CN113862246A

CN113862246A - 一种混合碳源诱导毕赤酵母表达重组巴曲酶及其纯化方法

Info

Publication number: CN113862246A
Application number: CN202111186090.4A
Authority: CN
Inventors: 姜松; 赵文辉; 滕灵艳; 李红; 杨子义
Original assignee: Beijing Greatsun Bio Pharm Tech Co ltd
Current assignee: Beijing Greatsun Bio Pharm Tech Co ltd
Priority date: 2021-10-12
Filing date: 2021-10-12
Publication date: 2021-12-31

Abstract

巴曲酶是目前广泛使用的止血药。本发明是关于利用甲醇和葡萄糖混合碳源连续发酵诱导来生产重组巴曲酶。发酵上清采用了离子膜过滤及高回收率的层析方法来纯化其中的重组巴曲酶。

Description

一种混合碳源诱导毕赤酵母表达重组巴曲酶及其纯化方法

技术领域

本发明属于微生物发酵工程技术领域，具体涉及采用连续发酵及混合诱导方式高效生产药用酶类蛋白质。

背景技术

基因重组蛋白药物工程菌发酵生产中，常使用不同的培养方法控制微生物细胞的生长，探索最佳的发酵培养配方、补料成分和控制参数对目的蛋白的表达十分重要。

毕赤酵母表达系统是一种成熟的外源蛋白表达系统，具有高水平的外源蛋白表达能力，兼具大肠杆菌的快速生长、便于大规模发酵优点和哺乳动物细胞翻译后修饰等特性。毕赤酵母能利用甲醇为唯一碳源，甲醇也是外源蛋白表达的诱导剂，但甲醇浓度过高会对菌体产生毒害作用。甲醇与其它碳源混合使用，可能是降低此种毒害作用的一个发展方向。传统研究中，倾向于使用山梨醇等非抑制碳源与甲醇共同混合。对于常规的葡萄糖、甘油等，因其已被定性属于抑制性碳源，研究相对较少。

巴曲酶（Batroxobin）最先是由奥地利维也纳学者于1936年从巴西矛头蝮蛇(Bothrops atrox)蛇毒中分离、精制而得。它是一种单链糖蛋白，总氨基酸数为231个，分子量39～43kDa。巴曲酶具有类凝血酶样作用，目前在手术当中作为止血药被广泛应用。

国内已上市的巴曲酶或与其类似的其它血凝酶，均为天然蛇毒提纯蛋白制剂。天然蛇毒制品本身有几个缺陷：一是蛇毒来自不同地点不同季节，品质把控是难题，甚至有混淆不同种类蛇毒的风险；二是蛇毒里本身含有多种毒素，在后期提纯过程中很难去除干净，痕量的杂质毒素可能会对用药病人造成损害。相对于上述问题，基因工程重组产品的优势则展现的淋漓尽致。

重组巴曲酶的基因工程表达通常使用毕赤酵母系统，但从已有的文献来看，表达量都不高。因此探索甲醇混合碳源诱导，提高重组巴曲酶表达产量将是非常有意的。本发明比较了几种碳源与甲醇混合后诱导毕赤酵母表达重组巴曲酶的效果，确定了比较合适的碳源和添加方式。

另外，毕赤酵母长时间的发酵过程必然导致发酵液中杂质蛋白、宿主核酸的增加。目前对于发酵上清有多种方式用于澄清或者除杂的预处理，其中离子交换膜层析方法被用于细胞发酵上清的处理，但尚未见到用于毕赤酵母的下游纯化工艺中。

发明内容

本发明提供了一种在连续培养过程中混合碳源诱导毕赤酵母，下游采用深层过滤、膜纯化、超滤及多步层析生产巴曲酶的方法。

本发明所述毕赤酵母为X-33或GS115。巴曲酶的氨基酸序列来源于Genebank公开发表的文献。依据其氨基酸序列将巴曲酶DNA序列进行了优化，以便适合于在毕赤酵母表达。将优化后的巴曲酶基因构建于醇氧化酶启动子的分泌性载体中，并转化整合进入酵母基因组内。经抗生素筛选含适当拷贝数巴曲酶基因的菌株作为种子库。

