CN102660568A - 一种重组胸腺肽α1的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明利用基因重组技术制备重组胸腺肽α1，包括人工合成融合蛋白基因并将所述融合蛋白基因重组到载体质粒pet-22b中构建表达载体，将该表达载体转化到宿主大肠杆菌中构建工程菌，将所述工程菌进行发酵并诱导融合蛋白表达，对表达产物进行纯化制备后得到融合蛋白目标产物。

Description

一种重组胸腺肽α1的制备方法

技术领域

本发明涉及医药生物工程技术领域，具体涉及一种重组多肽的制备方法。

背景技术

胸腺肽α1是Goldstein等1977年首次在胸腺组织中发现的由28个氨基酸组成的多肽，天然胸腺肽α1的氨基酸序列为：NH₂-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-COOH。胸腺肽α1具有免疫调节功能，是一种广谱免疫调节剂，临床上用于治疗乙型肝炎、丙型肝炎及肿瘤等疾病。此外，还可以用作疫苗辅助制剂。

目前，胸腺肽α1的生产方法有化学合成法和基因工程法。化学合成法的成本高，使用有机溶剂多，易造成环境污染。基因工程法是通过构建能表达胸腺肽α1的工程菌株(如大肠杆菌、酵母菌等)，在发酵阶段进行诱导表达，再经过纯化工序而制得胸腺肽α1。中国专利(专利号ZL200410077749.2)公开了一种通过基因工程技术制备胸腺肽α1的方法，该方法在pTRX质粒的基础上构建表达菌株，发酵中采用IPTG诱导工程菌表达，再采用亲和层析、离子交换层析纯化融合蛋白，肠激酶切释放出胸腺肽α1，再通过亲和层析和HPLC纯化出胸腺肽α1。

但该方法存在成本高、无法大规模生产等问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便、成本低、收率高且适用于大规模生产的重组胸腺肽α1的制备方法。

本发明利用基因重组技术制备重组胸腺肽α1，包括人工合成融合蛋白基因并将所述融合蛋白基因重组到载体质粒pet-22b中构建表达载体，将该表达载体转化到宿主大肠杆菌中构建工程菌，将所述工程菌进行发酵并诱导融合蛋白表达，对表达产物进行纯化制备后得到融合蛋白目标产物。

本发明的具体技术方案为：

一种重组胸腺肽α1的制备方法，包括以下步骤：

1)人工合成胸腺肽α1的融合蛋白基因全序列，如SEQ ID NO.1所示；

2)将合成的基因酶切后，重组到质粒pet-22b上构建表达载体，并将表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中构建工程菌；

3)将工程菌发酵培养，以乳糖作为诱导剂诱导融合蛋白表达；

4)将步骤3)的表达产物进行纯化，制备重组胸腺肽α1。

其中，步骤3)所述的发酵培养包括：

3a)将步骤2)构建的工程菌于培养基中培养获得活化的种子菌；

3b)将活化的种子菌进行高密度发酵培养，培养过程中加入补碳液和补氮液步骤4)所述的纯化包括以下步骤：

4a)收集经发酵培养的工程菌，用超高压均质机破碎，得细胞破碎液；

4b)用中空纤维滤膜过滤细胞破碎液，得滤液I；

4c)滤液I经亲和层析后，再经超滤除去咪唑，得滤液II；

4d)用肠激酶水解滤液II后，用亲和层析和HPLC纯化出胸腺肽α1。

进一步地，上述滤液II在15～20℃条件下，用肠激酶水解16hr。在所述条件可以减少肠激酶对胸腺肽α1的非特异性切割，有效提高胸腺肽α1的产量。

本发明的制备方法适用于大规模的工业化生产，不但显著提高了重组胸腺肽α1的产率，而且还具有制备工艺简单、生产成本低等有益效果。

附图说明

图1是实施例5所得胸腺肽的纯度和浓度的HPLC分析图。

图2是实施例6所得胸腺肽的纯度和浓度的HPLC分析图。

图3是实施例8中肠激酶水解融合蛋白的SDS-PAGE分析图；

其中，泳道1为胸腺肽α1对照品、泳道2-6的水解温度分别为：25℃、20℃、18℃、15℃、12℃。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明重组胸腺肽α1的制备方法进行详细描述。

