CN113563413A - 毕赤酵母高密度发酵过程中色素的去除方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种毕赤酵母（Pichia pastoris）高密度发酵过程中色素的去除方法，是用中空微滤法加阳离子交换层析顺序组合的方法。该组合方法可去除毕赤酵母发酵液中的色素，色素的外在表现呈孔雀绿色及黄色、棕色、红棕色，通过卷式膜的切向流中空微滤法去除，达到盒式膜包超滤无法达到的效果。本发明操作更简单，适合于工业上的大规模的连续生产，色素去除效果好，目标蛋白的回收率高，本发明可应用于生物制药技术领域、医美领域胶原蛋白纯化、食品领域中毕赤酵母高密度过程中产生的色素的去除。

Description

毕赤酵母高密度发酵过程中色素的去除方法

技术领域

本发明为生物技术纯化领域，涉及一种毕赤酵母高密度发酵中色素的去除方法。

背景技术

随着DNA重组技术的迅速进展，巴斯德毕赤酵母表达系统是近年来发展最为迅速的一种新型外源蛋白真核表达系统,是目前三大主流表达系统之一，由于其具有表达量高、操作简单、易于大规模高密度发酵培养等优点，被广泛应用于多种不同领域且成功表达了许多基因工程产品，到目前为止，已有600多种外源蛋白在该系统中得到表达。包括多种蛋白药物(如人血清白蛋白、白细胞介素-11、乙型肝炎表面抗原等)和工业用酶(如葡萄糖淀粉酶、脂肪酶等)，表达量更有高达22g/L的报道。巴斯德毕赤酵母是一种甲醇利用型酵母菌，当以葡萄糖,甘油等作为碳源时,在毕赤酵母中检测不到AOX1基因的表达；当以甲醇作为唯一碳源时，AOX1基因大量表达,AOX1氧化酶可占细胞总蛋白的30％以上。高密度发酵技术已被广泛运用到毕赤酵母工程菌发酵工程当中。高效外泌表达各种对人类有益的蛋白质和药物，如重组的酵母表达的desB30胰岛素类似物、重组β-甘露聚糖酶、重组人血红蛋白、重组水蛭素、重组人生长激素、重组人角质细胞生长因子、类人胶原蛋白等被成功表达。

在毕赤酵母高密度外泌发酵表达的产物中，产生的色素严重影响下游的分离纯化，一直以来是限制毕赤酵母宿主菌外泌表达应用的主要问题。巴斯德毕赤酵母发酵诱导过程中产生的色素有两类，一类是醇氧化酶(Aox1p)引起的，该酶在高密度发酵过程中会以同源八聚体与FAD结合，形成发色基团，表现为绿色，深绿色。只在甲醇诱导后才会产生，是发酵到了后期，随着细胞的裂解释放到培养基中的，到了发酵后期，甚至占比高达30％。另一类为发酵培养基中的色素，表现为黄色，棕色，乃至红棕色。

为了解决色素去除的难题，各个研究机构、厂家采用将外泌蛋白加上特异性标签，如GST、His标签，采用亲和层析法等多种方法来特异性捕获目的蛋白，但标签的去除又成为另一个难题。如中国期刊论文《重组谷氨酰胺转胺酶突变体的表达、分离纯化及其催化应用》一文中提到重组谷氨酰胺转胺酶突变体(MTG-MUT2)的分离纯化、糖基化和催化应用中，通过毕赤酵母高密度发酵获得组氨酸标记的MTG-MUT2，通过亲和层析法分离纯化得到高纯度MTG-MUT2。重庆大学博士学位论文《一种新型长效人胰岛素类似物的研制》中公开了一种新型长效人胰岛素类似物的研制，使用大孔吸附树脂法去除色素，但需要使用乙醇等有机试剂来进行纯化脱色，该方法却使得产品成本大大增加，又增加了环境污染，且去除色素的效果并不彻底。

中国期刊论文《毕赤酵母发酵液的脱色和重组水蛭素的分离》中用毕赤酵母表达重组水蛭素，对发酵上清的脱色和重组水蛭素的分离进行了探讨，通过离子交换、疏水层析、凝胶过滤、羟基磷灰石吸附层析以及它们的优化组合来最终达到去除色素的效果，但该方法纯化路径复杂，效率低下。

