CN116179582A - 一种通用型基因重组蛋白质a亲和纯化填料制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于属于生物化学和材料化学技术领域,尤其涉及一种通用型基因重组蛋白质A亲和纯化填料制备方法和应用,包括以下步骤:S1:构建含有重组葡萄球菌蛋白质A基因的重组表达质粒;S2:培养用该重组表达质粒所转化的宿主细胞,得重组菌株;S3:培养重组菌株,诱导重组蛋白的表达,分离并纯化所表达的重组蛋白;S4:用于偶联通用型基因重组蛋白质A微球的制备;S5:通用型基因重组蛋白质A树脂的制备。本发明天然蛋白质A做耐碱性改造引入碱性氨基酸,并综合蛋白质A、蛋白质G与蛋白质L与抗体的不同结构域结合优势,重新设计蛋白质A氨基酸序列,新的蛋白质A可以结合抗体Fc结构域、Fab片段中的L轻链和VHH片段。
Description
技术领域
本发明属于生物化学和材料化学技术领域,尤其涉及一种通用型基因重组蛋白质A亲和纯化填料制备方法和应用。
背景技术
亲和层析技术是利用纯化填料的配基与要纯化的目标物质之间的特异性亲和力,使目标物质得以分离提纯的一种方法,以蛋白A为亲和配基的填料是目前应用最为广泛的亲和纯化填料,其在抗体纯化实际生产中,一步亲和层析即可去除大部分的宿主细胞蛋白、DNA和色素等杂质,纯度达到95%以上;
同时琼脂糖微球具有良好的生物相容性和易于衍生功能基团的优点,而交联技术的引入,部分克服了琼脂糖微球机械低和孔径小的不足,可将其耐压指标提高到0.3MP,大大拓宽了其应用领域,但其耐压性能仍难以同时满足高流速和大规模化层析的要求;目前,国内抗体生产大多采用进口的Protein A亲和层析介质,如GE的MabSelect SuRe,其基质为高交联的琼脂糖微球,优点是亲水性极佳,生物相容性好,非常适合抗体类生物大分子的分离纯化。
但是传统的蛋白A亲和层析介质也具有一些局限性,比如天然蛋白质A价格昂贵,结构稳定性低,耐碱性差,无法结合Fab抗体片段也不能纯化VHH等纳米抗体,难以满足巨大的抗体市场需求,并且琼脂糖微球缺点是其结构偏软,粒径分布较宽且大,在实际使用过程中存在装柱柱效稳定性差,机械强度低等问题。因此,本领域技术人员提供了一种通用型基因重组蛋白质A亲和纯化填料制备方法和应用,以解决上述背景技术中提出的问题。
发明内容
本发明提供一种通用型基因重组蛋白质A亲和纯化填料制备方法和应用,旨在解决现有独权解决的问题。
本发明是这样实现的,一种通用型基因重组蛋白质A亲和纯化填料制备方法和应用,包括以下步骤:
S1:构建含有重组葡萄球菌蛋白质A基因的重组表达质粒;
S2:培养用该重组表达质粒所转化的宿主细胞,得重组菌株;
S3:培养重组菌株,诱导重组蛋白的表达,分离并纯化所表达的重组蛋白;
S4:用于偶联通用型基因重组蛋白质A微球的制备;
S5:通用型基因重组蛋白质A树脂的制备。
优选的,所述在步骤S1中重组蛋白质A基因包括通用型基因重组蛋白质A1、通用型基因重组蛋白质A2和通用型基因重组蛋白质A3,
其中,通用型基因重组蛋白质A1的序列:
MHHHHHHRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKVDTPAVTTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTEALVQKKTLNELATNTNDNFFGERFSAGDAVPHSGIYKCTKCNREVTVNAHSRDNTFPPHYPESTCKSPMWKPYVIANTKA EWCCC;
通用型基因重组蛋白质A2:
MHHHHHHRNGFIQSLKKRPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKVDTPAVTTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYKRATKTFTVTEALVQKKTLNELATNTNDNFFGERFSAGDAVPHSGIYKCTKCNREVTVNAHSRDNTFPPHYPESTCKSPMWKPYVIANTKA EWCCC;
通用型基因重组蛋白质A3:
