CN1831126A

CN1831126A - 重组胸腺素α1在大肠杆菌中的高分泌表达和分离纯化

Info

Publication number: CN1831126A
Application number: CN 200510024236
Authority: CN
Inventors: 甘人宝; 张倩; 冯宝山; 钱悦; 杜鹏; 丁红珍; 周庆玮
Original assignee: PULUO PHARMACEUTICAL RESEARCH INST Co Ltd SHANGHAI
Current assignee: Apeloa Pharmaceutical Co ltd; Shanghai Puluochuangzhi Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2005-03-07
Filing date: 2005-03-07
Publication date: 2006-09-13
Anticipated expiration: 2025-03-07
Also published as: CN100500844C

Abstract

本发明提供重组胸腺素α1(rTα－1)基因、表达质粒pKAT、含有表达质粒pKAT的工程菌YKAT以及从中筛选出的工程菌株YKAT－8。还提供重组胸腺素α1的制备方法，该方法利用大肠杆菌偏爱密码子，设计并化学合成重组胸腺素α1基因，以大肠杆菌碱性磷酸酯酶的启动子和信号肽基因作为启动表达和分泌重组胸腺素α1的上游序列，构建分泌表达质粒pKAT，进而构建并筛选得到工程菌株YKAT－8，该菌株经发酵培养，直接分泌表达rTα－1至培养基中，分泌表达量达到每升500毫克，经分离纯化，得到N端非乙酰化的重组胸腺素α1，纯度大于95％。该方法步骤简单，明显减少生产费用和缩短生产周期，使大规模工业化生产、大规模临床应用成为可能。

Description

重组胸腺素α1在大肠杆菌中的高分泌表达和分离纯化

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及通过基因工程方法制备重组胸腺素α1。

背景技术

胸腺是人体最重要的免疫器官，在免疫系统中具有关键的地位，七十年代中期，人们从胸腺组织中分离得到一种混合的胸腺多肽制备物，称之为TF5，TF5组分被认为是强有力的免疫系统增强剂，可以促使T细胞分化成熟以及发挥正常功能，增加机体的抗体表达和免疫移植反应，促进MIF(巨噬细胞移动抑制因子)的表达等等。

胸腺素α1(Thymosin α1，简称：Tα1)是最早从TF5组分中纯化得到均一状态的一个活性多肽，由28个氨基酸组成，N端被乙酰化，等电点为pH4.2，分子量3108，不含甲硫氨酸，半胱氨酸和芳香氨基酸。在某些测活系统中如MIF诱导、E-玫瑰花结实验、诱导淋巴细胞表面标记产生等实验显示，胸腺素α1比TF5活性高出10到1000倍，具有显著的免疫活性，是TF5组分中主要免疫活性成分之一。

胸腺素α1是免疫系统有力的增强剂，能促进免疫系统的多种功能，在临床上适用于很多疾病的治疗，如病毒性疾病乙型肝炎和丙型肝炎的治疗、癌症的辅助治疗、免疫低下症以及免疫性疾病的治疗。

目前，市场上销售的胸腺类产品的生产工艺有两种：化学合成法和动物组织提取法。化学合成法的生产工艺复杂，得率低，成本高，产品价格十分昂贵；而动物组织提取的产品是混合物，价格低，但质量不稳定，疗效不如胸腺素α1，对有些病人有致敏性。这些都极大地限制了该产品在临床上的应用。如果能降低生产成本，大量提供优质廉价的胸腺素α1药品，将会产生很高的社会效益和经济效益。

用基因工程方法生产多肽在基因工程领域中属于比较新的课题，也是一个难题。因为多肽的分子量较小，在宿主菌菌体内表达时很容易被蛋白酶水解，据报道直接表达的水平仅能达到每升几个毫克的水平，因此，目前国内外所采用的生产工艺大都限于用基因多拷贝表达或以融合蛋白的形式表达多肽，但用这些方法表达的产物还需经过化学裂解或酶切等后加工步骤，生产工艺十分复杂、繁琐。

本发明者们对直接分泌表达多肽进行了潜心研究，利用大肠杆菌碱性磷酸酯酶启动子和信号肽基因所构建的表达系统直接分泌表达重组胸腺素α1(rTα-1)至培养基中，获得了很高的分泌表达量，说明用分泌表达的方式生产胸腺素α1不仅仅是可行的，而且是非常有效的生产方式，从而完成了本发明。