本发明所述混合碳源为甲醇与甘油、甲醇与山梨醇、甲醇与葡萄糖的混合物，经实验最终确定为甲醇与葡萄糖。毕赤酵母发酵一般认为葡萄糖是抑制性碳源，添加过量时会阻碍甲醇诱导外源蛋白表达。所以本发明混合碳源的添加并非以批量添加，而是采用缓慢流加的方式，并随时检测中断流加碳源时的溶氧变化。这样可以保证甲醇和葡萄糖在培养液中没有积累的风险，既可以避免葡萄糖的抑制作用也可以防止甲醇中毒现象。

本发明所述连续培养为周期性地放出部分含毕赤酵母的发酵液，然后再补加相同体积的新鲜培养基的发酵方法。与传统方法相比，本发明可大幅度降低非诱导时段比例，提高生产强度。

在实施例中描述了如何利用常规发酵设备进行毕赤酵母的连续发酵，以及在诱导阶段混合碳源中甘油与葡萄糖适合的比例及流加速度。后续的多步层析方法实施例则具体展示了如何快速高效的从发酵液中提纯巴曲酶。

1、发酵种子的制备

种子液的质量对发酵生产起着至关重要的作用。若使用密度过低的种子来接种，则罐内的生长延滞期太久，导致整个发酵周期延长，生产成本增加；对于密度过大的种子，此时菌体细胞已经开始老化，活度不足，后期外源蛋白表达能力也会有所下降；合适的种子应在指数生长后期，此时菌体细胞密度中等，活力最强。根据巴斯德毕赤酵母在YPD培养基中的生长曲线，细胞密度OD600在4～6之间时种子菌处于对数生长中后期，本发明也以此作为合适种子液密度的目标。

本发明所述的发酵种子的制备分为两级。两级发酵种子均使用YPD培养基，其具体配方为：每升培养液含10g蛋白胨、20g酵母粉、2g葡萄糖。使用玻璃锥形瓶盛装培养基，装液比例为20%，无菌封口膜封口，121℃湿热灭菌20min。水平振荡培养条件为温度30℃，转速220rpm。

其中一级种子用于活化冻存的酵母甘油菌株，同时调整OD₆₀₀值后用于接种发酵二级种子。二级种子相对于一级种子来说，菌种活度及生长速率更加稳定，有利于罐发酵的批间一致性。

具体的本发明中一级种子制备方法如下：

甘油冻存的工作种子接种于含YPD培养基的锥形瓶中。30℃，220rpm条件下，通气振荡培养20-24hr作为一级种子。其OD₆₀₀值应在8-15之间。

本发明二级种子制备方法如下：

使用YPD培养基将一级种子调整OD₆₀₀值为8-10，以10%比例接种于含 YPD培养基的锥形瓶中。30℃，220rpm，振荡培养5-6hr作为发酵二级种子。其OD₆₀₀值应在4-6之间。

2、甘油批培养

本发明中所使用生物反应器为普通搅拌式通气发酵罐，常规配备有溶氧电极、pH电极、温度电极、压力感受器、泡沫感受器、通气转子流量计等。

发酵罐批培养及连续发酵补充的培养基均为FM22 培养基，其每升体积含如下成分: 42.9 g KH₂PO₄, 5 g (NH₄)₂SO₄, 1.0 g CaSO₄·2H₂O,14.3 g K₂SO₄, 11.7 g MgSO₄·7H₂O, 40 g 甘油，使用KOH 调整pH至4.5，灭菌后每升添加2ml PTM4。酵母微量金属母液PMT4 ，每升体积含如下成分：2.0 g CuSO₄·5H₂O, 0.08 g NaI,3.0 g MnSO₄·H₂O, 0.2 gNa₂MoO₄·2H₂O, 0.02 g H₃BO₃, 0.5 g CaSO₄·2H₂O, 0.5 g CoCl₂, 7 g ZnCl₂, 22 gFeSO₄·7H₂O, 0.2 g 生物素, 1 ml H₂SO₄，无菌过滤后使用。