硕士学位论文《毕赤氏酵母发酵液中重组人血清白蛋白分离纯化工艺的初步研究》进行了毕赤氏酵母重组人血清白蛋白分离纯化工艺的研究，以毕赤氏酵母重组人血清白蛋白的发酵液为研究对象，采用膜分离、层析等技术进行重组人血清白蛋白的分离工艺研究，分离纯化工艺路线为：发酵液离心上清→初级超滤分离→二级超滤分离→吸附脱色，吸附采用大孔树脂LS-305和LS-610B，滤液中色素的脱除率达到81.5％。

专利CN106543266A公开了一种规模纯化重组人载脂蛋白Apoa-I的方法，将毕赤酵母发酵上清超滤，浓缩，脱色。专利CN101029077B一种基因重组胰岛素前体纯化方法，其工艺采用加入活性炭和活性炭柱法去除色素并对基因重组的胰岛素前体蛋白进行纯化，目标蛋白回收率达到85％以上，采用活性炭吸附法去除色素残留，但活性炭吸附法操作难度大，活性炭粉末属于易燃易爆品，大量存放易造成危险，且活性炭本身对大分子蛋白质的吸附性更强，还需要同步进行过滤去除活性炭，导致了目标蛋白收率的大幅度降低，产品成本大增。专利CN102070714B1一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法，经过双水相萃取、回收有机溶剂后进行加热除色素。专利CN 102816819B采用反相层析对胰岛素前体融合蛋白的离子交换收集液进行再次纯化，达到了去除色素提高胰岛素前体融合蛋白纯度的目的。但无论是Source30还是硅胶，均属反相纯化，需要使用有机试剂如乙醇、甲醇或乙腈等有机试剂梯度系统，对环境污染严重，且色素对硅胶、聚合物有一定的非特异性吸附，长期使用，降低了填料的使用寿命和分离效果。总之，毕赤酵母高密度发酵中，诱导产生的色素问题是毕赤酵母高密度发酵的顽疾，困扰着众多的技术研究人员。

发明内容

本发明在于提供一种以切向流中空纤维微滤法联合阳离子交换层析法去除酵母发酵液中色素，尤其是孔雀绿色素的方法。

本专利的发明人通过研究发现，单纯以0.2μm中空纤维微滤法或阳离子交换层析法，都不能完全去除样品中的色素。而以中空纤维微滤法与阳离子交换层析法组合，对毕赤酵母发酵液中的色素去除有极大地效果，通过切向流中空纤维微滤法，可以将酵母发酵液中的第一类孔雀绿色素彻底去除，再通过阳离子色谱层析法在酸性pH条件下，流穿呈黄色、类黄色、棕色的色素，两步即可去除毕赤酵母发酵液中的两类色素，同时可大幅度降低产品中的内毒素残留量。

本发明经过研究发现，0.2μm(部分规格为0.22μm)中空微滤纤维素膜，对于毕赤酵母高密度发酵产生的色素具有非常高效的去除效果。而常规的盒式膜包微滤法，在毕赤酵母发酵液离心分离菌体后，依然难以实现大规模的死端微滤法过滤样品，原因在于死端膜过滤法过滤的路径太短，色素极易透过，并不能达到中空纤维过滤这样的高效去除产物色素的效果。

同时，本方案的实施，可同时将目标蛋白所处的环境变更为适合进一步色谱层析所需要的环境，如电导，pH值等，以顺利衔接两步工艺，使整个产品的纯化工艺更加高效。

具体的，本发明提供的毕赤酵母高密度发酵过程中色素的去除方法，是用中空微滤法加阳离子交换层析顺序组合的方法。进一步的，中空微滤法是切向流中空微滤法，通过控制切向流速与压力，达到截留色素和杂蛋白，使目标蛋白能够获得透过。

进一步的，中空微滤法是用聚丙烯酰胺、纤维素等材质或其改性材料制备的亲水性中空纤维滤柱。所述的中空纤维滤柱是孔径0.10um～0.45um规格的卷式滤柱；

进一步的，所述的阳离子交换层析，其离子交换基团为磺酸基的强阳离子交换层析。阳离子色谱层析，其基质包括现有的聚合物基质，如聚丙烯酰胺，聚乙烯苯等，以及传统的葡聚糖、琼脂糖基质的阳离子介质；