因此，本发明的一个目的是提供重组胸腺素α1基因。

本发明的另一个目的是提供分泌表达重组胸腺素α1的表达质粒pKAT。

本发明的再一个目的是提供分泌表达重组胸腺素α1的工程菌YKAT。

本发明的还有一个目的是提供高分泌表达重组胸腺素α1的工程菌株YKAT-8。

本发明的进一步目的是提供直接分泌表达重组胸腺素α1的方法。

发明内容

本发明提供的重组胸腺素α1基因具有与序列表中SEQ ID NO.1所示的如下核苷酸序列至少90％同源性的序列：

5′-TCTGACGCTG CTGTTGACAC TTCTTCCGAA ATCACTACCA AAGACCTGAA

AGAAAAGAAA GAAGTTGTAG AAGAGGCTGA AAACTAATAA-3′

本发明提供的分泌表达重组胸腺素α1的表达质粒pKAT包括与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列至少90％同源性的重组胸腺素α1基因，在所述基因的上游含有启动表达和分泌重组胸腺素α1的碱性磷酸酯酶phoA启动子和信号肽基因。

本发明的表达质粒pKAT中，所述的启动子和信号肽基因还包括可以启动表达和分泌重组胸腺素α1的所有原核启动子和信号肽基因。

本发明提供的工程菌YKAT是表达质粒pKAT转化入大肠杆菌YK537而得到的具有卡那霉素抗性的所有菌株。

本发明还提供分泌表达重组胸腺素α1的工程菌株YKAT-8，所述工程菌株是从工程菌YKAT中筛选出的表达量最高的菌株。

本发明提供的直接分泌表达重组胸腺素α1的方法包括如下步骤：

1.利用大肠杆菌偏爱密码子按照天然胸腺素α1的氨基酸序列设计并合成重组胸腺素α1基因；

2.以pTZ18R为起始质粒，以大肠杆菌碱性磷酸酯酶phoA启动子和信号肽基因作为重组胸腺素α1基因的上游序列，构建表达质粒pKAT；

3.接入卡那霉素抗性基因；

4.构建和筛选出基因工程菌株YKAT-8；

5.基因工程菌YKAT-8的发酵培养；

6.表达产物的分离纯化。

本发明提供的重组胸腺素α1分离纯化方法是采用超滤、阴离子交换柱层析、凝胶过滤层析和反相高压液相色谱的组合方式。

本发明的特征在于利用大肠杆菌偏爱密码子按照天然胸腺素α1的氨基酸序列设计了胸腺素α1在大肠杆菌表达的基因序列，并首次应用直接分泌表达的方式生产重组胸腺素α1，成功地直接分泌表达重组胸腺素α1至培养基中，目前的分泌表达水平已达到每升500毫克，经分离纯化，得到N端非乙酰化的重组胸腺素α1纯品，其纯度大于95％。实验证明，纯化的重组胸腺素α1和化学合成的胸腺素α1有类似的生物活性，而比胸腺肽的混合制备物活性高。本发明的方法步骤简单，与化学合成以及大肠杆菌融合表达生产胸腺素α1的方法比较，在生产费用和生产周期上明显减少和缩短，从而使大规模工业化生产、大规模临床应用成为可能。

附图说明

图1是pAAT质粒构建示意图。

图2是pKAT质粒构建示意图。

图3是质粒pAAT的酶切鉴定图。图中，第1泳道是pAAT经PstI、HindIII酶切后的电泳条带；第2泳道是DNA标准分子量。

图4是工程菌YKAT摇瓶筛选的SDS-PAGE凝胶电泳图。图中，第1-5，8-13，15泳道是300μl摇瓶培养基上清，依次为工程菌YKAT1-12；第6泳道是300μl不含质粒的YK537培养基上清；第7，14泳道是化学合成的胸腺素α1标准品。

图5是工程菌株YKAT-8在发酵罐中表达上清的SDS-PAGE凝胶电泳图。图中，第1-3泳道是10μl发酵液上清，依次为培养14小时，16小时，18小时；第4-8泳道是化学合成的胸腺素α1标准品，依次为0.5μg，1μg，2μg，3μg，5μg。