MHHHHHHRNGFIQSLKKRPSQSANLLARAKKLNDAQAPKVRTPAVTTYKLVINGKTLKGKTTTKAVRAETARKAFKQYANKNGVDGVWTYKRATKTFTVTRALVQKKTLNRLATNTNDNFFGKRFSAGDAVPHSGIYKCTKCNRKVTVNAHSRDNTFPPHYPKSTCKSPMWKPYVIANTKA EWCCC。
所述在通用型基因重组蛋白质A1-A3基因的5’端引入AIwN I位点及肠激酶识别位点,3’端引入XhoI位点及终止密码子,引物序列如下:上游引物:5-ATACAGATGCTGGATGACGATGACAAACATGCAGAA-3’,下划横线部分为AIwN I酶切位点,下划波浪线部分为肠激酶识别位点;下游引物:5’-ATACTCGAGTCATTAACCGCGGCCACG-3’,下划线部分为XhoI酶切位点,以pMD18T-SPA为模板,进行PCR扩增,获得目的基因片段SPA1-3。
优选的,所述目的基因经过AIwNI、XhoI双酶切处理,并暴露粘性末端后连入表达载体,酶切产物跑3%琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段,并用凝胶回收试剂盒回收目的片段SPA1-3/A,X。
优选的,所述在步骤S2中培养步骤包括以下步骤:
A1、表达质粒pET-31b(+)的处理:取适量保存菌种TOP10F/Pet31b(+)接于50mL添加有100μg/mLAmp的LLB培养液中,220rpm,28℃过夜摇床培养,并且在培养后使溶液在600nm波长处的吸光值约0.6,在培养后通过提取试剂盒提取pET31b(+)质粒;
A2、目的基因与质粒载体的连接:用T4DNA连接酶将经酶切处理的目的基因与质粒相连接,构建重组表达载体pET31b(+)-SPA1-3;
A3、菌种TOP10F’/pET-31b(+)-SPA1-3的构建:重组表达载体构建完成后,首先转化至扩增菌株E.coliTOP10F’,验证重组表达载体DNA序列的正确性,序列正确的阳性克隆子才能进一步转化表达菌株E.coliBL21(DE3)构建成表达工程菌;
A4、表达工程菌BL21(DE3)/pET-31b(+)-SPA1-3的构建和保存:将测序正确的重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,构建表达工程菌BL21(DE3)/pET-31b(+)-SPA1-3,并从转化平板上长出的菌落中挑取不同菌株进行培养,并制备15%-20%甘油菌,做好标记,-80℃保存。
优选的,所述在步骤S3中在培养重组菌株,诱导重组蛋白包括以下步骤:
1)在5L发酵罐中加入2.5L补料分批培养的基础培养基,并且将发酵罐进行灭菌,在灭菌后,将200mL种子菌接种入其中,整个发酵过程根据培养基中的残糖浓度0.1g·L-1控制补料;
2)在生长阶段将pH值控制在7.0左右,诱导后pH控制在7.4左右,溶解氧的控制通过调整搅拌速度使溶解氧在整个发酵过程中控制在30%以上,在发酵过程中,温度的控制是生长阶段控制30℃;
3)待菌体生长进入对数生长中期时,开始第1次升温诱导,诱导阶段温度控制为42℃,3-4h后,降低温度到37℃左右,恒温培养;
4)待菌体的生长又进入对数中期时,再第2次升温到42℃,进行第2次诱导表达,持续诱导表达5-6h,发酵结束。
优选的,所述在步骤S3中分离并纯化所表达的重组蛋白包括以下步骤:将收集的菌体用含有一定浓度的DTT还原剂的磷酸盐缓冲液悬浮,破碎后室温离心收集上清,利用Ni亲和柱和中低压层析系统进行蛋白提纯。
优选的,所述在步骤S4中用于偶联通用型基因重组蛋白质A微球为聚甲基丙烯酸甲酯微球,其中PMMA微球的偶联活化试剂为环氧氯丙烷或烯丙基缩水甘油醚,
合成路线如下:
优选的,所述在步骤S5中基因重组蛋白质A树脂的制备包括以下步骤:
a:取含有50%乙醇储存液为粒径90微米PMMA树脂、粒径60微米PMMA树脂或者粒径30微米PMMA树脂至过滤器中抽干;
b:加入3倍介质体积的纯化水,搅拌均匀后抽干;
c:将介质转移到反应器中;
d:将待偶联样品加入到反应器中,室温条件下温和搅拌约18小时;
e:将介质转移到过滤器中抽干,保存收集容器中偶联后的溶液;
