KR20210016400A - 재조합 인간 인슐린 또는 그 유사체의 전구체를 제조하는 방법 - Google Patents
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Abstract
다음을 포함하는, 재조합 인간 인슐린 또는 그 유사체의 전구체를 제조하는 방법이 개시되어 있다: a. 세균을 발효시키고, 연속 흐름으로 발효액을 원심분리하여 상등액을 수거하는 단계; b. 단계 (a)의 상등액을 중공사막을 사용하여 여과시키고 여액을 수거하는 단계; c. 단계 (b)의 여액을 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 정제하는 단계. 상기 방법은 간소화된 단계, 확장성, 유기 용매 미사용, 고수율 등의 이점을 갖는다. 상기 인슐린 전구체의 순도는 90%를 초과할 수 있고, 숙주 세포 단백질 제거율은 90%를 초과하며, 외인성 DNA 제거율은 89% 이상으로 0.1 ng/mg 미만을 달성한다.
Description
본 출원은 전체적으로 본원에 참고로 도입된, 2018년 5월 24일자로 출원된 중국 특허출원 CN201810507928.7 호를 우선권 주장한다.
본 발명은 단백질 및 폴리펩티드 약물 분야, 특히 재조합 인간 인슐린 또는 그 유사체의 전구체를 제조함으로써 당뇨병-관련 질환을 치료하기 위한 인슐린 유사 약물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
당뇨병은 흔한 대사 및 내분비 질환이며, 암 및 심혈관 및 뇌혈관 질환 다음으로 3번째로 많은 심각한 생명을 위협하는 질환이다. 당뇨병의 치료에서, 인슐린이 1차 약물이다. 당뇨 환자 수의 급속한 증가는 인슐린에 대한 수요를 급속히 증가시킨다. 생화학의 급속한 발전으로, 미생물 플랫폼 및 유전자 공학을 이용하여 인간 인슐린 및 그의 유사체를 발현하는 것이 상기 산업에 주요한 방법이 되었다.
다양한 인슐린 유사체 및 그의 유도체들이 존재한다. WO2005012347 호는, 위치 B30의 아미노산이 결실되고 위치 B29에 글루탐산 및 장쇄 지방산이 결합된 인슐린 유사체를 개시하였다. WO2007074133 호 및 WO2011141407 호는 각각 상기 인슐린 유사체 및 그의 제조 방법을 개시하였고; WO9507931 호는 위치 B30의 아미노산이 결실되고 인슐린 유사체의 위치 B29에 테트라데실 측쇄가 결합된 인슐린 유사체, 그의 제형 및 제조 방법을 개시하였으며; WO2018024186 호는 인간 인슐린 유사체의 아실화 유도체의 구조 및 생물 활성을 개시하였다.
인슐린 유사체 또는 그의 유도체의 제조와 관련하여, 1982년에 진테크(Genetech)와 릴리(Lilly)는 이. 콜라이(E. coli) 시스템을 사용하여 인슐린을 생산하는데 협력하였다. 이. 콜라이 세포에 봉입체의 형태로 존재한 인슐린 전구체를 세포 용해후 방출시켰다. 세포 용해에서 복원후에 정확한 구조를 갖는 인슐린 전구체를 수득하였다. CN1043719A 호는 인슐린 생산을 위한 효모 시스템의 사용을 개시하였는데, 여기에서는 인슐린 전구체가 발효액중에 직접 분비될 수 있으며, 원심분리에 의해 세균을 제거한 후의 상등액을 크로마토그래피 컬럼에 통과시켜 냉동 건조에 의해 전구체를 단리한다. CN106282274A 호는 피. 파스토리스(P. pastoris)의 고밀도 발효에 의해 인슐린 전구체를 제조하고 원심분리에 의해 발효액에 고체-액체 분리를 수행하는 방법을 개시하였다. US2014057318A 호는 중공사막 시스템을 사용하여 인슐린 전구체의 발효액을 정화시키는 방법을 개시하였다. CN1290299A 호는 거대다공성 수지로 흡착시킨 후 유기 용매로 용출시켜 인슐린 전구체를 포획하는 방법을 개시하였다. CN105153294A 호는, Capto MMC 시리즈 충전제를 유도 부하에 사용하여 효소 절단에 직접 사용될 수 있는 인슐린 전구체를 수득할 수 있는 방법을 개시하였다.
발효액의 정화는 효모에 의해 분비되고 발현된 인슐린 전구체의 제조에서 첫번째 단계로서, 세균과 단백질을 분리하고 인슐린 전구체를 함유하는 발효 상등액을 수득하는 것이 목적이다. 효모 고체와 액체를 분리하는 통상적인 방법은 플레이트 및 프레임 필터 프레스, 중공사막을 사용한 정화 및 분리, 원심분리, 응집 및 침강, 확장층 크로마토그래피 등을 포함한다. 발효액을 정화시킨 후, 인슐린 전구체를 함유하는 투명 액체가 수득된다. 상기 투명 액체는 통상적으로 효소 절단 전에 포획 과정을 거칠 필요가 있다. 높은 전도도로 인해, 상기 투명 액체는 이온 교환 크로마토그래피 전에 희석할 필요가 있다.