图6是Q Sepharose Fast Flow离子交换纯化图。

图7是Sephadex G-50凝胶过滤纯化图。

图8是反相HPLC纯化图。

图9是纯化产物的SDS-PAGE电泳分析图。图中，第1泳道为10μg纯化的重组胸腺素α1；第2泳道为10μg化学合成的胸腺素α1标准品。

图10是纯化产物的反相HPLC检定图。

图11是纯化产物的N端氨基酸序列检定图(1)。

图12是纯化产物的N端氨基酸序列检定图(2)。

图13是纯化产物的N端氨基酸序列检定图(3)。

下面用实施例对本发明进行详细描述。这些实施例仅仅是举例说明，并不对本发明构成任何限制。

实施例1 设计并合成重组胸腺素α1基因：

我们设计了如下两个片段(序列表中的SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)，下划线部分为两片段互补区。在设计合成片段时，充分遵循了以下原则：按照天然胸腺素α1的氨基酸序列(序列表中的SEQ ID NO.10)，选用大肠杆菌偏爱的密码子；AT、GC含量接近且分布均匀；片段内避免二级结构的产生；片段间避免重复序列；在基因的3’端加入两个终止密码子。

片段1：5′-TCTGACGCTGCTGTTGACACTTCTTCCGAAATCACTAC

CAAA GACCTGAAAGAAAAG-3′

片段2：5′-CCCAAGCTTATTAGTTTTCAGCCTCTTCTACAACTTCTTT

CTTTTCTTTCAGGTC-3′

将上述化学合成的两个基因片段各10D，在95℃退火5分钟，再缓慢冷却到室温，加入5U klenow酶(TaKaRa公司)、8μl 2.5mM dNTP(TaKaRa公司)和10μl 10×klenow酶缓冲液(TaKaRa公司)，补充蒸馏水至100μl，37℃聚合2小时，在1.5％的琼脂糖凝胶中电泳，割取97bp片断，用DNA胶回收试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)，按试剂盒提供的方法回收该DNA片段，即为重组胸腺素α1基因(序列表中的SEQ ID NO.1)。相应的天然人胸腺素α1基因见序列表中的SEQ ID NO.2。

实施例2 化学合成碱性磷酸酯酶phoA启动子和信号肽基因：

我们完全按照大肠杆菌碱性磷酸酯酶phoA启动子(phoA-P)和信号肽(sig)的天然基因序列(序列表中的SEQ ID NO.5)合成该基因。先合成如下4个片段(片段3-6)(序列表中依次为SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ IDNO.9)，下划线部分为片段间互补区。在phoA-P的5’端加上PstI、BglII、XbaI的酶切位点，以便于构建。

片段3：5′-AACTGCAGATCTAGAGCTCGTCAGTAAAAAGTTAATCTTT

TC AACAGCTGTCATAAAGTT-3′

片段4：5′- TTAAAAAATAAAAACAAAGCGACTATAAGTCTCGGCCGTG

AC AACTTTATGACAGCTGTT-3′

片段5：5′- TTTGTTTTTATTTTTTAATGTATTTGTACATGGAGAAAAT

AA AGTGAAACAAAGCACTAT-3′

片段6：5′-CGCTTTTGTCACAGGGGTAAACAGTAACGGTAAGAGTGCCAGTGCA ATAGTGCTTTGTTTCACT-3′

将上述化学合成的四个基因片段各1OD，在95℃退火5分钟，再缓慢冷却到室温，加入5U klenow酶(TaKaRa公司)、8μl 2.5mM dNTP(TaKaRa公司)和10μl 10×klenow酶缓冲液(TaKaRa公司)，补充蒸馏水至100μl，37℃聚合2小时，在1.5％的琼脂糖凝胶中电泳，割取190bp片断，用DNA胶回收试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)，按试剂盒提供的方法回收该DNA片段，即为碱性磷酸酯酶phoA启动子和信号肽基因。

实施例3 表达质粒的构建(图1)：

3.1载体的酶切处理：

以质粒pTZ18R(Pharmacia公司)作为出发质粒。取5微克pTZ18R加入20UPstI酶(TaKaRa公司)和10μl 10×PstI酶缓冲液(TaKaRa公司)，补充蒸馏水至100μl，37℃酶切4小时，再加入10μl 3M乙酸钠，200μl的无水乙醇，充分混匀，12000rpm离心10分钟，弃去上清，加入200μl 70％乙醇，充分混匀，12000rpm离心2分钟，弃上清。待沉淀晾干后，加入20U HindIII酶(TaKaRa公司)和5μl10×HindIII酶缓冲液(TaKaRa公司)，补充蒸馏水至50μl，37℃酶切过夜，酶切混合物在1％琼脂糖凝胶中电泳，割取约2.9kb条带，用DNA胶回收试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)，按试剂盒提供的方法回收该DNA片段，即获得两端含有PstI、HindIII粘性末端的线性载体。