二级种子生长成熟后按照5%-10%的比例接种到发酵罐内FM22培养基中，通空气量1-2vvm，搅拌速率300-600rpm，维持DO值在20%以上。经过18-24hr，罐内培养基甘油耗尽，DO值上升。此时毕赤酵母菌体湿重在100-120g/L。

3、甘油补料批培养

上述步骤2甘油耗尽后，流加补料50%甘油，其每升体积含500g甘油，灭菌后每升添加4ml PTM4。50%甘油补料流加速度控制在15-18ml/hr/L发酵液，流加时间4hr。通空气量1-2vvm，搅拌速率300-600rpm，维持DO值在20%以上，必要时通入氧气。此阶段结束后DO值上升，毕赤酵母菌体湿重在180-200g/L。

4、甲醇/葡萄糖混合诱导

上述步骤3甘油流加结束后，流加甲醇/葡萄糖混合补料，其每升体积甲醇含50-100g葡萄糖，每升添加4ml PTM4。甲醇/葡萄糖补料流加速度初始控制在2-3ml/hr/L发酵液，流加2hr后流加速度加倍至4-6 ml/hr/L发酵液。随后通过暂停补料DO值上升的方式判断调整流加速度，最终流加速可达到10-12ml/hr/L发酵液。本阶段通空气量1-2vvm，搅拌速率300-600rpm，维持DO值在10%以上，必要时通入氧气。诱导60-70h后，毕赤酵母菌体湿重在300-500g/L。

5、连续培养诱导

上述步骤4结束后，放出1/4-3/4体积发酵液。随后补加的含或不含甘油的FM22培养基，并继续流加甲醇/葡萄糖混合补料。本阶段通空气量1-2vvm，搅拌速率300-600rpm，维持DO值在20%以上，必要时通入氧气。诱导24-48h后，再次放出1/4-3/4体积发酵液，重复操作。

本发明中混合补料液中的葡萄糖可显著的快速增加毕赤酵母生物量，使放料后的巴曲酶的表达量能够快速回升至放料前水平。

6、培养上清的膜层析及超滤处理

毕赤酵母发酵液采用离心方式获得上清。上清液调整pH至中性，以0.45μm孔径滤芯过滤。过滤后上清以不含盐的中性pH缓冲液(20mM Tris,pH 7.0)稀释至电导为5mS/cm。稀释后的上清液紧接着通过已经预先平衡好的阴离子层析膜包，流速控制在10MV/min左右。发酵液中大部分的核酸及杂质蛋白吸附于阴离子层析膜上，穿透液即为含重组巴曲酶分子的澄清液。

经过阴离子膜去除杂质的澄清液以截留分子量10kDa的超滤膜包浓缩至原体积的5-10%。再以至少5倍体积琥珀酸缓冲液（50mM 琥珀酸，pH5.5）恒体积洗滤。洗滤后发酵液作为随后的层析纯化样品。

7、层析提纯

本发明中巴曲酶的提纯采用三步层析，分别为阳离子交换层析、疏水相互作用层析和凝胶过滤层析。各步骤衔接紧密，减少了换液步骤，有利于提高目标蛋白的回收率。各层析步骤均采用280nm紫外波长监测上样和洗脱组分。第一步，以5倍柱体积的低盐缓冲液平衡阳离子层析柱，280nm波长检测线平稳后设定零点。控制样品上样线性流速1cm/min左右。上样后以相同pH高盐溶液一步洗脱。第二步，以5倍柱体积的高盐缓冲液平衡疏水层析柱，280nm波长检测线平稳后设定零点。控制样品上样线性流速1cm/min左右，直接收集穿透液。上样后的疏水柱子再次以2倍柱体积的缓冲液2冲洗，继续收集未结和的样品。待280nm检测值降低至最高值10%时，停止收集。第三步，以1.5倍柱体积的低盐缓冲液平衡凝胶过滤层析柱，280nm波长检测线平稳后设定零点。凝胶过滤柱每次最多上样柱体积的10%，线性上样流速0.5cm/min，必要时和多次上样，收集主峰。

