CN102051369A

CN102051369A - 一种耐高温壳聚糖酶酵母工程菌及其耐高温壳聚糖酶的生产方法

Info

Publication number: CN102051369A
Application number: CN 201010507427
Authority: CN
Inventors: 马立新; 余晓岚; 陈小梅
Original assignee: Hubei University
Current assignee: Hubei University
Priority date: 2010-10-09
Filing date: 2010-10-09
Publication date: 2011-05-11
Anticipated expiration: 2030-10-09
Also published as: CN102051369B

Abstract

本发明提供了一种编码重组的耐高温壳聚糖酶的毕赤酵母基因工程菌株Gs115/HBCSN及其生产耐高温壳聚糖酶的方法。本发明根据毕赤酵母密码子偏爱性，对原始的Aspergillus fumigatus的壳聚糖酶基因(GenBank^TM accession number AY190324)进行了优化，优化后的核酸序列与原始核酸序列的同源性为77％。本发明中重组的毕赤酵母生产的壳聚糖酶以可溶的形式分泌到胞外，表达量高达3mg/mL，酶活可达25000U/mL。该壳聚糖酶在毕赤酵母中糖基化修饰后具有极好的耐热性，具体表现为在80℃处理120min，90℃处理40min，100℃处理20min后各自的残余活性分别为56％，87％，87％。本发明提供的耐高温壳聚糖酶特别适合大规模工业化降解壳聚糖，减少环境污染。

Description

一种耐高温壳聚糖酶酵母工程菌及其耐高温壳聚糖酶的生产方法

技术领域

本发明涉及一种耐高温壳聚糖酶酵母基因工程菌的构建及其生产耐高温壳聚糖酶的方法。属于微生物基因工程领域。

背景技术

壳聚糖酶(Chitosanase，EC.3.2.1.132)是降解壳聚糖的专一性酶，广泛存在于多种微生物中，目前在细菌(Bacillus、Enterobacter、Myxobacter)、放线菌(Streptomyces、Nocardioides)、真菌(Penicillium、AspergiUus、Rhizopus、Basidiomyce)、病毒(Chlorella virus PBCV-1、CVK-2)及植物的组织中均发现壳聚糖酶，但主要存在于细菌和真菌中。

近年来国内关于壳聚糖酶的研究主要集中在菌株的筛选、菌株发酵条件的优化以及酶学性质和分离纯化等方面。在现有的商品化壳聚糖酶中，由于原始的菌株产酶能力低，纯化率和得率都不高，所以导致成品酶的产量有限且售价高。要实现工业化大规模生产高酶活的壳聚糖酶，除了筛选高酶活的菌株外，还可通过分子生物学手段对现有的壳聚糖酶基因进行诱变改造，实现其高水平的表达。

现在商品化的壳聚糖酶在热稳定性等方面仍不足以适应工业化的要求，例如在许多工业应用中，常是在高温条件下使用壳聚糖酶，这就对壳聚糖酶的热稳定性提出较高的要求，但很多壳聚糖酶在温度超过40℃时，酶活降低很快。因此，迫切需要研制出一种廉价、高效、耐高温的壳聚糖酶来解决工业的发展需求和现有的壳聚糖酶热稳定性之间的矛盾。

发明内容

本发明的目的是提出一种运用基因工程手段寻找偏爱密码改变的耐高温壳聚糖酶基因，使其适合在毕赤酵母中高效稳定的表达，及制备该耐高温壳聚糖酶的方法。

一、耐高温壳聚糖酶基因的合成

GenBank^TM accession number AY190324所示的壳聚糖酶的氨基酸序列中，存在一个N糖基化位点，和多个氧糖基化位点。毕赤酵母作为真核表达系统，具有糖基化翻译后修饰功能，可使蛋白质的热稳定性得到提高。在氨基酸序列的不改变的前据下，对原始壳聚糖酶的核苷酸序利用DNAWORKS工具进行了优化，优化后的基因全部由毕赤酵母偏爱密码组成。优化后的核酸序列hbcsn与原始csn序列(GenBank^TM accession number AY190324)相比，有147个核苷酸发生了变化，核苷酸的同源性为77％，同时为了使壳聚糖酶在毕赤酵母中能够高效稳定的分泌表达，优化后的壳聚糖酶基因少了编码5’端信号肽序列的17个氨基酸。然后根据优化后的序列设计引物，利用套叠PCR的方法合成该基因。设计的引物长度为48-55bp，相邻两引物之间有20bp左右的重叠序列，Tm值为58-62℃，所有的引物均在invitrogen公司合成。将所有的引物加入反应体系中，进行PCR扩增。PCR扩增的条件为：98℃ 30s，58℃ 30s 72℃ 1min，共25个循环，最后72℃ 7min。

