CN86107784A - 生产肽的方法 - Google Patents
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Abstract
提供一种重组体病毒，即在家蚕核多角体病毒DNA的多角体蛋白质一编码结构基因区段中，具期望的蛋白质的结构基因的重组体家蚕核多角体病毒，所述基因与全部或部分多角体蛋白质一编码结构基因连接，其间插入或不插入连接子碱基序列。在蚕体或蚕体的衍生细胞中繁殖上述病毒，生产一种由期望的蛋白质及全部或部分多角体蛋白质结合成的融合蛋白质，当其结合时，插入或不插入连接子氨基酸或肽。所期望的蛋白质由在连接位点上分割或分解融合蛋白质而得到。
Description
本发明涉及重组体家蚕（Bombyx mori，蚕）核多角体病毒及应用这些重组体病毒生产肽的方法。
已经报导了利用Bombyx mori蚕体核多角体病毒（BmNPV）来生产肽的方法（见本文末尾所引用的参考文献之参考文献1）。
该方法的主要特征包括应用重组体DNA技术，以一种期望的蛋白质结构基因置换多角体蛋白质编码结构基因区段，以建造一种重组体BmNPV，并使这种重组体在培养的蚕（家蚕，Bombyx mori）体细胞中或活蚕（家蚕）体内繁殖，以便在其中积累期望的蛋白质。但是，这种方法在期望的蛋白质的产率方面仍不能使人满意。
此外，融合的蛋白质的生产也曾在大肠杆菌（Escherichia coli）体中实施过，但是，其产率也不能说已经有了大的增长（参考文献2-8）。
本发明就是关于一种重组体病毒，即是一种在Bombyx mori家蚕体核多角体病毒DNA的多角体蛋白质一个编码结构基因区段中，具有所期望的蛋白质的结构基因的重组体蚕核多角病毒，它连接到整个或部分的多角体蛋白质一编码结构基因中。该等基因之间具有或不具有中间插入的连接子碱序列。
本发明也是关于在培养的Bombyx mori家蚕体细胞中或在活的Bombyx mori的家蚕体内，繁殖重组体病毒从而生产融合的蛋白质的一种方法。
本发明还进一步是关于在融合蛋白质的连接位点将其分割或分解，从而生产所期望的蛋白质的方法。
在本文的附图中，
图1至图6通过一个举出的实例，用示意图表明用于生产重组体病毒的某些质粒的建造图解。
图7及图8是所期望的融合蛋白质的电泳图示。
BmNPV是养蚕工作者所广泛地知道的。T3菌株是由本发明者所分离来的一种典型的菌株。这种菌株的病毒DNA（BmNPV DNA）已经存放于在美国典型培养物保藏中心（ATCC），其登记号码是ATCC 40188。
为了从这种病毒的DNA中分离出含多角体蛋白质的结构基因的一个区段，用限制性内切酶（EcoRI）的处理来处理是适合的，如参考文献1所述，其中有一种带有质粒pBmE36的大肠杆菌菌株（E.coli K12JM83 DGB-0036），而质粒中含有病毒DNA的EcoRI-EcoRI片段〔约10.5千碱基（kb）〕，该片段是在EcoRI分裂位点插入到质粒中。此种菌株现已存放到日本通商产业省，工业科学与技术厅，发酵研究所，登记号码是FERM BP-813。
此外正如在参考文献1所叙述的那样，当应用HindⅢ处理pBmE36时，可得到含有多角体蛋白质的结构基因而长度约为3.9千碱基（kb）的片段。然后将此片段插入一市售的质粒pUC9〔可由P-L生物化学药品公司（Pharmacia P-L Biochemicals）买到〕。随后的EcoRI分割，Bal31处理（在此，不同长度的片断可通过调节处理时间而得到）此及进一步的HindⅢ分割，或者用一种相似的方法可提供包括全部或部份多角体蛋白质基因的片段。
应用一种适当的连接子（DNA）（参考文献19），可将所期望的蛋白质的一种结构基因，连接到整个或一部份多角体蛋白质基因上，而对所产生的融合蛋白质，当用一种适当的工具在由相应的连接子碱基顺序翻译成的氨基酸或肽的位点上分割时，可生成期望的蛋白质，然后可用通常的方法将其分离。当这种融合蛋白质本身就可应用时，自然不需要分割的步骤，在这种情况下;连接子也不需存在。
众所周知，在相当于连接子的肽或氨基酸（连接部份）及用于分割或分解融合蛋白质的各种工具之中所包括的分别是：异亮-谷-甘-精的序列及能够分割序列的凝血因子Xa（下面简称“F-Xa”）;脯-Ama-甘-脯（其中Ama是任何一种氨基酸）及能够分割序列的胶原酶;精氨酸或苯丙氨酸及能够分割在融合蛋白质之后的肽键的胰蛋白酶;酪氨酸或苯丙氨酸及能够分割在融合蛋白质之后的肽键的糜蛋白酶;脯氨酸-精氨酸及能够分解在融合蛋白质之后的肽键的凝血酶;色氨酸及能够分解融合蛋白质的N-溴代丁二酰亚胺;以及甲硫氨酸及能够分解融合蛋白质的溴化氰（参考文献2-10）。连接部份及分割或分解的工具并不限于上述者。许多其他的各种肽的组合物或氨基酸以及各种的化学的或酶促的方法均可分别用作连接区段及分割或分解的工具。