附图说明

图1：核酸琼脂糖凝胶电泳。泳道1为阴离子层析膜过滤前样品，可在泳道中明显见到核酸杂质。泳道2为过膜后样品，核酸杂质已经不可见。

图2：蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳。泳道1为阴离子层析膜过滤前样品，杂质蛋白较多，尤其是图片下部小分子量部分。泳道2为过膜后样品，多条蛋白杂质已经不可见，而目标蛋白未损失。

图3：蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳。泳道1为经过三步层析后重组巴曲酶样品，无可见杂质蛋白，纯度大于95%。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明内容做进一步说明。

实施例1

接种冻存的巴曲酶毕赤酵母工程菌工作种子1ml于含100ml YPD培养基的500ml锥形瓶中。30℃，220rpm条件下，通气振荡培养20hr。次日测定其OD₆₀₀值为12.4。加入24ml YPD培养基稀释，混匀。取10ml稀释后的一级种接种于含 100ml YPD培养基的500ml锥形瓶中，共10瓶。30℃，220rpm，振荡培养5hr后作为发酵种子接种发酵罐。

配制20升FM22培养基，将配好的基础盐培养基使用KOH 调整pH至4.5。以每份5升的体积均分至四个10升发酵罐中，进行高压蒸汽灭菌。灭菌条件：121℃，20min。灭菌结束后降温到30℃，每罐添加10ml PTM4。氨水调整发酵培养基的pH值为4.5。维持300rpm的搅拌速率及5L/min的空气流量，稳定后校正100%溶氧。

二级种子生长成熟后，每罐接种250ml到发酵罐内FM22培养基中。毕赤酵母基因工程菌株适应培养环境后开始代谢生长，溶氧开始下降，通过增加转速，增大通气量和通纯氧等操作使溶氧始终始终保持在20%以上。培养22hr后，罐内培养基甘油耗尽，DO值上升。测量此时毕赤酵母菌体湿重，并开始流加补料50%甘油（每升含4ml PTM4）。甘油补料流加速度1.5ml/min，流加时间4hr。期间通空气量增加至7.5L/min，搅拌速率逐渐增加至600rpm，维持DO值在20%以上，后期需要适量补充通入氧气。补料培养4hr后，停止甘油流加。DO值随后上升，测量此时毕赤酵母菌体湿重。

甘油流加结束后，各罐以不同混合碳源诱导。1号罐诱导剂为甲醇（每升体积甲醇含4ml PTM4）；2号罐诱导剂为甲醇/山梨醇（每升体积甲醇含50g山梨醇、4ml PTM4）；3号罐诱导剂为甲醇/葡萄糖（每升体积甲醇含50g葡萄糖、4ml PTM4）；4号罐诱导剂为甲醇/甘油（每升体积甲醇含50g甘油、4ml PTM4）。流加速度初始为0.2 ml/min，流加2hr后流加速度调整为0.4 ml/min发酵液。随后每一小时通过暂停补料DO值上升的方式来判断调整甲醇流加速度，每次增加0.2ml/min。最终甲醇流加速度增加至1ml/min。本阶段通空气量最终增加至10L/min，搅拌速率600rpm，通过掺氧维持DO值在20%以上。诱导65h后，测定毕赤酵母菌体湿重及巴曲酶活性。

