑甘露聚糖酶水解半乳甘露聚糖主链的空间位阻效应，提高β‑甘露聚糖酶对半乳甘露聚糖的水解程度，使半乳甘露聚糖不完全降解产物中高生物活性的低分子量组分比例显著增加。

Description

一种提高半乳甘露聚糖不完全降解产物中低分子量组分产量 的方法
技术领域
本发明属糖生物工程技术领域，具体涉及一种提高半乳甘露聚糖不完全降解产物中低分子量组分产量的方法。
背景技术
半乳甘露聚糖主要存在于田菁、香豆、瓜尔胶等植物种子的胚乳中，半乳甘露聚糖是由甘露糖通过β-1,4-糖苷键连接而成主链、半乳糖通过α-1,6-糖苷键形成支链的非线性杂多糖。近年来，随着糖生物工程的兴起，小分子天然植物多糖因具有特殊的生物学功能可作为功能性食品基料或饲料添加剂而备受关注。小分子植物多糖可通过植物多糖不完全降解的方法制备，因此，小分子植物多糖也称为植物多糖的不完全降解产物。半乳甘露聚糖不完全降解产物是指聚合度高于2(分子量342)的天然半乳甘露聚糖降解产物(包括二糖)，即半乳甘露聚糖不完全降解产物不包括降解产物中的单糖部分。半乳甘露聚糖不完全降解产物的生物学功能主要表现为对人或动物体肠道内双歧杆菌等有益菌的选择性增殖作用、阻断病原菌在消化道中定植、诱生免疫因子和可溶性膳食纤维功能等。研究表明，半乳甘露聚糖不完全降解产物组分分子量越低，其生物学功能尤其是对双歧杆菌等有益菌的选择性增殖作用越强，因此，提高半乳甘露聚糖不完全降解产物中低分子量组分的比例是半乳甘露聚糖不完全降解产物制备技术中需要解决的一个问题。
采用微生物酶选择性降解植物多糖是制备小分子植物多糖的常用方法。目前报道的半乳甘露聚糖不完全降解产物的酶法制备方法主要是采用β-甘露聚糖酶降解半乳甘露聚糖。β-甘露聚糖酶降解半乳甘露聚糖的机理是β-甘露聚糖酶随机切断半乳甘露聚糖主链上的β-1,4-糖苷键，得到主要产物为半乳甘露聚糖不完全降解产物和少量甘露糖。天然植物中的半乳甘露聚糖是一种高分支度的聚合物，在主链甘露聚糖链上通过α-1,6-糖苷键连接有数量不等的半乳糖。例如，来源于田菁种子和瓜尔豆的半乳甘露聚糖分子中，甘露糖和半乳糖分子的比例是1:2，即主链上平均每2个甘露糖分子上连有一个半乳糖分子；而来源于香豆的半乳甘露聚糖分子中甘露糖和半乳糖分子的比例高达1:1。在β-甘露聚糖酶降解半乳甘露聚糖过程中，β-甘露聚糖酶不能降解半乳甘露聚糖主链分子上的甘露糖与支链半乳糖形成的α-1,6-糖苷键，相反，半乳糖支链成为β-甘露聚糖酶降解半乳甘露聚糖过程中的一个障碍，即支链半乳糖对β-甘露聚糖酶的空间位阻效应，从而影响β-甘露聚糖酶对半乳甘露聚糖的降解程度，具体表现为半乳甘露聚糖不完全降解产物中低分子量组分在降解产物中所占的比例不高。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种提高半乳甘露聚糖不完全降解产物中低分子量组分产量的方法，该法通过β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶对半乳甘露聚糖的协同水解，有利于提高半乳甘露聚糖不完全降解产物中低分子量组分的比例，从而提高半乳甘露聚糖不完全降解产物的生物活性。
技术方案：为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种提高半乳甘露聚糖不完全降解产物中低分子量组分产量的方法，采用β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶协同水解半乳甘露聚糖，得到低分子量组分比列较高的半乳甘露聚糖不完全降解产物。
一种提高半乳甘露聚糖不完全降解产物中低分子量组分的方法，包括以下步骤：
将半乳甘露聚糖或含半乳甘露聚糖的植物材料与β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶充分混合，使反应体系中半乳甘露聚糖浓度5-40g/L、β-甘露聚糖酶添加量5-40U/g半乳甘露聚糖、α-半乳糖苷酶添加量2-40U/g半乳甘露聚糖，加入水，加入pH缓冲液或酸碱调节pH值4.8-5.2，于45-50℃的条件下反应12h以上，固液分离，液体部分即为低分子量组分含量较高的半乳甘露聚糖不完全降解产物的酶水解液。
所述的β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶来源于植物、动物和微生物。
所述的半乳甘露聚糖是来源于田菁种子、香豆、瓜尔豆等植物的半乳甘露聚糖。
所述的半乳甘露聚糖不完全降解产物中低分子量组分指的是平均分子量为342～6000Da的小分子半乳甘露聚糖或半乳甘露低聚糖。