재조합 인간 인슐린 또는 그 유사체의 전구체를 제조하기 위한 기존의 방법들에는 다음을 포함한 많은 문제들이 있다: 고비용, 시간 소모, 복잡한 작업, 유기 용매 사용으로 인한 생산 작업장의 증가된 방폭 요건, 투명 액체의 과도한 부피로 인한 저장 탱크의 면적 확장 요구, 수득된 인슐린 전구체의 직접 절단 불가능함, 및 인슐린 전구체 생산물의 낮은 회수율 등. 상기 문제들을 고려하여, 고효율, 고수율, 저비용, 및 생산 규모확대 용이성 하에 재조합 인간 인슐린 또는 그 유사체의 전구체를 제조하기 위한 개선된 방법이 시급하게 요구된다.
본 발명은 연속 흐름 원심분리와 중공사 미세여과를 유기적으로 결합시켜 재조합 인간 인슐린 또는 그 유사체의 전구체를 제조하며, 이것은 인슐린 전구체 및 인슐린의 대규모 산업적 생산에 적합하다.
일부 실시양태는 하기의 단계를 포함하는, 재조합 인간 인슐린 또는 그 유사체의 전구체를 제조하는 방법을 제공한다:
a. 세균 발효후 수득된 발효액에 연속 흐름 원심분리를 수행하고, 경질 액체를 수거하는 단계;
b. 단계 a의 경질 액체를 중공사막 여과에 의해 여과시키고 수득된 여액을 수거하는 단계;
c. 단계 b의 여액을 크로마토그래피 컬럼으로 정제하는 단계.
일부 실시양태에서, 연속 흐름 원심분리 후에, 1% 미만의 세균 함량을 갖는 경질 액체를 수득할 수 있으며, 크로마토그래피 후에 90%보다 큰 순도를 갖는 인슐린 전구체를 수득할 수 있다.
일부 실시양태에서, 단계 b의 중공사막은 바람직하게는 0.22 ㎛ 또는 0.45 ㎛의 기공 크기를 갖는다. 적어도 한 실시양태에서, 중공사막은 0.22 ㎛의 기공 크기를 갖는다.
일부 실시양태에서, 단계 b의 중공사막 여과는 순환 접선 유동 여과이고, 중공사막은 500 내지 1000 KDa의 분획분자량을 갖는다. 적어도 한 실시양태에서, 중공사막은 750 KDa의 분획분자량을 갖는다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:
a. 세균 발효후 수득된 발효액에 연속 흐름 원심분리를 수행하고, 경질 액체 및 중질 액체를 각각 수거하고; 중질 액체를 적어도 1회 희석한 다음 원심분리를 다시 수행하여 또 다른 경질 액체를 수득하고, 2개의 수득된 경질 액체를 하나로 취합하는 단계;
b. 단계 a에서 수득된 경질 액체를 중공사막을 사용하여 순환 접선 유동 여과에 의해 여과시키고, 여액을 수거하는 단계;
c. 단계 b의 여액을 크로마토그래피 컬럼으로 정제하는 단계(이때, 크로마토그래피 컬럼에 사용된 충전제는 양이온 교환 리간드 및 소수성 리간드를 포함하는 복합 충전제이다). 일부 특정 실시양태에서, 에쉬무노(Eshmuno)®HCX를 복합 충전제의 크로마토그래피 매질로 선택한다.
일부 실시양태에서, 양이온 교환 리간드는 강한 양이온 교환 리간드이다.
일부 실시양태에서, 기술된 희석은 산성 용액 또는 알카리성 용액으로부터 선택된 희석제를 사용하며, 이때 상기 산성 용액은 아세트산-아세트산나트륨 완충제 및 시트레이트 완충제로부터 선택되고 알칼리성 용액은 트라이하이드록시메틸-아미노메탄-염산(트리스-HCl) 완충제, 포스페이트 완충제 및 글리신 수산화나트륨 완충제로부터 선택된다. 적어도 한 실시양태에서, 산성 용액은 2.0 내지 6.0의 pH를 갖고, 알칼리성 용액은 7.0 내지 9.0의 pH를 갖는다. 적어도 한 실시양태에서, 산성 용액의 농도는 1 mM 내지 100 mM, 또는 1 mM 내지 50 mM, 또는 10 mM 내지 20 mM이거나, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM 또는 100 mM이거나, 약 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM 또는 100 mM이다. 적어도 한 실시양태에서, 알칼리성 용액의 농도는 1 mM 내지 100 mM 또는 1 mM 내지 50 mM 또는 10 mM 내지 30 mM이거나, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM 또는 100 mM이거나, 약 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM 또는 100 mM이다.
일부 실시양태에서, 단계 (a)의 발효액은 원심분리 전에 2.0 내지 9.0 또는 3.0 내지 8.5의 pH, 또는 4.0 내지 8.0 사이 임의 지점의 pH로 조정된다. 적어도 한 실시양태에서, 상기 pH는 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0 또는 8.5이거나, 약 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0 또는 8.5이다.
일부 실시양태에서, 연속 흐름 원심분리는 디스크 원심분리기로 수행한다.