较理想的是，所期望的蛋白质不含有任何一种氨基酸或肽，而该氨基酸或肽暴露在上述的连接区段分割或分解的过程时则会被分解。但是，限制性地应用恰当地受限制及缓和的条件去分解融合蛋白质，则也可能藉此达到目的。
在此所用的名词-“期望的蛋白质”-可以是一种真核生物蛋白质，较好的是一种哺乳动物蛋白质。期望的蛋白质的具体例子包括不同的生理活性物质及用作诊断试剂的物质，例如干扰素（IFNs），肿瘤坏死因子（TNF），白细胞素及其他的淋巴细胞活素，胰岛素，生长激素及其他的激素，肝炎疫苗，流感疫苗，及各种其他的抗原蛋白类，组织血纤维蛋白溶酶原活性因子（TPA），促生长因子，工业上应用的酶例如甾类化合物转化酶、酰基转移酶，淀粉酶、脂酶等，食物添加剂及饲料添加剂，以及其他种种。在这些物质中，有些会有糖链加于其中。按照本发明，肽是由真核细胞产生的。当应用一种由真核生物殖生的基因，肽的生产可经历与发生在真核生物体内相同的一种改性这或多种改性。因此，本发明所生产的产品与由细菌生产的产品相比较，可以说是具有较高的效益。
用于这些蛋白质的基因编码，可以是由天然发生的物质分离出的染色体DNAs，也可以是通过天然衍生的mRNAs的中间体制备的cDNAs，由化学合成的DNAs，或由上述列举的技术的适当组合（参考文献18及19）而生产出的DNAs。
假如一种产品在氨基酸顺序上与预期的物质在氨基酸顺序上有些不同（取代，减少或增加），但仍然具有所要求的功能（例如生理活性）的话，则可按需要去改变此种影响。例如当与上述连接区段有关的蛋氨酸被溴化氰分解时，存在于期望蛋白中的一个或多个蛋氨酸残基可被另一个氨基酸残基或其他的氨基酸残基所置换或被取消。在这种情况下，检验按照上述的概念而设计出的碱序列为基础所产生的肽，看其活性是否适合所要达到的目的，这样做是可取的。
在某些例子中，正如所看到的那样，一种氨基酸残基的部份，可以留在期望的蛋白质产品上，例如，在用2-硝基-5-硫氰基苯甲酸来化学分解半胱氨酸的情况就是如此。在这种情况下，最好也象上述那样检验产品的活性，以确定产品是否符合预定的用途。
以一种碱基序列插入其中的质粒（用于重组的质粒），可以应用有关的那些质粒、限制性内切酶及市场上买得到的其他材料，以惯用的重组体DNA技术生产出来。这种碱基序列包括Bombyx mori家蚕体核多角病毒DNA（BmNPV DNA）的全部或部份的多角体蛋白质基因与一个期望的蛋白质的结构基因结合在一起（有或没有中间插入的连接子），它即构成一种融合蛋白质的基因。这些质粒的生产可参考此文后面所述的例子按常规的方法来实施。
为了应用上述质粒来生产重组体病毒，可使一种规定的Bombyx mori蚕体细胞株的细胞，受到用于重组作用的一种质粒及BmNPV的混合感染，如果需要的话，接着用空斑方法（Plaque Method，参考文献11）或稀释方法（参考文献12）分离重组体病毒。可以应用的适合的规定Bombyx mori蚕体细胞株中，包括已知的Bm细胞（在参考文献1，11及13中所叙述的BM-N细胞，保藏于ATCC，保藏号：CRL-8910）及保藏于ATCC（保存号为CRL-8851）的BM-N细胞。为了在蚕体内生产所需要的物质，通过将在培养的细胞中繁殖的病毒（用重组体或非重组体病毒混合物或者从其中分离出的重组体病毒）经皮肤法射或注射到蚕体的体腔内，或通过口腔将病毒喂入蚕体，而使蚕体受到病毒的感染。然后用人工饲料桑叶饲喂适当的天数，使其积累所期望的融合蛋白。通常，融合蛋白质不溶于水而悬浮于蚕体体液内，而可用惯用的方法如色层层析法（离子交换树脂层析，亲合层析，胶体渗透层析，等等），离心法、萃取法等等进行分离或纯化。
当将蚕体磨碎并与溶剂〔例如十二烷基硫酸钠（SDS）水溶液，尿素水溶液，强碱水溶液等等〕混合或与这些溶剂一起磨碎时，可用上面叙述的方法从溶液中将融合蛋白质分离或纯化。当要将融合蛋白质分割时，其分割/分解的步骤可按上面叙述过的方法来进行。
下述的实例中〔在这些例子中期望的蛋白是胰岛素相似物生长因子（IGF-Ⅰ及IGF-Ⅱ）及α-干扰素〕用作进一步说明本发明。但是，必须指出，这些例子决不是意图限制本发明范围。质粒建造的示意图在图1-5中作了描述。除非有其他的说明，按照通常的惯例，DNA序列的5′末端（上行）表示于左侧;而3′末端（下行）则表示于右侧。