本发明中巴曲酶活性测定方式采用血浆凝固法。具体为取0.2ml抗凝血浆于血凝仪中预热，加入0.1ml适当稀释的待测试样品，仪器自动判读血浆凝固时间。凝固时间代表样品中巴曲酶含量，巴曲酶含量越高凝固所需时间越短。

各罐及各阶段菌体湿重和巴曲酶活性见下表1。

表1：不同诱导物发酵数据

实施例2

接种冻存的巴曲酶毕赤酵母工程菌工作种子1ml于含100ml YPD培养基的500ml锥形瓶中。30℃，220rpm条件下，通气振荡培养20hr。次日测定其OD₆₀₀值为13.1。加入31ml YPD培养基稀释，混匀。取10ml稀释后的一级种接种于含 100ml YPD培养基的500ml锥形瓶中，共10瓶。30℃，220rpm，振荡培养5hr后作为发酵种子接种发酵罐。

甘油流加结束后，各罐以不同比例葡萄糖混合甲醇碳源诱导。1号罐诱导剂为甲醇/葡萄糖（每升体积甲醇含25g葡萄糖、4ml PTM4）；2号罐诱导剂为甲醇/葡萄糖（每升体积甲醇含50g葡萄糖、4ml PTM4）；3号罐诱导剂为甲醇/葡萄糖（每升体积甲醇含100g葡萄糖、4ml PTM4）；4号罐诱导剂为甲醇/葡萄糖（每升体积甲醇含200g葡萄糖、4ml PTM4）。流加速度初始为0.2 ml/min，流加2hr后流加速度调整为0.4 ml/min发酵液。随后每一小时通过暂停补料DO值上升的方式来判断调整甲醇流加速度，每次增加0.2ml/min。最终甲醇流加速度增加至1ml/min。本阶段通空气量最终增加至10L/min，搅拌速率600rpm，通过掺氧维持DO值在20%以上。诱导67h后，测定毕赤酵母菌体湿重及巴曲酶活性。

巴曲酶活性测定方式仍采用血浆凝固法。具体为取0.2ml抗凝血浆于血凝仪中预热，加入0.1ml适当稀释的待测试样品，仪器自动判读血浆凝固时间。凝固时间代表样品中巴曲酶含量，巴曲酶含量越高凝固所需时间越短。

各罐及各阶段菌体湿重和巴曲酶活性见下表2。

表2：不同葡萄糖比例发酵数据

实施例3

接种冻存的巴曲酶毕赤酵母工程菌工作种子1ml于含100ml YPD培养基的500ml锥形瓶中。30℃，220rpm条件下，通气振荡培养20hr。次日测定其OD₆₀₀值为13.5。加入35ml YPD培养基稀释，混匀。取10ml稀释后的一级种接种于含 100ml YPD培养基的500ml锥形瓶中，共10瓶。30℃，220rpm，振荡培养5hr后作为发酵种子接种发酵罐。

甘油流加结束后，四罐以甲醇/葡萄糖（每升体积甲醇含100g葡萄糖、4ml PTM4）诱导表达外源蛋白。甲醇/葡萄糖补料流加速度为0.2 ml/min，流加2hr后流加速度调整为0.4ml/min发酵液。随后每一小时通过暂停补料DO值上升的方式来判断调整甲醇/葡萄糖流加速度，每次增加0.2ml/min。最终甲醇/葡萄糖流加速度增加至1ml/min。本阶段通空气量最终增加至10L/min，搅拌速率600rpm，通过掺氧维持DO值在20%以上。诱导70h后，测定毕赤酵母菌体湿重及巴曲酶活性。

上述阶段结束后，1号罐保留3L体积发酵液，补加2L的不含甘油的FM22培养基，并继续流加甲醇/葡萄糖溶液，流加速度调整为0.6ml/min。2号罐保留1L体积发酵液，补加4L的不含甘油的FM22培养基，并继续流加甲醇/葡萄糖，流加速度调整为0.2ml/min。此两罐随后每一小时通过暂停补料DO值上升的方式来判断调整甲醇/葡萄糖流加速度，每次增加0.2ml/min。最终甲醇/葡萄糖流加速度增加至1ml/min。本阶段通空气量维持10L/min，搅拌速率600rpm，通过掺氧维持DO值在20%以上。