일부 실시양태에서, 연속 흐름 원심분리의 원심력은 8000g 내지 14000g 범위의 임의의 값이다, 예를 들어, 8000, 8500, 9000, 10000, 11000, 12000, 13000 또는 14000g이거나, 약 8000, 8500, 9000, 10000, 11000, 12000, 13000 또는 14000g이다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:
a. 세균 발효후 발효액을 3.0 내지 8.0의 pH로 조정하고, 연속 흐름 원심분리를 수행하고, 경질 액체를 수거하는 단계;
b. 단계 a의 경질 액체를 중공사막을 사용하여 순환 접선 유동 여과 시스템에 의해 여과시키고, 여액을 수거하는 단계;
c. 단계 b의 여액을 강한 양이온-소수성 교환 리간드를 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로 정제하는 단계;
(이때, 단계 a는, 경질 액체 및 중질 액체를 각각 수거하고, 중질 액체를 적어도 1회 희석한 다음, 원심분리를 수행하여 또 다른 경질 액체를 수득하고, 2개의 경질 액체를 하나로 취합하는 단계를 추가로 포함하고; 상기 희석은 3.0 내지 5.0의 pH를 갖는 아세트산-아세트산나트륨 완충제 또는 7.0 내지 9.0의 pH를 갖는 트리스-HCl 완충제로부터 선택된 희석제를 사용한다). 단계 b의 중공사막은 0.22 ㎛의 기공 크기를 가질 수 있다.
일부 특정한 실시양태에서, 아세트산-아세트산나트륨 희석제의 pH는 3.0, 4.0 또는 5.0일 수 있거나, 약 3.0, 4.0 또는 5.0이고, 트리스-HCl 완충제의 pH는 7.0, 8.0 또는 9.0일 수 있거나, 약 7.0, 8.0 또는 9.0이다.
일부 특정한 실시양태에서, 단계 (c)의 정제는 평형화, 부하, 불순물 세척 및 용출 단계를 포함하고; 평형화 및 세척은 아세트산-아세트산나트륨 완충제의 용액을 사용하고, 용출은 트리스-HCl 완충제의 용액을 사용한다. 일부 특정한 실시양태에서, 아세트산-아세트산나트륨 완충제의 농도는 1 내지 50 mM 또는 10 내지 40 mM 또는 20 내지 30 mM이거나, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM 또는 50 mM이거나, 약 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM 또는 50 mM이다. 트리스-HCl 완충제의 농도는 10 mM 내지 150 mM 또는 30 mM 내지 100 mM 또는 50 mM 내지 70 mM이거나, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM 또는 150 mM이거나, 약 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM 또는 150 mM이다. 평형화에 사용되는 용액은 3.0 내지 6.0 또는 4.0 내지 5.0의 pH를 갖고; 불순물 세척에 사용되는 용액은 5.0 내지 7.0 또는 5.5 내지 6.0의 pH를 갖는다.
일부 실시양태는 또한 다음을 포함하는, 인간 재조합 인슐린 또는 그의 유사체를 제조하는 방법을 제공한다: 1) 인간 재조합 인슐린 또는 그의 유사체의 전구체를 효모에 의해 발현시키고; 2) 상기 정의된 바와 같은 방법에 따라서 인간 재조합 인슐린 또는 그의 유사체의 전구체를 정제하고; 3) 인간 재조합 인슐린 또는 그의 유사체의 전구체에 효소 절단을 수행하여 인간 재조합 인슐린 또는 그의 유사체를 수득한다.
일부 특정한 실시양태에서, 인간 재조합 인슐린 유사체는 B30 결실을 갖는 인간 인슐린이다.
일부 실시양태는 다음을 포함하는, 아실화된 인슐린 유도체를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 인슐린 유도체는 아실화 인슐린 유사체일 수 있다: 1) 인간 재조합 인슐린의 전구체를 효모에 의해 발현시키고; 2) 상기 정의된 바와 같은 방법에 따라서 인간 재조합 인슐린의 전구체를 정제하고; 3) 수득된 인간 재조합 인슐린에 효소 절단을 수행하고; 4) 인간 재조합 인슐린에 아실화기의 치환을 수행한다.
일부 실시양태에서, 아실화 치환은 위치 B29의 라이신에서 치환되고, 상기 아실화된 인슐린 유사체는 B30 결실을 갖는 인간 재조합 인슐린일 수 있거나 아닐 수 있다. 일부 특정한 실시양태에서, 상기 치환은 라이신 B29 (Nε-(Nα-헥사데칸다이오산-L-라이신-Nε-옥소부타노일)) 데스(B30) 인간 재조합 인슐린의 생성물을 갖는다.
일부 특정한 실시양태에서, 높은 세포 함량(예를 들어, 40%)을 갖는 발효액을 연속 흐름 원심분리기를 이용하여 연속 슬래깅에 의해 가공하고, 이에 의해 세포 및 상등액의 초기 분리가 신속히 달성되고 1% 미만의 세포 함량을 갖는 경질 액체가 수득될 수 있다. 경질 액체는 중공사 미세여과에 의해 여과시켜 높은 투명도를 갖는 인슐린 전구체를 함유하는 투명 액체를 수득한다. 단일 중공사막 여과와 비교하여, 상기 투명 액체의 부피는 70% 감소되고; 단일 연속 흐름 원심분리와 비교하여, 그 투명도는 상당히 개선되었다.