多角体蛋白质基因，用于生产期望的蛋白质基因，及用于生产融合蛋白质的基因的合成、分割、筛选、分离及其他处理，可应用在参考文献1中所叙述的技术，以及常规应用的基因操作技术（参看例如参考文献18及19）来进行。
实例1
A.脱除多角体基因的质粒的建造
用EcoRI分割质粒pBmE36（参考文献1），并用DNA聚合酶Ⅰ（Klenow片段）在dNTPs（四脱氧核苷三磷酸类）存在下，使分割产物变成平整末端（blunt ended）。用HindⅢ部份消化，接着进行琼脂糖凝胶电泳，得到含多角体基因片段。应用T4连接酶，使此片段与由EcoRI分裂pUC9而制备的pUC9片段相连接（pUC9可由P-L生化药品公司买到），应用Klenow片段使分割产品末端整平，并进一步用HindⅢ使之分割以生成一种连接产物。所得到的连结产物用于转化大肠杆菌K-12JM83。然后回收质粒接并命名为p9BmE36，（参考资料19中叙述了上述方法）。
由活体外的突变，将一种EcoRV识别位点及一种Aat Ⅰ识别位点分别引进p9BmE36的起始密码子ATG的位点及终止密码子TAA的位点（参考文献14）。于是在溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓存在下，以脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）来处理p9BmE36，以生产一种具切断口的质粒（参考文献14），然后此种质粒再与下面两个化学合成的DNA片段退火（annealing）。
接着用聚合酶Ⅰ及T4连结酶处理，而生成异源双链质粒，此质粒随后用于转化大肠杆菌K-12JM83。为了得到所希望的突变体，再进行一次转化作用。这样就得到了一种p9BmM36的质粒。
为了从p9BmM36上脱下多角体基因及插入聚连接子，用化学方法合成下面两个片段（每个片段为38个单体）
CTAAGAGCTCCCGGGAATTCCATGGATATCTAGATAGG 和
CCTATCTAGATATCCATGGAATTCCCGGGAGCTCTTAG
这两个片段是互相辅助的，并有Sac Ⅰ，SmaⅠ，EcoRI，NcoⅠ，EcoRV及XbaⅠ识别位点。
应用T4激酶分别将上述两个片段在5′末端磷酸化，然后一起退火。在T4连接酶存在下，退火的产物与用EcoRV及AatⅠ分割p9BmM36所得到的而没有多角体基因的片段相连接。这一步骤结果使BglⅡ识别位点及AatⅠ识别位点分别在连接子的5′侧及3′侧形成，由此而产生的质粒用作转变大肠杆菌K-12JM83，然后将其回收及命名为pBMO30。
现将pBMO30的DNA序列及在pBMO30的聚连接子区段上的分裂位点，与p9BmE36的多角体基因区段的对比，表示如下
B.具有部份缺陷的多角体基因的质粒的建造
应用EcoRI分裂质粒p9H18（参考文献1），然后以Bal31处理，从而削去分裂位点每边的一部份。由于用Bal31处理的时间不同，产生了不同长度的片段。用HindⅢ处理这些片段并经0.7%琼脂糖胶电泳分离，然后经过萃取，即可得到不同长度的病毒衍生的DNA片段。
用SmaⅠ及HindⅢ处理质粒pUC9，接着将先前得到的DNA片段（具有一个平整末端及一个HindⅢ末端）相连接。应用由此而生成的质粒，将大肠杆菌K-12JM83转变然后生长。回收质粒，应用一种引子（M13的15-碱基序列的引子），以二脱氧法（dideoxy method，参考文献15）由每个病毒殖生的插入物DNA片段的3′侧，检验碱基顺序，由此鉴定病毒多角体基因区段，从而在病毒殖生的DNA片段的碱基顺序中，发现了相对应于Serebryani等人（参考文献16）所叙述的多角体蛋白质的氨基酸顺序的碱基顺序。翻译的起始密码子ATG及终止实码子TAA也得到鉴证。
由于Bal31的处理时间长短，所得到的不同的质粒（p9B系列质粒）之中，从失去多角体基因的翻译始密码子ATG，具下行的212碱基对，338碱基对，662碱基对及727碱基对的那些质粒，分别被命名p9B240，p9B120，p8B115及p9BO86。多角体基因的长度为738碱基对，其中包括终止密码子TAA。
123 40
ATGCCGAATT ATTCATACAC CCCCACCATC GGGCGTACTT
ACGTGTACGA CAATAAATAT TACAAAAACT TGGGCTGTCT
TATCAAAAAC GCCAAGCGCA AGAAGCACCT AGTCGAACAT
GAACAAGAGG AGAAGCAATG GGATCTTCTA GACAACTACA
TGGTTGCGCA AGATCCCTTT TTAGGACCGG GCAAAAACCA