优化后的壳聚糖酶基因序列hbcsn与原始csn基因序列比较如下：(竖线表示上下对应的碱基相同，空格表示对应的碱基不同)：

二、含有耐高温壳聚糖酶基因表达载体的构建。

首先是将基因hbcsn用T4 DNA Polymerase处理，然后定向插入到毕赤酵母表达载体pHBM905A中。测序正确的重组载体命名为pHBMHBCSN。

三、表达耐高温壳聚糖酶的毕赤酵母工程菌的筛选。

将获得的重组质粒pHBMHBCSN经SalI线性化后，电击导入毕赤酵母Gs115中，重组子接种在含有壳聚糖为唯一碳源的平板上，从中筛选出水解圈最大的菌株，该菌株于2010年8月19号保藏于中国典型培养物保藏中心，名称为巴斯德毕赤酵母工程菌Gs115/HBCSN，保藏号：CCTCC NO：M 2010206，以下简称HBCSN。

HBCSN菌株的菌学特性：

A、形态特征：毕赤酵母属菌种细胞呈球形、椭圆形、拉长形，偶尔呈锥形，但不形成尖顶。菌落颜色为乳白色或奶油色。无性繁殖方式为多边芽殖。

B、生理生化特征：毕赤酵母能利用甲醇，石油，铵盐等特殊物质生长，最适生长温度为28℃-30℃。HBCSN除了具有毕赤酵母的生理生化外，其染色体上整合有壳聚糖酶基因，能够高效分泌表达耐高温的壳聚糖酶。

四.耐高温壳聚糖酶的制备方法。

具体方法如下：

方法一：摇瓶制备壳聚糖酶：将基因工程菌HBCSN接单菌落到BMGY培养基(2％蛋白胨，1％酵母提取物，100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％YNB，4×10^-5生物素，1％甘油)中，在28℃-30℃培养46-48小时，离心，再把菌体转入到BMMY(2％蛋白胨，1％酵母提取物，100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％YNB，4×10^-5生物素，1％甲醇)中，进行诱导表达。每24小时向培养基中加入100％甲醇至甲醇的终浓度为1％。诱导六天，离心发酵液，上清液即为含有壳聚糖酶的粗酶液。

方法二：发酵罐制备壳聚糖酶：

1.种子培养基的制备为：将基因工程菌HBCSN接单菌落到BMGY培养基(2％蛋白胨，1％酵母提取物，100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％YNB，4×10^-5生物素，1％甘油)中，在28℃-30℃培养46-48小时。

2.接种：按5％(种子培养基的体积/发酵罐中初始培养基的体积)的比例把种子培养基接入发酵罐中。发酵罐中的初始培养基为BMGY。

3.整个发酵过程分为两个阶段：

A.第一阶段为长生物量阶段，即菌体生长阶段。发酵参数为：温度28℃，pH5.8，通风量为0.5vvm，搅拌速度250-700转/分，溶氧量30％。自接种开始10-14小时后，发酵罐中的甘油被消耗尽，此时流加50％甘油(W/V)混合物(即每升50％甘油中含有12mL PTM1(PTM1微量元素(以下单位均为g/L)：五水硫酸铜6.0，碘化钠0.08，一水硫酸锰3.0，二水钼酸钠0.2，硼酸0.02，氯化钴0.5，氯化锌20，七水硫酸亚铁65，生物素0.2，浓硫酸9.2))，当菌体密度OD₆₀₀＝300-320时停加甘油混合物，准备转入第二阶段。

B.第二阶段为诱导阶段。发酵参数为：温度25℃，pH5.5，通风量为0.5vvm，搅拌速度680-700转/分，溶氧量30％。当停加甘油混合物后，流加甲醇混合物(即每升甲醇中含有12mL PTM1)进行诱导，诱导144-146小时左右，离心去除菌体，上清液即为含壳聚糖酶的粗酶液。

本发明的有益效果

1.本发明的壳聚糖酶具有明显的耐热性，在80℃处理120min后，酶的活性仍有56％。在90℃处理40min和100℃处理20min后，仍有87％的残余活性。高于已报道一般产品的耐热性。