일부 실시양태에서, 상기 방법에 따라 수득된 인슐린 전구체 및 그의 유사체의 수율은 60%보다 높고, 순도는 80%보다 높으며, 숙주 세포 단백질의 제거율은 80%보다 높고, 외인성 DNA의 제거율은 80%보다 높다. 일부 특정한 실시양태에서, 상기 방법에 따라 수득된 인슐린 및 그 유사체의 전구체의 수율은 70%보다 높고, 순도는 90%보다 높고, 숙주 세포 단백질의 제거율은 85%보다 높고, 외인성 DNA의 제거율은 85%보다 높다. 일부 특정한 실시양태에서, 상기 방법에 따라 수득된 인슐린 및 그 유사체의 전구체의 수율은 80%보다 높고, 순도는 90%보다 높고, 숙주 세포 단백질의 제거율은 90%보다 높고, 외인성 DNA의 제거율은 88%보다 높다. 일부 특정한 실시양태에서, 상기 방법에 따라 수득된 인슐린 및 그 유사체의 전구체의 수율은 81%보다 높거나 같고, 순도는 93%보다 높고, 숙주 세포 단백질의 제거율은 95%보다 높고, 외인성 DNA의 제거율은 89%보다 높다. 일부 특정한 실시양태에서, 상기 방법에 따라 수득된 인슐린 및 그 유사체의 전구체의 수율은 85%보다 높거나 같고, 순도는 93%보다 높고, 숙주 세포 단백질의 제거율은 96%보다 높고, 외인성 DNA의 제거율은 89%보다 높다. 일부 특정한 실시양태에서, 상기 방법에 따라 수득된 인슐린 및 그 유사체의 전구체의 수율은 93%보다 높거나 같고, 순도는 90%보다 높고, 숙주 세포 단백질의 제거율은 91%보다 높거나 같고, 외인성 DNA의 제거율은 89%보다 높거나 같다.
정의
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 '인슐린'은 인간 인슐린 호르몬을 포함하여 공지된 구조 및 성질을 갖는 인슐린 호르몬을 지칭한다. 인간 인슐린은 A쇄 및 B쇄로 명명된 2개의 폴리펩티드 쇄를 갖는다. A쇄는 21개 아미노산의 펩티드이고, B쇄는 30개 아미노산의 펩티드이다. 상기 두 쇄는 다이설파이드 가교에 의해 접합된다: 제1 가교는 A쇄의 위치 7의 시스테인과 B쇄의 위치 7의 시스테인 사이에 위치하고, 제2 가교는 A쇄의 위치 20의 시스테인과 B쇄의 위치 19의 시스테인 사이에 위치한다. 제3 가교는 A쇄의 위치 6 및 11의 시스테인들 사이에 위치한다.
용어 "모 인슐린"은 그 아미노산 서열에 임의의 변형이 적용되기 전의 인슐린을 지칭한다.
용어 "인슐린 유사체"는 인슐린의 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되었고/되었거나 하나 이상의 아미노산 잔기가 인슐린으로부터 결실되었고/되었거나 하나 이상의 아미노산이 부가되었고/되었거나 인슐린 내에 삽입된 변형된 인슐린을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 인슐린 유사체는 모 인슐린에 비해 8개 미만의 변형(치환, 결실, 부가(삽입 포함) 및 그의 임의의 조합), 또는 모 인슐린에 비해 7개 미만의 변형, 또는 모 인슐린에 비해 6개 미만의 변형, 또는 모 인슐린에 비해 5개 미만의 변형, 또는 모 인슐린에 비해 4개 미만의 변형, 또는 모 인슐린에 비해 3개 미만의 변형, 또는 모 인슐린에 비해 2개 미만의 변형을 함유한다. 인슐린 유사체의 예는 AspB28 인간 인슐린 및 데스(B30) 인간 인슐린을 포함한다.
용어 "인슐린 유도체"는 화학적으로 변형된 모 인슐린 또는 그의 유사체를 지칭하며, 이때 상기 변형은 결합된 아미드, 탄수화물, 알킬, 아실, 에스터, PEG화 등의 형태이다. 한 예는 라이신 B29 (Nε-(Nα-헥사데칸다이오산-L-라이신-Nε-옥소부타노일)) 데스(B30) 인간 인슐린이다.
선행기술과 비교하여, 본 발명은 하기의 이점들을 갖는다:
1. 연속 흐름 원심분리와 중공사 미세여과의 결합은 발효액의 신속한 정화를 달성할 수 있다. 단일 중공사막 여과 방법과 비교하여, 상기 결합은 정화된 액체의 부피와 저장 탱크의 부피를 상당히 감소시키고, 플랜트의 건설 면적을 감소시키고, 하위단계 크로마토그래피의 부하 시간을 상당히 단축시켜, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)의 고밀도 발효액 정화의 산업적 생산에 특히 적합하다;
2. 정화된 액체는 높은 투명도를 가지며 크로마토그래피에 바로 부하될 수 있으므로 후속 가공을 감소시킨다;
3. 정화된 액체의 1-단계 크로마토그래피는 안료 및 HCP를 제거할 수 있고, 동시에 효소에 의해 직접 절단될 수 있는 고농도의 인슐린 전구체를 수득할 수 있다. 더 높은 부하량 및 더 낮은 가격의 충전제의 사용은 포획 과정의 생산 비용을 상당히 감소시킨다;
4. 수득된 인슐린 전구체 또는 그의 유사체는 고수율, 고순도, 및 높은 불순물(숙주 세포 단백질 및 외인성 DNA 등 포함) 제거율을 갖는다.