3.2碱性磷酸酯酶phoA启动子和信号肽基因与重组胸腺素α1基因的连接与扩增：

将实施例1得到的重组胸腺素α1基因与实施例2得到的碱性磷酸酯酶phoA启动子和信号肽基因以1∶1的比例加入T₄DNA连接酶(TaKaRa公司)的反应体系(按T₄DNA连接酶使用说明书配制)中，16℃连接过夜。在500μl小离心管中加入1μl上述连接混合物、50pmol片段2(序列表中的SEQ ID NO.4)、50pmol片段3(序列表中的SEQ ID NO.6)、8μl 2.5mM dNTP(TaKaRa公司)、10μl 10×pfu DNA聚合酶缓冲液(TaKaRa公司)、2.5U pfu DNA聚合酶(TaKaRa公司)，并补充水至100μl，然后在PCR仪上进行扩增，扩增方法：94℃2分钟，1个循环；94℃30秒，72℃45秒，30个循环；72℃2分钟。将扩增混合物在1％的琼脂糖凝胶中电泳，割取287bp片断，用DNA胶回收试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)，按试剂盒提供的方法回收该DNA片段，即为连接顺序为5’-碱性磷酸酯酶启动子和信号肽+重组胸腺素α1-3’的基因(如图1)。

3.3碱性磷酸酯酶启动子和信号肽+重组胸腺素α1基因的酶切处理：

在3.2得到的碱性磷酸酯酶启动子和信号肽+重组胸腺素α1基因中加入50UPstI酶(TaKaRa公司)和10μl 10×PstI酶缓冲液(TaKaRa公司)，补充蒸馏水至100μl，37℃酶切过夜，再加入10μl 3M乙酸钠，200μl的无水乙醇，充分混匀，12000rpm离心10分钟，弃去上清，加入200μl 70％乙醇，充分混匀，12000rpm离心2分钟，弃上清。待沉淀晾干后，加入50U HindIII酶(TaKaRa公司)和5μl10×HindIII酶缓冲液(TaKaRa公司)，补充蒸馏水至50μl，37℃酶切过夜，酶切混合物在1％琼脂糖凝胶中电泳，割取约280bp条带，用DNA胶回收试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)，按试剂盒提供的方法回收该DNA片段，即获得5’端含有PstI粘端、3’端含有HindIII粘端的插入片段。

3.4连接：

将3.1得到的含有两粘端的线性载体与3.3得到的含有两粘端的碱性磷酸酯酶启动子和信号肽+重组胸腺素α1基因以1∶5的比例加入T₄DNA连接酶(TaKaRa公司)的反应体系(按T₄DNA连接酶使用说明书配制)中，16℃连接过夜。

3.5感受态细胞的制备：

接种大肠杆菌Top10F’甘油菌[F’{proAB，lacI^q，lacZΔM15，Tn10(Tet^R)}mcrA，Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)，Φ80lacZΔM15，ΔlacX74，deoR，recA1，araD139，Δ(ara-leu)7697，galU，galK，rpsL(Str^R)，endA1，nupGλ-](购自Invitrogen公司)至3mL LB培养基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母抽提物，10g/L氯化钠)中，37℃200rpm培养过夜。取100μl转接入3mL新鲜的LB培养基中，37℃200rpm继续培养至A600介于0.3～0.4，4000rpm离心10分钟，弃上清，菌体以预冷的钙溶液(0.1mol/LCaCl₂)洗涤，4000rpm离心10分钟，重悬于200μl的钙溶液中。

3.6连接产物的转化：

取3.4得到的连接混合物，加入3.5制备的感受态细胞中，冰浴30分钟，42℃热休克90秒，随后加入800μl新鲜的LB培养基，37℃，100rpm，缓慢振摇30分钟，取100μl涂布含有100微克/毫升氨苄青霉素的LB平板(10g/L蛋白胨，5g/L酵母抽提物，10g/L氯化钠，15g/L琼脂)上，37℃培养过夜。

3.7质粒的小量制备：

用灭菌牙签挑取3.6得到的单菌落于3mL含有100微克/毫升氨苄青霉素的LB培养基中，37℃200rpm培养8～10小时后，用质粒小抽试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)，按试剂盒提供的方法抽取质粒，进行酶切鉴定，完成表达质粒pAAT的构建。