有益效果：与现有技术相比，本发明采用β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶协同水解半乳甘露聚糖制备半乳甘露聚糖不完全降解产物，通过α-半乳糖苷酶对半乳甘露聚糖支链半乳糖的水解，降低了半乳糖支链对β-甘露聚糖酶水解半乳甘露聚糖主链的空间位阻效应，从而提高了β-甘露聚糖酶降解半乳甘露聚糖的程度以及半乳甘露聚糖不完全降解产物中低分子量组分的比例。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例中，不同分子量区间的半乳甘露聚糖不完全降解产物的平均分子量采用凝胶渗透色谱法(GPC)测定。色谱条件如下：色谱仪：安捷伦高效液相色谱仪1260，色谱柱：Waters Ultrahydrogel TM 2000(7.8×300mm)、Waters Ultrahydrogel TM 250(7.8×300mm)和Waters Ultrahydrogel TM 120(7.8×300mm)三柱依次串联，保护柱：WatersUltrahydrogel TM Guard Column(6×40mm)，检测器：示差检测器，流动相：水，流动相流速：0.60mL/min，柱温：65℃，进样体积：10.0μL，采用聚乙二醇作为标准样品进行分子量测定。
以下实施例中，甘露糖和半乳糖浓度采用高效液相离子交换色谱法测定。色谱条件如下：色谱仪：戴安离子色谱仪ICS-5000，色谱柱：Dionex AminoPac PA10(2×250mm)，保护柱：Dionex AminoPac PA10(2×50mm)，检测器：电导检测器，流动相：3mmol/L氢氧化钠，流动相流速：0.20mL/min，柱温：30℃，进样体积：10.0μL，外标法测定。
以下实施例中，有机溶剂分级沉淀物中半乳甘露聚糖不完全降解产物定量测定方法为：称取0.3000g绝干样品于水解瓶中，加入87.000mL 4％的H2SO4于121℃下反应1h，反应结束后用50％NaOH调节反应液pH值为1～3，用蒸馏水定容至一定体积V0，在ICS-5000离子交换色谱仪上测定稀释液中甘露糖和半乳糖浓度CA1和CA2，沉淀物中半乳甘露聚糖降解产物质量计算如下：
式中：V0，样品水解、中和、定容后的稀释液的体积，mL；CA1，酸解稀释液中甘露糖浓度，g/L；CA2，酸解稀释液中半乳糖浓度，g/L；m沉淀物—不同有机溶剂浓度下沉淀物干重，g；0.9，聚糖和单糖的转化系数。
实施例1
β-甘露聚糖酶水解半乳甘露聚糖获得不完全降解产物，过程如下：
1)β-甘露聚糖酶水解半乳甘露聚糖
称取粉碎至20-100目的田菁种子(水分含量10.87％，半乳甘露聚糖含量为26.05％)4.31g于250mL酶解瓶中，按酶用量20U/g半乳甘露聚糖加入β-甘露聚糖酶液，加入1M柠檬酸缓冲液2.5mL，加入蒸馏水使酶反应体系中水分为50mL，充分混合后，置于50℃、150转/分恒温摇床中酶水解12h，酶水解反应结束后，反应物于100℃下处理10min，于10,000转/分下离心10min，上清液即为含半乳甘露聚糖不完全降解产物的酶水解液。
2)不同平均分子量半乳甘露聚糖不完全降解产物的分级与定量
不同平均分子量半乳甘露聚糖不完全降解产物的分级与定量方法参考专利文献CN 105738529A：
a.取步骤1)得到的含半乳甘露聚糖不完全降解产物的酶水解液50mL，在搅拌条件下加入无水乙醇，使体系中乙醇浓度为40％(v/v)，于10000转/分条件下离心10min，得到上清液和沉淀。沉淀用40％(v/v)的乙醇水溶液30mL分3次洗涤、离心(10000转/分、10min)，冷冻干燥得到组分I，称重，并用于半乳甘露聚糖不完全降解产物的分子量测定和定量。上清液继续用于下一级的分级分离。
b.取步骤a固液分离后的上清液，在搅拌条件下加入无水乙醇，使体系中乙醇浓度为50％(v/v)，于10000转/分条件下离心10min，得到上清液和沉淀。沉淀用50％(v/v)的乙醇水溶液30mL分3次洗涤、离心(10000转/分、10min)，冷冻干燥得到组分II，称重，并用于半乳甘露聚糖不完全降解产物的分子量测定和定量。上清液继续用于下一级的分级分离。
c.取步骤b固液分离后的上清液，在搅拌条件下加入无水乙醇，使体系中乙醇浓度为65％(v/v)，于10000转/分条件下离心10min，得到上清液和沉淀。沉淀用65％(v/v)的乙醇水溶液30mL分3次洗涤、离心(10000转/分、10min)，冷冻干燥得到组分III，称重，并用于半乳甘露聚糖不完全降解产物的分子量测定和定量，并用于半乳甘露聚糖不完全降解产物的分子量测定和定量。上清液继续用于下一级的分级分离。
d.取步骤c固液分离后的上清液，于70℃、160mbar下减压旋转蒸发除去其中的乙醇，在除去乙醇的上清液中加入10g/L酿酒酵母发酵12h，完全除去其中的单糖，10000转/分条件下离心10min，固液分离获得二次上清液。二次上清液于70℃、160mbar下减压旋转蒸发、干燥后获得固形物得到组分IV，称重。固形物用于半乳甘露聚糖不完全降解产物的分子量测定和定量。
半乳甘露聚糖不完全降解产物按分子量分级后各级分(组分)质量(绝干)、平均分子量以及各组分占半乳甘露聚糖不完全降解产物的比例如表1。