3号罐保留3L体积发酵液，补加2L的正常甘油浓度的FM22培养基。4号罐保留1L体积发酵液，补加4L的正常甘油浓度的FM22培养基。培养2-3hr左右，罐内培养基甘油耗尽，DO值上升。开始流加甲醇/葡萄糖，流加速度调整为0.6ml/min。随后每一小时通过暂停补料DO值上升的方式来判断调整甲醇或甲醇/葡萄糖流加速度，每次增加0.2ml/min。最终甲醇/葡萄糖流加速度增加至1ml/min。本阶段通空气量维持10L/min，搅拌速率600rpm，通过掺氧维持DO值在20%以上。

此后每诱导48h后，再次放出发酵液，重复上述操作，共进行三次。

巴曲酶活性测定方式采用血浆凝固法。具体为取0.2ml抗凝血浆于血凝仪中预热，加入0.1ml适当稀释的待测试样品，仪器自动判读血浆凝固时间。凝固时间代表样品中巴曲酶含量，巴曲酶含量越高凝固所需时间越短。

各罐及各阶段菌体湿重和巴曲酶活性见下表3。

表3：连续培养中甲醇/葡萄糖共补料发酵数据

通过上述三个实施例可以看出，在诱导阶段的甲醇中添加葡萄糖碳源可以显著增加菌体生物量并提高巴曲酶的表达水平。在实施例1中并未观察到葡萄糖对巴曲酶表达的抑制作用。实施例2表明每升甲醇中含有50-100g葡萄糖是比较合适的比例。实施例3中采用连续发酵，可大大节省发酵过程中的非诱导时间，增加生产强度。在多次放料及加料过程中，酶活性基本保持稳定，略有下降，但仍在合理范围内。尤其在实施例3中，4号罐单位体积生物量基本保持稳定，活性较高，且排料体积大，故总体酶产量相对其它罐最高。

实施例4

上述实施例3中第4号发酵罐毕赤酵母发酵液多次收集物共25升，采用离心方式获得上清19升。上清液为酸性，以2mol/L氢氧化钠溶液调整以pH至7.0。0.45μm孔径PP折叠滤芯过滤，过滤终点压力上升至0.02Mpa。过滤后上清以不含盐的中性pH缓冲液（20mM Tris,pH 7.0)稀释4.5倍，最终体积为80L，电导为5mS/cm。

实施例5

选用的阴离子层析膜包的膜体积为140ml，膜材质为亲水改性聚醚砜，膜孔径0.8μm，离子功能团为季胺基。以缓冲液（20mM Tris,pH 7.0，5倍膜体积，700ml)充分平衡离子交换层析膜。稀释后的发酵上清液通过已经预先平衡好的阴离子层析膜包，流速控制在1-1.4L/min。发酵液中大部分的核酸及杂质蛋白吸附于阴离子层析膜上，穿透液（体积80L）即为含重组巴曲酶分子的澄清液。电泳结果具体见图1和图2.

实施例6

超滤膜包面积0.5m²，截留分子量10kDa，流速5L/min，跨膜压0.05Mpa。经过阴离子膜去除杂质的澄清液，超滤浓缩至4L。维持样品体积4L不变，以20L琥珀酸酸缓冲液（50mM琥珀酸，pH5.5）恒体积洗滤。洗滤后巴曲酶溶液用0.22um滤芯过滤，共3.8L，作为随后的层析纯化样品。