实施例4 表达质粒的鉴定

取1μg实施例3获得的小量制备的质粒，加入5U PstI酶(TaKaRa公司)和5U HindIII酶(TaKaRa公司)，再加入2μl 10×K缓冲液(TaKaRa公司)，补充蒸馏水至20μl，37℃酶切2小时，酶切混合物在1％琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下观测，切出约为280bp大小的片段，与实验设计时预期的相一致(图3)。

委托上海博亚生物技术有限公司进行DNA序列测定，测序结果表明在构建的表达质粒pAAT中，碱性磷酸酯酶phoA启动子和信号肽基因序列(序列表中的SEQ ID NO.5)以及重组胸腺素α1基因序列(序列表中的SEQ ID NO.1)都完全正确，并且碱性磷酸酯酶启动子和信号肽基因位于重组胸腺素α1基因的上游，与实验设计一致(见图1)。

实施例5 表达质粒的抗性改造(图2)：

5.1pAAT质粒的大量制备：

(1)将含有pAAT质粒的大肠杆菌Top10F’接入200mL LB培养基，37℃200rpm振荡培养过夜。

(2)4000rpm离心10分钟沉淀菌体，加入5mL溶液I，振荡器上打散菌体后加入10mL溶液II，室温放置3分钟后加入7.5mL溶液III，冰浴5分钟后12000rpm离心10分钟。

(3)取上清，加入两倍体积乙醇，混匀，12000rpm离心10分钟，弃上清，晾干沉淀，溶于1mL TE中，加入RNaseA至50μg/mL，37℃水浴30分钟。然后利用Sepharose CL-2B柱进行纯化，用TE洗脱，收集第一个峰。

(4)加入等体积酚/氯仿(1∶1)振荡后，12000rpm离心5分钟，吸取上层溶液。

(5)重复步骤(4)两次。

(6)加入1/10体积的3M NaAc和2倍体积的无水乙醇，混匀后12000rpm离心10分钟，用70％乙醇洗涤一次，晾干沉淀，并溶于TE中。

溶液I：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA，pH8.0。

溶液II：0.2mol/L NaOH，1％SDS。

溶液III：5mol/L乙酸钾60mL，冰乙酸11.5mL，无菌水28.6mL。

TE：10mM Tris HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH8.0)

RNaseA：10mg RNaseA粉末溶解于1mL蒸馏水，100℃加热15分钟，离心后上清保存于4℃。

5.2质粒pET-24a(+)和质粒pAAT的酶切处理：

用10U Eco57I酶(华美生物工程公司)分别酶切10μg质粒pET-24a(+)(Novogen公司)和5.1制备的10μg质粒pAAT，在100μl酶切体系(按Eco57I酶使用说明书配制)中，37℃酶切2小时，再分别加入100μl的酚∶氯仿(1∶1)充分混匀，12000rpm离心5分钟，吸取上层溶液，加入10μl 3M乙酸钠，200μl的无水乙醇，充分混匀，12000rpm离心10分钟，弃去上清。待沉淀晾干后，分别加入30U Hind III酶和5μl 10×HindIII酶缓冲液(TaKaRa公司)，补充蒸馏水至50μl，37℃酶切过夜，酶切混合物在1％琼脂糖凝胶中电泳，割取从pET-24a(+)中切出的1200bp卡那霉素抗性基因片断以及切去氨苄青霉素抗性基因的pAAT大片段，用DNA胶回收试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)，按试剂盒提供的方法回收DNA片段。

5.3卡那霉素抗性基因的接入：

按3.4方法将5.2得到的两回收DNA片段连接，并转化入大肠杆菌Top10F’感受态细胞中，涂布含50微克/毫升卡那霉素的LB平板，37℃培养过夜，挑取单菌落，于3mL含有50微克/毫升卡那霉素的LB培养基中，37℃200rpm培养8～10小时后，用质粒小抽试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)，按试剂盒提供的方法抽取质粒，再进行酶切鉴定。

5.4鉴定：

酶切鉴定方法同实施例4，酶切鉴定正确的质粒为表达质粒pKAT。进一步委托上海博亚生物技术有限公司对质粒pKAT进行DNA序列测定，序列测定结果表明碱性磷酸酯酶phoA启动子和信号肽基因序列(序列表中的SEQ ID NO.5)以及重组胸腺素α1基因序列(序列表中的SEQ ID NO.1)完全正确，并都已正确地连入卡那霉素抗性质粒中(见图2)。