GATACCATGA AGTTAATCGT CAACTGGAGC GGCAAAGAGT
TTTTGCGTGA AACTTGGACC CGTTTTGTTG AGGACAGCTT
GTCGCCAACC TCAAACCCAC ACGCCCCAAC AGGTGCTACA
AGTTCCTCGC TCAACACGCT CTTAGGTGGG AAGAAGACTA
CGTGCCCCAC GAAGTAATCA GAATTATGGA GCCATCCTAC
GTGGGCATGA ACAACGAATA CAGAATTAGT CTGGCTAAAA
AGGGCGGCGG CTGCCCAATC ATGAACATCC ACAGCGAGTA
CACCAACTCG TTCGAGTCGT TTGTGAACCG CGTCATATGG
GAGAACTTCT ACAAACCCAT CGTTTACATC GGCACAGACT
TTTCAAAATA AAGGAGTTTG CACCAGACGC GCCTCTGTTC
C.由多角体蛋白质及α-干扰素组成的融合蛋白质基因的建造
用Sma Ⅰ分裂pIFN2B310（参考文献1），用琼脂糖凝胶电泳分离α-IFN-J片段。应用T4连接酶使此片段与经Sma Ⅰ-分割的pBMO30相连接。生成的质粒用于转变大肠杆菌K-12JM83。重组体质粒被命名为pBT310，经证实，其中α-IFN-J基因是在正确的方位插入。
以Bgl Ⅱ分裂pBT310，用Klenow片段在dNTPs的存在下使分裂产品变成平整末端，然后用Sca Ⅰ分割。以琼脂糖凝胶电泳分离含有α-IFN-J基因的片段。
用EcoRI及Sca Ⅰ分割p9BO86，用琼脂糖凝胶电泳分离含有多角体基因的片段，应用S1核酸酶使此片段产生末端平整，并应用T4连接酶使此片段与上述含有α-IFN-J基因的片段连接。用生成的质粒转化大肠杆菌K-12JM83。然后，用二脱氧方法证实应用此方法得到的质粒的连接区段的DNA顺序是正确的。此种质粒命名为：pIFNFO86。
连接部份的DNA顺序是：
D.用于由胰岛素样生长因子（IGF-Ⅰ）及多角体蛋白质所组成的融合蛋白质的基因的建造。
将由大肠杆菌K12 MC1016 IGF001（FERM BP-932）回收得到的质粒pIGF001用Sal Ⅰ分割。在dNTPs的存在下，用Klenow片段使分裂的产品末端平整，并用Ava Ⅱ分割之，用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离含IGF-Ⅰ基因的片段。
分别用EcoRV及Sac Ⅰ分割pBMO30。
可以看到，在融合蛋白质的生产中，必须将氨基酸顺序：异亮-谷-甘-精导入多角体蛋白质及IGF-Ⅰ之间，由此，融合蛋白质可被识别出并可被凝血因子Xa（F-Xa）分割。为此目的，用化学合成法合成下面两个DNA片段：
ATTGAAGGCAGAG （13单体）
GACCTCTGCCTTCAATAGCT （20单体）
这两条片段是互补的，在退火之后，在上行的一侧形成了一个可与Sacl分裂末端连结的粘性末端，而在下行的一侧则形成一个可与AvaⅡ分裂末端连接的粘性末端。
应用T4激酶使这两条片段的5′末端磷酸化，然后在一起退火，将退火的产物，上述的IGF-Ⅰ片段与上述的分割pBMO30，用T4连接酶使之连接在一起。用此连接的产物使大肠杆菌K-12JM83转变以生成一种质粒。用二脱氧方法证实，在此质粒（pIFG-IO30）上的IGF-Ⅰ基因与F-Xa识别位点之间连接的DNA排列顺序是正确的。用BglⅠ分割pIGF-IO30，然后应用Klenow片段，在dNTPs的存在下使转变成平整末端，用ScaⅠ分割，含有IGF-Ⅰ基因的片段则用琼脂糖凝胶电泳分离。
分别用EcoRI及ScaⅠ分割p9B086，并用S1核酸酶使之转变成平整末端，用琼脂糖凝胶电泳将含多角体基因的片段分离，应用T4连接酶将此片段与上述含IGF-Ⅰ基因的片段相连接。应用所生成的质粒，使大肠杆菌K-12JM83转变，可得到一个具有由正确的连接构造的融合蛋白质基的质粒，并命名为pIGF-IFO86。连接区段的DNA顺序表示如下：
E.由不同长度的多角体蛋白质及IGF-Ⅱ所组成的融合蛋白质基因的建造
由大肠杆菌K12 MC1061 IGF002（FERM BP-933）回收得质粒pIGF002，以Sal Ⅰ部份消化，再用Klenow片段在dNTPs存在下使之变成平整末端，然后用Hae Ⅲ分割，接着用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，由此分离出一条含有IGF-Ⅱ基因的片段。应用T4连接酶使此片段与经SmaⅠ分裂的pBMO30连接，此连接产物用于大肠杆菌K-12JM83的转变。作为以此方法得到的转变物，它被证实带有一个质粒（pIGF-IIO30），其中由正确方位插入IGF-Ⅱ基因。