2.本发明中的基因由于根据酵母密码子偏爱性进行了优化，所以更适合在毕赤酵母中表达，经过高密度发酵后，其蛋白量为3g/L。

3.本发明中的壳聚糖酶经过高密度发酵后，其酶活可达25000U/mL。

附图说明

图1为本发明利用套叠PCR从头合成编码壳聚糖酶全长基因的原理图，

图2为本发明壳聚糖酶基因的PCR琼脂糖凝胶电泳结果，

其中M为DNA Marker(λ-EcoT14 Ⅰdigest)；1为第二次PCR产物；2为第一次PCR产物；

图3为本发明基因工程菌HBCSN在摇瓶中产壳聚糖酶的SDS-PAGE分析结果

其中，泳道1-6分别为在摇瓶中诱导24，48，72，96，120，144小时的蛋白表达情况，M为蛋白质Marker。每泳道上样量为15μL上清液。

图4为本发明基因工程菌HBCSN在发酵罐中产壳聚糖酶的SDS-PAGE分析结果

其中，泳道A-L分别为在发酵罐中诱导12，24，36，48，60，72，84，96，108，120，132，144小时的蛋白表达情况，M为蛋白质Marker。每泳道上样量为5μL上清液。

图5为本发明耐高温壳聚糖酶在80℃的热稳定性曲线

图6为本发明耐高温壳聚糖酶在90℃的热稳定性曲线

图7为本发明耐高温壳聚糖酶在100℃的热稳定性曲线

具体实施方式

实施例1：利用套叠PCR方法合成编码壳聚糖酶的全长基因及毕赤酵母基因工程菌的构建。

1.利用套叠PCR方法合成编码壳聚糖酶的全长基因。从已报道的Aspergillus fumigatus的壳聚糖酶的氨基酸序列(GenBank^TM accession number AY190324)，根据毕赤酵母密码子偏爱性，对编码壳聚糖酶的基因进行了优化。优化后的序列见序列表1，设计引物(见表1)，除了hbcsn-1为26bp，hbcsn-24为55bp外，其余每条引物的长度为50，相邻两引物之间有20bp左右的重叠序列，Tm值为58-62℃。然后用套叠PCR方法合成全长的壳聚糖酶基因。

表1 套叠PCR方法合成全长壳聚糖酶基因的引物

hbcsn-20	5’AGTGAAACCAATAAACAAAACGTCGTTAGGATCATGTCCATGGTTACCAT3’
		hbcsn-21	5’ACGTTTTGTTTATTGGTTTCACTTCAAAGGATGCTGTTCCAGGTGCTACT3’
hbcsn-22	5’AATTCCTTAGCGTTCTTAGCCTTCCACTTGGCAGTAGCACCTGGAACAGC3’
		hbcsn-23	5’GGCTAAGAACGCTAAGGAATTCGAAGATTCTATAAAGTCTATTGGTGACA3’
hbcsn-24	5’GGCCATTAAGCCTTCAAACCAGCAACCAACTTGTCACCAATAGACTTTATAGAATC3’

具体来说为：把所有的引物放入一个PCR反应体系中，引物之间相互为模板退火，延伸。经过多轮循环后，扩增得到全长的壳聚糖酶基因。其中引物hbcsn-1和引物hbcsn-24分别含有部分Cop Ⅰ和Not Ⅰ的酶切位点和保护碱基(斜线标明)。

1.1 第一次PCR扩增，初步得到壳聚糖酶的全长基因。PCR扩增的条件为：：98℃30s，58℃30s 72℃1min，共25个循环，最后72℃7min。其反应体系为：1μL(10μmol/L)hbcsn-1+1μL(10μmol/L)hbcsn-24+1.5μL(1μmol/L)hbcsn-2+1.5μL(1μmol/L)hbcsn-3+1.5μL(1μmol/L)hbcsn-4+1.5μL(1μmol/L)hbcsn-5+1.5μL(1μmol/L)hbcsn-6+1.5μL(1μmol/L)hbcsn-7+1.5μL(1μmol/L)hbcsn-8+1.5μL(1μmol/L)hbcsn-9+1.5μL(1μmol/L)hbcsn-10+1.5μL(1μmol/L)hbcsn-11+1.5μL(1μmol/L)hbcsn-12+1.5μL(1μmol/L)hbcsn-13+1.5μL(1μmol/L)hbcsn-14+1.5μL(1μmol/L)hbcsn-15+1.5μL(1μmol/L)hbcsn-16+1.5μL(1μmol/L)hbcsn-17+1.5μL(1μmol/L)hbcsn-18+1.5μL(1μmol/L)hbcsn-19+1.5μL(1μmol/L)hbcsn-20+1.5μL(1μmol/L)hbcsn-21+1.5μL(1μmol/L)hbcsn-22+1.5μL(1μmol/L)hbcsn-23+5×PrimeSTAR