表达载体的构建

【实施例1】

1、试剂和材料

载体质粒pet-22b购自美国MERK公司，大肠杆菌BL21(DE3)购自天根生化科技(北京)公司，融合蛋白基因的合成及质粒的测序委托生工生物工程(上海)有限公司合成，T4DNA连接酶、DNA限制性内切酶Nde I和Not I购自生工生物工程(上海)有限公司，胶回收试剂购自宝生物工程(大连)有限公司。

2、方法

(1)融合蛋白基因

人工合成如SEQ ID NO.1所示的融合蛋白基因全序列；在序列中含NdeI和NotI酶切位点(分别为CATATG和GCGGCCGC)和肠激酶识别序列(CATCATCATCATCATCAT)。

(2)重组质粒的构建

将合成的上述基因用Nde I和NotI双酶切后，回收DNA片段，然后与经Nde I和NotI双酶切的pet-22b质粒连接，构建出融合蛋白表达质粒。

(3)将上述融合表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，以氨苄青霉素为选择标记，筛选出转化子并进行酶切鉴定。

(4)将重组质粒测序，以确定表达载体构建的正确性。

(5)上述含表达载体的BL21(DE3)菌株作为重组胸腺肽α1的工程菌。

发酵工艺研究

【实施例2】发酵工艺1

1、培养基：

一级种子用LB培养基(g/L)：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g。

二级种子用2YT培养基(g/L)：蛋白胨16g，酵母粉10g，NaCl 5g。

发酵罐发酵培养基(g/L)：蛋白胨12g，酵母粉12g，NaCl5g，KH₂PO₄4g，K₂HPO₄5g，MgSO₄·7H₂O 1g，葡萄糖2g。

补碳液(400ml)：葡萄糖40g，MgSO₄·7H₂O 3g，。

补氮液(g/L)：蛋白胨37g，酵母粉37g。

2、种子菌活化：

取在-70℃、20％甘油中保藏的工程菌划平板，37℃培养约16hr，挑单克隆接种于含200ml LB培养基(含氨苄青霉素100μg/ml)的锥形瓶中，37℃，250rpm培养10小时左右。然后按2YT培养基量的1％转种一次，在相同条件下培养14.5小时，即成为活化种子菌。

3、发酵培养：

10L发酵罐中加入8L发酵用培养基，按1∶25的比例加入活化种子菌，另加入少量消泡剂，于37℃，pH7.0的条件下发酵。发酵过程中控制溶解氧浓度在30％～60％，起始转速为300rpm，溶解氧浓度不足时，最大转速可达800rpm。pH使用自动流加2N的HCl或4N的NaOH调节至7.0。发酵过程中取样测定0D600和菌体密度，当加入种子菌2hr时后开始加入补碳液，10L发酵罐补充400ml，诱导前30min左右完成；当加入种子菌后3hr开始加入补氮液，10L发酵罐补充2000ml，诱导完毕前1hr左右完成。当加入种子菌后5hr加入IPTG诱导表达，诱导的终浓度为0.6mM，诱导1hr后将IPTG浓度补充至1mM，IPTG终浓度为1mM，37℃诱导后4hr结束，诱导前和诱导后每小时取样，SDS-PAGE分析融合蛋白表达率。发酵结束后于4℃，5000rpm离心10min收集菌体，得到湿菌体300g～320g。

【实施例3】发酵工艺2

1、培养基：

一级种子用LB培养基(g/L)：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g。

二级种子用2YT培养基(g/L)：蛋白胨16g，酵母粉10g，NaCl 5g。

发酵罐发酵培养基(7000ml)：蛋白胨80g，酵母粉100g，NaCl 60g，KH₂PO₄45g，K₂HPO₄50g，MgSO₄·7H₂O 12g，葡萄糖70g。