도 1은 실시예 9의 방법에 의해 제조된 인슐린 전구체 샘플의 포획된 샘플의 HPCL 검출 도표이다.
도 2는 실시예 10의 방법에 의해 제조된 인슐린 전구체 샘플의 포획된 샘플의 HPCL 검출 도표이다.
도 3은 실시예 11의 방법에 의해 제조된 인슐린 전구체 샘플의 포획된 샘플의 HPCL 검출 도표이다.
도 2는 실시예 10의 방법에 의해 제조된 인슐린 전구체 샘플의 포획된 샘플의 HPCL 검출 도표이다.
도 3은 실시예 11의 방법에 의해 제조된 인슐린 전구체 샘플의 포획된 샘플의 HPCL 검출 도표이다.
하기의 실시예는 본 발명을 추가로 기술하기 위해 사용되며, 본 발명의 범위가 실시예들로 한정되지 않는다.
재료: 맥스셀(MaxCell) 중공사 컬럼 및 접선 유동 여과 시스템은 제네랄 일렉트릭(중국) 메디칼 그룹(General Electric (China) Medical Group)에서 구입하였고; 에쉬무노®HCX는 메르크 밀리포어 차이나(Merck Millipore China)에서 구입하였다.
피치아 파스토리스: 당해 분야에서 발효에 통상적인 모든 피치아 파스토리스를 본 발명에 사용할 수 있다, 예를 들어, CN106282274A 호의 GS115 유형 피치아 파스토리스(미국의 인비트로겐(Invitrogen)에서 구입)를 사용하여 발효시키고 재조합 인간 인슐린 전구체를 발현시킬 수 있다.
재조합 인간 인슐린 및 그의 전구체: 본 발명의 재조합 인간 인슐린 및 그의 전구체는 임의 유형의 재조합 인간 인슐린 및 그의 전구체, 예를 들어, 재조합 인간 인슐린 라이신 B29 (Nε-(Nα-헥사데칸디오산-L-라이신-Nε-옥소부타노일)) 데스 (B30) 인간 인슐린 및 그의 전구체일 수 있다.
인간 인슐린의 구조 확인: 본 발명의 재조합 인간 인슐린 전구체를 정제한 후, 목표 생성물을, 예를 들어, V8 프로테아제로 절단할 수 있으며, 절단된 생성물은 LC-MS로 분석할 수 있다. 재조합 인간 인슐린: 본 발명의 재조합 인간 인슐린은 임의 종류의 재조합 인간 인슐린, 예를 들어, PCT/CN2019/074146 호의 재조합 인간 인슐린 라이신 B29 (Nε-(Nα-헥사데칸디오산-L-라이신-Nε-옥소부타노일)) 데스 (B30) 인간 인슐린일 수 있다.
실시예 1: 발효액의 원심 분리
피치아 파스토리스를 사용하여 발효시키고 인슐린 전구체를 발현시켰다. 40% 세균 함량을 갖는 발효액 50 L를 아세트산으로 pH 4.0으로 조정하고, 10,000g의 원심력, 60 L/h의 유량 및 2 분에 1회의 슬래그 방출 빈도하에 알파 라발(Alfa Laval) 유동 원심분리기 T20으로 처리하였다. 25 L의 경질 액체와 25 L의 중질 액체를 수거하였다. 중질 액체를 pH 4.0의 10 mM 아세트산-아세트산나트륨으로 50 L로 희석하고, 다시 원심분리하고, 추가로 25 L의 경질 액체를 수거하여, 총 50 L의 경질 액체를 수거하였다. 인슐린 전구체의 총 수율은 90%였고, 세균 함량은 1% 미만이었다.
실시예 2: 발효액의 원심 분리
피치아 파스토리스를 사용하여 발효시키고 인슐린 전구체를 발현시켰다. 40% 세균 함량을 갖는 발효액 50 L를 트리스로 pH 5.0으로 조정하고, 10,000g의 원심력, 60 L/h의 유량 및 2 분에 1회의 슬래그 방출 빈도하에 알파 라발 유동 원심분리기 T20으로 처리하였다. 25 L의 경질 액체와 25 L의 중질 액체를 수거하였다. 중질 액체를 pH 5.0의 10 mM 아세트산-아세트산나트륨으로 50 L로 희석하고, 다시 원심분리하고, 추가로 25 L의 경질 액체를 수거하여, 총 50 L의 경질 액체를 수거하였다. 인슐린 전구체의 총 수율은 95%였고, 세균 함량은 1% 미만이었다.
실시예 3: 발효액의 원심 분리
피치아 파스토리스를 사용하여 발효시키고 인슐린 전구체를 발현시켰다. 34% 세균 함량을 갖는 발효액 500 L를 아세트산으로 pH 5.0으로 조정하고, 10,000g의 원심력, 1000 L/h의 공급 속도 및 5 바의 경질 액체 배출 압력하에 연속 흐름 원심분리기로 처리하였다. 210 L의 경질 액체와 290 L의 중질 액체를 수거하였다. 중질 액체를 pH 5.0의 10 mM 아세트산-아세트산나트륨으로 400 L로 희석하고, 다시 원심분리하고, 추가로 120 L의 경질 액체를 수거하여, 총 330 L의 경질 액체를 수거하였다. 인슐린 전구체의 총 수율은 88%였고, 세균 함량은 1% 미만이었다.