Buffer 10μL+2.5mmol/L dNTPs 4μL+0.5μL PrimeSTAR

HS DNA Polymerase+ddH₂O to 50μL。

1.2 第二次PCR扩增全长基因。为了得到较均一的全长基因，以第一次的PCR产物为模板，hbcsn-1，hbcsn-24为引物，进行第二次PCR。PCR条件为： ℃ 9s， ℃ 5s ℃ min，共25个循环，最后72℃ 7min。上述两次的PCR扩增产物的1％琼脂糖凝胶电泳如图2所示，其大小约700bp。

2.含有耐高温壳聚糖酶基因表达载体的构建。回收后的PCR产物经T4 DNA Polymerase处理后，克隆到pHBM905A载体中，经菌落PCR验证为阳性的克隆利用Sanger双脱氧链终止法进行测序。测序正确的重组质粒命名为pHBMHBCSN。

3.耐高温壳聚糖酶的毕赤酵母基因工程菌的构建。将含有目的基因测序正确的重组质粒pHBMHBCSN用Sal Ⅰ线性化后，电击导入毕赤酵母GS115中，重组子接种在含有壳聚糖为唯一碳源的平板上，从中筛选出水解圈最大的菌株作为生产耐高温壳聚糖酶的基因工程菌HBCSN。

实施例2：毕赤酵母基因工程菌HBCSN在摇瓶中培养制备壳聚糖酶。

将基因工程菌HBCSN接单菌落到BMGY培养基中，在28℃-30℃培养46-48小时，离心，再把菌体转入到BMM中，进行诱导表达。每24小时向培养基中加入 100％甲醇至甲醇的终浓度1％。诱导六天，离心发酵液，上清液即为含有壳聚糖酶的粗酶液。每24小时取样进行SDS-PAGE检测蛋白表达情况，其结果如图3所示。

实施例3：毕赤酵母基因工程菌HBCSN在发酵罐中的放大培养制备壳聚糖酶。

1.种子制备为：接单菌落到BMGY培养基中，在28℃-30℃培养46-48小时。

3.整个发酵过程分为两个阶段：

A.第一阶段为长生物量阶段，即菌体生长阶段。发酵参数为：温度28℃，pH5.8，通风量为0.5vvm，搅拌速度250-700转/分，溶氧量30％。自接种开始10-14小时后，发酵罐中的甘油被消耗尽，此时流加50％甘油(W/V)混合物(即每升50％甘油中含有12mL PTM1)，当菌体密度OD₆₀₀＝300-320时停加甘油混合物，准备转入第二阶段。

B.第二阶段为诱导阶段。发酵参数为：温度25℃，pH5，通风量为0.5vvm，搅拌速度680-700转/分，溶氧量30％。当停加甘油混合物后，流加甲醇混合物(即每升甲醇中含有12mL PTM1)进行诱导，每隔12小时取样进行SDS-PAGE检测蛋白表达情况，其结果如图4所示。诱导五天后蛋白表达量已达到最大，最大为3mg/mL，其粗酶活为25000U/mL。诱导144-146小时后，离心去除菌体，上清液即为含壳聚糖酶的粗酶液。

实施例4：耐高温壳聚糖酶的酶学性质分析。

(一)酶活测定方法

1.反应体系：取1mL适当稀释的发酵酶液加入试管中，再加入1mL 1％的壳聚糖，55℃反应15min后，加入2mL的DNS，于沸水浴中煮10min。迅速冷却后，离心除去没反应的壳聚糖，在OD₅₄₀测吸光值。

2.酶活定义：每分钟水解产生1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活单位(U)

(二)耐高温壳聚糖酶的热稳定性分析

该酶在毕赤酵母中重组表达后，其最适反应温度，pH性质没有发生很大的变化但是耐热性发生很大的变化，可能是该壳聚糖酶在毕赤酵母中重组表达存在糖基化所致(如Chih Yu Cheng and Yaw-Kuen Li1，Biotechnol.Appl.Biochem.(2000)32，197-203)。具体来说：