实施例6 基因工程菌YKAT的构建和筛选

6.1基因工程菌YKAT的构建：

按3.5方法制备大肠杆菌YK537[supE44 hsdR hsdM recA1 phoA8 leuB6 thilacY rpsL20 galK2 ara-14xyl-5mtl-1](由Dr.Yamasaki惠赠)的感受态细胞，按3.6方法将表达质粒pKAT转化入YK537中，涂布含50微克/毫升卡那霉素的LB平板，37℃培养过夜。

6.2基因工程菌YKAT的诱导表达：

挑取6.1获得的单菌落放入3毫升LB培养基中，37℃200rpm培养过夜，然后按1∶100的比例转接入LB培养基中，6小时后利用5N NaOH调节培养基pH至7.0，每1小时调节一次，继续培养12小时，取1mL培养液作为试样，离心后取上清，在上清中加入4倍体积的丙酮，冰浴10分钟后12000rpm离心5分钟，倾去溶液，晾干沉淀，用于进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。

6.3培养上清经SDS-PAGE凝胶电泳分析(图4)，筛选出表达量最高的工程菌株：YKAT-8。SDS-PAGE电泳方法如下：

(1)SDS-PAGE电泳分离胶(17％)的配制：将3.2mL 38％丙烯酰胺贮液、2.33mL分离胶缓冲液、1.5mL 50％甘油、100μl 10％过硫酸铵和100μl 10％TEMED混合。配制好后立即使用，胶的上层用水封好，以隔绝氧气。

(2)SDS-PAGE电泳堆积胶(5％)的配制：将0.5mL 30％丙烯酰胺贮液、0.38mL堆积胶缓冲液、2mL H₂O、60μl 0.5M EDTA(pH8.0)、60μl 10％过硫酸铵和60μl 10％TEMED混合。配制好后立即使用，胶凝固后放置1小时后使用。

(3)安装好电泳仪，加入内槽电泳缓冲液和外槽电泳缓冲液，待用。

(4)将6.2获得的晾干试样溶于15μl 1×SDS加样缓冲液中，在沸水浴中放置5分钟即可上样进行电泳，待溴酚兰走出凝胶后停止电泳。

38％丙烯酰胺贮液：35.76g丙烯酰胺，2.24g甲叉双丙烯酰胺，加蒸馏水定容至100mL，过滤后避光4℃保存。

30％丙烯酰胺贮液：29g丙烯酰胺，1g甲叉双丙烯酰胺，加蒸馏水定容至100mL，过滤后避光4℃保存。

分离胶缓冲液：3M Tris碱，0.3％g SDS，pH为8.9。

堆积胶缓冲液：1M Tris碱，pH为6.8。

10×内槽电泳缓冲液：1M Tris碱，1M Tricine，1％SDS。

5×外槽电泳缓冲液：1M Tris碱，pH为8.9。

1×上样缓冲液(10mL)：0.2mg溴酚兰，0.15g二巯基乙醇，0.2g SDS，1mL甘油，1.25mL堆积胶缓冲液，补充水至10mL。

实施例7 基因工程菌YKAT-8在20L发酵罐中的发酵培养

将实施例6筛选得到的菌株YKAT-8按1∶100的比例接入200mL LB培养基，37℃200rpm振荡培养到对数生长期后，转接入发酵罐10L培养基。培养过程中通过搅拌速度的调节将溶氧控制在20％左右，利用氨水将pH控制在7.0。培养8小时后开始补料，补料速度为1.5mL/分钟；培养12小时后每隔2小时取样1mL，离心后取上清待检测。培养18-20小时后放罐。放罐后，培养液4000rpm离心取上清以备后面的纯化。

发酵液按6.3方法进行SDS-PAGE凝胶电泳，经扫描分析表明：重组胸腺素α1被分泌到培养基中，其最高表达量超过500mg/L培基(图5)。

发酵培养基：1％酵母抽提物，2％蛋白胨，0.5％酪蛋白氨基酸，0.2％MgSO₄，0.2％NH₄Cl，0.2％(NH₄)₂SO₄，0.1％NaCl，0.6％葡萄糖；

补料：300g/L葡萄糖，5g/L酪蛋白氨基酸；

实施例8 表达产物的分离纯化

8.1超滤：

将实施例7获得的培养基上清液用截留分子量100,000的超滤膜除去一些大分子量的杂蛋白。

8.2离子交换柱(Q-Sepharose Fast Flow)层析：

离子交换柱Q-Sepharose FF(Φ26×100mm)用平衡缓冲液(10mM TrispH7.2)平衡，将超滤过的发酵液用平衡缓冲液稀释至电导率为5以下，上样，流速为10ml/分钟。待上样完毕再用平衡缓冲液洗柱，将未被吸附的蛋白洗尽。然后在平衡缓冲液中依次加入0.05M、0.1M、2M NaCl进行阶段洗脱，收集0.1M NaCl的洗脱峰(图6)。