用EcoRI部份消化pIGF-ⅡO30，然后用ScaⅠ分割，用琼脂糖凝胶电泳使含有IGF-Ⅱ基因的片段分离，在T4连接酶的存在下，这一片段与含有一部份多角体基因的片段连接，后者是在用EcoRI及ScaⅠ分割了p9B240，p9B120及p9B115之后用琼脂糖凝胶电泳分离得到。
应用由前面的步骤中所得到的质粒转变大肠杆菌K-12JM83。应用二脱氧方法测定DNA排列顺序，证实由生成的转变物所生成的各质粒中具有以正确方式建造的各个融合蛋白质基因。
这些质粒分别被命名为pIGF-IIF240，pIGF-IIF120及pIGF-IIF115。
在各个质粒中连接区段的DNA顺序表示如下：
PIGF-IIF240
实例2
Bm细胞的转染
BmNPV T株病毒DNA（ATTC保藏号40188）及PIFNF086（摩尔比为1∶100）与溶液Ⅰ和溶液Ⅱ相混合，溶液Ⅰ与Ⅱ分别有下列的组成：
溶液Ⅰ 蒸馏水 2.1毫升
载体DNA（鲑精巢，1毫克/毫升） 50微升
BmNPV DNA 10微升
pIFNF086 DNA 50微克
2M氯化钙 300微克
溶液Ⅱ 50mM HEPES 缓冲溶液（pH7.1） 2.5毫升
（含0.28M氯化钠）
磷酸盐缓冲溶液
（35mM Na2HPO4-35mM NaH2PO4） 50微升
将生成物悬浮液一份1毫升加入到4毫升的一种Bm细胞培养介质（含有10%的牛犊胎儿血清的TC-10介质;参考文献17），将此混合物加到Bm细胞中（ATTC保藏号CRL-8910，2×106个细胞）从而将上述DNA引入Bm细胞中。20小时后，换入新鲜的介质，经过再培养5天后，回收介质并离心分离，将上清液进行空斑测定（参考文献11），由此回收作为无性繁殖系的重组体病毒。将其命名为vIFNF086。
分别应用pIGF-IF086，pIGF-IIF240，pIGF-IIF120及pIGF-IIF115，以上述同样的方法取得重组体病毒无性繁殖系，vIGF-IF086，vIGF-IIF240，vIGF-IIF120及vIGF-IIF115。
实例3
在Bm细胞中融合蛋白质的表达
向Bm细胞群（ATTC保藏号：CRL-8910，2×106个细胞中）加入一种vIFNF086的悬浮液〔5×107空斑单位（pfu）〕，以使其受vIFNF086的感染。卅分钟后，除去上清液，加入4.5毫升的新鲜介质一份并在25℃继续培育四天。之后，用离心法（1000转/分，经10分钟）处理培养液得到一种沉淀。将500微升的新鲜介质一份加到沉淀中，经过5次重复的冰冻-解冻循环，离心分离混合物（15，000转/分，10分钟），向以此法收集到的沉淀中加入200微升4%的十二烷基硫酸钠（SDS）-10%的巯基乙醇。用5微升的生成物溶液一份作为样品，进行SDS-14%聚丙烯酸酰胺凝胶电泳。
电泳过后，凝胶中可观察到与所期望的融合蛋白质相关的一条带。因此，可以应用光密度计来测量该带的密度并与每一个标志物的密度相比较（每个标志物带含有1微克蛋白质）。这样测定的产率是每一毫升第一次得到的细胞培养液中含有0.3毫克。由于计算出在此种融合蛋白质中IFN部分约占40%（按分子量计），这一产量在成功的分割及IFN回收后，应相当于0.12毫克/毫升产率的IFN。当该产率与在一份报告所给出的用于表达在家蚕体细胞中的IFN的数值即5×106单位/毫升（相当于0.005毫克/毫升）相比较，是后者的20倍（参考文献1）。
同上述的同样方法测定用vIGF-IF086，vPIGF-IIF240，vPIGF-IIF120及vIGF-IIF115感染Bm细胞而生产的融合蛋白质的产量分别是每毫升细胞培养液含0.5毫克，0.1毫克，0.4毫克及0.5毫克，或者当根据含于这些蛋白质中的IGF-Ⅰ或IGF-Ⅱ的数量来表示时，则分别是0.1毫克/毫升，0.05毫克/毫升，0.1毫克/毫升及0.1毫克/毫升。
实例4
A.在Bm细胞中的融合蛋白质的表达
向Bm细胞群（ATTC保藏号CRL-8910，2×106个细胞）中加入vIGF-IIF120悬浮液（5×107空斑单位），使Bm细胞受到vIGF-IIF120之感染。卅分钟后，将病毒除去，加入4.5毫升的新鲜介质一份，在25℃继续培养4天，并离心分离（1，000转/分，10分钟）培养液。向离心后收集到的沉淀加入500微升诉鲜的介质。在重复5次冷冻-解冻循环后，将混合物离心分离（15，000转/分，10分钟）以取得沉淀，用蒸馏水洗涤沉淀，溶于0.5%SDS中，经高效液体色谱分离〔HPLC：TSK凝胶苯基5PWRP〔由东洋曹达工业株式会社（Toyo soda Manufacturing co，Ltd.）生产〕;溶剂系统：0.1%三氟乙酸-20-75%乙腈，线性浓度梯度。由此可收集到含有融合蛋白质的液分2毫升。