f:将介质用5倍PH值为8.0乙醇胺溶液,重悬,室温条件温和搅拌6小时,抽干,用2倍体积的纯净水清洗,再次抽干;
g:加入3倍介质体积的PH值为8.5的Tris-HCl溶液,搅拌均匀后抽干;
h:将介质转移到反应器中,加入3倍介质体积的PH值为4.0醋酸钠溶液,室温条件下温和搅拌2h;
i:加入3倍介质体积的20%乙醇溶液,搅拌均匀后抽干;
j:将介质转移到容器中,加入等体积的20%乙醇溶液后保存备用。
优选的,一种通用型基因重组蛋白质A亲和纯化填料制备方法在分离纯化抗体及抗体Fab片段和VHH抗体中的应用。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:本发明的一种通用型基因重组蛋白质A亲和纯化填料制备方法和应用,本发明天然蛋白质A做耐碱性改造,引入碱性氨基酸,如赖氨酸、精氨酸、组氨酸,从而使得蛋白质A具有结构稳定性高,耐碱性好的效果,并综合蛋白质A、蛋白质G与蛋白质L与抗体的不同结构域结合优势,重新设计蛋白质A氨基酸序列,新的蛋白质A可以结合抗体Fc结构域、Fab片段中的L轻链和VHH片段,从而可满足巨大的抗体市场需求;同时采用聚甲基丙烯酸甲酯微球,其粒径较小,粒径均一,同时机械强度高,可在高流速下使用,分离效果好,并且在装柱时柱效稳定性好。
附图说明
图1为pET31b(+)质粒结构图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。
一种通用型基因重组蛋白质A亲和纯化填料制备方法和应用,包括以下步骤:
S1:构建含有重组葡萄球菌蛋白质A基因的重组表达质粒;在步骤S1中重组蛋白质A基因包括通用型基因重组蛋白质A1、通用型基因重组蛋白质A2和通用型基因重组蛋白质A3,
其中,通用型基因重组蛋白质A1的序列:
MHHHHHHRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKVDTPAVTTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTEALVQKKTLNELATNTNDNFFGERFSAGDAVPHSGIYKCTKCNREVTVNAHSRDNTFPPHYPESTCKSPMWKPYVIANTKA EWCCC;
通用型基因重组蛋白质A2的序列:MHHHHHHRNGFIQSLKKRPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKVDTPAVTTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYKRATKTFTVTEALVQKKTLNELATNTNDNFFGERFSAGDAVPHSGIYKCTKCNREVTVNAHSRDNTFPPHYPESTCKSPMWKPYVIANTKA EWCCC;
通用型基因重组蛋白质A3的序列:MHHHHHHRNGFIQSLKKRPSQSANLLARAKKLNDAQAPKVRTPAVTTYKLVINGKTLKGKTTTKAVRAETARKAFKQYANKNGVDGVWTYKRATKTFTVTRALVQKKTLNRLATNTNDNFFGKRFSAGDAVPHSGIYKCTKCNRKVTVNAHSRDNTFPPHYPKSTCKSPMWKPYVIANTKA EWCCC。
在通用型基因重组蛋白质A1-A3基因的5’端引入AIwN I位点及肠激酶识别位点,3’端引入XhoI位点及终止密码子,引物序列如下:上游引物:5-ATACAGATGCTGGATGACGATGACAAACATGCAGAA-3’,下划横线部分为AIwN I酶切位点,下划波浪线部分为肠激酶识别位点;下游引物:5’-ATACTCGAGTCATTAACCGCGGCCACG-3’,下划线部分为XhoI酶切位点,以pMD18T-SPA为模板,进行PCR扩增,获得目的基因片段SPA1-3。
目的基因经过AIwNI、XhoI双酶切处理,并暴露粘性末端后连入表达载体,酶切产物跑3%琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段,并用凝胶回收试剂盒回收目的片段SPA1-3/A,X。
