CN111197039B - 一种发酵生产壳聚糖酶的复合培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种发酵生产壳聚糖酶的复合培养基。所述的培养基成分包括特定分子量壳聚糖、肌醇、生物素、酵母浸粉、葡萄糖、盐酸硫胺素、核黄素和维生素。本发明所述的培养基可供芽孢杆菌良好生长，并产生高活力壳聚糖酶。本发明的培养基与普通培养基相比，壳聚糖酶产量提高2‑3倍，产量达到1.5mg/mL，酶活可达300000U/L。该培养基大大降低了壳聚糖酶的生产成本，对壳聚糖酶的应用尤其是酶法制备低分子量壳寡糖具有极其显著的经济意义。

Description

一种发酵生产壳聚糖酶的复合培养基
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体为一种一种发酵生产壳聚糖酶的复合培养基。
背景技术
开发应用壳寡糖(chitosan oligosaccharide COS)是甲壳素和壳聚糖天然资源开发应用的核心问题,也是当今生物制药领域的热点之一。壳寡糖,又称低聚壳聚糖、低聚氨基葡萄糖等。相对于壳聚糖,壳寡糖不但水溶性好,易于吸收利用,还具有抗氧化、抑菌、抗肿瘤、抗炎、调节血脂和血糖、增强免疫、活化肠道菌群等多种生理作用,具有比壳聚糖更优越的生理及生化活性。随着对壳寡糖生理作用机制研究的深入,壳寡糖在预防保健、疾病辅助治疗以及日常生活其他方面的应用将会愈发广泛。现今壳寡糖主要制备方法有化学法、物理法和生物酶法。化学方法是最早用于工业化生产的壳寡糖制备方法,该方法的技术要求相对较低,降解快速,也易于实现工业化大生产。然而,化学法的产率低而且分子量分布较宽，单糖含量高,生产过程中产品的化学结构可能遭到破坏,产品安全性饱受质疑。从生产工艺的角度来说,化学方法的制备条件不易控制，可重复性差、脱盐工艺复杂。物理法主要有超声波法、微波法、射线法、光解法等。与化学法相比,物理法所具有的优势在于该法操作较为简单，可控性好、污染小,如果和其他降解方式联合使用可能会取得更好的效果。物理法降解普遍存在的问题是降解初期的速率较快,后期较缓慢,这意味着降解成更小的寡糖分子需要耗费很长的时间和较高的能量,单独使用效果不佳,而且设备投资较大,目前仍未见工业化生产的报道。酶法降解是用专一性酶或非专一性酶对壳聚糖进行降解进而得到分子量较低的壳寡糖。酶水解法因条件温和、分子量分布相对容易控制且不会导致还原端基的氧化和降解,反应无需加入大量的化学试剂,对环境的污染较小,是一种公认的比较理想的绿色制备方法。
壳聚糖酶(chitisanase)是一类水解酶,1992年,壳聚糖酶被系统命名(Ec.3.2.1.99)。壳聚糖酶能催化水解完全脱乙酰的壳聚糖形成壳寡糖,同时也能选择性切断部分乙酰化壳聚糖的GlNc-GlNc和GlNc-GlNcAc。壳聚糖酶主要存在于真菌和细菌细胞中,在单子叶和双子叶植物的不同组织中也发现有该酶活性。另外,在病毒中也发现壳聚糖酶。现己发现多种微生物中如Apergillusfumigatus,Psuedomanas,等都能产壳聚糖酶。这些酶大多为内切酶。一般来说,植物中分离得到的壳聚糖酶分子量为10000-23000,而从微生物中分离得到的壳聚糖酶分子量为20000-40000。壳聚糖酶大部分为碱性蛋白,等电点Pl为7.0-8.5,最适pH为4.5-8.0。
但是目前壳聚糖酶发酵存在培养基成本高、酶发酵活力低等不足，其工业酶制剂的价格十分昂贵，如：丹麦诺维信公司生产的固体壳聚糖酶制剂(酶活力为400U/g)，其售价高达1200元/kg，我国浙江金壳集团生产的液体壳聚糖酶(300U/ml),售价也达到了800元/L。昂贵的酶价格限制了壳聚糖酶在工业生产中的应用。因此，筛选出一种专用于壳聚糖酶的培养基，以提酶产量，这对降低壳寡糖生产成本具有重要意义。
发明内容
为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
一种发酵生产壳聚糖酶的复合培养基，所述的培养基成分每升中包括3-10g分子量为8000-10000Da的壳聚糖、7-18g酵母浸粉、10-20g葡萄糖。