实施例7

IEX 层析介质：SP Sepharose Fast Flow，柱体积：200ml；

HIC 层析介质：Phenyl Sepharose 6 FF（high sub），柱体积：50ml；

GF 层析介质：Superdex 200 prep grade，柱体积500ml；

缓冲液1：50mM 琥珀酸，pH5.5；

缓冲液2：50mM 琥珀酸，80mM NaCl，pH5.5；

缓冲液3：50mM 琥珀酸，500mM NaCl，pH5.5。

第一步，以1L体积缓冲液1平衡SP层析柱，280nm波长检测线平稳后设定零点。超滤膜包洗滤后巴曲酶溶液以50ml/min的流速上样，弃穿透液。上样后的的SP柱子再次以400ml体积的缓冲液1冲洗，除去未结和的样品。待检测基线平稳后，SP层析柱以缓冲液2预洗杂质，随后以10ml/min流速，用缓冲液3将结合的巴曲酶样品洗脱下来。收获洗脱物120ml。

第二步，以250ml体积的缓冲液3平衡Phenyl层析柱，280nm波长检测线平稳后设定零点。SP洗脱样品5ml/min的流速上样，同时收集穿透液。上样后的的Phenyl柱子再次以100ml体积的缓冲液3冲洗，继续收集未结和的样品。待280nm检测值降低20mAu时，停止收集。收获穿透物131ml。

第三步，以750ml柱体积的缓冲液1平衡Superdex层析柱，280nm波长检测线平稳后设定零点。Phenyl穿透样品分三次上样Superdex层析柱，每次40ml，流速3ml/min，收集主峰。三次收集主峰合并。

经过三步层析后，经过SDS-PAGE分析（图3），巴曲酶纯度基本达到95%以上。巴曲酶活性测定方式采用血浆凝固法。活性测定的标准品采用英国国家生物标准与控制研究所（The National Institute for Biological Standards and Control）的矛头蝮蛇蛇毒提取的巴曲酶。具体方法与前述实施例相同。

各步纯化巴曲酶组分体积及活性见下表4。

表4：纯化中巴曲酶体积活性数据（实施例5-实施例7）

通过以上所有实施例的结果和数据表明，以甲醇和葡萄糖作为补料和诱导系统，结合传统的酵母基础培养基能够增强重组巴曲酶的表达量，同时采取半连续发酵可以把生产强度大大提高。发酵上清经过离子交换膜层析除去大量杂质核酸和蛋白，大大减轻了随后的三步层析纯化压力。在符合纯度要求下。简化了缓冲液配方及种类，蛋白活性回收率高。10升发酵罐在连续发酵时单批次可生产80,000 IU重组巴曲酶。

Claims

1.一种利用毕赤酵母发酵重组巴曲酶的方法，其特征在于：

1) 在发酵过程中使用连续发酵方法；

2) 在发酵过程中使用混合碳源对毕赤酵母进行诱导。

2.根据权利要求1所述方法包括如下步骤：

1) 发酵种子的制备；

2) 甘油批培养；

3) 甘油补料批培养；

4) 甲醇/葡萄糖混合诱导；

5) 连续培养诱导。

3.根据权利要求1所述，其连续发酵方法为半连续发酵，其特征在于：在批次发酵结束后可放出部分发酵液，补加培养基后发酵继续进行。

4.根据权利要求3所述，其补加培养基为FM22，至少可进行3次以上的放料补料操作。

5.根据权利要求1所述，其混合碳源为甲醇和葡萄糖的混合物。

6.根据权利要求5所述，甲醇和葡萄糖混合物的最佳比例为：800g甲醇：100g葡萄糖：100g纯化水。

7.一种毕赤酵母发酵液中提取重组巴曲酶的方法，其特征在于：

1) 纯化方法中包含阴离子膜层析作为发酵液预处理步骤；

2) 预处理后顺序包括了IEX 层析、HIC 层析、GF 层析。

8.根据权利要求7所述，IEX 层析、HIC 层析、GF 层析仅使用最简单琥珀酸及氯化钠作为缓冲体系。