CN106282274B - 一种胰岛素前体蛋白的毕赤酵母高密度发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物领域,公开了一种胰岛素前体蛋白的毕赤酵母高密度发酵方法,包括菌种扩培、发酵培养和菌体收集等步骤,发酵培养又分为分批生长阶段、甘油补加阶段和甲醇诱导阶段。该方法通过控制发酵过程中菌种的菌龄、补料速率、pH值等参数,可将糖基化2的浓度有效降低60±8%,同时也可将胰岛素前体蛋白的单位产量提高了25%以上。且该方法具有简单、易操作和成本低等优点。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域,具体涉及一种胰岛素前体蛋白的毕赤酵母高密度发酵方法。
背景技术
目前已有多种微生物表达系统用于生产胰岛素及其衍生物,如大肠杆菌(Escherichia coli),酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)等。由于表达水平低、纯化困难等缺点,前两种系统的应用较少。毕赤酵母具有能够高效表达并有效分泌胞外蛋白、生产成本低等优点而普遍用于重组蛋白商业生产。
然而,巴斯德毕赤酵母在表达外源蛋白的过程中不可避免地进行蛋白质的翻译后修饰,其随后在终产物中以杂质形式存在,该终产物难以纯化。其中,最常见形式还是糖基化。根据表达系统糖基化可以是N~连接的或O~连接的。在酵母细胞的高尔基体中,通过不同的甘露糖酶转移酶进行甘露糖残基的一系列添加而形成一种高甘露糖的外部糖链结构。这类糖基化通常是不期望的,因为在碳水化合物组成以及分子量两个方面,均会导致重组蛋白质产物的异质性,这可能使蛋白质纯化复杂化。它还可以使蛋白质变成高度免疫原性或可以引起不期望的变应性反应。在胰岛素前体表达的过程中会出现两种O~连接的糖基化杂蛋白。其中,糖基化1的含量较低,在纯化过程中容易除去,但糖基化2的含量较高,对纯化工艺造成较大负担,因此寻求一种在上游工艺中减少这种糖基化的有效方法。
目前,改善巴斯德毕赤酵母糖基化的方法主要是通过基因工程的方法进行的,主要包括:(1)位点专一性突变,减少潜在的糖基化位点;(2)利用酵母的突变株,如外周糖链生物合成缺陷型和α~1,6甘露糖基转移酶缺陷型。通过这些方法对菌株进行改造已取得许多成功应用,但仍有不可避免的缺点,如基因操作困难且改造后的菌株并非会取得理想的效果。另外,基因改造后可能会对菌体本身产生一些负作用,如生长变缓、代谢减弱、表达效率降低等。
专利CN 103003438A公开了一种通过破坏蛋白甘露糖基转移酶(PMT)提供了包括毕赤酵母尤其是巴斯德毕赤酵母的甲醇营养型酵母的基因工程敲除菌株,使他们能够生产糖基化减少的异源性蛋白质,从而使生产的胰岛素类似物的糖基化可减少65%左右。虽然该方法可有效的降低O-糖基化,但该方法成本高,操作复杂。因此需要开发一种操作方便、工艺简单、成本低的有效方法来降低酵母生产的蛋白质糖基化。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺陷和不足,本发明提供了一种胰岛素前体蛋白的毕赤酵母高密度发酵方法,该方法通过控制发酵过程中的菌龄、补料速率、pH值等参数,将糖基化2的浓度有效降低60±8%,也将胰岛素前体蛋白的单位产量提高了25%以上。
本发明的技术方案提供了一种胰岛素前体蛋白的毕赤酵母高密度发酵方法,其特征在于,包括以下步骤:
菌种扩培:将活化后的菌种接种至种子培养基中,于28~32℃振荡培养10~14h后,以0.5%~1.5%的体积比转接到二级种子培养基中,于28~30℃振荡培养20~24h;
发酵培养:①分批生长阶段:将扩培后的菌种接种至发酵培养基中,控制溶氧量≥50%,在28~32℃下培养至溶氧量反弹;②甘油补加阶段:以18~25g/L/h的速率补加甘油溶液并控制溶氧≥30%,控制pH值在4.0~5.0,培养至OD600为200~300时停加甘油;③甲醇诱导阶段:溶氧量反弹后以6.0~8.0g/L/h的速率补加甲醇溶液,培养温度降至25~28℃,控制溶氧为5~10%,培养130~140h时结束。