S2:培养用该重组表达质粒所转化的宿主细胞,得重组菌株;
在步骤S2中培养步骤包括以下步骤:
A1、在步骤S2中培养步骤包括以下步骤:
A1、表达质粒pET-31b(+)的处理:取适量保存菌种TOP10F/Pet31b(+)接于50mL添加有100μg/mLAmp的LLB培养液中,220rpm,28℃过夜摇床培养,并且在培养后使溶液在600nm波长处的吸光值约0.6,在培养后通过提取试剂盒提取pET31b(+)质粒;结构如图1;
A2、目的基因与质粒载体的连接:用T4DNA连接酶将经酶切处理的目的基因与质粒相连接,构建重组表达载体pET31b(+)-SPA1-3;
A3、菌种TOP10F’/pET-31b(+)-SPA1-3的构建:重组表达载体构建完成后,首先转化至扩增菌株E.coliTOP10F’,验证重组表达载体DNA序列的正确性,序列正确的阳性克隆子才能进一步转化表达菌株E.coliBL21(DE3)构建成表达工程菌;
A4、表达工程菌BL21(DE3)/pET-31b(+)-SPA1-3的构建和保存:将测序正确的重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,构建表达工程菌BL21(DE3)/pET-31b(+)-SPA1-3,并从转化平板上长出的菌落中挑取不同菌株进行培养,并制备15%-20%甘油菌,做好标记,-80℃保存。
S3:培养重组菌株,诱导重组蛋白的表达,分离并纯化所表达的重组蛋白;
在步骤S3中在培养重组菌株,诱导重组蛋白包括以下步骤:
1)在5L发酵罐中加入2.5L补料分批培养的基础培养基,并且将发酵罐进行灭菌,在灭菌后,将200mL种子菌接种入其中,整个发酵过程根据培养基中的残糖浓度0.1g·L-1控制补料;
2)在生长阶段将pH值控制在7.0左右,诱导后pH控制在7.4左右,溶解氧的控制通过调整搅拌速度使溶解氧在整个发酵过程中控制在30%以上,在发酵过程中,温度的控制是生长阶段控制30℃;
3)待菌体生长进入对数生长中期时,开始第1次升温诱导,诱导阶段温度控制为42℃,3-4h后,降低温度到37℃左右,恒温培养;
4)待菌体的生长又进入对数中期时,再第2次升温到42℃,进行第2次诱导表达,持续诱导表达5-6h,发酵结束。
在步骤S3中分离并纯化所表达的重组蛋白包括以下步骤:将收集的菌体用含有一定浓度的DTT还原剂的磷酸盐缓冲液悬浮,破碎后室温离心收集上清,利用Ni亲和柱和中低压层析系统进行蛋白提纯。
S4:用于偶联通用型基因重组蛋白质A微球的制备;
在步骤S4中用于偶联通用型基因重组蛋白质A微球为聚甲基丙烯酸甲酯微球,其中PMMA微球的偶联活化试剂为环氧氯丙烷或烯丙基缩水甘油醚,环氧活化聚甲基丙烯酸甲酯微球与Protein A的质量比1:1.2~1:2。
合成路线如下:
S5:通用型基因重组蛋白质A树脂的制备,
在步骤S5中基因重组蛋白质A树脂的制备包括以下步骤:
a:取含有50%乙醇储存液为粒径90微米PMMA树脂、粒径60微米PMMA树脂或者粒径30微米PMMA树脂至过滤器中抽干;
b:加入3倍介质体积的纯化水,搅拌均匀后抽干;
c:将介质转移到反应器中;
d:将待偶联样品加入到反应器中,室温条件下温和搅拌约18小时;
e:将介质转移到过滤器中抽干,保存收集容器中偶联后的溶液;
f:将介质用5倍PH值为8.0乙醇胺溶液,重悬,室温条件温和搅拌6小时,抽干,用2倍体积的纯净水清洗,再次抽干;
g:加入3倍介质体积的PH值为8.5的Tris-HCl溶液,搅拌均匀后抽干;
h:将介质转移到反应器中,加入3倍介质体积的PH值为4.0醋酸钠溶液,室温条件下温和搅拌2h;
i:加入3倍介质体积的20%乙醇溶液,搅拌均匀后抽干;
j:将介质转移到容器中,加入等体积的20%乙醇溶液后保存备用。
并且将通用型基因重组蛋白A1-3活性检测:
①将制备的通用型基因重组蛋白A1-3溶于1M氢氧化钠溶液中10小时、30小时和60小时,该氢氧化钠的浓度在0.5-1.0摩尔之间,然后测蛋白A降解情况。
②将Elisa测试经过耐碱性测试后的通用型基因重组蛋白A1-3的活性。
将9种通用型基因重组蛋白质A亲和纯化填料制备