B.用溴化氰（BrCN）分割
向此含融合蛋白质的液分加入50微升的1%十二烷基硫酸钠（SDS），将混合物浓缩至干，并将浓缩物溶于50徵升的蒸馏水中。取此溶液15微升并向其中加入35微升的甲酸及45微升70%的甲酸，接着进一步加入含有溴化氰溶液（200微摩尔/毫升）的70%的甲酸5微升。在室温下反应24小时后，将反应混合物浓缩至干，将浓缩物溶于7.5微升的蒸馏水中，并将此溶液电泳，检测出有一相当于IGF-II的带。
从而，用十二烷基硫酸钠水溶液萃取受vIGF-IIF120感染的Bm细胞，并接着用高效液相色谱进行部份纯化而取得的液份，在十二烷基硫酸钠-16%聚丙烯酰胺凝胶电泳中，得到相当于由多角体蛋白质（部份）及IGF-II组成的融合蛋白质的一条约23K带，而溴化氰分解产物则显示约7K的带（相当于IGF-II）与几条在10-14K的带一起，估计可能是由于多角体蛋白质的分解产物所致（见图8;其中A是标志物，B是融合蛋白，C是溴化氰分解产物）。
C.IGF-IP的N-末端的确定
应用类似于上面所叙述的方法，从50毫升受vIGF-II120感染的Bm细胞的培养液中取得的20毫克融合蛋白质，用溴化氰分割此融合蛋白质，并浓缩此反应的混合物。
将此浓缩物溶于5毫升200毫摩尔的吡啶-醋酸缓冲液中（pH3.0），用桂色谱〔SP-Toyopearl（东洋曹达工业株式会社生产）;溶剂体系：200毫摩尔吡啶-醋酸缓冲液（pH3.0）-2.0M吡啶-醋酸缓冲液（pH5.0），线性浓度梯度〕进行分离。从而收集含有IGF-II的液份。将此液份冷冻干燥后溶于蒸馏水中，并使之经过高效的液相色谱〔HPLC：0DS-120T（东洋曹达工业株式会社生产）;溶剂体系：0.1%三氟醋酸-10-65%乙腈，线性浓度梯度〕。所得到的纯IGF-II经过测定其肽顺序排列〔470A蛋白质定序器（由Applied Biosytems生产）〕。由此确定IGF-II的氨基末端氨基酸排列顺序表示于下：
Ala Tyr Arg Pro Ser Glu Thr Leu Cys Gly Gly Glu
Leu Val Asp Thr Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg
Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Ala Ser
实例5
A.在Bm细胞中融合蛋白质的表达
从大肠杆菌K12 MC1061 IGF001（FERM BP-932）中回收质粒pIGF001，并用Sal Ⅰ分割。应用Klenow片段在dNTPs的存在下使分割的产物变成平整末端并用Ava Ⅱ分割，用聚丙烯酰胺凝胶电泳，将含有IGF-Ⅰ基因的片段分离。
分别用EcoRV及EcoRI分割pIGF-IIF120以除去含IGF-II基因片段。
可以看出，在制备融合蛋白质时，必须将氨基酸顺序：甘-脯-丙重复地引至多角体蛋白质与IGF-Ⅰ之间，因而使融合蛋白质可被胶原酶所识别及分割，这种酶识别氨基酸顺序：脯-Ama-甘-脯（Ama是指任何一种氨基酸）并在Ama与甘氨酸之间分割。为此目的用化学方法合成下面两个DNA片段：
（54单体）
GACCTCTGCCTTCAATGAATTCACCCGCGGGACCAGCTGGACCAGCTGGGCCC
（53单体）
这两个片段是互补的，在退火以后，在上行一侧形成一个可与EcoRI分裂末端相连接的粘性末端，而在下行一侧则形成一个可与Ava Ⅱ分裂末端相连接的粘性末端。
应用T4激酶使这两个片段各在5′末端磷酸化，然后在一起退火。用T4连接酶使退火的产物，上述的IGF-Ⅰ片段与上述的分割的pIGF-IIF120连接在一起。用连接的产物转变大肠杆菌K-12JM83，以产生一种质粒并命名为pIGF-IF120。用二脱氧法断定DNA的排列顺序，得知在此质粒中的IGF-Ⅰ基因与胶原酶识别位点之间的连接是正确的。连接区段的DNA顺序可表示如下：
应用pIGF-IF120，并使用与实例2中所叙述的相类似的方法，可取得重组体病毒vIGF-IF120。