本发明毕赤酵母高密度发酵过程中色素的去除具体操作步骤为：

(1)发酵液经过离心，收获上清，测上清液中目标物浓度、上清pH值和电导率；用缓冲液调整上清液的pH值和电导率；

(2)上清液用中空纤维微滤设备，维持透过压力0.05-0.2Mpa，连续不断进样，收集滤过液，连续补充缓冲液，洗涤浓缩液8-10倍体积，收集滤过液；

(3)收集的中空纤维滤过液，以阳离子交换填料，缓冲液平衡后，进样，目标物与阳离子填料结合，色素流穿，缓冲液冲洗柱床至基线走平，以含500mM氯化钠洗的脱液洗脱，收集目标峰。

进一步的，步骤(1)-(3)所用的缓冲液相同。

更进一步的，所述的缓冲液，为pH值为酸性的缓冲液或酸性水溶液，pH范围在2.0-7.0，进一步优选的pH范围在3.0-6.0，进一步优选pH范围在4.0-6.0。

缓冲液组合选自下列组分：

柠檬酸-柠檬酸钠，乙酸钠-乙酸，磷酸二氢钠-磷酸氢二钠、甘氨酸-盐酸、磷酸氢二钠-柠檬酸、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸及其组合等等。

上述缓冲液均能达到所期望的维持目标物所处的缓冲液pH值稳定的目的。

本发明的目标物分子量应在3-500KD之间；目标物亲水性强，可溶性好。在进行中空微滤的缓冲液pH值范围内，远离目标物的等电点pI＞1个pH，充分的溶解。

有益效果

毕赤酵母工程菌株，经高密度发酵培养，流加甲醇(含PTM)长时间(约90-120h)诱导表达后，目标物在发酵液中累积。达到发酵终点后，发酵液进行离心，分离菌体。上清以0.2μm中空纤维滤柱，以0.05-0.20Mpa压力下进行切向流微滤。目标物透过滤柱，而色素则被浓缩。通过连续不断的添加新鲜的离心上清，可达到连续不断的收获滤液。浓缩后的浓液，需要使用缓冲液进行洗涤5-10次，以增加目标物的收率，同时，降低样品中的电导值，变更pH值。本方法可一步去除孔雀绿色素，两步将色素去除完全。时间短，操作简单，除色素效果好，成本远远低于其他方法。

该组合方法可去除毕赤酵母发酵液中的色素，色素的外在表现呈孔雀绿色及黄色、棕色、红棕色，通过卷式膜的切向流中空微滤法去除，达到盒式膜包超滤无法达到的效果；与沉淀法、疏水层析、反相色谱、凝胶色谱层析去除色素相比，该方法具有死端过滤、盒式活性炭或硅藻土吸附等方法，操作更简单，适合于工业上的大规模的连续生产，色素去除效果好，目标蛋白的回收率高。极大的解决了生物技术领域，毕赤酵母高密度发酵甲醇诱导过程中产生的色素去除困难的问题。

本发明可应用于生物制药技术领域、医美领域胶原蛋白纯化、食品领域中毕赤酵母高密度过程中产生的色素的去除。

附图说明

图1：毕赤酵母高密度发酵诱导表达类人胶原蛋白样品离心上清。

图2：毕赤酵母发酵液离心上清经0.22um中空纤维微滤后透过液效果。

图3：毕赤酵母发酵液用中空纤维微滤与0.22um过滤效果差异对比图。说明左图为发酵液离心上清，经中空纤维微滤后，再进行10KD超滤浓缩后；右图为发酵液离心上清，经0.22um平面膜死端过滤后，再进行10KD超滤浓缩后。

图4：中空微滤浓缩液(稀释5倍照片)(左)和中空微滤透过液(右)对比图。

图5：阳离子交换层析后，洗脱液除色素效果。

图6：单独使用阳离子交换层析的洗脱液除色素效果。

具体实施方式

实施例1

本实施例中，以巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris菌株，pPick9K载体，GS115，表达重组人源化胶原蛋白α1片段，分子量74KD，等电点9.93。

发酵液经过10000rpm离心10-15min，收获上清，测目标物(重组人源化胶原蛋白α1片段)浓度3.54g/L。上清pH值4.0±0.5，电导率30±5mS/cm。所用缓冲液20mM柠檬酸缓冲液(pH4.0)，电导率2.5mS/cm。