8.3Sephadex G-50凝胶过滤：

将8.2收集的洗脱组份冷冻干燥，然后溶解在小体积的蒸馏水中，经0.45μm微孔滤膜过滤，上Sephadex G-50柱(Φ100×900mm)进行纯化。缓冲液为5mM PB(pH7.2)，流速为20ml/分钟，收集2#峰(图7)。

8.4反相HPLC：

将8.3获得的2#组份冷冻干燥，然后溶解在小体积的重蒸馏水中，经0.45μm微孔滤膜过滤，然后用Waters公司的高压液相色谱仪进行纯化，收集主峰(图8)。

C8反相柱：ULTRASPHERE(Φ10.0mm×25cm)。

缓冲液A：0.1％TFA。

缓冲液B：0.1％TFA，50％乙腈。

梯度：0％～50％B，25分钟内。

流速：3ml/分钟。

实施例9 纯化产物的检定

9.1电泳检定：

按6.3方法进行SDS-PAGE凝胶电泳，经扫描分析，纯化的重组胸腺素α1纯度大于95％(图9)。

9.2反相HPLC检定：

分析结果(图10)表明，纯化的重组胸腺素α1纯度大于95％。

RP-300(Φ2.1×30mm)HPLC分析条件：

缓冲液A：0.1％TFA。

缓冲液B：0.1％TFA，90％乙腈。

梯度：0％～45％B，35分钟内。

流速：0.4ml/分钟。

9.3N端氨基酸序列分析：

委托中科院上海生物化学与细胞生物学研究所用ABI公司Protein Sequencer491型测序仪进行N端氨基酸序列分析(见图11-13)，共测出了纯化的重组胸腺素α1N端15个氨基酸，其序列依次为：

Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp，与天然胸腺素α1N端氨基酸序列(序列表中SEQ ID NO.10)一致，证明信号肽已被正确切除。

9.4玫瑰花结法测定活性：

(1)T细胞的制备：新鲜小牛胸腺1个，去脂并剪碎，加适量Hank′s液，含T细胞的混浊细胞液经100目筛过滤，滤液加入有1/3体积淋巴细胞分离液的离心管中，2000rpm离心20分钟，小心吸出中间的白色胸腺细胞，放入另一离心管中，加入5毫升Hank′s液洗涤(振摇均匀)，1500rpm离心3分钟，弃上清液，再加5毫升Hank′s液，反复三次。最后，加入3毫升Hank′s液摇匀，45℃恒温水浴30分钟、1500rpm离心3分钟，弃上清液，用Hank′s液反复洗三次，最后用Hank′s稀释并计数，使其最终浓度为3-5×10⁶细胞/毫升。

(2)绵羊红血球的制备：取新鲜绵羊血，用适量Hank′s液洗三次，弃上清液，加适量Hank′s液稀释并计数，使最终浓度为T细胞的10倍，约3-5×10⁷细胞/毫升。

(3)测定：将不同浓度的胸腺素α1加入1毫升稀释好的T细胞液中，37℃保温1小时，1500rpm离心3分钟，弃上清液，用Hank′s反复洗三次，加入稀释好的绵羊红细胞悬液及Hank′s液各1毫升，混匀，1500rpm离心3分钟，放入4℃冰箱过夜。次日取出，弃上清液(留少许)，各管分别涂片，加固定液各1滴，摇匀后静置至固定液快干时，加染色液2滴，摇匀，静置30分钟左右，先用Hank′s冲洗去染色液，最后用清水冲洗一次，在光学显微镜上计数，共数100-200个T细胞，计算出E玫瑰花结成的百分数(指结合4个以上绵羊红血球的淋巴细胞)。

Hank′s液：含0.8％氯化钠、0.1％葡萄糖、0.04％氯化钾、0.015％磷酸二氢钾和0.038％磷酸氢二钠溶液，用4％碳酸钠溶液调pH至7.20。

固定液：25％戊二醛，3.5％碳酸氢钠。

染色液：取姬姆萨原液2毫升，加Hank′s液6毫升，混匀，离心取上清液。

(4)活性检定结果见表1，结果表明纯化的重组胸腺素α1和化学合成的胸腺素α1有类似的生物活性，比胸腺肽的混合制备物活性要高。

表1：玫瑰花结试验结果

样品名称	空白	胸腺肽混合制备物	化学合成的胸腺素α1			纯化的重组胸腺素α1
样品名称	空白	胸腺肽混合制备物	化学合成的胸腺素α1			纯化的重组胸腺素α1			浓度(μg/ml)	--	50	0.1	1	10	0.1	1	10
玫瑰花结百分率(％)	10	26	15	22	35	14	24	33	浓度(μg/ml)	--	50	0.1	1	10	0.1	1	10