补碳液(800ml)：葡萄糖250g，MgSO₄·7H₂O 10g，甘油120g。

补氮液(2000ml)：蛋白胨130g，酵母粉130g，硫酸铵130g。

2、种子菌活化：

取在-70℃、20％甘油中保藏的工程菌划平板，37℃培养约16hr，挑单克隆接种于含200ml LB培养基(含氨苄青霉素100μg/ml)的锥形瓶中，37℃，250rpm培养10小时左右。然后按2YT培养基量的1％转种一次，在相同条件下培养14.5小时，即成为活化种子菌。

3、高密度发酵培养：

10L发酵罐中加入7L发酵用培养基，按1∶25的比例加入活化种子菌，另加入适量消泡剂，于37℃，pH7.0的条件下发酵。发酵过程中控制溶解氧浓度在30％～60％，起始转速为300rpm，溶解氧浓度不足时，最大转速可达800rpm。pH使用自动流加2N的HCl或氨水调节至7.0。发酵过程中取样测定0D600和菌体密度，当加入种子菌3hr时后开始加入补碳液，10L发酵罐补充800ml，诱导前30min左右完成；当加入种子菌后4hr开始加入补氮液，10L发酵罐补充2000ml，诱导完毕前1hr左右完成。当加入种子菌后6hr一次性加入乳糖进行诱导，乳糖终浓度为10mM，37℃诱导后4hr结束，诱导前和诱导后每小时取样，SDS-PAGE分析融合蛋白表达率。发酵结束后于4℃，5000rpm离心10min收集菌体，得到湿菌体1180g～1380g。

发酵工艺1和发酵工艺2的比较：上述2种发酵工艺的主要区别在于：

第一，诱导剂不同。工艺2使用乳糖作为诱导剂，成本大大低于工艺1使用的IPTG，且乳糖是动植物和微生物体内常见成分，对细胞无毒，适合于药物制备，而IPTG对细胞有一定毒性。

第二，培养基的成分不同，与工艺1相比，工艺2中的补碳液增加了甘油，在补氮液中增加了硫酸铵，通过工艺2培养基配方的调整，发酵液中细菌密度提高5倍以上，且不会对目标蛋白的表达产生负面影响。

第三，pH调节剂不同，工艺1中使用盐酸和氢氧化钠作为pH调节剂，工艺2中使用盐酸和氨水作为pH调节剂，氨水即可调节pH，又可提供细菌生长所需的氮元素，细菌生长更好。

按上述工艺1(实施例2)和工艺2(实施例3)分别进行三次发酵，发酵罐体积10L，所产生的湿菌重量及目标蛋白的表达率结果比较，如表1所示。

表1：两者发酵工艺试验结果比较

从上表可以看出，在相同发酵液体积的情况下，利用发酵工艺2所得的湿菌重量远远大于发酵工艺1所得的湿菌重量。由于在这两种工艺中，目标蛋白重组胸腺肽α1的表达率基本相似，目标蛋白表达后是存在于细菌细胞内。所以发酵工艺2所得的目标蛋白表达量远远大于发酵工艺1。

此外，发酵工艺2使用乳糖作为诱导剂来诱导目标蛋白表达，其与发酵工艺1中使用的诱导剂IPTG的诱导能力相似，但乳糖成本大大低于IPTG，且乳糖是动植物和微生物体内常见成分，对细胞无毒，适合于药物制备，而IPTG对细胞有一定毒性。

纯化工艺研究

【实施例4】胸腺肽α1的纯化工艺1

1、菌体处理：将发酵后收集的菌体，用10倍重量的50mM Tris-HCl(pH8.0)，0.5M NaCl，重新悬浮菌体后，采用Branson450型超声波细胞粉碎机破碎细菌，探头型号为1/2”，以70％的功率在冰浴下超声15～25min，(超声8sec，间歇4sec)。4℃、10000rpm离心30收集上清液，用于精纯。