将9种实施例进行耐碱性、载量和重复使用次数测试,即利用中低压层析仪器测试9种通用型基因重组蛋白质A亲和纯化填料的耐碱型、载量和重复使用次数;
用鼠单抗、Fab片段和驼科VHH抗体作为样品,PBS溶液进行洗杂,甘氨酸酸溶液(PH3.5)进行洗脱,1M氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液进行在线清洗。层析柱选择1mL预装柱。用SDS-PAGE检测纯化出来的蛋白产品纯度
表1鼠单抗测试结果如下
表2Fab片段测试结果如下
表3驼科VHH抗体测试结果如下
通过上表数据可知,制备的通用型基因重组蛋白质A亲和纯化填料通过对天然蛋白质A做耐碱性改造,引入碱性氨基酸,如赖氨酸、精氨酸、组氨酸,从而使得蛋白质A具有结构稳定性高,耐碱性好的效果,并综合蛋白质A、蛋白质G与蛋白质L与抗体的不同结构域结合优势,重新设计蛋白质A氨基酸序列,新的蛋白质A可以结合抗体Fc结构域、Fab片段中的L轻链和VHH片段,从而可满足巨大的抗体市场需求;同时采用聚甲基丙烯酸甲酯微球,其粒径较小,粒径均一,同时机械强度高,可在高流速下使用,分离效果好,并且在装柱时柱效稳定性好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种通用型基因重组蛋白质A亲和纯化填料制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
S1:构建含有重组葡萄球菌蛋白质A基因的重组表达质粒;
S2:培养用该重组表达质粒所转化的宿主细胞,得重组菌株;
S3:培养重组菌株,诱导重组蛋白的表达,分离并纯化所表达的重组蛋白;
S4:用于偶联通用型基因重组蛋白质A微球的制备;
S5:通用型基因重组蛋白质A树脂的制备。
2.如权利要求1所述的一种通用型基因重组蛋白质A亲和纯化填料制备方法,其特征在于:所述在步骤S1中重组蛋白质A基因包括通用型基因重组蛋白质A1、通用型基因重组蛋白质A2和通用型基因重组蛋白质A3,
其中,通用型基因重组蛋白质A1的序列为:
MHHHHHHRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKVDTPAVTTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTEALVQKKTLNELATNTNDNFFGERFSAGDAVPHSGIYKCTKCNREVTVNAHSRDNTFPPHYPESTCKSPMWKPYVIANTKA EWCCC;
通用型基因重组蛋白质A2:
MHHHHHHRNGFIQSLKKRPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKVDTPAVTTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYKRATKTFTVTEALVQKKTLNELATNTNDNFFGERFSAGDAVPHSGIYKCTKCNREVTVNAHSRDNTFPPHYPESTCKSPMWKPYVIANTKA EWCCC;
通用型基因重组蛋白质A3:
MHHHHHHRNGFIQSLKKRPSQSANLLARAKKLNDAQAPKVRTPAVTTYKLVINGKTLKGKTTTKAVRAETARKAFKQYANKNGVDGVWTYKRATKTFTVTRALVQKKTLNRLATNTNDNFFGKRFSAGDAVPHSGIYKCTKCNRKVTVNAHSRDNTFPPHYPKSTCKSPMWKPYVIANTKA EWCCC。
所述在通用型基因重组蛋白质A1-A3基因的5’端引入AIwN I位点及肠激酶识别位点,3’端引入XhoI位点及终止密码子,引物序列如下:上游引物:5-ATACAGATGCTGGATGACGATGACAAACATGCAGAA-3’,下划横线部分为AIwN I酶切位点,下划波浪线部分为肠激酶识别位点;下游引物:5’-ATACTCGAGTCATTAACCGCGGCCACG-3’,下划线部分为XhoI酶切位点,以pMD18T-SPA为模板进行PCR扩增,获得目的基因片段SPA1-3。