应用在实例4（a）中所叙述的相似方法，用vIGF-IF120感染Bm细胞，将从50毫升培养液收集的Bm细胞冷冻-解冻之后，离心该细胞（15，000转/分，10分钟）以取得沉得沉淀。将沉淀溶于6M盐酸胍溶液中并离心分离（15，000转/分，5分钟）以除去残余物。将溶液用蒸馏水渗析，用离心法收集所生成的沉淀（15，000转/分，10分钟）。
B.用胶原酶分割
将由上面步骤中取得的沉淀溶于800微升的10M尿素溶液中，接着加入200毫摩尔的氯化钙100微升，250毫摩尔的Tris-盐酸缓冲液（pH7.4）200微升及胶原酶溶液900微升〔由两格玛化学公司（Sigma Chemical co.）生产〕（1，500单位/毫升）。在40℃培育两小时之后，离心此混合物（15，000转/分，5分钟）以收集上清液，将此上清液进行离子交换色谱分析〔DEAE-Toyopearl（由东洋曹达工业株式会社生产;溶剂体系：25毫摩尔的Tris-盐酸缓冲液（pH7.4）〕。由此收集到含有IGF-Ⅰ而在其氨基末端有额外的氨基酸残基（以下简称为“IGF-IP”）的液份。
C.IGF-IP的N-末端的鉴定
将含有IGF-IP的液份浓缩，并将浓缩物进行高效液相色谱分析〔HPLC∶RPSC，由贝克曼公司（Beckman co.）生产;溶剂体系：0.1%三氟乙酸-10-65%乙腈，线性浓度梯度〕。将所得到的纯IGF-IP经过肽定序鉴定〔470A蛋白质定序器（由Applied Biosystems生产）〕，结果显示胶原酶在所期望的位点分割融合蛋白质，由此确定的IGF-IP的氨基末端氨基酸序列表示如下：
Gly-Pro-Ala-Gly-Glu-Phe-Ile-Glu-Gly-Arg-Gly-Pro-Glu-Thr-Leu-Cys-Gly-Ala-Glu-Leu
实例6
在蚕类（家蚕）体中多角体-IGF-Ⅰ融合蛋白质的表达
将vIGF-IF086的悬浮液经皮注射到5龄1天的蚕（家蚕）体中，其剂量为0.5毫升/只（107空斑单位）然后在25℃下以桑叶喂食3天。再用收集针插入腹肢，将所收集的体液放入一个冰冻的Eppendorf管中。离心该体液（15，000转/分，10分钟），将沉降物溶于4%十二烷基硫酸钠（SDS）-10%巯基乙醇混液200微升中，并将2微升的生成溶液一份作为样本进行SDS-14%聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳之后在凝胶上有一条与融合蛋白质相应的带。因此，用光密度计测定此带的密度并将之与每一标志物的密度相比较（每一标志物含有1微克蛋白质）。这样测定出的产率为5毫克/毫升体液。（以分子量为基础计算表明，在IGF-Ⅰ从融合蛋白质中分离之后，IGF-Ⅰ可能的回收率为1毫克/毫升）。
在SDS-14%聚丙烯酰胺凝胶电泳中，从受BmNPV-T3株感染的家蚕所得到的体液，大约在相应于多角体蛋白质的30K处显示出一清晰的带，然而从经vIGF-IF086感染的家蚕体液中却没有显示出相应于多角体蛋白质的任何带，但却显示一条由多角体蛋白质及IGF-Ⅰ组成的融合蛋白质的特征的约36K带（见图7其中A是标志物，B是受vIGF-IF086感染的体液而C是受BmNPV-T3感染的体液）。
应用于上述各个实例中的IGF-Ⅰ及IGF-Ⅱ的每一个合成基因，与相应的氨基酸序列表示如下：
IGF-Ⅰ
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly
┄TCGAATTC ATG GGT CCA GAA ACC TTG TGT GGT
Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe Val Cys
GCT GAA TTG GTT GAC GCT TTG CAA TTC GTT TGT
Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr
GGT GAC AGA GGT TTC TAC TTC AAC AAG CCA ACT
Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln
GGT TAC GGA TCC TCT TCC AGA AGA GCT CCA CAA
Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys Phe Arg Ser
ACT GGT ATC GTC GAT GAA TGT TGT TTC AGA TCT
Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala
TGT GAC TTG AGA AGA TTG GAA ATG TAC TGT GCT
Pro Leu Lys Pro Ala Lys Ser Ala
CCA TTG AAG CCA GCT AAG TCT GCT TAG TCGACTG
IGF-II
Ala Tyr Arg Pro Ser Glu Thr Leu
-AATTC ATG GCT TAC AGA CCA TCT GAA ACC TTG
Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr Leu Gln Phe
TGT GGT GGT GAA TTG GTC GAC ACC TTG CAA TTC
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Ser Arg
GTT TGT GGT GAC AGA GGT TTC TAC TTT TCC AGA
Pro Ala Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly
CCA GCC TCC AGA GTT TCT AGA AGA TCC AGA GGT
Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp
ATC GTC GAA GAA TGT TGT TTC AGA TCC TGT GAC
Leu Ala Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro
TTG GCT TTG TTG GAA ACT TAC TGT GCC ACC CCA
Ala Lys Ser Glu
GCC AAG TCC GAA TAG┉
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Claims (5)
1、一种重组体病毒，即在家蚕(Bombyx mori)核多角体病毒DNA(BmNPV DNA)的多角体蛋白质编码结构基因区段中，具有期望的蛋白质结构基因的一种重组体家蚕(Bombyx mori)核多角体病毒，将所述基因连接到全部或部份的多角体蛋白质一编码结构基因上，它们之间有或者没有插入连接子碱基序列。
2、一种生产肽的方法，它包括，
建造一种重组体病毒，即在家蚕（Bombyx mori）核多角体病毒DNA（BmNPV DNA）的多角体蛋白质编码结构基因区段中，具有所期望的蛋白质结构基因的一种重组体核多角体病毒，将上述基因连接到全部或部份的多角体蛋白质-编码结构基因上，它们之间有或者没有插入连接子碱基序列，以及
繁殖所述的病毒，以生产出一种融合蛋白质，此种融合蛋白质含有所述的期望蛋白质及全部或者部份多角体蛋白质，它们之间以插入或者不插入连接的氨基酸或者肽相连接。
3、一种生产期望的蛋白质的方法，它包括，
建造一种重组件病毒，即在家蚕（Bombyx mori）核多角体病毒DNA（BmNPV DNA）的多角体蛋白质-编码结构基因区段中，具有期望蛋白质结构基因的一种重组体家蚕核多角体病毒，将所述基因连接到全部或部份多角体蛋白质-编码结构基因上，其间插入或没有插入连接子碱基序列，
繁殖所说的病毒，以生产一种融合蛋白质，此种蛋白质含有所述的期望蛋白质及全部或部份的多角体蛋白质，它们之间以插入或没有插入连接的氨基酸或肽相连接，
然后在其连接位点，分割上述融合蛋白质，以生产期望的蛋白质。
4、一种质粒，它含有5′-上行碱基序列，其中包括：家蚕（Bmobyx mori）核多角体病毒DNA（BmNPV DNA）的启动区段，全部或部份BmNPV DNA的多角体蛋白质-编码结构基因，选择性的一种连接子碱基序列，一种期望的蛋白质的结构基因（选择性地包括期望蛋白质的终止区的一种碱基序列），及含有一种3′-下行的碱基序列（包括上述BmNPV DNA的终止区段）。
5、一种生产重组体家蚕（Bombyx mori）核多角体病毒DNA的方法，其中包括共转染一种培养的家蚕细胞系或者带有家蚕核多角体病毒DNA（BmNPV DNA）的家蚕的一种品系，以及一种质粒，质粒中含有5′-下行碱基序列，其中包括：家蚕核多角体病毒DNA（BmNPV DNA）的启动区段，BmNPV DNA的全部或部份的多角体蛋白质-编码结构基因，选择性的一种连接子碱基序列，一种期望的蛋白质的结构基因（选择性地包括期望蛋白质的终止区的一种碱基序列），及含有上述BmNPV DNA的终止区段的一种3′-下行碱基序列。
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