以上描述的具体实施方式旨在阐述本发明的最佳实施方式而不是以任何形式限制本发明。本领域技术人员根据本发明的启示，结合本领域的常识所做的各种变更，均落在本发明申请权利要求的范围内。

序列表

<110>上海普洛药物研究院有限公司

<120>重组胸腺素α1在大肠杆菌中的高分泌表达和分离纯化

<130>021252

<160>10

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>90

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

tctgacgctg ctgttgacac ttcttccgaa atcactacca aagacctgaa agaaaagaaa 60

gaagttgtag aagaggctga aaactaataa 90

<210>2

<211>84

<212>DNA

<213>人(human)

<400>2

tcagacgcag ccgtagacac cagctccgaa atcaccacca aggacttaaa ggagaagaag 60

gaagttgtgg aagaggcaga aaat 84

<210>3

<211>57

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

tctgacgctg ctgttgacac ttcttccgaa atcactacca aagacctgaa agaaaag 57

<210>4

<211>55

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

cccaagctta ttagttttca gcctcttcta caacttcttt cttttctttc aggtc 55

<210>5

<211>175

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

gctcgtcagt aaaaagttaa tcttttcaac agctgtcata aagttgtcac ggccgagact 60

tatagtcgct ttgtttttat tttttaatgt atttgtacat ggagaaaata aagtgaaaca 120

aagcactatt gcactggcac tcttaccgtt actgtttacc cctgtgacaa aagcg 175

<210>6

<211>60

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

aactgcagat ctagagctcg tcagtaaaaa gttaatcttt tcaacagctg tcataaagtt 60

<210>7

<211>60

<212>DNA

<213>人工合成

<400>7

ttaaaaaata aaaacaaagc gactataagt ctcggccgtg acaactttat gacagctgtt 60

<210>8

<211>60

<212>DNA

<213>人工合成

<400>8

tttgttttta ttttttaatg tatttgtaca tggagaaaat aaagtgaaac aaagcactat 60

<210>9

<211>64

<212>DNA

<213>人工合成

<400>9

cgcttttgtc acaggggtaa acagtaacgg taagagtgcc agtgcaatag tgctttgttt 60

cact 64

<210>10

<211>28

<212>PRT

<213>人(human)

<400>10

Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys Asp Leu

1 5 10 15

Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn

20 25

Claims

1.重组胸腺素α1基因，其具有与SEQ ID NO.1至少90％同源性的核苷酸序列。

2.分泌表达重组胸腺素α1的表达质粒pKAT，其包含权利要求1所述的重组胸腺素α1基因，及位于所述重组胸腺素α1基因上游的启动表达和分泌重组胸腺素α1的碱性磷酸酯酶phoA启动子和信号肽基因。

3.如权利要求2所述的表达质粒pKAT，其中所述的位于所述重组胸腺素α1基因上游的基因包含可以启动表达和分泌重组胸腺素α1的所有原核启动子和信号肽基因。

4.工程菌YKAT，所述工程菌是权利要求2所述表达质粒pKAT转化入大肠杆菌YK537而得到的具有卡那霉素抗性的所有菌株。

5.工程菌株YKAT-8，所述工程菌株是从权利要求4所述的工程菌YKAT中筛选出的重组胸腺素α1分泌表达量最高的菌株。

6.重组胸腺素α1的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)利用大肠杆菌偏爱密码子按照天然胸腺素α1的氨基酸序列设计并合成重组胸腺素α1基因；

(2)以pTZ18R为起始质粒，以大肠杆菌碱性磷酸酯酶phoA启动子和信号肽基因作为重组胸腺素α1基因的上游序列，构建表达质粒pKAT；

(3)接入卡那霉素抗性基因；

(4)构建和筛选出基因工程菌株YKAT-8；

(5)基因工程菌YKAT-8的发酵培养；

(6)表达产物的分离纯化。

7.如权利要求6所述的制备方法，其中所述的分离纯化方法是采用超滤、阴离子交换柱层析、凝胶过滤层析和反相高压液相色谱的组合方式。