进一步，所述的培养基成分每升中还包括肌醇0.01-0.03g、生物素0.03-0.05mg、盐酸硫胺素7-10g、核黄素3.5-5g、维生素B12 3.0-4.5mg。
更进一步，所述的培养基的pH值为6.0-6.5。
本发明的有益效果如下：
本发明提供一种能节约成本、适合于培养芽孢杆菌，又可显著提高壳聚糖酶发酵水平的生产壳聚糖酶的培养基。其生产成本低、效果好且对环境无影响。
具体实施方式
表1实施例1-4对壳聚糖酶活性(U/ml)的影响具体实施方式
本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。
实施例1
发酵生产壳聚糖酶的芽孢杆菌培养基。1000mL摇瓶，培养液组成为：特定分子量(8000-10000Da)壳聚糖5g/L；酵母浸粉12g/L；葡萄糖10g/L；肌醇0.01g/L；生物素0.05mg/L；盐酸硫胺素8g/L；核黄素3.5g/L；维生素B12 4.2mg/L，pH值为6.5。种子液种龄24小时，10％接种，装液量10ml/250mL，转速175rpm/min,37℃培养48小时，壳聚糖酶活力达到240U/ml。
实施例2
发酵生产壳聚糖酶的芽孢杆菌培养基。1000mL摇瓶，培养液组成为：特定分子量(8000-10000Da)壳聚糖7.5g/L；酵母浸粉10g/L；葡萄糖10g/L；肌醇0.03g/L；生物素0.05mg/L；盐酸硫胺素7g/L；核黄素4.0/L；维生素B12 3.5mg/L，pH值为6.5。种子液种龄24小时，10％接种，装液量10ml/250mL，转速200rpm/min,37℃培养48小时，壳聚糖酶活力达到300U/ml。
实施例3
发酵生产壳聚糖酶的芽孢杆菌培养基。1000mL摇瓶，培养液组成为：特定分子量(8000-10000Da)壳聚糖10g/L；酵母浸粉8g/L；葡萄糖10g/L；肌醇0.01g/L；生物素0.03mg/L；盐酸硫胺素8g/L；核黄素5.0/L；维生素B12 3.5mg/L，pH值为6.0。种子液种龄24小时，10％接种，装液量10ml/250mL，转速200rpm/min,37℃培养48小时，壳聚糖酶活力达到210U/ml。
实施例4
发酵生产壳聚糖酶的芽孢杆菌培养基。1000mL摇瓶，培养液组成为：特定分子量(8000-10000Da)壳聚糖3g/L；酵母浸粉15g/L；葡萄糖15g/L；肌醇0.03g/L；生物素0.02mg/L；盐酸硫胺素10g/L；核黄素3.5/L；维生素B12 3.0mg/L，pH值为6.5。种子液种龄24小时，10％接种，装液量10ml/250mL，转速200rpm/min,37℃培养48小时，壳聚糖酶活力达到235U/ml。
壳聚糖酶活的测定:
取一定量的壳聚糖溶于0.2M的CH3COOH溶液中,用0.2M的CH3COONa调节至一定的pH,配成1％的壳聚糖溶液,吸取1.5mL壳聚糖溶液,保温5min后,加入0.5mL一定浓度的酶液,一定温度下水浴振荡,反应30min后,加入3mL铁氰化钾试剂,中止反应,4000rpm离心除去不溶物,采用Imoto法测定上清液中还原糖含量一个酶活单位(U)定义为:每分钟形成1μmol氨基葡萄糖所需要的酶量。
Figure BDA0001868174780000051
表1
上述对比实验中，采用的实验方案与各实施例保持一致。其中实施例2效果最佳。
本实施例中的实验结果表明，使用本发明公开的一种发酵培养基，使芽孢杆菌在良好生长的前提下能够高产壳聚糖酶，其中壳聚糖酶活力最高达到300U/ml。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (1)

1.一种发酵生产壳聚糖酶的复合培养基，其特征在于，每升复合培养基中组成为3-10g分子量为8000-10000Da的壳聚糖、7-18g酵母浸粉、10-20g葡萄糖、0.01-0.03g肌醇、0.03-0.05mg生物素、7-10g盐酸硫胺素、3.5-5g核黄素、3.0-4.5mg维生素B12。
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