离心上清以柠檬酸调整pH4.0±0.5，BONA-GM-20小型中空纤维微滤设备，滤柱为聚丙烯酰胺(改性)，孔径0.2μm，膜面积0.4㎡，维持透过压力0.2Mpa，连续不断进样5L，收集滤过液。最终料液浓缩至1L后，连续补充pH4.0±0.5柠檬酸缓冲液，洗涤浓缩液10倍体积，收集滤过液15L。

收集的中空纤维滤过液，电导2.5mS/cm，pH4.1，以UniPMM S-50阳离子交换填料500ml，pH4.0缓冲液平衡后，进样，目标物与阳离子填料结合，色素流穿，pH4.0缓冲液冲洗柱床至基线走平，以含500mM氯化钠洗的脱液洗脱，收集目标峰600ml，浓度27.5g/L，收率96.49％，两步组合收率93.22％。洗脱液中不含色素。

对不同脱色阶段的发酵液进行色素含量和内毒素含量的测定，同时，进行对比实验，对比实验为单独用本实施例的阳离子层析去除色素，测定的具体数据如表1和表2。

表1：中空纤维微滤法+阳离子层析去除毕赤酵母发酵(胶原蛋白)液中色素产物

ND表示未检测。

表2：单独用本实施例的阳离子层析去除色素和内毒素的数据如下：

同时，对不同脱色阶段和脱色方法，本实施例附带附图进行说明，具体见附图1-6，图1是毕赤酵母高密度发酵诱导表达类人胶原蛋白样品离心上清。图1显示，发酵液比较浑浊，带大量色素。

图2是毕赤酵母发酵液离心上清经0.22um中空纤维微滤后透过液效果图，可以看出，中空微滤透过液是透明的，色素含量大大降低。

图3是毕赤酵母诱导表达的类人胶原蛋白发酵液进行的中空纤维微滤与0.22um过滤效果差异。说明：图3(左)为发酵液离心上清，经中空纤维微滤后，再进行10KD超滤浓缩后；图3(右)为发酵液离心上清，经0.22um平面膜死端过滤后，再进行10KD超滤浓缩后。可以看出，中空纤维微滤比现有技术中常用的0.22um平面膜死端过滤效果得到显著提升。

图4是中空微滤浓缩液(稀释5倍照片)(左图)和中空微滤透过液(右图)的对比图。

图5是阳离子交换层析后，洗脱液最终除色素效果图。可以看出，最终的洗脱液成透明状。

图6是单独使用阳离子交换层析，洗脱液的最终除色素效果。图5和图6对比发现，两种脱色效果差异特别大。

实施例2

巴斯德毕赤酵母表达重组人DesB30胰岛素前体蛋白，分子量约6KD，高密度培养，甲醇诱导至90-120h，发酵液经离心，分离菌体，收获上清。上清中重组人DesB30胰岛素前体目标物含量约占60％。

离心上清以20mM乙酸钠-乙酸缓冲液，pH4.5，电导率35±5mS/cm，BONA-GM-20小型中空纤维微滤设备，滤柱为聚丙烯酰胺(改性)，孔径0.2um，膜面积0.4㎡，维持透过压力0.2Mpa，连续不断进样5L，收集滤过液。最终料液浓缩至约1L后，连续补充pH4.5乙酸钠缓冲液，洗涤浓缩液8倍体积，收集滤过液12L。

收集的中空纤维滤过液，电导3.5mS/cm，pH4.1，以GE公司Sepharose SP FF阳离子交换填料，pH4.0缓冲液平衡后，进样，目标物与阳离子填料结合，色素流穿，pH4.0缓冲液冲洗柱床至基线走平，以含500mM氯化钠洗的脱液洗脱，收集目标峰650ml。目标物浓度26.92g/L，收率96.09％，两步组合收率89.01％，洗脱液中不含色素。