2、精纯：纯化中所用层析介质chelating sepharose FF，Q-Sepharose Fast Flow，sephadex G-25，sephadex G-10为美国GE公司产品，反相C18柱和prep LC300型液相系统为美国waters公司产品。

第一步，Ni²⁺-chelating sepharose亲和层析：将离心上清液过Ni²⁺-chelating sepharose FF亲和层析柱，弃去穿透液，然后再以50mM Tris-HCl(pH 7.0)，0.5M NaCl，20mM咪唑溶液洗脱，继之以Tris-HCl(pH 7.0)，0.5MNaCl，150mM咪唑溶液洗脱，收集融合蛋白峰流出液。

第二步，Q-Sepharose Fast Flow离子交换：将第一步收集的融合蛋白溶液，通过Sephadex G-25柱更换成20mM Tris-HCl(pH 8.0)，20mM NaCl缓冲液后上Q-Sepharose Fast Flow柱，用50mM Tris-HCl(pH 8.0)，150mM NaCl进行洗脱，收集洗脱峰用于酶切。

第三步，肠激酶水解融合蛋白：在第二步收集的融合蛋白峰液中，紫外法测定超滤处理后蛋白溶液浓度，加入肠激酶，于15℃水解16小时，按每μl肠激酶切割4mg融合蛋白的比例酶切。

第四步：Ni²⁺-chelating sepharose亲和层析：先用50mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.5M NaCl，缓冲液平衡亲和层析柱，将融合蛋白水解液上柱，收集穿透液，通过sephadex G-10柱将其中的缓冲液置换成超纯水。

第五步：制备型HPLC(C₁₈)纯化：流动相A(乙腈)，流动相B(0.01MKH₂PO₄，)，按流动相5％流动相A到30％流动相A进行梯度洗脱，洗脱时间为30分钟，收集胸腺肽α1峰，进行分析型反相HPLC(C₁₈柱)分析其纯度，测定其含量。

【实施例5】胸腺肽α1的纯化工艺2

1、菌体处理：将发酵后收集的菌体，用10倍重量的50mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.5M NaCl，20mM咪唑溶液重新悬浮菌体，用低温超高压连续流细胞破碎机(广州聚能JN-100C)破碎2次，利用中空纤维滤膜过滤(美国PALL公司，孔径0.1μm～0.65μm)，并洗滤3～5倍体积。

2、精纯：纯化中所用层析介质chelating sepharose FF，sephadex G-10为美国GE公司产品，反相C18柱和prep LC300型液相系统为美国waters公司产品，超滤系统和超滤膜为美国millipore公司产品。

第一步，Ni²⁺-chelating sepharose亲和层析：先用50mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.5M NaCl，20mM咪唑，缓冲液平衡亲和层析柱，将过滤后收集的澄清液体上柱，弃去穿透液，然后再以50mM Tris-HCl(pH 7.0)，0.5M NaCl，20mM咪唑，缓冲液平衡层析柱，继之以Tris-HCl(pH 7.0)，0.5M NaCl，150mM咪唑，缓冲液洗脱，收集融合蛋白峰流出液。

第二步，肠激酶水解融合蛋白：将第一步收集的融合蛋白峰流出液，先以截留分子量为5KD或10KD的超滤膜超滤除去咪唑并将其中的缓冲液置换为20m mol/L Tris-HCl，pH8.0，20mM NaCl缓冲液，超滤后体积约为超滤前的90％左右，紫外法测定超滤处理后蛋白溶液浓度，加入肠激酶，于15℃水解16小时。按每1μl肠激酶切割4mg融合蛋白的比例酶切。

第三步：Ni²⁺-chelating sepharose亲和层析：先用50mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.5M NaCl，缓冲液平衡亲和层析柱，将融合蛋白水解液上柱，收集穿透液，通过sephadex G-10柱将其中的缓冲液置换成超纯水。