在本发明的一些实施方式中,分批生长阶段菌种接种至培养基的接种量为:菌种的体积为发酵培养基体积的2.5%。
在本发明的一些实施方式中,种子培养基各组分的组成为:酵母提取物10g/L,蛋白胨20g/L,无氨基酵母氮源(YNB)13.4g/L,甘油20g/L,0.1mol/L的磷酸缓冲液。
在本发明的一些实施方式中,控制pH值的物质为0.5g/L的尿素溶液。
在本发明的一些实施方式中,发酵培养基各组分的组成为:甘油20~40g/L,酵母粉3~7g/L,尿素5~8g/L,CaSO4·2H2O 0.4~1.0g/L,MgSO45~8g/L,KOH 20~30g/L,H3PO420~30ml/L,PTM1溶液2~6ml/L,消泡剂1~3ml/L。
在本发明的一些实施方式中,溶氧的浓度是通过调节培养过程中的转速来实现的。
在本发明的一些实施方式中,所述的溶氧量反弹,是指溶氧达到80%。
在本发明的一些实施方式中,甘油溶液的组成为:0.5g/L的甘油和12ml/L PTM1溶液。
在本发明的一些实施方式中,所述甲醇溶液是将12ml PTM1溶于1L甲醇溶液中配制而成。
在本发明的一些实施方式中,菌种为巴斯德毕赤酵母GS115。
在本发明的一些实施方式中,在发酵50h后开始每隔3-4.5h定时取样,并将离心后的发酵样品上清液置于冷冻冰箱中保存待用。
在本发明的一些实施方式中,补加甲醇溶液后先降温至28℃培养90h后,再降温至25℃。
在本发明的一些实施方式中,PTM1溶液的组成为:CuSO4·5H2O 6g/L,KI 0.08g/L,MnSO4·H2O 3g/L,Na2MoO4·2H2O 0.2g/L,H3BO30.02g/L,ZnSO4·7H2O 20g/L,FeSO4·7H2O65g/L,CoCl2·6H2O 0.5g/L,H2SO45ml/L,Biotin 0.2g/L。
在本发明的一些实施方式中,使用的水均为纯化水。
除非明确地说明与此相反,否则,本发明引用的所有范围包括端值。例如,“以18~25g/L/h的速率补加甘油溶液并控制溶氧≥30%”,表示补加甘油溶液的速率为18≤v≤25g/L/h。
本发明中的数字均为近似值,无论有否使用“大约”或“约”等字眼。数字的数值有可能会出现1%、2%、5%、7%、8%、10%等差异。每当公开一个具有N值的数字时,任何具有N+/-1%,N+/-2%,N+/-3%,N+/-5%,N+/-7%,N+/-8%或N+/-10%值的数字会被明确地公开,其中“+/-”是指加或减。
在本发明的一些实施方式中,所用的器皿均为已灭菌的。
本发明的有益效果为:
本发明在不需要通过基因工程将甲醇营养型酵母的菌株敲除来实现降低糖基化的含量的目的,而是在不影响胰岛素前体中糖基化1的前提下仅仅通过改变发酵过程中的一些参数,即可有效的将糖基化2的含量减少60±8%,而剩余的糖基化杂蛋白可通过下游纯化工艺轻易去除。本发明达到了和通过基因工程方法来降低糖基化差不多的效果,且本发明的方法具有操作方便、工艺简单、成本低等优点。
(2)本发明所提供了发酵工艺在不影响菌体生长的同时也将胰岛素前体蛋白的单位产量提高了25%以上。最优条件下的表达量为4.40g/L,并且随着周期的延长仍有较大幅度提高的潜力。
附图说明
图1为实施例1中胰岛素前体糖基化峰HPLC图谱,主峰前的小峰为糖基化峰1,主峰后的小峰为糖基化峰2。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种减少蛋白质糖基化的毕赤酵母高密度发酵方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
实施例1
对象:采用GS115型毕赤酵母(购自Invitrogen公司,美国)发酵表达重组人胰岛素前体