3.如权利要求2所述的一种通用型基因重组蛋白质A亲和纯化填料制备方法,其特征在于:所述目的基因经过AIwNI、XhoI双酶切处理,并暴露粘性末端后连入表达载体,酶切产物跑3%琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段,并用凝胶回收试剂盒回收目的片段SPA1-3/A,X。
4.如权利要求1所述的一种通用型基因重组蛋白质A亲和纯化填料制备方法,其特征在于:所述在步骤S2中培养步骤包括以下步骤:
A1、表达质粒pET-31b(+)的处理:取适量保存菌种TOP10F/Pet31b(+)接于50mL添加有100μg/mLAmp的LLB培养液中,220rpm,28℃过夜摇床培养,并且在培养后使溶液在600nm波长处的吸光值约0.6,在培养后通过提取试剂盒提取pET31b(+)质粒;
A2、目的基因与质粒载体的连接:用T4DNA连接酶将经酶切处理的目的基因与质粒相连接,构建重组表达载体pET31b(+)-SPA1-3;
A3、菌种TOP10F’/pET-31b(+)-SPA1-3的构建:重组表达载体构建完成后,首先转化至扩增菌株E.coliTOP10F’,验证重组表达载体DNA序列的正确性,序列正确的阳性克隆子才能进一步转化表达菌株E.coliBL21(DE3)构建成表达工程菌;
A4、表达工程菌BL21(DE3)/pET-31b(+)-SPA1-3的构建和保存:将测序正确的重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,构建表达工程菌BL21(DE3)/pET-31b(+)-SPA1-3,并从转化平板上长出的菌落中挑取不同菌株进行培养,并制备15%-20%甘油菌,做好标记,-80℃保存。
5.如权利要求1所述的一种通用型基因重组蛋白质A亲和纯化填料制备方法,其特征在于:所述在步骤S3中在培养重组菌株,诱导重组蛋白包括以下步骤:
1)在5L发酵罐中加入2.5L补料分批培养的基础培养基,并且将发酵罐进行灭菌,在灭菌后,将200mL种子菌接种入其中,整个发酵过程根据培养基中的残糖浓度0.1g·L-1控制补料;
2)在生长阶段将pH值控制在7.0左右,诱导后pH控制在7.4左右,溶解氧的控制通过调整搅拌速度使溶解氧在整个发酵过程中控制在30%以上,在发酵过程中,温度的控制是生长阶段控制30℃;
3)待菌体生长进入对数生长中期时,开始第1次升温诱导,诱导阶段温度控制为42℃,3-4h后,降低温度到37℃左右,恒温培养;
4)待菌体的生长又进入对数中期时,再第2次升温到42℃,进行第2次诱导表达,持续诱导表达5-6h,发酵结束。
6.如权利要求1所述的一种通用型基因重组蛋白质A亲和纯化填料制备方法,其特征在于:所述在步骤S3中分离并纯化所表达的重组蛋白包括以下步骤:将收集的菌体用含有一定浓度的DTT还原剂的磷酸盐缓冲液悬浮,破碎后室温离心收集上清,利用Ni亲和柱和中低压层析系统进行蛋白提纯。
8.如权利要求1所述的一种通用型基因重组蛋白质A亲和纯化填料制备方法,其特征在于:所述在步骤S5中基因重组蛋白质A树脂的制备包括以下步骤:
a:取含有50%乙醇储存液为粒径90微米PMMA树脂、粒径60微米PMMA树脂或者粒径30微米PMMA树脂至过滤器中抽干;
b:加入3倍介质体积的纯化水,搅拌均匀后抽干;
c:将介质转移到反应器中;
d:将待偶联样品加入到反应器中,室温条件下温和搅拌约18小时;
e:将介质转移到过滤器中抽干,保存收集容器中偶联后的溶液;
f:将介质用5倍PH值为8.0乙醇胺溶液,重悬,室温条件温和搅拌6小时,抽干,用2倍体积的纯净水清洗,再次抽干;
g:加入3倍介质体积的PH值为8.5的Tris-HCl溶液,搅拌均匀后抽干;
h:将介质转移到反应器中,加入3倍介质体积的PH值为4.0醋酸钠溶液,室温条件下温和搅拌2h;
i:加入3倍介质体积的20%乙醇溶液,搅拌均匀后抽干;
j:将介质转移到容器中,加入等体积的20%乙醇溶液后保存备用。
9.如权利要求1-8中任一项所述的一种通用型基因重组蛋白质A亲和纯化填料制备方法在分离纯化抗体及抗体Fab片段和VHH抗体中的应用。
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