1.耐高温壳聚糖酶在80℃热稳定性的测定：

壳聚糖酶于80℃水浴锅分别保温0.5、1、1.5、2小时，保温后的酶液按上述(一)所述的方法测定其酶活。结果表明处理120min后，其残余活性仍有56％。每个反应独立重复五次。其结果如图5所示。

2.耐高温壳聚糖酶在90℃热稳定性的测定：

壳聚糖酶于90℃水浴锅分别保温10、20、30、40min，保温后的酶液按上述(一)所述的方法测定其酶活。结果表明在90℃处理40min后，仍有87％的残余活性。每个反应独立重复五次。其结果如图6所示。

3.耐高温壳聚糖酶在100℃热稳定性的测定：

壳聚糖酶于100℃水浴锅分别保温5、10、15、20min，保温后的酶液按上述(一)所述的方法测定其酶活。结果表明在100℃处理20min后，壳聚糖酶的活性仍有87％。每个反应独立重复五次。其结果如图7所示。

Claims

1.一种耐高温壳聚糖酶的基因，其特征在于该基因的核苷酸序列如下：

tacaacctac ccaacaattt gaagcaaatt tacgataagc ataagggtaa atgttctaag 60

gtccttgcta agggattcac taacggtgat gcttctcaag gtaagtcttt ttcttactgt 120

ggagatattc ctggtgctat tttcatttct tcttcaaaag gttacacaaa catggatatt 180

gattgtgatg gagctaacaa ctcagctggt aagtgcgcta acgatccatc tggtcaaggt 240

gaaactgctt ttaagtctga tgttaagaag tttggtattt ctgacttgga tgctaatatt 300

catccatacg ttgtttttgg taacgaagat cattctccaa agtttaagcc acaatctcat 360

ggtatgcaac cattgtctgt tatggctgta gtttgtaacg gtcaattaca ttacggaatt 420

tggggtgata ctaatggtgg tgtttctact ggtgaggcat caatttcctt ggctgatttg 480

tgttttccaa acgaacactt agatggtaac catggacatg atcctaacga cgttttgttt 540

attggtttca cttcaaagga tgctgttcca ggtgctactg ccaagtggaa ggctaagaac 600

gctaaggaat tcgaagattc tataaagtct attggtgaca agttggttgc tggtttgaag 660

gcttaa 666。

2.一种耐高温壳聚糖酶酵母工程菌Gs 115/HBCSN，简称为HBCSN，其保藏号为：CCTCC No：M 2010206。

3.一种耐高温壳聚糖酶的生产方法，其特征在于摇瓶生产步骤为：

将基因工程菌HBCSN接单菌落到BMGY培养基中，在28℃-30℃培养46-48小时，离心，再把菌体转入到BMMY中，进行诱导表达，每24小时向培养基中加入100％甲醇至甲醇的终浓度为1％，诱导六天，离心发酵液，上清液即为含有耐高温壳聚糖酶的粗酶液。

4.一种耐高温壳聚糖酶的生产方法，其特征在于发酵罐生产步骤为：

1)、种子培养基的制备为：将基因工程菌HBCSN接单菌落到BMGY培养基中，在28℃-30℃培养46-48小时；

2)、接种：按5％(种子培养基的体积/发酵罐中初始培养基的体积)的比例把种子培养基接入发酵罐中，发酵罐中的初始培养基为BMGY；

3)、第一阶段为菌体生长阶段，发酵参数为：温度28℃，pH5.8，通风量为0.5vvm，搅拌速度250-700转/分，溶氧量30％，自接种开始10-14小时后，发酵罐中的甘油被消耗尽，此时流加50％甘油(W/V)混合物，当菌体密度OD₆₀₀＝300-320时停加甘油混合物，准备转入第二阶段，50％甘油(W/V)混合物成分为：每升50％甘油混合物中含有12mLPTM1微量元素混合物；PTM1微量元素混合物组分为：五水硫酸铜6.0，碘化钠0.08，一水硫酸锰3.0，二水钼酸钠0.2，硼酸0.02，氯化钴0.5，氯化锌20，七水硫酸亚铁65，生物素0.2，浓硫酸9.2，以上单位均为g/L；

4)第二阶段为诱导阶段，发酵参数为：温度25℃，pH5.5，通风量为0.5vvm，搅拌速度680-700转/分，溶氧量30％，当停加甘油混合物后，流加甲醇混合物(即每升甲醇中含有12mL PTM1)进行诱导，诱导144-146小时左右；

5)离心去除菌体，上清液即为含有耐高温壳聚糖酶的粗酶液。