菌种扩培:将活化后的菌种接种至种子培养基中,于28℃振荡培养10h后,以0.5%的体积比转接到二级种子培养基中,于28℃振荡培养20h;
发酵培养:1)分批生长阶段:将扩培后的菌种接种至发酵培养基中,菌种的接种体积为发酵培养基体积的2.5%,通过转速控制溶氧量≥50%,在28℃下培养至溶氧量反弹至80%;2)甘油补加阶段:以25g/L/h的速率补加甘油溶液、通过转速控制溶氧≥30%,补加尿素控制pH值在4.0,培养至菌体浓度为OD600=200时停加甘油;3)甲醇诱导阶段:等溶氧量反弹至80%后以6.0g/L/h的速率补加甲醇溶液,培养温度降至25℃,通过转速控制溶氧为5%,培养130h时结束。
菌体收集:发酵培养50h后每隔3-4.5h定时取样,将离心后的发酵样品上清液置于冷冻冰箱中保存待用。
将发酵样品上清液进行蛋白质糖基化1和2的峰面积、菌体浓度OD600、胰岛素前体表达量及相对对比例胰岛素前体表达量提高量等指标进行检测及分析,结果见表1。
实施例2
对象:采用GS115型毕赤酵母(购自Invitrogen公司,美国)发酵表达重组人胰岛素前体。
菌种扩培:将活化后的菌种接种至种子培养基中,于32℃振荡培养14h后,以1.5%的体积比转接到二级种子培养基中,于32℃振荡培养24h;
发酵培养:1)分批生长阶段:将扩培后的菌种接种至发酵培养基中,菌种的接种体积为发酵培养基体积的2.5%,通过转速控制溶氧量≥50%,在32℃下培养至溶氧量反弹至80%;2)甘油补加阶段:以18g/L/h的速率补加甘油溶液、通过转速控制溶氧≥30%,补加尿素控制pH值在5.0,培养至菌体浓度为OD600=300时停加甘油;3)甲醇诱导阶段:等溶氧量反弹至80%后以8.0g/L/h的速率补加甲醇溶液,培养温度降至28℃,通过转速控制溶氧为10%,培养140h时结束。
菌体收集:发酵培养50h后每隔3-4.5h定时取样,将离心后的发酵样品上清液置于冷冻冰箱中保存待用。
将发酵样品上清液进行蛋白质糖基化1和2的峰面积、菌体浓度OD600、胰岛素前体表达量及相对对比例胰岛素前体表达量提高量等指标进行检测及分析,结果见表1。
实施例3
对象:采用GS115型毕赤酵母(购自Invitrogen公司,美国)发酵表达重组人胰岛素前体。
菌种扩培:将活化后的菌种接种至种子培养基中,于30℃振荡培养10~14h后,以1.0%的体积比转接到二级种子培养基中,于30℃振荡培养22h;
发酵培养:1)分批生长阶段:将扩培后的菌种接种至发酵培养基中,菌种的接种体积为发酵培养基体积的2.5%,通过转速控制溶氧量≥50%,在30℃下培养至溶氧量反弹至80%;2)甘油补加阶段:以20g/L/h的速率补加甘油溶液、通过转速控制溶氧≥30%,补加尿素控制pH值在5.0,培养至菌体浓度为OD600在250时停加甘油;3)甲醇诱导阶段:等溶氧量反弹至80%后以7.0g/L/h的速率补加甲醇溶液,培养温度降至28℃,等培养至90h时再降温25℃,通过转速控制溶氧为8%,培养135h时结束。
菌体收集:发酵培养50h后每隔3-4.5h定时取样,将离心后的发酵样品上清液置于冷冻冰箱中保存待用。
将发酵样品上清液进行蛋白质糖基化1和2的峰面积、菌体浓度OD600、胰岛素前体表达量及相对对比例胰岛素前体表达量提高量等指标进行检测及分析,结果见表1。
对比例
对象:采用GS115型毕赤酵母(购自Invitrogen公司,美国)发酵表达重组人胰岛素前体。
菌种扩培:将活化后的菌种接种至种子培养基中,于30℃振荡培养10h后,以0.5%的体积比转接到二级种子培养基中,于30℃振荡培养18h;