表1半乳甘露聚糖不完全降解产物各组分参数
组分 质量(g) 平均分子量(Da) 比例(％)
组分I 0.392 1.20×104 63.23
组分II 0.051 5.56×103 8.23
组分III 0.094 4.38×103 15.16
组分IV 0.083 0.91×103 13.39
结果表明，半乳甘露聚糖经β-甘露聚糖酶降解后，可形成平均分子量不等的半乳甘露聚糖不完全降解产物，其中平均分子量在342～6000Da的低分子量组分占半乳甘露聚糖不完全降解产物的比例为36.78％。
实施例2
β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶协同水解半乳甘露聚糖获得不完全降解产物，过程如下：
1)β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶协同水解半乳甘露聚糖
称取粉碎至20-100目的田菁种子(水分含量10.87％，半乳甘露聚糖含量为26.05％)4.31g于250mL酶解瓶中，按酶用量20U/g半乳甘露聚糖加入β-甘露聚糖酶液、5U/g半乳甘露聚糖加入α-半乳糖苷酶酶液，加入1M柠檬酸缓冲液2.5mL，加入蒸馏水使酶反应体系中水分为50mL，充分混合后，置于50℃、150转/分恒温摇床中酶水解12h，酶水解反应结束后，反应物于100℃下处理10min，于10,000转/分下离心10min，上清液即为含半乳甘露聚糖不完全降解产物的酶水解液。
对酶水解液进行不同平均分子量半乳甘露聚糖不完全降解产物的分级与定量，方法同实施例1，半乳甘露聚糖不完全降解产物按分子量分级后各级分(组分)质量(绝干)、平均分子量以及各组分占半乳甘露聚糖不完全降解产物的比例如表2。
表2半乳甘露聚糖不完全降解产物各组分参数
组分 质量(g) 平均分子量(Da) 比例(％)
组分I 0.317 1.20×104 51.63
组分II 0.088 5.56×103 14.33
组分III 0.112 4.38×103 18.24
组分IV 0.097 0.91×103 15.80
结果表明，半乳甘露聚糖经β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶协同水解后，α-半乳糖苷酶对半乳甘露聚糖支链半乳糖的水解，降低了半乳糖支链对β-甘露聚糖酶水解半乳甘露聚糖主链的空间位阻效应，从而提高了β-甘露聚糖酶对半乳甘露聚糖的水解程度。半乳甘露聚糖经β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶协同水解后，半乳甘露聚糖不完全降解产物中平均分子量在342～6000Da的低分子量组分占降解产物的比例为48.37％，半乳甘露聚糖不完全降解产物中低分子量组分的比例比β-甘露聚糖酶降解产物中低分子量组分的比例提高11.59个百分点。

Claims (6)

1.一种提高半乳甘露聚糖不完全降解产物中低分子量组分产量的方法，其特征在于，采用β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶协同水解半乳甘露聚糖，获得半乳甘露聚糖不完全降解产物。
2.根据权利要求1所述的提高半乳甘露聚糖不完全降解产物中低分子量组分产量的方法，其特征在于，半乳甘露聚糖酶水解体系中，β-甘露聚糖酶用量5-40U/g半乳甘露聚糖，α-半乳糖苷酶用量2-40U/g半乳甘露聚糖。
3.根据权利要求1所述的提高半乳甘露聚糖不完全降解产物中低分子量组分产量的方法，其特征在于，所述的β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶来源于植物、动物和微生物。
4.根据权利要求1所述的提高半乳甘露聚糖不完全降解产物中低分子量组分产量的方法，其特征在于，所述的半乳甘露聚糖是来源于田菁种子、香豆、瓜尔豆。
5.根据权利要求1所述的提高半乳甘露聚糖不完全降解产物中低分子量组分产量的方法，其特征在于，所述的半乳甘露聚糖不完全降解产物中低分子量组分指的是平均分子量为342-6000 Da的小分子半乳甘露聚糖和半乳甘露低聚糖。
6.根据权利要求1所述的提高半乳甘露聚糖不完全降解产物中低分子量组分产量的方法，其特征在于，将半乳甘露聚糖或含半乳甘露聚糖的植物材料与β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶充分混合，使反应体系中半乳甘露聚糖浓度5-40 g/L、β-甘露聚糖酶添加量5-40 U/g半乳甘露聚糖、α-半乳糖苷酶添加量2-40 U/g 半乳甘露聚糖，调节pH值4.8-5.2，于45-50℃的条件下反应12 h以上，固液分离，液体部分即为低分子量组分含量较高的半乳甘露聚糖不完全降解产物的酶水解液。
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