对不同脱色阶段的发酵液进行色素含量和内毒素含量的测定，同时，进行对比实验，对比实验为单独用本实施例的阳离子层析去除色素，测定的具体数据如表3和表4：

表3：中空纤维微滤+阳离子层析法去除毕赤酵母发酵液(DsB30胰岛素类似物)中色素产物

ND表示未检测。

表4：单独用本实施例的阳离子层析去除色素和内毒素的数据如下：

实施例3

本发明中，以巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris菌株，pPick9K载体，GS115，表达重组人源化胶原蛋白α1片段，分子量34KD，等电点9.83。

发酵液300L，经过碟片式离心机10000rpm离心分离菌体，收获上清450L，测目标物浓度约3.12g/L。上清pH值6.0±0.5，电导率30±5mS/cm。所用缓冲液20mM乙酸钠缓冲液(pH6.0)，电导率2.5mS/cm。

离心上清以乙酸钠调整pH6.0±0.5，安徽信达中空纤维微滤设备，滤柱为聚丙烯酰胺，孔径0.2μm，膜面积2㎡，维持透过压力0.2Mpa，连续不断进样，收集滤过液。最终料液浓缩至约20L后，连续补充pH6.0±0.5乙酸钠缓冲液，洗涤浓缩液100L体积，收集滤过液520L。

中空微滤液520L，Sepharose SP6FF层析填料40L，pH6.0乙酸钠缓冲液平衡柱床3CV，收集的滤过液进样至层析柱上，色素流穿，目标蛋白结合至层析填料上，以含500mMNaCl洗脱目标蛋白，收集洗脱峰45L。

对不同脱色阶段的发酵液进行色素含量和内毒素含量的测定，同时，进行对比实验，对比实验为单独用本实施例的阳离子层析去除色素，测定的具体数据如表5和表6：

表5：中空纤维微滤+阳离子层析法去除毕赤酵母发酵液(类人胶原蛋白α1型)中的色素产物

ND表示未检测。

表6：单独用本实施例的阳离子层析去除色素和内毒素的数据如下：

Claims (9)

1.毕赤酵母高密度发酵过程中色素的去除方法，其特征在于，是用中空微滤法加阳离子交换层析顺序组合的方法。

2.根据权利要求1所述的毕赤酵母高密度发酵过程中色素的去除方法，其特征在于，中空微滤法是切向流中空微滤法。

3.根据权利要求1所述的毕赤酵母高密度发酵过程中色素的去除方法，其特征在于，中空微滤法是用聚丙烯酰胺、纤维素等材质或其改性材料制备的亲水性中空纤维滤柱。

4.根据权利要求3所述的毕赤酵母高密度发酵过程中色素的去除方法，其特征在于，所述的中空纤维滤柱是孔径0.10um-0.45um规格的卷式滤柱。

5.根据权利要求1所述的毕赤酵母高密度发酵过程中色素的去除方法，其特征在于，所述的阳离子交换层析，其离子交换基团为磺酸基的强阳离子交换层析。

6.根据权利要求1-5任一项权利要求所述的毕赤酵母高密度发酵过程中色素的去除方法，其特征在于，具体步骤为：

（1）毕赤酵母的发酵液经过离心，收获上清，测上清液中目标物浓度、上清pH值和电导率；用缓冲液调整上清液的pH值和电导率；

（2）上清液用中空纤维微滤设备，维持透过压力0.05-0.2Mpa，连续不断进样，收集滤过液，连续补充缓冲液，洗涤浓缩液8-10倍体积，收集滤过液；

（3）收集的中空纤维滤过液，以阳离子交换填料，缓冲液平衡后，进样，目标物与阳离子填料结合，色素流穿，缓冲液冲洗柱床至基线走平，以含100-1500mM 氯化钠洗的脱液洗脱，收集目标峰。

7.根据权利要求6所述的毕赤酵母高密度发酵过程中色素的去除方法，其特征在于，步骤（1）-（3）所用的缓冲液相同。

8.根据权利要求6所述的毕赤酵母高密度发酵过程中色素的去除方法，其特征在于，所述的缓冲液，为pH值为酸性的缓冲液或酸性水溶液，pH范围在3.0-6.0。

9.根据权利要求8所述的毕赤酵母高密度发酵过程中色素的去除方法，其特征在于，缓冲液组合选自下列组分：

柠檬酸-柠檬酸钠，乙酸钠-乙酸，磷酸二氢钠-磷酸氢二钠、甘氨酸-盐酸、磷酸氢二钠-柠檬酸、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸等等及其组合。

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