실시예 4: 발효액의 원심 분리
피치아 파스토리스를 사용하여 발효시키고 인슐린 전구체를 발현시켰다. 41% 세균 함량을 갖는 발효액 350 L를 아세트산으로 pH 3.0으로 조정하고, 10,000g의 원심력, 800 L/h의 공급 속도 및 5 바의 경질 액체 배출 압력하에 연속 흐름 원심분리기로 처리하였다. 110 L의 경질 액체와 240 L의 중질 액체를 수거하였다. 중질 액체를 pH 3.0의 10 mM 아세트산-아세트산나트륨으로 350 L로 희석하고, 다시 원심분리하고, 추가로 120 L의 경질 액체를 수거하여, 총 230 L의 경질 액체를 수거하였다. 인슐린 전구체의 총 수율은 85%였고, 세균 함량은 1% 미만이었다.
실시예 5: 발효액의 원심 분리
피치아 파스토리스를 사용하여 발효시키고 인슐린 전구체를 발현시켰다. 40% 세균 함량을 갖는 발효액 350 L를 5 M NaOH로 pH 8.0으로 조정하고, 10,000g의 원심력, 60 L/h의 유량, 800 L/h의 공급 속도 및 5 바의 경질 액체 배출 압력하에 알파 라발 유동 원심분리기 T20으로 처리하였다. 130 L의 경질 액체와 220 L의 중질 액체를 수거하였다. 중질 액체를 pH 8.0의 20 mM 트리스-HCl로 350 L로 희석하고, 다시 원심분리하고, 추가로 140 L의 경질 액체를 수거하여, 총 270 L의 경질 액체를 수거하였다. 인슐린 전구체의 총 수율은 95%였고, 세균 함량은 1% 미만이었다.
실시예 6: 중공사 미세여과
0.22 ㎛의 중공사 컬럼을, 환류 종료 및 공급물 유입시 pH가 동일할 때까지, 평형화 용액(10 mM 아세트산-아세트산나트륨, pH 4.0)으로 주기적으로 세척하였다. 실시예 1에서 수득된 경질 액체 50 L를 15 psi의 막통과 압력하에 중공사 미세여과에 적용하였다. 투과 배출물로부터 약 48 L의 여액을 수거하였으며, 인슐린 전구체의 수율은 95%였다.
실시예 7: 중공사 미세여과
0.22 ㎛의 중공사 컬럼을, 환류 종료 및 공급물 유입시 pH가 동일할 때까지, 평형화 용액(10 mM 아세트산-아세트산나트륨, pH 5.0)으로 주기적으로 세척하였다. 실시예 2에서 수득된 경질 액체 50 L를 15 psi의 막통과 압력하에 중공사 미세여과에 적용하였다. 투과 배출물로부터 약 48 L의 여액을 수거하였으며, 인슐린 전구체의 수율은 90%였다.
실시예 8: 중공사 미세여과
0.22 ㎛의 중공사 컬럼을, 환류 종료 및 공급물 유입시 pH가 동일할 때까지, 평형화 용액(20 mM 트리스-HCl, pH 8.0)으로 주기적으로 세척하였다. 실시예 5에서 수득된 경질 액체 270 L를 15 psi의 막통과 압력하에 중공사 미세여과에 적용하였다. 투과 배출물로부터 약 255 L의 여액을 수거하였으며, 인슐린 전구체의 수율은 93%였다.
실시예 9: 인슐린 전구체의 포획
실시예 6에서 수득된 여액을 양이온 크로마토그래피에 적용하고, 에쉬무노®HCX를 복합 크로마토그래피 매질로 사용하였으며, 크로마토그래피 컬럼을 컬럼 부피 3배의 평형화 용액(10 mM 아세트산-아세트산나트륨 완충제, pH 4.0)으로 세척하였다. 여액을 바로 60 g/L의 샘플 부피로 컬럼에 부하시킨 다음, 컬럼 부피 5배의 세척액(10 mM 아세트산-아세트산나트륨 완충제, pH 5.8)으로 컬럼을 세척하여 안료 및 HCP 부분을 제거하였다. 최종적으로, 용출제(100 mM 트리스-HCl, pH 8.0)를 용츨에 사용하였고 용출 피크를 수집하여 93.1%의 순도 및 81%의 수율하에 인슐린 전구체를 수득하였다. 결과는 도 1에 나타내었다. 용출 피크에서 숙주 세포 단백질 및 외인성 DNA를 검출시, 상기 숙주 세포 단백질과 외인성 DNA의 제거율은 여액의 1 단계 크로마토그래피 후에 각각 95.6% 및 89.6%에 이른 것으로 확인되었다. 결과는 표 1에 나타내었다.