第四步：制备型HPLC(C18)纯化：流动相A(乙腈)，流动相B(0.01MKH₂PO₄，)，按流动相5％流动相A到30％流动相A进行梯度洗脱，洗脱时间为30分钟，收集胸腺肽α1峰，进行分析型反相HPLC(C₁₈柱)分析其纯度，测定其含量。

纯化工艺1和纯化工艺2的比较

第一，在纯化工艺1中，采用超声波细胞粉碎机破碎细菌，由于目前市场上超声波破碎机功率有限，该方法只适宜于试验研究，无法规模化生产。而工艺2采用超高压均质机破碎细菌，可以实现大规模生产。

第二，在纯化工艺1中，细胞破碎液采用10000rpm离心30min中的方法进行固液分离，很难实现大规模生产，而且离心效果不佳。而工艺2采用中空纤维过滤的方法进行分离，试验证明，工艺2的方法所得液体更澄清，不会污染下一工序的层析介质，同时，通过放大膜面积，很容易实现规模化生产。

第三，与纯化工艺1中采用sephadex G-25的方法不同，工艺2采用超滤的方法除去咪唑，可以节省时间，省去层析介质成本，因为sephadex G-25为进口介质，使用次数有限，价格昂贵，层析过程耗时很长。而采用超滤方法后，除去咪唑后的溶液同样可顺利用于下一步的酶切工序，不影响酶切效果，而所用工时缩短一半以上。

第四，在纯化融合蛋白的步骤中，与工艺2不同，工艺1不采用离子交换的方法，而是除去咪唑后直接酶切，试验证明，减少离子交换步骤，可以提高产量20％以上，而且最终产品的纯度和质量丝毫不受影响。所以工艺2减少了工序，明显提高了产率。

纯化工艺1(实施例4)的分析结果如图1所示，纯化工艺2(实施例5)的分析结果如图2所示。通过和标准品的HPLC分析图对照，计算出实施例4和实施例5方法制备的胸腺肽α1的含量，再计算出每克菌体所得到的胸腺肽α1毫克数，结果如表2所示。

表2：胸腺肽α1的质量

	样品纯度	每克菌体所得胸腺肽α1毫克数
			实施例4	98.4％	1.98mg
实施例5	99.1％	2.50mg

【实施例6】肠激酶最适水解温度的筛选

肠激酶是专一性很高的蛋白水解酶，其切割位点为DDDDK(天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-赖氨酸)后面的肽键，但有时也出现非特异性切割的现象。一般使用融合表达时，特意在融合蛋白序列中，设计了该位点，以便利用肠激酶将目标多肽释放出来。若减少肠激酶对胸腺肽α1的非特异性切割，可有效提高胸腺肽α1的产量。

本发明对肠激酶的水解温度和时间进行了筛选，融合蛋白溶液浓度为4mg/ml，缓冲液为20mM Tris-HCl(pH 8.0)，20mM NaCl，于融合蛋白溶液中加入肠激酶溶液，按每微升(μl)肠激酶切割4mg融合蛋白的比例加入混匀，分成两份，分别置25℃，20℃，18℃，15℃，12℃的条件下进行水解，水解时间16hr，水解结束后，取样进行SDS-PAGE分析，确定水解最适合温度。结果如图3所示。从图3中可以看出，而25℃、20℃、18℃水解后，融合蛋白已被完全水解，但同时出现了较强的胸腺肽α1的非特异性水解，电泳图中出现了较深的一条小分子带，而目的多肽胸腺肽α1的电泳带变浅，说明造成了胸腺肽α1的损失，减少了胸腺肽α1的产量。而15℃水解条件下，非特异性水解较少，而目的多肽胸腺肽α1的带最深，说明该条件下目的多肽胸腺肽α1产率最高，故选用15℃作为水解温度。