发酵培养:将扩培后的菌种接种至发酵培养基中,菌种的接种体积为发酵培养基体积的2.5%,通过转速控制溶氧量≥50%,在30℃温度下培养至溶氧量反弹至80%;然后以15g/L/h的速率补加甘油溶液、通过转速控制溶氧≥30%,补加尿素控制pH在6.0左右,培养至菌体浓度为OD600=150左右时停加甘油;等溶氧量反弹至80%后以5.0g/L/h的速率补加甲醇溶液,通过转速控制溶氧在零以上,培养160h时结束。菌体收集:发酵培养50h后每隔3-5h取样,将离心后的发酵样品上清液进行蛋白质糖基化1和2的峰面积、菌体浓度OD600及胰岛素前体表达量等指标进行检测及分析。培养结束时的检测结果如下:菌体浓度OD600:680±10;糖基化峰1比例:(0.30±0.05)%;糖基化峰2比例:(2.10±0.05)%;胰岛素前体表达量:2.85±0.2g/L。
表1培养过程中各项参数测试结果如下:
Claims (9)
1.一种胰岛素前体蛋白的毕赤酵母高密度发酵方法,其特征在于,包括以下步骤:
菌种扩培:将活化后的菌种接种至种子培养基中,于28~32℃振荡培养10~14h后,以0.5%~1.5%的体积比转接到二级种子培养基中,于28~32℃振荡培养20~24h;
发酵培养:1)分批生长阶段:将扩培后的菌种接种至发酵培养基中,控制溶氧量≥50%,在28~32℃下培养至溶氧量反弹至80%;2)甘油补加阶段:以18~25g/L/h的速率补加甘油溶液并控制溶氧≥30%,控制pH值在4.0~5.0,培养至OD600为200~300时停加甘油;3)甲醇诱导阶段:溶氧量反弹至80%后以6.0~8.0g/L/h的速率补加甲醇溶液,培养温度降至25~28℃,控制溶氧为5~10%,培养130~140h时结束;
所述甘油溶液的组成为:0.5g/L的甘油和12ml/L PTM1溶液。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,分批生长阶段菌种接种至培养基的接种量为:菌种的体积为发酵培养基体积的2.5%。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述种子培养基各组分的组成为:酵母提取物10g/L,蛋白胨20g/L,无氨基酵母氮源YNB 13.4g/L,甘油20g/L,0.1mol/L的磷酸缓冲液。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,控制pH值的物质为0.5g/L的尿素溶液。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述发酵培养基各组分的组成为:甘油20~40g/L,酵母粉3~7g/L,尿素5~8g/L,CaSO4·2H2O 0.4~1.0g/L,MgSO4 5~8g/L,KOH 20~30g/L,H3PO4 20~30ml/L,PTM1溶液2~6ml/L,消泡剂1~3ml/L。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述甲醇溶液是将12ml PTM1溶于1L甲醇溶液中配制而成。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在发酵50h后开始每隔3-4.5h定时取样,并将离心后的发酵样品上清液置于冷冻冰箱中保存待用。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的菌种为巴斯德毕赤酵母GS115。
9.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述PTM1溶液的组成为:CuSO4·5H2O 6g/L,KI 0.08g/L,MnSO4·H2O 3g/L,Na2MoO4·2H2O 0.2g/L,H3BO3 0.02g/L,ZnSO4·7H2O 20g/L,FeSO4·7H2O 65g/L,CoCl2·6H2O 0.5g/L,H2SO4 5ml/L,Biotin 0.2g/L。
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