실시예 10: 인슐린 전구체의 포획
실시예 7에서 수득된 여액을 양이온 크로마토그래피에 적용하고, 에쉬무노®HCX를 복합 크로마토그래피 매질로 사용하였으며, 크로마토그래피 컬럼을 컬럼 부피 3배의 평형화 용액(10 mM 아세트산-아세트산나트륨 완충제, pH 5.0)으로 세척하였다. 여액을 바로 80 g/L의 샘플 부피로 컬럼에 부하시킨 다음, 컬럼 부피 5배의 세척액(10 mM 아세트산-아세트산나트륨 완충제, pH 6.0)으로 컬럼을 세척하여 안료 및 HCP 부분을 제거하였다. 최종적으로, 용출제(30 mM 트리스-HCl, pH 8.5)를 용출에 사용하였고 용출 피크를 수집하여 93.5%의 순도 및 85%의 수율하에 인슐린 전구체를 수득하였다. 결과는 도 2에 나타내었다. 용출 피크에서 숙주 세포 단백질 및 외인성 DNA를 검출시, 상기 숙주 세포 단백질과 외인성 DNA의 제거율은 여액의 1 단계 크로마토그래피 후에 각각 96.8% 및 89.8%에 이른 것으로 확인되었다. 결과는 표 1에 나타내었다.
실시예 11: 인슐린 전구체의 포획
실시예 8에서 수득된 여액을 pH 5.0으로 조정한 후, 양이온 크로마토그래피에 적용하고, 에쉬무노®HCX를 복합 크로마토그래피 매질로 사용하였으며, 크로마토그래피 컬럼을 컬럼 부피 3배의 평형화 용액(10 mM 아세트산-아세트산나트륨 완충제, pH 5.0)으로 세척하였다. 여액을 바로 80 g/L의 샘플 부피로 컬럼에 부하시킨 다음, 컬럼 부피의 5배의 세척액(10 mM 아세트산-아세트산나트륨 완충제, pH 6.0)으로 컬럼을 세척하여 안료 및 HCP 부분을 제거하였다. 최종적으로, 용출제(30 mM 트리스-HCl, pH 8.5)를 용출에 사용하였고 용출 피크를 수집하여 90.1%의 순도 및 93%의 수율하에 인슐린 전구체를 수득하였다. 결과는 도 3에 나타내었다. 용출 피크에서 숙주 세포 단백질 및 외인성 DNA를 검출시, 상기 숙주 세포 단백질과 외인성 DNA의 제거율은 여액의 1 단계 크로마토그래피 후에 각각 91.0% 및 89.0%에 이른 것으로 확인되었다. 결과는 표 1에 나타내었다.
[표 1] 전구체 포획 샘플에서 HCP 및 HCD의 검출 결과 및 제거율
주: HCP의 검출 방법은 중국 약전 2015년판의 제 6권의 기본 통칙 3414(General Rule 3414 of Volume VI of the Chinese Pharmacopoeia, 2015 edition)에 따르며, 시판하는 키트를 검출에 사용하였다. HCD는 SYBR 녹색 형광 염료에 기반한 실시간 형광 정량 PCR 방법(q-PCR 방법)으로 검출하였다.
당해 분야의 숙련가라면 특정 예들에 대한 상기 설명이 단지 예시적인 것이며 본 발명의 원리 및 본질에서 벗어나지 않고 상기 예들에 다양한 변화 및 수정이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 보호 범위는 첨부한 청구범위에 의해 정해진다.
Claims (17)
- 하기 단계를 포함하는, 재조합 인간 인슐린 또는 그 유사체의 전구체를 제조하는 방법:
a. 세균 발효후 수득된 발효액에 연속 흐름 원심분리를 수행하고, 경질 액체를 수거하는 단계;
b. 단계 a의 경질 액체를 중공사막 여과에 의해 여과시키고, 수득된 여액을 수거하는 단계; 및
c. 단계 b의 여액을 크로마토그래피 컬럼으로 정제하는 단계. - 제 1 항에 있어서,
중공사막이 바람직하게는 0.22 ㎛ 또는 0.45 ㎛, 보다 바람직하게는 0.22 ㎛의 기공 크기를 갖거나; 중공사막이 500 내지 1000 KDa, 바람직하게는 750 KDa의 분획분자량을 갖는 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
단계 b의 중공사막 여과가 순환 접선 유동 여과인 방법. - 제 1 항에 있어서,
하기 단계를 포함하는 방법:
a. 세균 발효후 수득된 발효액에 연속 흐름 원심분리를 수행하고, 경질 액체 및 중질 액체를 각각 수거하고; 중질 액체를 1회 이상 희석한 다음 원심분리를 다시 수행하여 또 다른 경질 액체를 수득하고, 2개의 수득된 경질 액체를 하나로 취합하는 단계;
b. 단계 a에서 수득된 경질 액체를 중공사막을 사용하여 순환 접선 유동 여과에 의해 여과시키고, 여액을 수거하는 단계; 및
c. 단계 b의 여액을 충전제로서 복합 충전제를 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로 정제하는 단계로서, 상기 충전제는 양이온 교환 리간드 및 소수성 리간드를 포함하고, 바람직한 양이온 교환 리간드는 강한 양이온 교환 리간드인, 단계. - 제 4 항에 있어서,
단계 a의 희석이 산성 용액 또는 알카리성 용액으로부터 선택된 희석제를 사용하고, 상기 산성 용액이 아세트산-아세트산나트륨 완충제 및 시트레이트 완충제로부터 선택되고, 상기 알칼리성 용액이 트라이하이드록시메틸-아미노메탄-염산 완충제, 포스페이트 완충제 및 글리신 수산화나트륨 완충제로부터 선택되는 방법. - 제 5 항에 있어서,