Claims (4)

1.一种重组胸腺肽α1的制备方法，包括以下步骤：

1)人工合成胸腺肽α1的融合蛋白基因全序列，所述基因序列如SEQ IDNO.1所示；

2)将合成的基因酶切后，重组到质粒pet-22b上构建表达载体，并将表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中构建工程菌；

3)将工程菌发酵培养，以乳糖作为诱导剂诱导融合蛋白表达；

4)将步骤3)获得的表达产物按下述步骤进行纯化，制备重组胸腺肽α1；

4a)收集经发酵培养的工程菌，悬浮菌体，用超高压均质机破碎，得细胞破碎液；

4b)用中空纤维滤膜过滤细胞破碎液，得滤液I；

4c)滤液I经亲和层析后，再经超滤，得滤液II；

4d)用肠激酶水解滤液II后，用亲和层析和HPLC纯化出胸腺肽α1。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4)所述纯化包括以下步骤：

4a)收集经发酵培养的工程菌，用10倍重量的50mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.5MNaCl，20mM咪唑溶液重新悬浮菌体，然后用超高压均质机破碎，得细胞破碎液；

4b)用孔径0.1μm～0.65μm的中空纤维滤膜过滤细胞破碎液的上清液，并洗滤3～5倍体积得滤液I；

4c)用50mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.5M NaCl，20mM咪唑的缓冲液平衡亲和层析柱，将滤液I上柱，弃去穿透液，然后再以50mM Tris-HCl(pH 7.0)，0.5M NaCl，20mM咪唑的缓冲液平衡层析柱，以Tris-HCl(pH 7.0)，0.5M NaCl，150mM咪唑的缓冲液洗脱，收集融合蛋白峰流出液，以截留分子量为5KD或10KD的超滤膜超滤除去流出液中的咪唑，并将其中的缓冲液置换为20mmol/LTris-HCl，pH8.0，20mM NaCl的缓冲液，得滤液II；

4d)测定滤液II的蛋白质浓度，以1μl肠激酶切割4mg融合蛋白的比例加入肠激酶，于15℃水解16小时，用50mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.5M NaCl的缓冲液平衡亲和层析柱，将融合蛋白水解液上柱，收集穿透液，并将其中的缓冲液置换成超纯水，然后用HPLC纯化出胸腺肽α1。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述发酵包括以下步骤：

3a)将步骤2)构建的工程菌于培养基中培养获得活化的种子菌；

3b)将活化的种子菌进行高密度发酵培养，培养过程中加入补碳液和补氮液，以盐酸-氨水调节pH，加入乳糖诱导剂培养获得含表达的胸腺肽α1的菌体；其中补碳液含葡萄糖、MgSO₄·7H₂O和甘油，补氮液含蛋白胨，酵母粉和硫酸铵。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3b)包括：

i)向发酵罐中加入发酵培养基，每升发酵培养基组成为：蛋白胨11.43g，酵母粉14.3g，NaCl 8.57g，KH₂PO₄6.43g，K₂HPO₄7.14g，MgSO₄·7H₂O 1.71g，葡萄糖10g，按体积比1∶25向发酵培养基中加入活化种子菌，另加入消泡剂，于37℃，pH7.0的条件下发酵；

ii)控制发酵过程的溶解氧浓度为30％～60％，转速为300-800rpm，自动流加2N的HCl或氨水将发酵液的pH调节至7.0；

iii)加入种子菌后3hr时至诱导前30min，连续向发酵罐加入补碳液，每升补碳液组成为：葡萄糖312.5g，MgSO₄·7H₂O 12.5g，甘油150g；

iv)加入种子菌后4hr至诱导完毕前1hr，连续向发酵罐加入补氮液，每升补氮液组成为：蛋白胨65g，酵母粉65g，硫酸铵65g；

v)加入种子菌后6hr一次性加入乳糖进行诱导，使乳糖终浓度为10mM，诱导4hr后收集菌体。

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