산성 용액이 2.0 내지 6.0의 pH를 갖고, 알칼리성 용액이 7.0 내지 9.0의 pH를 갖는 방법. - 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
산성 용액이 1 mM 내지 100 mM, 바람직하게는 1 mM 내지 50 mM, 보다 바람직하게는 10 mM 내지 20 mM, 가장 바람직하게는 10 mM의 농도를 갖고; 알칼리성 용액이 1 mM 내지 100 mM, 바람직하게는 1 mM 내지 50 mM, 보다 바람직하게는 10 mM 내지 30 mM, 가장 바람직하게는 20 mM의 농도를 갖는 방법. - 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 a의 발효액을 원심분리 전에 2.0 내지 9.0의 pH, 바람직하게는 3.0 내지 8.5의 pH, 보다 바람직하게는 4.0 내지 8.0의 pH로 조정하는 방법. - 제 8 항에 있어서,
단계 a의 발효액의 pH를 원심분리 전에 약 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0 또는 8.5로 조정하는 방법. - 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 a의 연속 흐름 원심분리가 디스크 원심분리기에 의해 수행되고, 바람직하게는 8000 내지 14000g의 원심력을 선택하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
a. 세균 발효후 발효액을 3.0 내지 8.0의 pH로 조정하고, 연속 흐름 원심분리를 수행하고, 경질 액체를 수거하는 단계;
b. 단계 a의 경질 액체를 중공사막을 사용하여 순환 접선 유동 여과 시스템에 의해 여과시키고, 여액을 수거하는 단계;
c. 단계 b의 여액을 강한 양이온-소수성 교환 리간드를 사용하여 크로마토그래피 컬럼으로 정제하는 단계
를 포함하는 방법으로서,
상기 단계 a는, 경질 액체 및 중질 액체를 각각 수거하고, 중질 액체를 1회 이상 희석한 다음, 원심분리를 수행하여 또 다른 경질 액체를 수득하고, 2개의 경질 액체를 하나로 취합하는 단계를 포함하고;
상기 희석은 3.0 내지 5.0의 pH를 갖는 아세트산-아세트산나트륨 완충제 또는 7.0 내지 9.0의 pH를 갖는 트라이하이드록시메틸-아미노메탄-염산 완충제로부터 선택된 희석제를 사용하고;
상기 단계 b의 중공사막은 0.22 ㎛의 기공 크기를 갖는, 방법. - 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 c의 정제가 평형화, 부하, 불순물 세척 및 용출 단계를 포함하고; 평형화 및 세척이 아세트산-아세트산나트륨 완충제의 용액을 사용하고, 용출이 트라이하이드록시메틸-아미노메탄-염산 완충제의 용액을 사용하는 방법. - 제 12 항에 있어서,
아세트산-아세트산나트륨 완충제가 1 내지 50 mM, 바람직하게는 10 mM의 농도를 갖고; 트라이하이드록시메틸-아미노메탄-염산 완충제가 10 mM 내지 150 mM, 바람직하게는 30 mM 내지 100 mM의 농도를 갖는 방법. - 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,
평형화에 사용되는 용액이 3.0 내지 6.0, 바람직하게는 4.0 내지 5.0의 pH를 갖고; 불순물 세척에 사용되는 용액이 5.0 내지 7.0, 바람직하게는 5.5 내지 6.0의 pH를 갖는 방법. - 인간 재조합 인슐린 또는 그의 유사체를 제조하는 방법으로서,
1) 인간 재조합 인슐린 또는 그 유사체의 전구체를 효모에 의해 발현시키는 단계;
2) 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 방법에 따라서 인간 재조합 인슐린 또는 그 유사체의 전구체를 정제하는 단계; 및
3) 인간 재조합 인슐린 또는 그 유사체의 전구체에 효소 절단을 수행하여 인간 재조합 인슐린 또는 그의 유사체를 수득하는 단계
를 포함하되,
인간 재조합 인슐린 유사체는 바람직하게는 B30 결실을 갖는 인간 인슐린인, 방법. - 다음을 포함하는, 아실화된 인슐린 유사체를 제조하는 방법:
1) 인간 재조합 인슐린의 전구체를 효모에 의해 발현시키는 단계;
2) 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 방법에 따라서 인간 재조합 인슐린의 전구체를 정제하는 단계;
3) 수득된 인간 재조합 인슐린에 효소 절단을 수행하는 단계; 및
4) 인간 재조합 인슐린에 아실화기의 치환을 수행하는 단계로서, 치환은 바람직하게는 위치 B29의 라이신의 치환인, 단계. - 제 16 항에 있어서,
아실화된 인슐린 유사체가 B30 결실을 갖는 인간 재조합 인슐린이고, 바람직하게 상기 치환이 라이신 B29 (Nε-(Nα-헥사데칸다이오산-L-라이신-Nε-옥소부타노일)) 데스(B30) 인간 재조합 인슐린의 생성물을 갖는 방법.
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